Αφηρημένο

Η χημειοθεραπεία αποτελεί το πρότυπο τροπικότητα της θεραπείας για εντοπισμένη κεφαλής και του τραχήλου καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (HNSCC). Ωστόσο, πολλοί ασθενείς αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν και υποτροπής μετά από αυτές τις θεραπείες, λόγω της εξαγοράς της χημειο-αντίστασης. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων που θα μπορούσε να αντιστρέψει το ανθεκτικό φαινότυπο. Η κουρκουμίνη, το συστατικό του κουρκουμά μπαχαρικό έχει αποδειχθεί ότι έχουν αντι-φλεγμονώδη, αντι-οξειδωτικό και αντι-πολλαπλασιαστικές ιδιότητες σε διάφορους τύπους όγκων. Ωστόσο, η χρήση της κουρκουμίνης έχει περιοριστεί λόγω της κακής βιο-απορρόφηση της. Πρόσφατα, μία νέα κατηγορία αναλόγων κουρκουμίνη, με βάση diarylidenylpiperidones (DAP), έχει αναπτυχθεί ενσωματώνοντας έναν σύνδεσμο πιπεριδόνης με τη δομή βήτα-δικετόνη και φθόριο υποκαταστάσεις στις ομάδες φαινυλίου. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα του H-4073, ένα parafluorinated παραλλαγή της DAP, χρησιμοποιώντας και τα δύο

in vitro

και

in vivo

κεφαλής και του τραχήλου μοντέλα καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι H-4073 είναι ένας ισχυρός παράγων κατά του όγκου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανέστειλε σημαντικά σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν σε HNSCC έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, προεπεξεργασία της σισπλατίνης ανθεκτικών HNSCC κυτταρικές γραμμές με H-4073 αντέστρεψε σημαντικά την χημειο-αντίσταση όπως παρατηρείται με τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (ΜΤΤ), δοκιμασία απόπτωσης (δέσμευση αννεξίνης V) και διασπασμένη κασπάση-3 (Western blot). H-4073 προκαλούμενα αποτελέσματα κατά του όγκου του με αναστολή JAK /STAT3, FAK, Akt και VEGF μονοπάτια που παίζουν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση, την επιβίωση και την αγγειογένεση σηματοδότησης. Στο SCID μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, Η-4073 ενίσχυσε σημαντικά την αντι-καρκινική και αντι-αγγειογένεσης επιδράσεις της σισπλατίνης, χωρίς πρόσθετα συστηματική τοξικότητα. Είναι ενδιαφέρον, Η-4073 ανέστειλε την αγγειογένεση του όγκου αναστέλλοντας την παραγωγή του VEGF από τα καρκινικά κύτταρα, καθώς και την αναστολή της απ ‘ευθείας τη λειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η H-4073 είναι ένας ισχυρός παράγοντας κατά των όγκων και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ξεπεράσει την αντίσταση χημειοθεραπεία σε HNSCC

Παράθεση:. Kumar B, Yadav Α, Hideg Κ, Kuppusamy P, Teknos TN, Kumar P (2014) A Novel κουρκουμίνη Αναλογική (H-4073) Ενισχύει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα της σισπλατίνης Θεραπεία με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. PLoS ONE 9 (3): e93208. doi: 10.1371 /journal.pone.0093208

Επιμέλεια: Α Ρ Μ Ruhul Amin, Winship Cancer Institute του Πανεπιστημίου Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 του Νοέμβρη του 2013? Αποδεκτές: 28 Φεβ 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 του Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Kumar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH /NCI-CA133250, P. Kumar), του Ταμείου Έρευνας Grant του Joan (BK Π Kumar), Πειραματική χορήγηση σπόρων θεραπευτικά από το Ohio State University Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου (Π Kumar) , Arthur G. James Αντικαρκινικό Νοσοκομείο και Richard J. Solove Ίδρυμα Ερευνών (ΤΤ, P. Kumar). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κεφάλι και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα τραχήλου (HNSCC) είναι ένα από τα συχνότερος καρκίνος παγκοσμίως, με περισσότερες από 600.000 περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο [1]. χρήση καπνού και η κατανάλωση αλκοόλ είναι γνωστό ότι είναι ο ισχυρότερος παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη αυτής της νόσου. [2] Ωστόσο, τώρα αναγνωρίζεται ότι ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) μπορεί επίσης να διαδραματίσει ένα ρόλο στην ανάπτυξη ενός υποσυνόλου κεφαλής και τραχήλου [3]. Τα περισσότερα από τα HNSCC διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια και η έκβαση των ασθενών αυτών είναι συχνά κακής ποιότητας [4]. Η σισπλατίνη είναι ένας από τους συνήθως χρησιμοποιούμενους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες για τη θεραπεία της κεφαλής και του τραχήλου καρκίνους [5]. Η σισπλατίνη είναι ένα ανόργανο μέσο πλατίνας, η οποία μπορεί να συνδεθεί με το DNA, προκαλώντας ενδοκλωνικά και διακλαδική DNA διασυνδέσεις, καθώς επίσης και DNA-πρωτεΐνης διασυνδέσεις. Αυτές οι διασυνδέσεις να οδηγήσει σε απόπτωση και την κυτταρική ανάπτυξη αναστολή [6]. Ωστόσο, πολλοί ασθενείς αναπτύσσουν αντίσταση στη θεραπεία σισπλατίνη οδηγεί στην αποτυχία της θεραπείας [7]. Ως εκ τούτου, υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθούν νέες θεραπευτικές στρατηγικές που είναι πιο αποτελεσματικές και έχουν λιγότερες παρενέργειες από χρησιμοποιούνται σήμερα θεραπευτικές αγωγές.

