Αφηρημένο

Το μελάνωμα αντιγόνο Α (MAGE-Α) πρωτεΐνες περιλαμβάνουν ένα δομικά και βιοχημικά παρόμοια υπο-οικογένεια του Καρκίνου /αντιγόνα όρχεων που εκφράζονται σε πολλούς τύπους καρκίνου και πιστεύεται ότι συμβάλλουν ενεργά στην κακοήθεια. Οι πρωτεΐνες MAGE-A εγκατεστημένος ρυθμιστές ορισμένων παραγόντων μεταγραφής σχετίζονται με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων των ρ53 και είναι ενεργοποιητές αρκετών RING δακτύλου εξαρτώμενη λιγάσες ουβικιτίνης Ε3. Εδώ, αποδεικνύουμε ότι το MAGE-A2 συνεργάτες με MDM2, ένα ubiquitin Ε3 λιγάση που μεσολαβεί ubiquitylation άνω των 20 υποστρώματα συμπεριλαμβανομένων κυρίως ρ53, η ίδια MDM2 και MDM4, ένας ισχυρός αναστολέας ρ53 και ΜΌΜ2 εταίρος που σχετίζεται δομικά με MDM2. Θεωρούμε ότι το MAGE-A2 αλληλεπιδρά με MDM2 μέσω του Ν-τερματικού τσέπη ρ53 δέσμευσης και την περιοχή RING δάχτυλο του MDM2 που απαιτείται για ομο /ετερο-διμερισμό και για την αλληλεπίδραση λιγάσης Ε2. Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, δείχνουμε ότι το MAGE-Α2 είναι ένας ισχυρός αναστολέας της ουμπικουϊτίνης δραστηριότητα λιγάσης Ε3 του MDM2, όμως δεν έχει καμία σημαντική επίδραση επί του κύκλου εργασιών ρ53 διαμεσολαβείται από MDM2. Εντυπωσιακά, ωστόσο, η αυξημένη έκφραση MAGE-A2 οδηγεί σε μειωμένη ubiquitylation και αυξημένα επίπεδα MDM4. Παρομοίως, αποσιώπηση του ενδογενούς MAGE-Α έκφραση μειώνεται επίπεδα MDM4 με έναν τρόπο που μπορεί να διασωθεί από τον αναστολέα πρωτεασώματος, bortezomid, και επιτρέπει αυξημένη συσχέτιση MDM2 /MDM4. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι πρωτεΐνες MAGE-A μπορεί να: (i) αποσυνδέσει τα ουμπικουϊτίνης λιγάση και η υποβάθμιση των λειτουργιών MDM2? (Ii) δρουν ως ισχυροί αναστολείς της λειτουργίας λιγκάσης Ε3? και (iii) ρυθμίζει τον κύκλο εργασιών της MDM4. Μπορούμε επίσης να βρούμε μια συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας της MAGE-Α και αυξημένα επίπεδα MDM4 σε πρωτοπαθή καρκίνο του μαστού, γεγονός που υποδηλώνει ότι το MAGE-Α-εξαρτώμενο έλεγχο των επιπέδων MDM4 έχει σχέση με τον καρκίνο κλινικά

Παράθεση:. Marcar L, Ihrig Β, Hourihan J, Bray SE, Quinlan PR, Ιορδανία LB, et al. (2015) MAGE-A Λειτουργία του Καρκίνου /όρχεων αντιγόνα Αναστέλλουν MDM2 Ubiquitylation και να προωθήσει την αύξηση των επιπέδων της MDM4. PLoS ONE 10 (5): e0127713. doi: 10.1371 /journal.pone.0127713

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Chunhong Yan, Γεωργία Regents του Πανεπιστημίου, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 22η Ιανουαρίου 2015? Αποδεκτές: 17 Απρ 2015? Δημοσιεύθηκε: 22η Μαΐου του 2015

Copyright: © 2015 Marcar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή υποστηρίχθηκε από τους αριθμούς επιχορήγησης: 2008NovPR32 και 2001NovPhD07, URL: https://www.breastcancercampaign.org. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αντιγόνα σχετιζόμενα με μελάνωμα (MAGE) αρχικά ανακαλύφθηκε ως σχετιζόμενη με καρκίνο αντιγόνων σε ασθενείς με μελάνωμα [1] και είναι τώρα γνωστό ότι περιλαμβάνει ένα υπερ-οικογένεια (που περιλαμβάνει πολλές υπο-οικογένειες) πάνω από 60 γονίδια σε ανθρώπους [2,3]. Οι MAGEs υποδιαιρούνται σε δύο ομάδες, MAGE-Ι και MAGE-ΙΙ, με βάση τις χρωμοσωμικές θέσεις των γονιδίων και την ιστική κατανομή των προϊόντων τους [2,3]. πρωτεΐνες MAGE-Ι (η οποία περιλαμβάνει υπο-οικογένειες MAGE-A, -Β και -C) είναι μέλη της ευρύτερης οικογένειας του Καρκίνου /όρχεων (CT) αντιγόνα τα οποία φυσιολογικά εκφράζονται κυρίως σε γεννητικά κύτταρα, αλλά τα παρεκκλίνοντα εκφράζονται, κυρίως μέσω επιγενετικών αναπρογραμματισμός, σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων του στήθους, των ωοθηκών, του πνεύμονα, της ουροδόχου κύστης και [3,4,5,6]. πρωτεΐνες MAGE-II είναι ευρύτερα εκφράζονται και κανονικά δεν σχετίζονται με τον καρκίνο.

Μέλη του MAGE-A υπο-οικογένεια δείχνουν εντυπωσιακή δομική και λειτουργική ομοιότητα με το άλλο [3]. Η έκφραση του ΜΑΟΕ-Α παρατηρείται κυρίως σε καρκίνους που έχουν αποκτήσει κακοήθεις φαινοτύπους όπως επιθετικότητα ή μετάσταση, και συσχετίζεται με φτωχή πρόγνωση [3]. Περιέργως, τα γονίδια ΜΑΟΕ-Α συχνά συν-εκφράζονται, με τους περισσότερους καρκίνους που δείχνει την παρουσία τουλάχιστον δύο ή περισσότερα από αυτά τα αντιγόνα. Τα επίπεδα έκφρασης μπορούν επίσης να ποικίλλουν σε μεγάλο βαθμό και μπορεί, κατά συνέπεια, επηρεάζει τη βιολογική μοίρα των κυττάρων που εκφράζουν αυτές τις πρωτεΐνες. Συνεπής με ένα ρόλο καρκίνο προαγωγής, ΜΑΟΕ-Α έκφραση διεγείρει εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, ο ρυθμός μετανάστευσης και διεισδυτικότητα των καλλιεργημένων κυττάρων

in vitro

και μπορεί να προωθήσει την αύξηση του μεγέθους του όγκου και του αριθμού και του μεγέθους των μεταστατικών εστιών σε ζωικά μοντέλα [7,8]. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι MAGE-Α έκφραση μπορεί να συμβάλει στην κακοήθεια.

