Abstract

Από εξατομικευμένη θεραπεία γίνεται όλο και πιο σημαντική για τη θεραπεία του καρκίνου του ορθού, μια θα πρέπει να καθοριστούν ακριβή και αποτελεσματική προσέγγιση στις κλινικές ρυθμίσεις για να βοηθήσει τους γιατρούς να λαμβάνουν τις αποφάσεις τους. Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ), προήλθε από την κύρια ή μεταστατικό καρκίνο, θα μπορούσε να παράσχει σημαντικές πληροφορίες για τη διάγνωση και την παρακολούθηση του καρκίνου. Ωστόσο, η επίπτωση και η ανάπτυξη ΚΜΑ περιορίζονται λόγω της εξαιρετικής σπανιότητας αυτών των κυττάρων όγκου. Σε αυτή τη μελέτη κατασκευάζεται μια απλή και υψηλής απόδοσης συσκευή μικρορευστονικής, η οποία αξιοποιείται πολυάριθμες διηθείται μικροδιαύλους σε αυτό τον εμπλουτισμό των μεγάλου μεγέθους κύτταρα όγκου στόχου από ολικό αίμα. Μια πολύ υψηλή απόδοση σύλληψης CTC (μέσο ποσοστό ανάκτησης: 94%) ελήφθη σε αυτή τη συσκευή στη βέλτιστη ταχύτητα ροής 0,5 ml /h και το κανάλι ύψος 5 μm. Επιπλέον, έχουμε χρησιμοποιήσει αυτή τη διάταξη για την ανίχνευση CTCs σε 60 ασθενείς με καρκίνο του ορθού. Οι μετρήσεις CTC των ασθενών με καρκίνο του ορθού ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή σε υγιή άτομα. Επιπλέον, οι μετρήσεις CTC ανιχνεύονται από αυτή τη συσκευή ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά με την μέθοδο EpCAM βάση σφαιρίδια για ασθενείς ορθού με διάφορα στάδια. Ειδικά, για ασθενείς εντοπισμένη ορθού, τα θετικά ποσοστά των δειγμάτων με περισσότερους από 3 ΚΜΑ ανά 5 mL αίματος με χρήση του μικροσυσκευή vs. αυτά EpCAM-based ήταν 100% έναντι 47%, αντίστοιχα. Έτσι, αυτή η συσκευή παρέχει ένα νέο και αποτελεσματικό εργαλείο για την ακριβή ταυτοποίηση και μέτρηση της ΚΜΑ σε ασθενείς με καρκίνο του ορθού, και έχει ευρείες δυνατότητες στην κλινική πρακτική

Παράθεση:. Sun W, Jia C, Huang Τ, Sheng W , Li G, Zhang Η, et al. (2013) High-Performance Size-Based μικροσυσκευή για την ανίχνευση των κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου από το περιφερικό αίμα σε ασθενείς με καρκίνο του ορθού. PLoS ONE 8 (9): e75865. doi: 10.1371 /journal.pone.0075865

Επιμέλεια: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Ισπανία

Ελήφθη: 23 Απρίλη του 2013? Αποδεκτές: 16 Αυγούστου 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Sun et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από ορισμένες επιστημονικές έρευνες κεφάλαια ως εξής: 1. Εθνικό Πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (973 Πρόγραμμα Νο 2012CB933303) 2. το Κλειδί Κλινική του έργου του Υπουργείου Υγείας (2010-2012) 3. Πανεπιστήμιο Fudan ακτινοβολία Ιατρικής έρευνας 3η φάση «985 έργο» (Grant Νο 985III-YPT06) 4. Το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81101645, 61271162) 5. Σαγκάη Δημοτική Επιτροπή Επιστήμης και Τεχνολογίας (No.12nm0503702, 11JC1414400). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα τελευταία χρόνια, η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του ορθού αυξάνεται δραματικά σε όλο τον κόσμο [1]. Παρά τις πρόσφατες εξελίξεις στη διαγνωστική και τη θεραπεία των τεχνικών, το αποτέλεσμα μετά τη θεραπεία παραμένει φτωχή, κυρίως λόγω της εμφάνισης των απομακρυσμένων μεταστάσεων [2] – [4].