Οι μετατροπείς σήματος και ενεργοποιητές μεταγραφής (STATs) είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών σηματοδότησης οι οποίες είναι ενεργοποιούνται από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες [8]. Μέχρι σήμερα, έχουν 7 μέλη της οικογένειας STAT έχουν ταυτοποιηθεί σε θηλαστικά. Σε φυσιολογικά κύτταρα, πρωτεΐνες STAT παίρνουν παροδικά ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση και παίζουν ένα ρόλο στην ανάπτυξη κυτοκίνης και αποκρίσεις παράγοντας μεσολάβηση σαν την κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση και τη φλεγμονή [9], [10], [11]. Ωστόσο, έχει παρατηρηθεί σε πολλές μελέτες που STAT3 είναι ουσιαστικά δραστική σε μία ποικιλία ανθρώπινων συμπαγών όγκων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [12], του καρκίνου του προστάτη [13], του καρκίνου του μαστού [14] και σε περισσότερο από το 95% των καρκίνων της κεφαλής και του τραχήλου [10]. Δυσλειτουργία και συστατική ενεργοποίηση του STAT3 διεγείρει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και συμβάλλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου με προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων στόχων STAT3 συμπεριλαμβανομένων Bcl-2, c-myc, η κυκλίνη D1 και VEGF, η οποία μπορεί να ενισχύσει την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και προάγουν την αγγειογένεση [15] [16], [17]. Αυξημένη έκφραση STAT3 έχει συνδεθεί με την κακή πρόγνωση σε ασθενείς με γαστρικό, του παχέος εντέρου, του τραχήλου της μήτρας καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων και γλοιώματα [18], [19], [20]. Επιπλέον, STAT3 υπερέκφραση και σηματοδότηση έχουν βρεθεί να σχετίζονται με σισπλατίνη αντίσταση στο HNSCC [21], [22]. Ως εκ τούτου, έντονες προσπάθειες έχουν επικεντρωθεί στην στοχεύουν STAT3 σηματοδότηση χρησιμοποιώντας νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις οι οποίες θα μπορούσαν να προκαλέσουν απόπτωση και ευαισθητοποιούν όγκους σε χημειοθεραπεία [23].

Πρόσφατα, μια νέα τάξη diarylidenylpiperidone (DAP) ενώσεων έχει συντεθεί με την ενσωμάτωση ενός δακτύλιος πιπεριδόνη στη δομή ραχοκοκαλιάς βήτα-δικετόνη της κουρκουμίνης [24]. Αυτές οι ενώσεις έδειξαν σημαντικά υψηλότερες αντικαρκινική δράση από ό, τι η κουρκουμίνη σε ένα μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών [25]. Διαπιστώθηκε επίσης ότι αυτές οι ενώσεις ανέστειλαν την ενεργοποίηση του STAT3. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα μιας ένωσης της diarylidenylpiperidone (DAP), Η-4073 είτε ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με σισπλατίνη, τόσο

in vitro

και

in vivo

. Δείχνουμε ότι H-4073, ως ένας και μόνο παράγοντας, ήταν αποτελεσματική στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και να επάγουν απόπτωση. Επιπλέον, Η-4073 που προκαλείται αναστολή της STAT3, κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), Akt και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα κυττάρων (VEGF) οδούς σηματοδότησης και ήταν σε θέση να ευαισθητοποιήσει κύτταρα όγκου στα αποτελέσματα του cisplatin, με αποτέλεσμα την αναστολή της μετανάστευσης και της απόπτωσης

in vitro

, καθώς και μείωση του όγκου του όγκου

in vivo

. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν τη θεραπευτική χρήση των Η-4073 σε συνδυασμό με σισπλατίνη στη θεραπεία του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι εργασίες ζώο εγκρίθηκε από την ηθική επιτροπή Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο IACUC των ζώων και διεξάγεται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές τους (Animal Welfare Διασφάλισης Αριθμός A3261-01).

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

UM-SCC-74Α, UM- SCC-1, UM-SCC-74Β, UM-SCC-38 και UM-SCC-47 λήφθηκαν από το εργαστήριο του Δρ Thomas E. Carey στο Πανεπιστήμιο του Μίσιγκαν [26]. CAL27 ελήφθη από την ATCC (Manassas, VA). ανθεκτική Cisplatin κυτταρική γραμμή (CAL27-άδΚ) παρήχθη από τη γονική CAL27 κυτταρική γραμμή του (ATCC) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Η ταυτότητα του όλες τις κυτταρικές σειρές κυρώθηκε από STR του γονότυπου (AmpFlSTR Identifiler Ενίσχυση PCR Kit, Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Όλες οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου κεφαλής και λαιμού καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ, Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και 1% μη απαραίτητα αμινοξέα (Invitrogen). H-4073 συντέθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Η ένωση απόθεμα πρόσφατα διαλύθηκε σε DMSO για

in vitro

εργασίας. Για

in vivo

εργασία, Η-4073 αναμίχθηκε με ζωοτροφές (50 ppm δόση από Harlan Tekland). Αντισώματα έναντι pSTAT3 (Tyr705), pAkt (Ser473), ρρ38 (Thr180 /Tyr182), pERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) και GAPDH ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ) και pFAK αντίσωμα (Tyr397) ήταν από Abcam ( Cambridge, ΜΑ). αντίσωμα CD31 ήταν από Dianova (Αμβούργο, Γερμανία) και το αντίσωμα p21 λήφθηκε από Calbiochem (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ).