Η κανονική λειτουργία (ες) της MAGE-A οικογένεια παραμένει άγνωστη, αλλά όλο και περισσότερες ενδείξεις δείχνουν οι πρωτεΐνες αυτές ρυθμίζουν βασικούς μεταγραφικούς παράγοντες όπως SKIP , P300, P160 (TIF2) υποδοχέα ανδρογόνων ER-άλφα, και ο καταστολέας όγκου ρ53 [3,7,9,10,11,12,13,14,15]. Μέσα από την αλληλεπίδραση με αυτές τις πρωτεΐνες, MAGE-Α (και άλλες MAGE Ι πρωτεΐνες) μπορεί να ρυθμίσει μεταγραφικά γεγονότα με διάφορους μηχανισμούς, όπως η πρόσληψη και η στόχευση της ιστόνης δεακετυλάσης (HDAC) δραστηριότητα στο SKIP ή p53 [11,13,16], την προώθηση της αλληλεπίδρασης του υποδοχέα ανδρογόνων με P160 και άλλες πρωτεΐνες συν-ενεργοποιητή [14], ή η σύζευξη του συν-καταστολέα, KAP1 /TRIM28, να δακτύλου ψευδαργύρου KRAB πεδίο παραγόντων (KZNF) μεταγραφή [8,17,18]. Εκτός από αυτά τα αποτελέσματα, τα τελευταία στοιχεία δείχνουν ότι μια σειρά από πρωτεΐνες MAGE (και οι δύο τύποι Ι και II) μπορούν να προωθήσουν ubiquitylation δρώντας ως ενεργοποιητές της RING (πραγματικά ενδιαφέρον νέο γονίδιο) λιγάσες δάχτυλο τύπου Ε3 ουμπικουιτίνης [8,17,19] . Για παράδειγμα, MAGE-G1 μπορεί να τονώσει την ουμπικιτίνη δραστηριότητα λιγάσης του NSE1. Παρομοίως, η αλληλεπίδραση του MAGE-C2 με την πρωτεΐνη συγκαταστολέας KAP1 (TRIM28) μπορεί να διεγείρει KAP1 εξαρτώμενη κύκλος εργασιών του καταστολέα όγκων ρ53 ανεξάρτητα από την κύριος ρυθμιστής ρ53, MDM2 [17]. Αυτό το ενοποιητικό θέμα των πρωτεϊνών MAGE ως ρυθμιστές της RING λιγάσες δάχτυλο ενισχύεται από την παρατήρηση ότι εννέα νέων εταίρων δέσμευσης MAGE-Ι προσδιορίζονται από την ανάλυση ΤΑΠ-tag /φασματομετρία μάζας είναι πρωτεΐνες ΔΑΧΤΥΛΙΔΙ δάχτυλο [17]. Εντός της MAGE-A οικογένεια, ρεύμα βιοχημικές ενδείξεις υποδεικνύουν έναν υψηλό βαθμό λειτουργικής πλεονασμού, για παράδειγμα στη ρύθμιση της λειτουργίας της ρ53 [12,13]. Από την άλλη πλευρά, οι πρόσφατες δημοσιεύσεις δείχνουν ότι μπορεί να υπάρχει υψηλός βαθμός εξειδίκευσης σε αλληλεπιδράσεις MAGE /εταίρο, τουλάχιστον για ορισμένους εταίρους [14,15,17].

p53 δρα κυρίως ως παράγοντας μεταγραφής που εξαλείφει τα καρκινικά κύτταρα μέσω του συντονισμού αλλαγές στην έκφραση γονιδίων, οδηγώντας σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, γήρανση ή απόπτωση [20]. p53 ρυθμίζεται κυρίως μέσω της αλληλεπίδρασής της με MDM2, ένα δαχτυλίδι δάχτυλο τύπου ουβικουϊτίνης Ε3 λιγάση. MDM2 και ρ53 λειτουργούν μέσα σε ένα βρόχο ανάδρασης στο οποίο p53 διεγείρει

MDM2

έκφραση, οδηγώντας σε κατιούσα ρύθμιση των επιπέδων ρ53 με MDM2. Επαγωγή και ενεργοποίηση της ρ53 από διάφορα ερεθίσματα άγχους επιτυγχάνεται μέσω διαφορετικών αλλά επικαλυπτόμενες μηχανισμούς που αποσυνδέσει κυρίως την αλληλεπίδραση ρ53 /MDM2 [21]. Τα κύρια χαρακτηριστικά της πρωτείνης Mdm2 είναι: ένα Ν-τερματικό τομέα δέσμευσης ρ53 στα οποία το Ν-τελικό άκρο της ρ53 αλληλεπιδρά με ένα υδρόφοβο θύλακα στη MDM2? ακολουθίες πυρηνικών εξαγωγών και των εισαγωγών που μεσολαβούν πυρηνο-κυτταροπλασματική παλινδρόμηση των δύο MDM2 και ρ53? ένα πολύ όξινο και άκρως φωσφορυλιωμένο κεντρική περιοχή η οποία είναι κρίσιμη για την αποικοδόμηση της ρ53? και ένα Ο-τερματικό RING δάκτυλο που απαιτείται τόσο για την ubiquitylation και την υποβάθμιση του p53. Αυτοί οι τομείς στηρίζουν πολλές βιοχημικές λειτουργίες στο MDM2 που δρουν διαδοχικά και συνεργατικά προς τα κάτω-ρύθμιση των επιπέδων p53: αυτές περιλαμβάνουν κυρίως ubiquitylation, πυρηνο-κυτταροπλασματικής μεταφοράς, και η στόχευση της p53 στον πρωτεασώματος για την αποικοδόμηση. Επιπλέον, αυτές οι βιοχημικές λειτουργίες μπορούν να ρυθμιστούν

ανεξάρτητα

από το άλλο. Για παράδειγμα, ενώ η φωσφορυλίωση multi-site της όξινης κεντρική περιοχή της MDM2 δεν έχει καμία ανιχνεύσιμη επίδραση στην ικανότητά της να μεσολαβήσει ubiquitylation του p53, οι τροποποιήσεις αυτές διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην προώθηση του κύκλου εργασιών της p53 διεγείροντας τη σύνδεση της MDM2 με διάφορες συνιστώσες του η πρωτεασώματος [22,23]. Αν και ικανά να μεσολαβούν την αλληλεπίδραση με το πρωτεάσωμα, ο ακριβής μηχανισμός (ες) με την οποία ΜϋΜ2 κινεί αποδόμηση ρ53 ελλιπώς κατανοητός.