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ), να ρίξει είτε από πρωτογενή ή μεταστατικό καρκίνο, έχουν ταυτοποιηθεί στο περιφερικό αίμα των ασθενών και συχνά συνδέονται με υποτροπή του καρκίνου και μετάσταση [5] – [6]. Κατά συνέπεια, η ανίχνευση των CTCs θα αναμένεται να παρέχει ένα ισχυρό εργαλείο για την πρόγνωση του καρκίνου, διάγνωση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου, εκτίμηση της ευαισθησίας όγκου σε αντικαρκινικά φάρμακα, και την εφαρμογή της εξατομικευμένης θεραπείας [7].

Ωστόσο , επιχειρεί να μελετήσει ΚΜΑ περιορίζονται από τη σπανιότητά τους, με συγκεντρώσεις τόσο χαμηλά όσο ένα CTC ανά δισεκατομμύριο κυκλοφορούντα κύτταρα αιματολογικές [8]. Έτσι ΚΜΑ πρέπει να εμπλουτίζεται, απομονώνονται και ταυτοποιούνται καταλλήλως, ώστε να είναι κλινικά χρήσιμη. Επί του παρόντος, ένα από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μέθοδοι ανίχνευσης CTC βασίζεται στην χρήση μαγνητικών συζευγμένα αντισώματα έναντι επιθηλιακής χάντρα που σχετίζονται όγκων επιφανειακά αντιγόνα όπως τα επιθηλιακά μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM) [9] – [10]. Η CellSearch (Veridex, NJ, USA) το σύστημα είναι ένα τυπικό παράδειγμα με τη χρήση αντι-EpCAM μέθοδο μαγνητικά σφαιρίδια με βάση την ανίχνευση CTCs και αυτό είναι το μόνο σύστημα που εγκρίθηκε από το FDA των ΗΠΑ για κλινική χρήση στα μεταστατικό καρκίνο του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του προστάτη μέχρι τώρα [ ,,,0],11]. Παρ ‘όλα αυτά, ορισμένα δεδομένα πρότειναν ότι επιθηλιακό αντιγόνο μπορεί να χαθεί στις ΚΜΑ λόγω της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ), το οποίο θεωρείται ότι είναι ένα κρίσιμο γεγονός στη μεταστατική διαδικασία [12] – [13]. Αυτό μπορεί να είναι το κύριο πρόβλημα που περιορίζει την ευρεία εφαρμογή της μεθόδου ΕρΟΑΜ που βασίζεται στην κλινική πρακτική.

Από την άλλη πλευρά, μια άλλη προσέγγιση που χρησιμοποιούνται συνήθως για το διαχωρισμό CTCs από δείγματα αίματος βασίζεται σε διαφορές στο μέγεθος των κυττάρων και παραμόρφωσης μεταξύ ΚΜΑ και τα κύτταρα αιματολογικές. Σε γενικές γραμμές, τα μεγέθη των CTCs κυμαίνονται από 15 έως 25 μm σε διάμετρο, μεγαλύτερα από εκείνα των κυττάρων αιματολογικών (. Μέσα μεγέθη των ερυθροκυττάρων και των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος είναι 8 μm και 7-10 μm σε διάμετρο, αντίστοιχα) [14] – [ ,,,0],15]. ISET (Les Ulis, Γαλλία), το οποίο απαριθμεί ΚΜΑ με διήθηση του αίματος μέσα από πολυανθρακικό μεμβρανών Track-Etch-τύπου με 8 μm κυλινδρικό πόρους, είναι ένα αντιπροσωπευτικό ένα με συγκριτικά υψηλή απόδοση σύλληψης [16]. Ωστόσο, οι πόροι του πολυανθρακικά φίλτρα, τα οποία κατασκευάζονται με εγχάραξη κομμάτι, τοποθετούνται τυχαία με ανομοιόμορφη πυκνότητα [17] – [18]. Πρόσφατα, η ανάπτυξη της τεχνικής μικροκατασκευής επέτρεψε την εισαγωγή μικρορευστονικής προσεγγίσεων για τη σύλληψη αυτά τα σπάνια κύτταρα, τα οποία θα μπορούσαν να καταστήσουν την αδυναμία του ISET [19] – [20]. Χρησιμοποιώντας ένα στρώμα μεμβράνης parylene-C μικρο-φίλτρα, Zheng S et al. [21] ανακτήθηκαν 89,5% ± 9,5% ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα που εμπλουτίστηκαν σε πλήρες αίμα από υγιείς δότες. Επιπλέον, Tan και Lim et al. [14] ανέπτυξε μια μικρορευστομηχανική διάταξη με πολλαπλές συστοιχίες πηγαδιών σχήματος ημισελήνου και ελήφθησαν αποδόσεις σύλληψη υψηλότερη από 80% για τις κυτταρικές σειρές του μαστού και του καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, Bhagat et al. [22] χρησιμοποίησε ένα ορθογώνιο μικρο-διαύλων διαμορφωμένο με μία συστοιχία συστολή-διαστολή και απέκτησε το ποσοστό ανάκτησης μεγαλύτερη από 90% για ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου μαστού των MCF-7. Παρ ‘όλα αυτά, αυτές οι μέθοδοι ανιχνεύονται μόνο τα δείγματα με καρκινικές κυτταρικές σειρές εμπλουτίστηκε σε υγιή αίμα, αλλά χωρίς την εξακρίβωση της CTCs στο αίμα των ασθενών με καρκίνο, καθώς και η περαιτέρω ανάλυση της κλινικής εφαρμογής τους.