Κυτταρικής Πρόσληψη

Για να προσδιοριστεί η πρόσληψη H-4073 από HNSCC κύτταρα

in vitro

, κύτταρα UM-SCC-74Α αναπτύχθηκαν σε τρυβλία 10 cm και υποβλήθηκε σε επεξεργασία with10 μΜ Η-4073 ή 100 μΜ κουρκουμίνη. Μετά από 1 ώρα επώασης, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν και πλύθηκαν με PBS. Το σφαιρίδιο του κυττάρου αφέθηκε να ξηρανθεί, επαναιωρήθηκε σε μεθανόλη και κατεργασία με υπερήχους για 15 λεπτά. Το προϊόν κατεργασίας με υπερήχους φυγοκεντρείται σε 10.000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο αραιώνεται με ίσο όγκο μεθανόλης και μετράται με Vis φασματοφωτόμετρο (λ = 328 nm, ε = 25000 Μ

-1 εκατοστά

-1).

Δοκιμασία UV /κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Η ευαισθησία των κυττάρων στην σισπλατίνη και Η-4073 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το ΜΤΤ-based κιτ πολλαπλασιασμού κυττάρου χρωματομετρική (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) [27]. Εν συντομία, 5000 κύτταρα /φρεάτιο απλώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του Η-4073, σισπλατίνη, ή ένα συνδυασμό και των δύο. Μετά από 72 ώρες, 10 μΙ /φρεάτιο διαλύματος ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν περαιτέρω επί 4 ώρες στους 37 ° C. Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης που σχηματίζονται στα φρεάτια διαλυτοποιήθηκαν με προσθήκη διαλύματος διαλυτοποίηση και επώαση των πλακών στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Οι πλάκες αναγνώστηκαν στα 590 nm σε αναγνώστη πλακός Spectramax 190 (Molecular Devices Inc., Sunnyvale CA). Το ποσοστό αναστολής κυτταρικής ανάπτυξης για κάθε ομάδα αγωγής υπολογίστηκε με την προσαρμογή του χωρίς θεραπεία ομάδα ελέγχου σε 100%. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism (GraphPad Λογισμικού, Inc., San Diego, CA) και οι καμπύλες απόκρισης δόσης χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης του Η-4073 ή σισπλατίνη οδηγεί σε 50% αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (IC50) με τη χρήση τεσσάρων παραμετρική υλικοτεχνική μοντέλο. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές

Για τις μελέτες συνδυασμού φαρμάκου, η συνεργιστική δράση εκτιμήθηκε με τον δείκτη συνδυασμού (CI), σύμφωνα με την μέθοδο των Chou και Talalay, όπου συνεργία ορίζεται ως CI & lt?. 1, ενώ ο ανταγωνισμός είναι CI & gt? 1, και ένα πρόσθετο αποτέλεσμα θεωρείται ως CI = 1 [28]. Οι τιμές CI υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ).

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Καρκινικά κύτταρα εμβολιάστηκαν σε 6 cm πιάτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σισπλατίνη, Η-4073 ή ένας συνδυασμός και των δύο. Μετά από 48 ώρες επεξεργασίας, 4 × 10

3 βιώσιμα κύτταρα από κάθε ομάδα καλλιεργήθηκαν σε 6 πιάτα cm και καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 10 ημέρες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Μικροφωτογραφίες πάρθηκαν και ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε με λογισμικό απεικόνισης της Alpha Innotech (San Leandro, CA).

Προσδιορισμός απόπτωσης

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 6-cm πιάτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες. Κυττάρων υπερκείμενο καλλιέργειας και τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την αγωγή. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αννεξίνη V 488 (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) και ιωδιούχο προπίδιο (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής [27].

ανοσοαποτύπωσης

κυτταρολύματα έτρεξαν σε Νονβχ Bis-Tris γέλης (Invitrogen) υπό αναγωγικές συνθήκες, στυπώθηκαν σε μεμβράνες PVDF (GE Healthcare Επιστήμες της ζωής /Amersham, Piscataway, NJ), ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα, στη συνέχεια ξεπλύθηκαν και επωάστηκαν με αντι-ποντικού προβάτου ή γαϊδάρου αντι-κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση (GE Healthcare). Οι μεμβράνες απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το ECL Plus Kit (GE Healthcare).