MDM4 (επίσης γνωστή ως MDMX ή HDMX) είναι ένας ελαττωματικός ουβικιτίνη λιγάση που σχετίζεται δομικά με MDM2 και αναστέλλει ρ53 μέσω επικαλυπτόμενων μηχανισμών [24,25]. Πρώτον, είναι μια διεγερτική εταίρος της MDM2 [26] που είναι η ίδια ρυθμίζεται από MDM2 μεσολάβηση ubiquitylation [27,28,29]. Επιπλέον, όπως με ΜϋΜ2, ρ53 δεσμεύεται με MDM4 κυρίως μέσω ενός Ν-τερματικού υδρόφοβου θύλακα εμποδίζοντας έτσι στερικά την αλληλεπίδραση της περιοχής ρ53 διενεργοποίησης (TAD1) με το μεταγραφικό μηχανήματα και με αυτόν τον τρόπο τα κάτω ρύθμιση ρ53-διαμεσολαβούμενη διενεργοποίησης [30].

λειτουργία ρ53 χάνεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης ενός υψηλού ποσοστού καρκίνων των διαφόρων τύπων μέσω μετάλλαξης του

ΤΡ53

γονιδίου (που κωδικοποιεί ρ53). Σε ορισμένες μορφές καρκίνου, ωστόσο, η

TP53

συχνότητα μετάλλαξης είναι χαμηλότερο, αλλά και άλλοι μηχανισμοί, όπως η αλλοιωμένη έκφραση ή μετάλλαξη των ρυθμιστικών αρχών p53 (π.χ. MDM2, MDM4, ARF) πιστεύεται ότι εξαλείφει την λειτουργία του p53 [31]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι διάφορα μέλη της MAGE-A οικογένεια, όλα εκ των οποίων παρουσιάζουν εντυπωσιακή ομοιότητα αλληλουχίας, ενεργούν με παρόμοιο τρόπο και είναι ισχυροί αναστολείς της ρ53-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή και απόπτωση [8,12,13]. Δύο από αυτές τις μελέτες δείχνουν ότι οι πράξεις MAGE-A, τουλάχιστον εν μέρει, με σύνδεση προς τον πυρήνα περιοχή του p53 (πρόσδεσης τοποειδική DNA) και για τη ρύθμιση προς τα κάτω λειτουργία μεταγραφή του [12,13]. MAGE-Α μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ακετυλίωση p53 (ενεργοποίηση) μέσω της πρόσληψης HDAC3 και την αλληλεπίδραση με PML πυρηνική φορείς [13,16]. Μέσω των μηχανισμών αυτών MAGE-A μπορεί να προσδώσει ανθεκτικότητα σε φάρμακα που δρουν μέσω της οδού της ρ53 [13]. Είναι ενδιαφέρον ότι, περίπου [17,32], αλλά δεν είναι όλα [12,13], μελέτες δείχνουν ότι οι πρωτεΐνες MAGE μπορεί να ρυθμίσει τα επίπεδα ρ53, για παράδειγμα μέσω της αλληλεπίδρασης με λιγάσες Ε3 όπως KAP1 (TRIM28) [17]. Ωστόσο, το ζήτημα αυτό δεν έχει επιλυθεί. Επιπλέον, δεδομένης της πλέον καθιερωμένο ρόλο των πρωτεϊνών MAGE-Α ως ρυθμιστές της RING δάχτυλο Ε3 λιγάσες δεν έχει αποδειχθεί κατά πόσο αυτές οι πρωτεΐνες μπορεί να έχει επιπτώσεις για το ρόλο της MDM2.

Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι η ενδογενής MAGE -Ένα πρωτεΐνες και, μέσω έκτοπη έκφραση, MAGE-Α2, συνεργάτης με MDM2

ανεξάρτητα

της p53. Η παρατήρηση αυτή μας ώθησε να διερευνήσει την αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο πρωτεϊνών σε μεγαλύτερο βάθος, με σκοπό την κατανόηση της λειτουργικής σημασίας του συλλόγου τους. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι, εκτός από τη ρύθμιση της λειτουργίας ρ53 άμεσα, MAGE-Α μπορεί να επηρεάσει επιλεκτικά τα επίπεδα MDM4 μέσω της αλληλεπίδρασης με MDM2, και υποστηρίζουν την ιδέα ότι αυτή η οικογένεια των πρωτεϊνών ρυθμίζει τη λειτουργία της ρ53 σε μερικούς ανεξάρτητες αλλά συμπληρωματικές μηχανιστική γεγονότα. Μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι οι πρωτεΐνες MAGE-A, ενώ παράλληλα δρουν ως διεγέρτες ορισμένων πρωτεϊνών τύπου RING δάχτυλο [17], μπορεί επίσης να συμπεριφέρεται ως ένας ισχυρός αναστολέας του MDM2 RING τύπου δάχτυλο Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές γραμμές, επιμολύνσεις, και τα πλασμίδια

(ανθρώπινου οστεοσαρκώματος προερχόμενα) κύτταρα και Η1299 κύτταρα (καρκίνωμα ανθρώπινου πνεύμονα που προέρχεται) ελήφθησαν από το αποθετήριο Cancer Research UK U2OS. Τα κύτταρα ελέγχθηκαν για ρ53- και MAGE-Μια κατάσταση κατά western αποτύπωση. Οι επιμολύνσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πλασμίδια που χρησιμοποιούνται για την έκφραση της ανθρώπινης cDNAs ήταν παράγωγα του pcDNA3 και ήταν ως εξής (με τους αριθμούς καταλόγου σε παρενθέσεις): άγριου τύπου ρ53 σε pCDNA3 (DWM715), ΗΑ-tagged MAGE-A2 σε pCDNA3 (DWM1574), ανθρώπινη άγριου τύπου MDM2 ( υπό CMV προαγωγός? DWM1127), MDM2-C464A (DWM1214), ΗΑ-tagged (Ν-άκρο) ανθρώπινη MDM4 (1318), His