νέες θεραπευτικές στρατηγικές βελτίωσης η αποτελεσματικότητα έναντι μεταστατική νόσο και ακριβή βιοδεικτών για την παρακολούθηση των ασθενών με καρκίνο του ορθού είναι οι κορυφαίες προκλήσεις, σε συνδυασμό με την έγκαιρη ανίχνευση και τον έλεγχο σε πληθυσμούς υψηλού κινδύνου. Σε αυτή τη μελέτη, σχεδιάσαμε και συνθετικά μια συσκευή μικρορευστονικής διήθησης για να συλλάβει αυτά τα σπάνια ΚΜΑ με βάση τις διαφορές στο μέγεθος μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των συστατικών του αίματος. Στην συσκευή μας, τη ροή του αίματος περνά μέσα από ένα σύστημα μικρο-καναλιών που βασίζεται επιτρέποντας μέγεθος επιλεκτική απομόνωση των σπάνιων καρκινικών κυττάρων, με πολύ υψηλή απόδοση σύλληψης και πλήρως επαναληψιμότητα. Μετά τη χρώση ανοσοφθορισμού, ΚΜΑ μπορούν μετά να ταυτοποιηθούν και απαριθμήθηκαν άμεσα κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. συσκευή μας είναι ένα εξαιρετικά αποτελεσματικό εργαλείο για τη σύλληψη των σπάνιων ΚΜΑ χωρίς την απαίτηση των μεγάλων και ακριβών συσκευών. Οι σκοποί αυτής της μελέτης είχαν ως εξής: Πρώτον, μετρήσαμε και βελτιστοποιημένη τις παραμέτρους της microfluidic συσκευή μας με κέντρισμα του παχέος καρκινικά κύτταρα σε δείγματα αίματος. Δεύτερον, απαριθμούνται και ανέλυσε την αποδοτικότητα δέσμευσης CTC τόσο στο εμβολιασμένο μοντέλο κύτταρα και σε δείγματα αίματος από ασθενείς με καρκίνο του ορθού. Τέλος, σε σύγκριση συσκευή μας με αντισώματα αντι-ΕρΟΑΜ συζευγμένο μέθοδος immunobead-based.