Μετανάστευση Δοκιμασία

Το αποτέλεσμα για τη μετανάστευση των κυττάρων μετά από θεραπεία μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον xCELLigence RTCA DP Μέσο (Roche Applied Science, Mannheim, Γερμανία) [29]. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο άνευ ορού για 24 ώρες. Το κάτω μέρος του θαλάμου του CIM-πλάκα 16 πληρώθηκε με 160 μΐ πλήρους μέσου. Το επάνω και κάτω θάλαμοι έσπασε μαζί. Άνευ ορού μέσο τοποθετείται στο άνω θάλαμο και επωάστηκε για 1 ώρα στο CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, σφαιροποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν ώστε 80000 κύτταρα προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο του άνω θάλαμο σε μέσο που περιέχει σισπλατίνη ελεύθερο ορού, Η-4073 ή ένα συνδυασμό και των δύο. Το CIM-Plate 16 τοποθετήθηκε στο σταθμό RTCA DP και τη μετανάστευση παρακολουθήθηκε για 24 ώρες.

In vivo Μελέτες

για τις μελέτες αποτελεσματικότητας κατά του όγκου, χρησιμοποιήθηκαν

γυμνά αθυμικά ποντίκια που έφεραν ξενομοσχεύματα όγκου . Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες της επιτροπής Ohio State University για τη χρήση και τη φροντίδα των ζώων. Καρκινικά κύτταρα (1 χ 10

6) αναμείχθηκαν με 100 μΐ Matrigel και εγχύθηκαν υποδορίως στην περιοχή πλευρό των ποντικών [30]. Μετά από 8 ημέρες, τα ποντίκια κατηγοριοποιήθηκαν σε διαφορετικές ομάδες (n = 5), έτσι ώστε ο μέσος όγκος του όγκου σε κάθε ομάδα ήταν συγκρίσιμη. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή με H-4073 με την ανάμειξή του με την τροφή (50 δόση ppm, Harlan Teklad) αρχίζοντας την ημέρα 8. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη (5 mg /kg) στις ημέρες 8, 11, 14, 17, 21, 24, και 28 μέσω ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις. μετρήσεις όγκου των όγκων [όγκος (mm

3) = L χ W

2/2 (μήκος L, mm? πλάτος W, mm)] ξεκίνησε την ημέρα 6 και συνεχίστηκε δύο φορές την εβδομάδα μέχρι το τέλος της μελέτης. Μετά από 30 ημέρες, πρωτογενείς όγκοι απομακρύνονται προσεκτικά, φωτογραφήθηκαν και αναλύθηκαν για pSTAT3, TUNEL-θετικών κυττάρων και την αγγειογένεση των όγκων.

Ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστοί όγκου ξενομοσχεύματος μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη όλη νύκτα και τομές παραφίνης. Τομές ιστού deparffinized, προκατεργασμένο με ρυθμιστικό ανάκτηση αντιγόνου (EDTA, ρΗ 8.0? pSTAT3) (κιτρικό, ρΗ 6.0? CD31) [27]. Η ενδογενής υπεροξειδάση και μη ειδικές θέσεις σύνδεσης αποκλείστηκαν και οι τομές επωάστηκαν με pSTAT3 (Tyr 705) ή CD31. Το πρωτογενές αντίσωμα δέσμευση ανιχνεύθηκε με τη χρήση IgG βιοτινυλιωμένο κατσίκας αντι-κουνελιού (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ή βιοτινυλιωμένη κατσίκας IgG αντι-αρουραίου (BD Biosciences, San Jose, CA). Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με αβιδίνη-βιοτίνη σύμπλοκο (Vector Laboratories). Οι θέσεις αντίδραση οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB? Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται και τοποθετείται με Permount.

Η ApopTag υπεροξειδάσης σε Situ Apoptosis Detection Kit (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων με τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης dUTP nick τέλος σήμανσης ( TUNEL) χρώση στα τμήματα ξενομοσχεύματος όγκου σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, οι τομές απαλλάχθηκαν από την παραφίνη, επανυδατώθηκαν και επωάστηκαν με πρωτεϊνάση Κ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια πλένονται. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης σβήστηκε και μετά έκπλυση οι τομές επωάστηκαν με συγκέντρωση τελική δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης (TdT) που εργάζονται στους 37 ° C για 1 ώρα. Οι τομές μετά πλύθηκαν και επωάστηκαν με αντι-διγοξιγενίνη συζυγούς (υπεροξειδάση) σε θερμοκρασία δωματίου. Το σήμα οπτικοποιήθηκε με DAB ως χρωμογόνου.

Στατιστική Ανάλυση

Δεδομένα από όλα τα πειράματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημασία των αποτελεσμάτων αξιολογήθηκε με αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης ή δοκιμασία t του Student (όπου ισχύει) και μια τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. IC

50 τιμές για H-4073 και σισπλατίνη για αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism (GraphPad Λογισμικού, Inc., San Diego, CA) και ο δείκτης συνδυασμού (CI) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό CompuSyn (ComboSyn, Inc ., Paramus, NJ).