6 χαρακτηρισμένες ουβικιτίνη (DWM1432). Η γλουταθειόνη πρωτεΐνες-σύντηξης S-τρανσφεράσης (GST) έχουν κωδικοποιηθεί σε παράγωγα του φορέα, pGEX-4Τ. Σε αυτά περιλαμβάνεται ένα σύνολο από προηγουμένως δημοσιευθείσες MDM2 «μινι-πρωτεΐνες» όπου οι επικαλυπτόμενες περιοχές του MDM2 συγχωνευμένο με GST [33,34] και είχαν ως εξής: GST μόνη της (DWM223), GST-ΜΡ1 (DWM1074), GST-MP2 (DWM1093 ), GST-MP3 (DWM1076), GST-MP4 (DWM1077).

Αντισώματα και ανάλυση Western blot

SDS-PAGE και κηλίδωση Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπες συνθήκες. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως ακολούθως: 6C1 (pan MAGE-A), και H164 (p21) ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology. DO1 (p53), 4Β2 ​​(MDM2) και SMP14 (MDM2) ήταν από Μοραβίας Βιοτεχνολογίας. CM1 ήταν ένα είδος δώρο από τον καθηγητή Sir D. Lane. αντισώματα αντι-MDM4 8C6 και BL1258 ελήφθησαν από την Millipore και από Bethyl Εργαστήρια αντίστοιχα. 12CA5 (HA-tag) ήταν από την Cancer Research UK και 20-33 (ακτίνη) ήταν από την Sigma-Aldrich. HRP (υπεροξειδάση αρμορακίας), συζευγμένης κουνελιού αντι-ποντικού και δευτερογενή αντισώματα αντι-κουνελιού κατσίκας αγοράστηκαν από την Dako και Bio-Rad, αντίστοιχα. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Pierce Biotechnology, Inc.).

GST-pull-down Πείραμα

GST-tagged πρωτεΐνες σύντηξης MDM2 [33,34] (ή GST μόνο ως έλεγχο) δεσμεύθηκαν σε GSH (γλουταθειόνης Sepharose 4Β) σφαιρίδια (Amersham) και στη συνέχεια επωάστηκαν με

35S-σημασμένο MAGE-A2 (που παρασκευάζεται με

in vitro

μεταγραφής /μεταφρασμένο ΤΝΤ Τ7 συστήματος (Promega )). Μετά την εντατική πλύση των σφαιριδίων, ακινητοποιημένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν σε ρυθμιστικό δείγματος 2 Χ SDS και ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western.

In vitro

pull-down αναλύσεις που χρησιμοποιούν βιοτινυλιωμένα πεπτίδια

Βιοτινυλιωμένο πεπτίδια αγοράστηκαν από την Mimotopes και γενικώς περιελάμβανε την ακόλουθη μορφή: «Βιοτίνη-SGSG-ΠΕΠΤΙΔΙΟ-αμίδιο». Πεπτίδια που αντιπροσωπεύουν το Ν- και C-άκρα ήταν, αντίστοιχα: «Αμίνη-πεπτιδίου GSG-βιοκυτίνη αμιδίου» και «Βιοτίνη-SGSG-πεπτίδιο οξύ». σφαιρίδια στρεπταβιδίνης-αγαρόζης (Sigma) πλύθηκαν σε PBS που περιέχει 0,1% (ν /ν) του Tween-20 πριν από την προσθήκη 10 μg βιοτινυλιωμένου πεπτιδίου. Σφαιρίδια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C και στη συνέχεια πλένεται με το ίδιο ρυθμιστικό.

35S-σημασμένο MAGE-A2 (που παρασκευάζεται με

in vitro

μεταγραφής /μετάφρασης TNT Τ7 System (Promega)) προστέθηκε στα σφαιρίδια και επωάστηκαν για 2 ώρες στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν 4 φορές σε PBS /Tween-20 και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS-PAGE. Συν-καταβύθιση πρωτεΐνης αναλύθηκε με SDS-PAGE και ανιχνεύθηκαν με φθοριογραφία.

Ανοσοκαταβύθιση

Τα κύτταρα λύθηκαν επί πάγου για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό IP (50mM Tris-HCI [ρΗ 7,5], 150 mM NaCl, 1% (ν /ν) ΝΡ-40, 2 mM EDTA και αναστολέα πρωτεάσης (Roche)), φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στις 13.000 xg και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε για ανάλυση. Το προϊόν λύσης στη συνέχεια προ-καθαρίζεται με 50 μΙ πολτού σφαιριδίων πρωτεΐνης G (Sigma) για 30 λεπτά στους 4 ° C, φυγοκεντρήθηκε για 3 λεπτά στα 2000 χ g και τα σφαιρίδια απορρίφθηκαν. Συνολικά 1-2 μg πρωτεΐνης επωάστηκε με 2 μg /ml του αντισώματος όλη τη νύκτα στους 4 ° C και ανοσοκατακρημνίσθηκαν την επόμενη ημέρα με 50 πολτό μΙ σφαιριδίων πρωτεΐνης G (Sigma) για 2 ώρες στους 4 ° C. Τα ιζήματα πλύθηκαν τρεις φορές για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό IP στους 4 ° C πριν από την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος SDS-gel-φόρτωσης και ανοσοκατακρημνίσθηκαν οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με western blot.