Υλικά και Μέθοδοι

Συσκευή Σχεδιασμός και Κατασκευή

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, ο μικροροής συσκευή αποτελείται από 80 κύρια κανάλια και 81 πλευρά κανάλια, τα οποία είναι διατεταγμένα σε μία interdigital τρόπο ώστε να ελαχιστοποιηθεί το αποτύπωμα τσιπ. Μια ομάδα των στενών παράλληλα τοποθετημένα κανάλια φίλτρου έχουν σχεδιαστεί για να συνδέσετε κάθε ζεύγος κύριο κανάλι και δίπλα πλευρά του καναλιού. Αμφότερα τα κύρια κανάλια και τα πλευρικά κανάλια έχουν τις διατομές των 50 μm σε πλάτος και 50 μm σε ύψος, ενώ εκείνα των διαύλων του φίλτρου έχουν πλάτη 20 μm και ύψη που κυμαίνεται από 2 μm έως 8 μm. Για κάθε κύριο κανάλι, η δεξιά πλευρά συνδέεται άμεσα με την είσοδο του δείγματος, και η αριστερή πλευρά είναι συνδεδεμένο μέσω ενός καναλιού φίλτρο σε ένα θάλαμο αποβλήτων, με μια σειρά από μικρο-θέσεις που έχουν σχεδιαστεί για να αποφευχθεί η κατάρρευση του θαλάμου. Για κάθε πλευρά του καναλιού, η δεξιά πλευρά είναι τυφλός και το αριστερό συνδέεται άμεσα με το θάλαμο αποβλήτων. Αφού το δείγμα αίματος φορτώνεται στην είσοδο, μια αρνητική πίεση εφαρμόζεται στην έξοδο, η οποία αναρροφά το δείγμα αίματος μέσα στα κύρια κανάλια. Εν τω μεταξύ, λόγω της διαφοράς πίεσης μεταξύ του κύριου καναλιού και του πλευρικού καναλιού, τα περισσότερα από τα μικρού μεγέθους αιματολογικές κυττάρων σε πλήρες αίμα όπως ερυθροκύτταρα και τα λευκοκύτταρα μπορεί να φιλτραριστεί σε γειτονικά πλευρικά κανάλια τους μέσω διαύλων του φίλτρου και στη συνέχεια αποβάλλεται από το θάλαμο αποβλήτων. Οι μεγάλου μεγέθους κύτταρα όπως καρκινικά κύτταρα δεν μπορούν να περάσουν μέσα από τα στενά κανάλια του φίλτρου και στη συνέχεια παραμένουν στα κύρια κανάλια. Αυτή είναι η θεωρία της απομόνωσης του ΚΜΑ για αυτή τη συσκευή

Α) Η σχηματική της microfluidic συσκευή.? Β) Το σχηματικό της εγκατάσταση του σταθμού εργασίας για την απομόνωση CTC? Γ) Η δομή της συσκευής κάτω από το μικροσκόπιο? Δ) Το σχηματικό που δείχνει τη θεωρία της συσκευής σε κάθετη άποψη? Ε) Η σχηματική παράσταση που δείχνει τη θεωρία της συσκευής στην προβολή του προφίλ.

Η

Η συσκευή μας κατασκευάστηκε με σύνδεση ενός πλάκα υβριδικό πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο (PDMS) που περιέχει τρισδιάστατο μικρο-κανάλια με ένα γυάλινο πλακίδιο. Η microfluidic συσκευή κατασκευάστηκε μέσα από την καθιερωμένη διαδικασία πολλαπλών στρώσεων μαλακό λιθογραφία [23]. Εν συντομία, ένα master δύο επιπέδων παρασκευάστηκε από ένα αρνητικό φωτογραφίας-αντισταθεί, SU-8 (Microchem, USA). Στη συνέχεια, απαερώθηκε PDMS (αναμίχθηκαν σε αναλογία 10:01 βάσεως PDMS με τον παράγοντα σκλήρυνσης, Sylgard 184, Dow Corning Inc., USA) χυτεύθηκε επί το κύριο καλούπι και ψήθηκε στους 90 ° C για 1 ώρα σε ένα φούρνο. Μετά την ωρίμανση, η πλάκα PDMS προσεκτικά τη φλούδα τους μακριά από την κύρια φόρμα. Μία είσοδο και μία έξοδο τρυπήθηκαν διαμέσου των PDMS χρησιμοποιώντας μια βελόνα με ένα πεπλατυσμένο άκρο. Η πλάκα PDMS στη συνέχεια συνδέεται με ένα γυάλινο slide μετά την επεξεργασία με πλάσμα οξυγόνου, και η διαδικασία που περιγράφεται ως εξής: Η συγκόλληση με πλάσμα οξυγόνου έγινε χρησιμοποιώντας ειδικό καθαριστικό πλάσματος (PDC-32G-2, Harrick Plasma Corp., USA). Η γυάλινη πλάκα και PDMS πλάκα τοποθετήθηκαν σε θάλαμο καθαρότερων πλάσματος για 50 δευτερόλεπτα. Μετά από αυτό, PDMS πλάκας και γυάλινη πλάκα ελήφθησαν από το θάλαμο, και PDMS τοποθετήθηκε και πιέζεται στη γυάλινη επιφάνεια αμέσως.