Αποτελέσματα

Η-4073 είναι ένας ισχυρός αναστολέας του πολλαπλασιασμού των HNSCC

Τα ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης cisplatin σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών HNSCC ήταν αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, θεραπεία σισπλατίνη ανέστειλε την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών HNSCC κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Έχουμε επιλέξει δύο κυτταρικές σειρές (CAL27-άδΚ και UM-SCC-74Α) που ήταν πιο ανθεκτικά στην σισπλατίνη για περαιτέρω πειράματα. UM-SCC-74Α είναι πλακώδους κυτταρική γραμμή καρκινώματος κυττάρων που προέρχονται από μια βάση του όγκου γλώσσας. Αυτή η κυτταρική σειρά πάρθηκε για να μιμείται τα φυσικά ή εγγενή σισπλατίνη αντίσταση. CAL27-άδΚ επιλέχθηκε με ανάπτυξη της κυτταρικής γραμμής πλακώδες καρκίνωμα γονική γλώσσα (CAL27) σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης επί παρατεταμένο χρονικό διάστημα [27]. Αυτή η κυτταρική γραμμή δημιουργήθηκε για να μιμηθεί ανθεκτικός αποκτηθεί σισπλατίνη φαινότυπο. Η κουρκουμίνη είναι εκτεταμένη μελετηθεί για STAT3-ανασταλτικές ιδιότητες του και κατά του όγκου δραστικότητα [31]. Ωστόσο, λόγω της κακής βιοδιαθεσιμότητας της και ταχύ μεταβολισμό, κουρκουμίνη δεν έχει μεταβεί στην κλινική. Ως εκ τούτου, έχουμε αναπτύξει ένα συνθετικό ανάλογο της κουρκουμίνης, Η-4073 (Σχ. 1Β). Στη μελέτη μας, Η-4073 (10 μΜ) απέδειξε & gt? 5 φορές υψηλότερη κυτταρική πρόσληψη σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κυτταρική σειρά (UM-SCC-74Α) σε σύγκριση με κουρκουμίνη (100 μΜ, Σχήμα 1 C).. H-4073 ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματική στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων όλων των HNSCC κυτταρικές σειρές που ελέγχθηκαν, ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53 ή το καθεστώς ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV, σχήμα 1Δ). Σε μηχανιστικές μελέτη μας, παρατηρήσαμε μια σημαντική αναστολή της STAT3, FAK και η φωσφορυλίωση της Akt από H-4073 αγωγή σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ. 1 Ε). Επιπλέον, Η-4073 αγωγή προκάλεσε επίσης την ενεργοποίηση του ρ38 ΜΑΡΚ, μια στρες ενεργοποιημένη κινάση που είναι γνωστό ότι μεσολαβούν τον κυτταρικό θάνατο

Α:.

Κυτταρικές σειρές HNSCC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις cisplatin (CDDP) και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εκτιμήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ.

Β:

Χημική δομές της κουρκουμίνης και H-4073.

C:

κύτταρα UM-SCC-74Α καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας των 10 cm και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κουρκουμίνη ή Η-4073 για 1 ώρα. Κυτταρική πρόσληψη της κουρκουμίνης και Η-4073 μετρήθηκε με ένα φασματοφωτόμετρο UV /Vis.

D: κυτταρικές σειρές

HNSCC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Η-4073 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εκτιμήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ.

E:

κύτταρα UM-SCC-74Α υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του H-4073 για 2 ώρες. STAT3, FAK, Akt φωσφορυλίωση και ρ38 εξετάστηκε με στύπωση Western και ίση φόρτωσης πρωτεΐνης επαληθεύθηκε με απογύμνωση των κηλίδων και της ανιχνεύσεως με αντίσωμα GAPDH.

Η

Η-4073 ενισχυμένη συνεργικά την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της σισπλατίνης σε κύτταρα HNSCC

στη συνέχεια εξετάσαμε εάν H-4073 αγωγή θα μπορούσε να αντιστρέψει την αντίσταση σισπλατίνη σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κυττάρων και να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου του κατά συνεργικό τρόπο. Έχουμε επιλέξει δύο σισπλατίνη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, UM-SCC-74Α (φυσικώς σισπλατίνη ανθεκτικά) και CAL27-cis-R (που παράγεται στο εργαστήριο μας) για όλες τις μελέτες μας. Το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του Η-4073 και θεραπεία συνδυασμού σισπλατίνη (CDDP) μετρήθηκε με τον υπολογισμό του δείκτη συνδυασμού (CI) σύμφωνα με τη μέθοδο Chou-Talalay [28] χρησιμοποιώντας ένα σταθερό λόγο δόσεων. Τόσο H-4073 και CDDP προστέθηκαν στις κυτταρικές καλλιέργειες όγκου σε 0,25 ×, 0.5 ×, 1 ×, 1,5 φορές και 2 φορές αντίστοιχες IC τους

50 δόσεις. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και στις δύο κυτταρικές σειρές σημαντικά μειωμένη μετά από αγωγή συνδυασμού στις πολλαπλές ζεύγη συγκεντρώσεις σε σύγκριση με την θεραπεία με είτε μεμονωμένων παραγόντων μόνο (Σχ. 2). δείκτη συνδυασμού (CI) για διαφορετικές αποτελεσματικές δόσεις (ED) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό CompuSyn. τιμές CI για τα κύτταρα UM-SCC-74Α σε ED50, ED75 και ED90 ήταν 0.550, 0.537 και 0.244 αντίστοιχα. Οι τιμές CI για τα κύτταρα CAL27-άδΚ ήταν 0,628, 0,606 και 0,507 σε ED50, ED75 και ED90, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι H-4073 και θεραπεία συνδυασμού σισπλατίνη ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματική στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου σε ένα συνεργιστικό τρόπο και στις δύο σισπλατίνη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές

Α και Γ:.