Ubiquitylation δοκιμασία

Η δοκιμασία ubiquitylation επικαλείται την επιμόλυνση των κυττάρων με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί επισύναψη His ουμπικουϊτίνης που ακολουθείται από τη σύλληψη και τον καθαρισμό των πρωτεϊνών από ubiquitylated εκχυλίσματα κυττάρων χρησιμοποιώντας σφαιρίδια νικελίου-αγαρόζης. Αυτή η δοκιμασία έχει περιγραφεί με σημαντική λεπτομέρεια αλλού [35]. Οι καθαρίζεται ubiquitylated πρωτεΐνες αναλύθηκαν με western αποτύπωση

σίγηση γονιδίων με τη χρήση siRNA

MAGE-Α έκφραση σίγησε χρησιμοποιώντας δύο ανεξάρτητες, προηγουμένως δημοσιευθεί ολιγονουκλεοτιδίων siRNA [12,13]:. MAGE-A siRNA (1) [13] και MAGE-A siRNA (2) [12] στοχεύουν ενάντια σε δύο διαφορετικές αλληλουχίες κοινές σε καθένα από τα μέλη Mage-A οικογένεια εκτός Mage-A10 και έχουν ως εξής:

MAGE- Μια Ολίγο 1 [13] 5′-AACCAGCUAUGUGAAAGUC-3 ‘

MAGE-Α Ολίγο 2 [12] 5′-UCACAAAGGCAGAAAUGCU-3′

μη φίμωση ολίγο (έλεγχος) 5′ CAGUCGCGUUUGCGACUGG-3 ‘

Τα ολιγονουκλεοτίδια siRNA κατασκευάστηκαν από Dharmacon και εισήχθησαν σε κύτταρα με ανάστροφη διαμόλυνση χρησιμοποιώντας RNAiMAX (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Ασθενείς, συναίνεση και ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Η ομάδα που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη (TMA24) έχει αναφερθεί στο παρελθόν [36,37] και περιλαμβάνει πρωτοταγείς, είχαν λάβει προηγουμένως θεραπεία του καρκίνου του μαστού από 225 μη επιλεγμένα προ- και μετα-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες (ηλικίας 28 έως 89? διάμεση 62 έτη) αντιμετωπίζονται στο Tayside Πανεπιστήμιο Νοσοκομεία, Σκωτία από το 1997 έως το 2002. η απόκτηση των δειγμάτων και την προετοιμασία των μικροσυστοιχιών όγκου (TMA) έχουν έχουν λεπτομερώς αλλού [36,37]. Η μελέτη έλαβε ηθική έγκριση τόσο από το Tayside Έρευνας και Επιτροπής Δεοντολογίας (Κωδ. 07 /S1402 /90) και ο ιστός Tayside Επιτροπή Τράπεζα (Ref. TR000236). Generic, γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή πριν από την απόκτηση ιστού και πριν από τη χειρουργική επέμβαση πραγματοποιήθηκε, μια διαδικασία που έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας, για τη χρήση της περίσσειας ιστού δεν απαιτείται για διαγνωστικούς σκοπούς και για φλεβική κλήρωση του αίματος για να χρησιμοποιηθεί στον τομέα της έρευνας .

τμήματα από το μπλοκ TMA (ονομαστικά 4 μικρά πάχος) παρασκευάστηκαν και επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Αντισώματα ειδικά για πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ήταν: 6C1 (παν-MAGE-Α)? και BL1258 (MDM4).

ΤΜΑ βαθμολόγησης για ΜΑΟΕ-Α και MDM4 διεξήχθη από έναν παθολογοανατόμο ειδικός του μαστού (LBJ) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Quickscore [38] για την ένταση και την αναλογία των κυττάρων βάφονται με το κατάλληλο αντίσωμα .

Αποτελέσματα

πρωτεϊνών MAGE-Α αλληλεπιδρούν με MDM2 σε καλλιεργημένα κύτταρα

Για να καθοριστεί εάν πρωτεΐνες MAGE-Α αλληλεπιδρούν άμεσα με MDM2 ανεξάρτητα από ρ53, συνανοσοκαθίζησης των ενδογενώς εκφρασμένες πρωτεΐνες διεξήχθη χρησιμοποιώντας Η1299 κύτταρα (τα οποία δεν εκφράζουν ρ53). Ως έλεγχος, τα πειράματα έγιναν επίσης σε ρ53-κύτταρα που εκφράζουν U2OS άγριο τύπο που εμείς και άλλοι έχουν χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για μελέτες αλληλεπίδρασης ΜΑΟΕ-Α /p53 [12,13,16]? και οι δύο αυτές γραμμές εκφράζουν αρκετές ανιχνεύσιμη μέλη της MAGE-Μια οικογένεια (S1 Σχήμα). Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση η παν-MAGE-Α αντίσωμα, 6C1, ανιχνεύονται αρκετές στενά μεταναστεύουν ζώνες που αντιστοιχούν στα διάφορα μέλη MAGE-Μια οικογένεια στα κυτταρικά εκχυλίσματα (Σχήμα 1Α, κάτω πίνακα). Ανοσοκαταβύθιση MAGE-Α χρησιμοποιώντας 6C1 είχε ως αποτέλεσμα την συνανοσοκαθίζηση του MDM2 (Σχήμα 1Α, άνω πίνακας). Σε μία αμοιβαία ανάλυση, πρωτεΐνες MAGE-A βρέθηκαν να είναι παρούσα σε ανοσοκαθιζήματα από MDM2 από τα ίδια εκχυλίσματα με τη χρήση των αντισωμάτων, 4Β2 ​​και SMP14 (κάτω πίνακας). Συν-ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη επίσης χρησιμοποιώντας κύτταρα U2OS (που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53), με παρόμοια ευρήματα. Οι πιο αργά μεταναστεύει πρωτεΐνες MDM2 φαίνεται να συν-ανοσοκαθιζάνουν με ΜΑΟΕ-Α στις δύο κυτταρικές σειρές δείχνουν ότι οι πρωτεΐνες MAGE-Α μπορεί κατά προτίμηση να αλληλεπιδράσει με μια μετα-μεταφραστικά τροποποιημένη μορφή (ες) του MDM2. Ομοίως, πιο αργή-μεταναστεύουν ζώνες της MAGE-Α θα μπορούσαν να υποδηλώνουν ότι τροποποιημένες πρωτεΐνες MAGE-Α κατά προτίμηση συνδέουν με MDM2 ή, εναλλακτικά, ότι MDM2 συνεργάτες προτίμηση με συγκεκριμένα μέλη της MAGE-A οικογένεια. Δεν έχουμε οριστικές απαντήσεις σε αυτά τα σημεία προς το παρόν. πρωτεΐνες MAGE-A δεν ήταν ανιχνεύσιμα σε MDM4 ανοσοκαθιζήματα ούτε, αμοιβαίως, έκανε MDM4 συν-ανοσοκαθιζάνουν όταν χρησιμοποιήθηκε το αντι-ΜΑΟΕ-Α αντίσωμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ειδικότητα με την αλληλεπίδραση /MDM2 MAGE-A. Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι MDM2 και ΜΑΟΕ-Α συνεργάτης σε ένα κυψελοειδές πλαίσιο.