Cell Culture and Cell κεντρίσματος

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά ορθοκολικού HT- 29 που ελήφθη από κυτταρική τράπεζα του American Type Culture Collection καλλιεργήθηκε σε μέσο McCoy 5Α (Gibco, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, Carlsbad, CA, USA). Η κυτταρική καλλιέργεια διεξήχθη σε έναν επωαστήρα στους 37 ° C σε 5% CO

2. Το μέσο ανάπτυξης αναρροφήθηκε και τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη. Αμέσως πριν από τα πειράματα, τα κύτταρα ξεπλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα PBS και επαναιωρήθηκαν. Ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Vybrant με Dil λύσεις σήμανσης κυττάρων (Carlsbad, Invitrogen, CA) για 5 λεπτά στους 37 ° C, στη συνέχεια ξεπλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα PBS και επαναιωρήθηκαν. Η συγκέντρωση των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση με ένα αιματοκυτταρόμετρο. Η επιθυμητή συγκέντρωση των κυττάρων παρασκευάστηκε αραιώνοντας κυτταρικά εναιωρήματα σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS. Σημασμένα κύτταρα με γνωστούς αριθμούς εμπλουτίστηκαν σε δείγματα αίματος για περαιτέρω μετρήσεις.

αίματος Συλλογή δειγμάτων και επεξεργασία

Τα δείγματα αίματος από 60 ασθενείς με καρκίνο του ορθού λήφθηκαν από το Μάρτιο έως το Δεκέμβριο του 2012. Όλα ασθενείς επιβεβαιώθηκαν ως παθολογικά ορθού καρκίνωμα με βιοψία ή χειρουργική επέμβαση. Από αυτούς, 30, 10 και 20 ασθενείς επιβεβαιώθηκαν ως νεοδιαγνωσθέντες Στάδιο ΙΙ-ΙΙΙ, τοπική υποτροπή και απομακρυσμένη μετάσταση, αντίστοιχα. Για όλους αυτούς τους 60 ασθενείς, 10 mL ελήφθησαν δείγματα αίματος για την ανίχνευση CTC, συμπεριλαμβανομένων των 5 mL με microfluidic συσκευή και 5 ml με τη μέθοδο που βασίζεται EpCAM.

Σαν μία ομάδα ελέγχου, τα δείγματα αίματος επίσης προέρχονται από 30 υγιείς εθελοντές που είχαν καμία γνωστή ασθένεια ή πυρετός κατά τη στιγμή της κλήρωσης και χωρίς ιστορικό κακοήθους νόσου.

Όλα τα δείγματα ελήφθησαν σε εκκενωμένους σωλήνες συλλογής αίματος που περιέχουν EDTA, φυλαγμένο σε 4 ° C και υποβάλλονται σε επεξεργασία εντός 72 ωρών. Μετά από φυγοκέντρηση του περιφερικού αίματος στις 1500 rpm για 10 λεπτά, τα δείγματα πλάσματος αφαιρέθηκαν προσεκτικά από το άνω τμήμα του υπερκειμένου. Κόκκινο αίμα ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης (0,139 Μ NH

4Cl, 0.02 Μ Tris, ρΗ 7,2) προστέθηκε στα δείγματα του αίματος απομένον και αναμίχθηκε για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από φυγοκέντρηση στις 1500 rpm για 10 λεπτά, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το απομένον περιφερικά μονοπύρηνα κυττάρων (PBMC) σβώλος επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS.