UM-SCC -74A

(

Μια

)

ή CAL27-άδΚ

(

C

)

κύτταρα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με η-4073 ή σισπλατίνη (CDDP) μόνη ή σε συνδυασμό σε 0,25, 0,5, 1, 1,5 και 2 φορές αντίστοιχες IC

50 δόσεις και κυτταρικός πολλαπλασιασμός τους εκτιμήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο Chou-Talalay και οι τιμές του δείκτη συνδυασμού (CI) υπολογίζεται από το λογισμικό CompuSyn.

Β και D:

διαγράμματα Bar που δείχνει τα αποτελέσματα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων για UM-SCC-74Α

(

Β

)

και CAL27-άδΚ

(

D

)

σε IC

50 δόσεις των Η-4073 και σισπλατίνη (CDDP). *, Αντιπροσωπεύει μια σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με μη ομάδα θεραπείας και **, αντιπροσωπεύει μία σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05)., Σε σύγκριση με τις ομάδες απλής θεραπείας

Η

επόμενο διερευνηθεί η επίδραση του Η-4073 μόνο του ή σε συνδυασμό με σισπλατίνη στον σχηματισμό αποικίας των κυττάρων του όγκου. Όπως παρατηρήθηκε με δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μία θεραπεία συνδυασμού με H-4073 και σισπλατίνη σε αντίστοιχες IC τους

50 δόσεις σχηματισμός ανέστειλε αποικίας κυττάρου όγκου σε έναν συνεργιστικό τρόπο (93% σε UM-SCC-74Α και 92% σε CAL27-άδΚ κύτταρα) (Εικ. 3Α-C).

CAL27-άδΚ

(

Α-Β

)

ή UM-SCC-74α

(

C

)

κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Η-4073 ή σισπλατίνη (CDDP) μόνη ή σε συνδυασμό για 48 ώρες. Τέσσερις χιλιάδες βιώσιμα κύτταρα από κάθε ομάδα καλλιεργήθηκαν για 10 επιπλέον ημέρες σε πλάκες 6-cm. Κάθε δοκιμασία φωτογραφήθηκε και ο αριθμός των αποικιών που αναλύθηκαν. *, Αντιπροσωπεύει μια σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με μη ομάδα θεραπείας και **, αντιπροσωπεύει μία σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05)., Σε σύγκριση με τις ομάδες απλής θεραπείας

Η

H-4073 ανέστειλε κυτταρική μετανάστευση και αυξημένη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων

Εξετάσαμε την επόμενη την επίδραση του H-4073 και θεραπεία συνδυασμού με σισπλατίνη σε καρκινικών κυττάρων κινητικότητα με τη δοκιμασία μηδέν. Η-4073 και θεραπεία cisplatin μόνο του έδειξε 48% και 44% αναστολή της κινητικότητας των κυττάρων UM-SCC-74Α και 46% και 42% αναστολή της κινητικότητας των κυττάρων CAL27-άδΚ, αντίστοιχα (Εικ. 4Α-Β). H-4073, όταν συνδυάζεται με σισπλατίνη εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη αναστολή της UM-SCC-74Α και κινητικότητα CAL27-άδΚ κυττάρων (85% και 82%), αντίστοιχα. Στην επόμενη σειρά πειραμάτων, εξετάσαμε αν οι Η-4073-προκαλούμενα αποτελέσματα κατά του όγκου που προκαλείται από απόπτωση. Πράγματι, Η-4073 σε συνδυασμένη θεραπεία με σισπλατίνη εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων (αννεξίνη V χρώση, Σχ. 4C) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ή Η-4073 και τα κύτταρα σισπλατίνη επεξεργασμένα μόνο. Επιπλέον, ο συνδυασμός θεραπείας ανέστειλε σημαντικά την ενεργοποίηση STAT3 και σημαντικά αυξημένα τα επίπεδα των ενεργοποιημένων κασπάσης 3 και ρ21 (Εικόνα 4D).

Α-Β:.

Όγκου κυτταρική κινητικότητα εξετάσθηκε με ανίχνευση μηδέν . Κάθε δοκιμασία φωτογραφήθηκε και τις αποστάσεις μεταξύ των άκρων που μεταναστεύουν κυττάρων ποσοτικά και μετανάστευση ποσοστό των κυττάρων υπολογίστηκε. *, Αντιπροσωπεύει μια σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με μη ομάδα θεραπείας και **, αντιπροσωπεύει μία σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τις ομάδες απλής θεραπείας.

C-D:

κύτταρα UM-SCC-74Α υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Η-4073 ή σισπλατίνη (CDDP) μόνη ή σε συνδυασμό. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα είτε βάφτηκαν με Annexin V και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής ή με στύπωμα Western για pSTAT3, ρ21 ή διασπασμένη κασπάση 3. Ίσες πρωτεΐνη φόρτωση επαληθεύτηκε με απογύμνωση των κηλίδων και της ανιχνεύσεως με αντίσωμα GAPDH.