(Α) Η1299 κύτταρα (πάνελ αριστερού χεριού) ή κύτταρα U2OS (πάνελ δεξί χέρι) λύθηκαν και ανοσοκαθίζηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι MAGE-A (6C1), MDM2 (SMP14 συν 4Β2) ή, ως έλεγχο, ένα μη ειδικό IgG ποντικού. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν για την παρουσία MDM2 (άνω πάνελ) ή MAGE-A (κάτω πάνελ). Οι θέσεις των βαριών αλυσίδων αντισώματος (HC) και ελαφριές αλυσίδες (LC) υποδεικνύεται στα κάτω πάνελ. (Β) αναλύσεις καθέλκυσης GST διεξήχθησαν στο οποίο

35S-ραδιοεπισημασμένο MAGE-A2 συνελήφθη επί γλουταθειόνης sepharose 4Β σφαιρίδια χρησιμοποιώντας GST συνδέεται με πλήρους μήκους ΜΌΜ2 ή έως τέσσερα μίνι-πρωτεΐνες (ονομάζονται ΜΡ1, -2, -3 και -4) που αντιπροσωπεύουν επικαλυπτόμενες περιοχές του MDM2 [33,34]. Η συν-καταβύθιση MAGE-A2 ανιχνεύθηκε με SDS-PAGE ακολουθούμενη από φθορογραφία (άνω πάνελ). Το μεσαίο πλαίσιο δείχνει την παρουσία των GST-MDM2 πρωτεΐνες μετά τη δέσμευση στα σφαιρίδια γλουταθειόνης. Το κάτω πάνελ είναι ένα σχηματικό που δείχνει πλήρους μήκους MDM2 μαζί με τα επικαλυπτόμενα περιοχές που περικλείονται εντός των μινι-πρωτεϊνών. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

πρωτεϊνών MAGE-Α αλληλεπιδρούν με MDM2

in vitro

Η

Για να προσδιορίσετε αν MDM2 και MAGE-Α αλληλεπιδρούν

in vitro

, GST πειράματα pull-down διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μία σειρά πρωτεϊνών σύντηξης GST που περιέχει GST-πλήρους μήκους ανθρώπινο ΜΌΜ2 μαζί με ένα προηγουμένως δημοσιευμένες σειρές των πρωτεϊνών σύντηξης GST που συνδέονται με επικαλυπτόμενες περιοχές του MDM2 [33, 34]. Τα δεδομένα (Εικόνα 1Β) επιβεβαιώνουν ότι

35S-επισημασμένη

in vitro

-translated MAGE-A2 αλληλεπιδρά με MDM2 και όχι με το τμήμα GST της πρωτεΐνης σύντηξης σε ανάλυση pull-down. (Επιλέχθηκε MAGE-A2 για την ανάλυση αυτή, διότι είναι ένα καλά χαρακτηρισμένο ρυθμιστής του μονοπατιού ρ53 που εκτελεί εξίσου καλά σε σύγκριση με άλλες πρωτεΐνες MAGE-A (-Α1 και -Α6) στην ικανότητά τους να μπλοκάρουν τη λειτουργία του ρ53 [12,13 ]). τα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι το MAGE-A2 αλληλεπιδρά ισχυρά με τα Ν-τερματικά 110 αμινοξέα του MDM2 και Ο-τερματική περιοχή που περιλαμβάνει τα αμινοξέα 279-491. Υπάρχει μια αδύναμη αλληλεπίδραση με MDM2 αμινοξέων 108-207, αλλά πολύ μικρή συσχέτιση με τα αμινοξέα 203-282 περιλαμβάνει κυρίως τη σημαντική όξινο τομέα.

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η ιστοσελίδα (ες) της αλληλεπίδρασης, την ικανότητα των MDM2 αλληλουχίες αμινοξέων να συν-ίζημα

35S-επισημασμένη

in vitro

-translated MAGE-A2 μετρήθηκε σε pepscan δοκιμασίες. Αυτές οι δοκιμασίες χρησιμοποιούνται μία αντίστοιχη σειρά 15-μερών πεπτιδίων biotyinylated δεσμεύεται με στρεπταβιδίνη σφαιρίδια, κάθε πεπτίδιο επικάλυψη με το επόμενο στη σειρά με 5 ή περισσότερα αμινοξέα, και περιλαμβάνει αντίστοιχα ολόκληρη την αλληλουχία ανθρωπίνου MDM2 αμινοξέων (S2 Εικ). Χρησιμοποιήσαμε προηγουμένως μια παρόμοια προσέγγιση για τον προσδιορισμό των θέσεων αλληλεπίδρασης του MAGE-A2 σε p53 [12]. Τα δεδομένα από την ανάλυση αυτή εντοπίσει αρκετά πεπτίδια ως αλληλεπιδρά με MAGE-Α2 (σχήμα 2Α και συνοψίζονται στο Σχήμα 2Β). Υπάρχουν δύο ισχυρά αλληλεπιδρούν πεπτίδια που αντιπροσωπεύουν Ν-τερματικά αμινοξέα (51-65 και ιδιαίτερα 91-105) και τρεις πεπτίδια που αντιπροσωπεύουν αλληλουχίες μέσα στο C-τελικό άκρο της MDM2 (451 με 465, 461-475 και 481-491). Τα στοιχεία υπογραμμίζουν επίσης ασθενέστερες αλληλεπιδράσεις σε πεπτίδια που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 151-165 και 171-185 που περιέχει αντιστοίχως τα δύο καθιερωμένων αλληλουχίες πυρηνικού εντοπισμού στο MDM2. Ασθενής αλλά ανιχνεύσιμη αλληλεπιδράσεις παρατηρήθηκαν σε 191-205, 291-305 και 311-325. Εντυπωσιακά, τα στοιχεία αυτά είναι σε εξαιρετική συμφωνία με τα πειράματα pull-down GST (Σχήμα 1Β). (Οι πέντε μεγάλες αλληλεπιδρούν πεπτίδια στα Ν- και C-τερματικές περιοχές του MDM2 φαίνονται ευθυγραμμισμένες με τις αντίστοιχες αλληλουχίες στο MDM4 σε S3 Σχ. Αυτές οι ευθυγραμμίσεις επισημάνει ορισμένα σημαντικές διαφορές στις αλληλουχίες αμινοξέων σε τουλάχιστον τέσσερα από τα πεπτίδια, ειδικά το πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 91-105 της MDM2 η οποία έδειξε το μεγαλύτερο βαθμό αλληλεπίδρασης (Σχ 2Α). Αυτές οι διαφορές στην αλληλουχία μπορεί να εξηγήσει γιατί MDM4 δεν μπορούσε να συν-ανοσοκαταβυθίζεται με αντι-ΜΑΟΕ-Α αντίσωμα (Σχήμα 1) .)