Η

H-4073 ενίσχυσε σημαντικά τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα της σισπλατίνης σε καρκίνους ανθεκτικά σισπλατίνη κεφαλής και του τραχήλου

μας

in vitro

δεδομένα υποδηλώνουν ότι η H-4073 αντιστράφηκε σημαντικά την αντίσταση σισπλατίνη στο κεφάλι και το λαιμό καρκινικά κύτταρα . Έχουμε ακόμη επικυρωθεί μας

in vitro

αποτελέσματα χρησιμοποιώντας ένα αθυμικό γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Στην πρώτη ομάδα πειραμάτων, χρησιμοποιήσαμε ένα φυσικά ανθεκτικά καρκίνο κεφαλής και λαιμού κυτταρική σειρά (UM-SCC-74Α). Η-4073 (50 ppm) και σισπλατίνη (5 mg /kg) της θεραπείας μόνο του έδειξε 33% και 39% αναστολή της ανάπτυξης του όγκου κατά την ημέρα 30, αντίστοιχα (Σχ. 5Α-Β). H-4073 σε συνδυασμό με σισπλατίνη εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα ομάδα (84%) ή μονού παράγοντα μόνο (Σχ. 5Α-Β). Επιπλέον, η θεραπεία συνδυασμού ήταν πολύ καλά ανεκτή, και δεν προκάλεσε καμία τοξικότητα των ζώων ή να προκαλέσει σημαντική μείωση του σωματικού βάρους.

Τα ζώα που φέρουν UM-SCC-74Α, CAL27 και CAL27-άδΚ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με H -4073 (50 ppm) ή σισπλατίνη (CDDP, 5 mg /kg) μόνο ή σε συνδυασμό.

Α:

Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες όγκων UM-SCC-74Α από μη επεξεργασμένο, σισπλατίνη (CDDP), H-4073, ή CDDP και H-4073-ομάδων.

Β:

καμπύλες ανάπτυξης όγκου για UM-SCC-74Α όγκοι που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη (CDDP), H-4073, ή CDDP και H-4073.

C:

καμπύλες ανάπτυξης όγκου για CAL27 και CAL27-άδΚ όγκοι που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη (CDDP), H-4073, ή CDDP και H-4073. *, Αντιπροσωπεύει μια σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με μη ομάδα θεραπείας και **, αντιπροσωπεύει μία σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05)., Σε σύγκριση με τις ομάδες απλής θεραπείας

Η

Στο δεύτερο σετ των πειραμάτων, χρησιμοποιήσαμε σισπλατίνη ανθεκτική κυτταρική γραμμή (CAL27-άδΚ, IC

50 28 μmol /L) και της γονικής κυτταρικής γραμμής σισπλατίνη ευαίσθητα της (CAL27, IC

50 3 μmol /L). Όπως έχουμε αποδείξει προηγουμένως [27], θεραπεία cisplatin (5 mg /kg) των ζώων που φέρουν CAL27-άδΚ όγκοι δεν επηρέασε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου (9%) την ημέρα 30, ενώ η σισπλατίνη θεραπεία των γονικών κυττάρων του (CAL27) αισθητά μειωμένη ανάπτυξη του όγκου (45%). H-4073 αγωγή σε κύτταρα CAL27-άδΚ ήταν σημαντικά πιο αποτελεσματικό στη μείωση του φορτίου του όγκου (32%). Η-4073 και ο συνδυασμός σισπλατίνης θεραπεία ήταν πιο αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου των όγκων CAL27-άδΚ (77%, Σχ. 5C).

Η-4073 και θεραπεία συνδυασμού σισπλατίνη αναστέλλει σημαντικά STAT3 φωσφορυλίωση

in vivo

και αυξημένη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων

σε μας

in vitro

μελέτη, έχουμε παρατηρήσει ότι η H-4073 είναι ένας ισχυρός αναστολέας της φωσφορυλίωσης STAT3. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν H-4073 θεραπείας ανέστειλε φωσφορυλίωση SAT3

in vivo

. UM-SCC-74Α όγκων από το μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού βάφτηκαν με pSTAT3 αντίσωμα. Η-4073 και θεραπεία σισπλατίνη ανέστειλαν σημαντικά τη φωσφορυλίωση STAT3 (43% και 30%, αντίστοιχα). Η-4073 και ο συνδυασμός σισπλατίνης θεραπεία ήταν πιο αποτελεσματική στην αναστολή της φωσφορυλίωσης STAT3 (94%) (Σχ. 6Α-Β). Παρομοίως, Η-4073 και ο συνδυασμός σισπλατίνης θεραπεία ήταν πιο αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα

A-D (Σχήμα 6C-D.):.

Εγκλεισμένα σε παραφίνη UM-SCC-74Α δείγματα όγκων χρωματίστηκαν για pSTAT3 (Y705) και αποπτωτικών κυττάρων (ΑΠΟΠ κιτ Tag).

Α:

Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες των δειγμάτων όγκου χρωματίστηκαν για pSTAT3 από μη επεξεργασμένο, σισπλατίνη (CDDP) ή H-4073 μόνο του ή ομάδες συνδυασμό.

Β:

pSTAT3 θετικά κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε 5 πεδία υψηλής ισχύος (400 ×) κάθε δείγματα όγκου και το ποσοστό των θετικών κυττάρων υπολογίστηκε.