(α) Pepscan δοκιμασίες (πειράματα pull-down) διεξήχθησαν στο οποίο μια σειρά από 15-mer βιοτινυλιωμένα πεπτίδια (που αριθμούνται 1-49) επικαλυπτόμενα από 5 ή περισσότερα αμινοξέα και που αντιπροσωπεύουν το σύνολο της MDM2 αμινο αλληλουχία οξύ συζεύχθηκαν με στρεπταβιδίνη-σεφαρόζη σφαιρίδια και να χρησιμοποιηθεί για να συλλάβει

35S-επισημασμένη, in vitro μεταφρασμένη MAGE-A2. Η συν-καταβύθιση MAGE-A2 ανιχνεύθηκε με SDS-PAGE που ακολουθείται από φθοριογραφία. Ο έλεγχος pull-down (κάτω πίνακας αριστερά) ήταν ένα πεπτίδιο που αντιπροσωπεύει την /V περιοχή BoxIV του p53 που έχουμε προηγουμένως συσταθεί συνδέεται πολύ στενά με MAGE-Α2 [12]. (Β) Σχηματική δείχνει τις περιοχές που αντιπροσωπεύονται από τις αλληλεπιδρώντας πεπτίδια στην δοκιμασία pull-down. Τα θετικά και αρνητικά θέσεις πρόσδεσης αναφέρονται στο πλαίσιο των σημαντικών λειτουργικών τομέων εντός της πρωτεΐνης MDM2. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Το μοντέλο δείχνει ένα διμερές MDM2 RING δακτύλων, με βάση τη δημοσιευμένη 3D δομή (Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεϊνών αριθμός πρόσβασης: 2HDP). Οι δύο ταυτόσημες υπομονάδες στο διμερές εκπροσωπούνται σε γκρι και μπλε φως αντίστοιχα. Η εικόνα στα δεξιά λήφθηκε με περιστροφή της δομής 3D κατά περίπου 90 ° προς τα δεξιά στο οριζόντιο επίπεδο. Η θέση των δεσμευτικών MAGE-A2 πεπτιδίων δείχνονται σε μια υπομονάδα: αμινοξέα 456-470 αντιπροσωπεύονται με κόκκινο χρώμα, ενώ τα αμινοξέα 486-491 φαίνεται στο ανοιχτό πορτοκαλί

Η

Ο MDM2 Οτελική. πεπτίδια στα οποία MAGE-Α2 δεσμεύεται βρίσκεται εντός του τομέα δακτύλου RING το οποίο είναι ζωτικής σημασίας για homo-διμερισμό και ετερο-διμερισμού με MDM4. Αυτή η περιοχή παίζει επίσης έναν κρίσιμο ρόλο στην αλληλεπίδραση με, και στη διαμεσολάβηση της μεταφοράς των ουβικιτίνη από, λιγάσες Ε2 σε υποστρώματα [39,40,41,42,43]. Επιπλέον, όταν παρατηρείται στο πλαίσιο της 3D δομής του MDM2 RING, αυτές οι αλληλουχίες πεπτιδίου κείνται αντιπαρατίθενται στην επιφάνεια του δακτυλίου που έχει προταθεί ότι μεσολαβεί επαφή με την λιγάση Ε2, UbcH5 ([39,40,42]? Εικ 2C). Επιπλέον, περιέχουν διάφορα αμινοξέα που έχουν αποδειχθεί με ανάλυση μεταλλαξιγένεσης να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο στην MDM2-εξαρτώμενη p53 ubiquitylation και auto-ubiquitylation [39,40,41,42,43]. Η σύνδεση του MAGE-A2 στην περιοχή αυτή υποδεικνύει ότι θα μπορούσε να επηρεάσει MDM2 εξαρτώμενη ubiquitylation, πιθανώς σε μία ανασταλτική τρόπο.

MAGE-A2 αλληλεπιδρά με το Ν-άκρο του MDM2

in vitro

με έναν τρόπο παρόμοιο με ρ53

Περαιτέρω εξέταση της σύνδεσης των MAGE-A2 με το Ν-άκρο του MDM2 έδειξε ότι τα δύο πεπτίδια που αλληλεπιδρούν αντιπροσωπεύουν αντίστοιχα σε κάθε πλευρά του υδρόφοβου άλσος που είναι υπεύθυνο για τη μεσολάβηση της αλληλεπίδρασης με το Ν-τερματικό πεδίο του ρ53. Οι θέσεις αυτών των πεπτιδίων εντός της κρυσταλλικής δομής της περιοχής MDM2 Ν-τερματικό [44] επισημαίνονται σε κόκκινο και πορφυρό αντίστοιχα σε σχήμα 3Α. Τα αμινοξέα εντός και των δύο αυτών των περιοχών που απαιτούνται για την ρ53 δέσμευσης [44] υποδηλώνοντας είτε ότι το MAGE-A2 μπορεί να αλληλεπιδράσουν με MDM2 με τρόπο παρόμοιο με εκείνο του ρ53 ή ότι μπορεί να επηρεάσει την αλληλεπίδραση ρ53 /MDM2. Για να καθοριστεί εάν MAGE-A2 προσδένεται στο Ν-τελικό άκρο της MDM2 σε ένα κυψελοειδές πλαίσιο, η μινι-πρωτεΐνη MDM2 «ΜΡ1» (που περιλαμβάνει τα αμινοξέα 1-110 της MDM2) εκφράστηκε ως σύντηξη με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP? Εικ 3Β) μαζί με MAGE-A2 σε Η1299 κύτταρα. Ως θετικός έλεγχος, ρ53 εκφράστηκε στη θέση του GFP-ΜΡ1. ανάλυση (Σχήμα 3C) Συν-ανοσοκαταβύθιση επιβεβαίωσε ότι και οι δύο MAGE-A2 και το ρ53 ελέγχου ήταν σε θέση να συνδέσουν με την GFP-ΜΡ1 (MDM2) σε καλλιεργημένα κύτταρα. Καμία σχέση δεν παρατηρήθηκε όταν GFP λείπει η επέκταση MP1 χρησιμοποιήθηκε.

δεσμευτική (Α) Η δομή του Ν-τελικού άκρου (περιοχή p53-δέσμευσης) του MDM2 (1YCR) δείχνει τις θέσεις των MAGE-Α2 πεπτίδια 51 -65 (κόκκινο) και 91-105 (ματζέντα). Η σπονδυλική στήλη εμφανίζεται με πράσινο χρώμα. Οι θέσεις των αμινοξέων στις πλευρές του καθενός από αυτά τα πεπτίδια φαίνονται. (Β) Σχηματική που δείχνει τη δομή της μινι-πρωτεΐνης, ΜΡ1 GST-MDM2, που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα. Μια εκδοχή στην οποία GST υποκαταστάθηκε με GFP και χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση καλλιεργημένο κύτταρο και την ανάλυση ανοσοκαταβύθισης. (C) Ανάλυση Συν-ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη μετά από έκφραση της GFP-ΜΡ1 (ή GFP μόνο ως έλεγχο) σε Η1299 κύτταρα μαζί με MAGE-Α2 ή ρ53 (ως θετικός μάρτυρας). (D) αναλύσεις καθέλκυσης GST διεξήχθησαν στο οποίο

35S-ραδιοεπισημασμένο MAGE-A2, ή

35S-ραδιοεπισημασμένο ρ53 ως έλεγχος, συνελήφθησαν επί σεφαρόζης γλουταθειόνης 4Β σφαιρίδια χρησιμοποιώντας GST που συνδέονται με την MDM2 μινι-πρωτεΐνη, MP1, το οποίο περιλαμβάνει τα αμινοξέα 1-110, συμπεριλαμβανομένου του υδρόφοβου ρ53 δέσμευσης σχισμή. Η ένωση των ΜΑΟΕ-Α2 ή ρ53 μετρήθηκε με την παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων νουτλίνη-3α. Οι συν-καταβύθιση πρωτεϊνών MAGE-Α2 και ρ53 ανιχνεύθηκαν με SDS-PAGE που ακολουθείται από φθοριογραφία. Σημειώστε ότι

in vitro

μεταγραφή /μετάφραση του p53 οδηγεί σε δύο πολυπεπτίδια. (Ε) Ποσοτικοποίηση της pull-down πείραμα παρακάτω πυκνότητας. Σε όλες τις περιπτώσεις τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να δοκιμαστεί η ιδέα ότι η ρ53 και MAGE-A2 δεσμεύονται με MDM2 με παρόμοιο τρόπο, τα πειράματα pull-down GST διεξήχθησαν

in vitro

να προσδιορίσει αν η συναγωνιστικό αναστολέα, νουτλίνη-3α, η οποία μιμείται ρ53 και δεσμεύει σφικτά μέσα στην υδρόφοβη αύλακα στο MDM2 που αποτελεί την θέση σύνδεσης ρ53, θα μπορούσε να μπλοκάρει την αλληλεπίδραση του MAGE-A2 με MDM2 [45] . Τα δεδομένα δείχνουν ότι αυξανόμενες συγκεντρώσεις του νουτλίνη-3a πράγματι εμποδίζουν MAGE-A2 από σύνδεση προς το Ν-άκρο της MDM2 (Σχ 3D και 3Ε). Η αλληλεπίδραση της ρ53 με MDM2, η οποία μετρήθηκε με τον ίδιο πείραμα ως έλεγχος, επίσης προοδευτικά αναστέλλεται από αυξανόμενες συγκεντρώσεις νουτλίνη-3a (Σχ 3D και 3Ε). Το IC

50 τιμές για τη διάσταση της ρ53 και MAGE-Α2 αντίστοιχα από MDM2 ήταν 18 μΜ και 10 μΜ υποδεικνύοντας ότι η ρ53 συνδέεται προς αυτή την περιοχή συγκριτικά καλύτερη από MAGE-A2. Περιέργως, τα υψηλότερα επίπεδα από νουτλίνη-3α αντιστραφεί πραγματικά αναστολή και τόνωσε δέσμευση του MAGE-Α2 MDM2, ένα αποτέλεσμα που δεν συνέβη με την p53. Μια πιθανή εξήγηση αυτού του αποτελέσματος είναι ότι η προηγούμενη σύνδεση του ρ53 (ή ένα ανάλογο ρ53) μπορεί να επηρεάσουν την επακόλουθη σύνδεση του MAGE-A2.

μπλοκ MAGE-A2 MDM2 μεσολάβηση ubiquitylation σε καλλιεργημένα κύτταρα αλλά δεν επηρεάζει p53

κύκλος εργασιών

Για να καθοριστεί εάν όντως πρωτεΐνες MAGE-A μπορεί να ενεργεί ως ρυθμιστές MDM2, μία δοκιμασία ubiquitylation καθιερωμένη κυτταρική καλλιέργεια με βάση χρησιμοποιήθηκε [35] στην οποία Η1299 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με πλασμίδια που εκφράζουν άγριου τύπου ανθρώπινη ρ53 , MDM2, His-tagged ουβικιτίνης, και αυξανόμενες ποσότητες MAGE-A2. Σε 36 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν σε 6Μ ρυθμιστικό γουανιδίνιο, συνθήκες που εμποδίζουν deubiquitylation πρωτεϊνών και να διαταράξουν οποιεσδήποτε μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών. Τα His-tagged ubiquitylated πρωτεΐνες καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιώντας Νί

2 + -αγαρόζης χάντρες, εν συνεχεία εκλούστηκε και αναλύθηκε με κηλίδωση Western με το αντίσωμα αντι-p53, DO-1. Τα δεδομένα (Εικόνα 4Α, άνω πάνελ) επιβεβαίωσε ότι MDM2 ήταν σε θέση να ubiquitylate ρ53 σε αυτή τη δοκιμασία και, το σημαντικότερο, να μειώσουν τα επίπεδα ρ53. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ρ53 δεν ubiquitylated από MAGE-A2 μόνον (σύγκρινε λωρίδες 1, 2 και 3).