C:

Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες των δειγμάτων όγκου χρωματίστηκαν για αποπτωτικά κύτταρα από μη επεξεργασμένα, σισπλατίνη (CDDP) ή H-4073 μόνο του ή ομάδες συνδυασμό.

D:

TUNEL-θετικών κυττάρων προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε 5 πεδία υψηλής ισχύος (400 ×) κάθε δείγματα όγκου και το ποσοστό των θετικών κυττάρων υπολογίστηκε. *, Αντιπροσωπεύει μια σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με μη ομάδα θεραπείας και **, αντιπροσωπεύει μία σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05)., Σε σύγκριση με τις ομάδες απλής θεραπείας

Η

H-4073 ανέστειλε αγγειογένεση του όγκου με προς τα κάτω ρύθμιση της έκκρισης VEGF από κύτταρα όγκου

ένας αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι STAT3 είναι ένας βασικός ρυθμιστής της αγγειογένεσης [16], [32]. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν H-4073 και το συνδυασμό σισπλατίνης θεραπείας επηρεαστούν αγγειογένεσης των όγκων. Η-4073 και θεραπεία cisplatin μόνο του έδειξε 24% και 31% αναστολή της αγγειογένεσης του όγκου σε UM-SCC-74Α (Σχ. 7Α-Β), ενώ H-4073 και θεραπεία συνδυασμού cisplatin έδειξαν 62% αναστολή της αγγειογένεσης του όγκου. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν H-4073 ανέστειλε την αγγειογένεση του όγκου αναστέλλοντας την παραγωγή του VEGF από τα κύτταρα του όγκου. κύτταρα UM-SCC-74Α υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με H-4073 και τα επίπεδα VEGF σε υπερκείμενα καλλιέργειας μετρήθηκαν με ELISA. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα UM-SCC-74Α παρήγαγαν υψηλά επίπεδα του VEGF (1121 pg /ml /10

6 κύτταρα, το Σχ. 7C). Η-4073 και θεραπεία cisplatin μόνο του έδειξε 36% και 55% αναστολή των επιπέδων VEGF. Η-4073 και θεραπεία συνδυασμού cisplatin ανέστειλε σημαντικά την παραγωγή VEGF (83%). Στην επόμενη σειρά πειραμάτων, εξετάσαμε αν H-4073 θα μπορούσαν να επηρεάσουν άμεσα αγγειογενετική λειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων με αναστολή VEGF σηματοδότησης. Τα αποτελέσματά μας από αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι H-4073 σημαντικά αναστέλλουν VEGF με μεσολάβηση ERK1 /2 και φωσφορυλίωσης Akt (Σχ. 7D). Εκτός από την αναστολή της προ-επιβίωσης μόρια σηματοδότησης (ERK1 /2 και Akt) H-4073 επίσης ενεργοποιημένη ρ38 ΜΑΡΚ (ένα προ-αποπτωτικό μόριο) κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο (Σχ. 7D).

Α:

Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες χρώση των αιμοφόρων αγγείων του όγκου για θεραπεία, σισπλατίνη (CDDP) ή H-4073 μόνο του ή ομάδες συνδυασμού για όγκους UM-SCC-74Α.

Β:

πυκνότητα μικροαγγείων στα δείγματα όγκου υπολογίστηκε μετρώντας 5 τυχαία πεδία (200 Χ) και εκφράζεται ως πυκνότητα αγγείου ± SE.

C:

κύτταρα UM-SCC-74Α υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη ή μόνο του ή σε συνδυασμό H-4073. Μετά από 72 ώρες, τα υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για τα επίπεδα VEGF. *, Αντιπροσωπεύει μια σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με μη ομάδα θεραπείας και **, αντιπροσωπεύει μία σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τις ομάδες απλής θεραπείας.

D:

ενδοθηλιακά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με VEGF παρουσία ή απουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του H-4073 για 30 λεπτά. ERK1 /2, Akt και ρ38 φωσφορυλίωση εξετάστηκε από κηλίδωση Western και της ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης επαληθεύθηκε με απογύμνωση των κηλίδων και της ανιχνεύσεως με ένα αντίσωμα GAPDH.

Η

Συζήτηση

Οι ασθενείς με το κεφάλι και το λαιμό του καρκίνου περιλαμβάνει μια ετερογενή ομάδα και ακόμη και με την πρόοδο στις επιλογές θεραπείας, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης για τους ασθενείς με προχωρημένη νόσο δεν έχει αλλάξει σημαντικά κατά τις τελευταίες δεκαετίες [33]. Χειρουργική ακολουθούμενη από επικουρική ακτινοθεραπεία έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό στη διαχείριση ασθενών με HNSCC [34]. Πιο πρόσφατα, τα σχήματα με βάση την πλατίνα ενσωματώνονται στις θεραπευτικές επιλογές [35]. Ωστόσο, πολλοί από τους ασθενείς αναπτύσσουν αντοχή στη σισπλατίνη, ένα από τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα μέσο πλατίνας, οδηγώντας σε αποτυχία της θεραπείας [21], [36]. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων που στοχεύει συγκεκριμένα μονοπάτια προ-επιβίωσης. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η STAT3 ιδιοσυστατικά ενεργοποιείται σε καρκινικά κύτταρα και υπερεκφράζεται σε σισπλατίνη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές [21], [37].