Μέσο Ρύθμιση

Πριν από την επεξεργασία του εντοπισμού, οι συγκεντρώσεις των δειγμάτων PBMC από ασθενείς με καρκίνο του ορθού (ή δείγματα από υγιείς δότες με εμβολιασμένο ΗΤ-29 κυττάρων) μετρήθηκαν με ένα αιματοκυτταρόμετρο και αραιώνονται σε ρυθμιστικό PBS ως 5 × 10

7 κύτταρα /mL. Στη συνέχεια, οι 0,5-0,6 mL αραιωμένα δείγματα PBMC εισήχθησαν εντός της συσκευής με άντληση. Μία αντλία σύριγγας (PHD 22/2000, συσκευή Håvard, Massachusetts, USA) με σύριγγα 5 κ.εκ. για τη συλλογή αποβλήτων συνδέεται με την έξοδο της συσκευής. Η είσοδος της συσκευής συνδέθηκε με τα δείγματα του αίματος μέσω του πολυμερούς σωλήνα. Η αντλία σύριγγας τέθηκε σε λειτουργία και η πίεση ρυθμίζεται ανάλογα με το απαιτούμενο ρυθμό ροής. Τα δείγματα αίματος που αντλείται από την είσοδο στο microfluidic συσκευή για τη σύλληψη CTC και συλλέχθηκαν τα φιλτραρισμένα συστατικά αιματολογικές όπως λευκοκύτταρα μέσα στο θάλαμο αποβλήτων.

ταυτοποίηση και μέτρηση της ΚΜΑ από μικροσκόπιο φθορισμού

Μετά τη διαδικασία της δέσμευσης CTC, καρκινικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν και διακρίνονται από λευκοκύτταρα με βάση την έκφραση αντιγόνων μορφολογία και διαφορικό. καρκινικά κύτταρα είναι επιθηλιακά (κυτοκερατίνη + /CD45-/DAPI +), ενώ λευκοκύτταρα είναι μη επιθηλιακά (cytokeratin- /CD45 + /DAPI +). Φθορισμού αντιδραστήρια αντλείται εντός της συσκευής και αντίδραση ανοσοφθορισμού έγινε κατευθείαν στα κανάλια της συσκευής. Πρώτον, τα αντισώματα να CD45 συζευγμένο με FITC (BD Biosciences, USA) εισήχθησαν μέσα στη συσκευή, που ακολουθείται από επώαση για 30 λεπτά στους 0 ° C. Ακολούθως, ένα διάλυμα 0.2% Triton Χ-100 και τα αντισώματα να κυτοκερατίνη συζευγμένη με φυκοερυθρίνη (C-11, Abcam, UK) αντλήθηκε μέσα στην συσκευή και επωάστηκαν για 10 λεπτά και 1 ώρα, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, συλληφθέντα κύτταρα αναμίχθηκαν με διάλυμα DAPI για 20 λεπτά. Τέλος, δεν σταματούν τα κύτταρα στερεώθηκαν με ένα διάλυμα 1% παραφορμαλδεΰδη επί 20 λεπτά. Μετά από αυτές τις αντιδράσεις, η συσκευή ξεπλύθηκε με 1 mL PBS για την απομάκρυνση της περίσσειας αντιδραστηρίων. Κατέλαβε κύτταρα εντοπίζονται και απαριθμούνται χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (Olympus America). ΚΜΑ προσδιορίστηκαν σύμφωνα με την λεκιασμένη χρώμα και μορφολογικά χαρακτηριστικά, όπως το μέγεθος των κυττάρων, το σχήμα και την πυρηνική μέγεθος. Τα κύτταρα που βάφτηκαν κυτοκερατίνη + /CD45-/DAPI + και πληρούνται οι φαινοτυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά βαθμολογήθηκαν ως ΚΜΑ. Ένας έμπειρος παθολόγος ο οποίος ήταν τυφλός στα κλινικά αποτελέσματα αξιολογούνται διεξοδικά κάθε δείγμα αίματος για τον προσδιορισμό της CTC.

Ανίχνευση ΚΜΑ από EpCAM με βάση τη μέθοδο

Η απόδοση της δέσμευσης της ΚΜΑ μετρήθηκε επίσης με EpCAM-based μέθοδος. Λεπτομερής μέθοδος περιγράφεται ως ακολούθως: Ο διαχωρισμός των CTCs διεξήχθη με χρήση του ανοσομαγνητικά σφαιρίδια επικαλυμμένα με αντισώματα επιθηλιακών κυττάρων ειδικών EpCAM (μαγνητικό σφαιρίδιο: 4.5 μm διάμετρος? DYNAL, Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το σφαιρίδιο PBMC επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS και αναμίχθηκε με ανοσομαγνητικά σφαιρίδια. Το μίγμα κυττάρων-σφαιριδίων επωάστηκε για 40 λεπτά στους 2-8 ° C με ήπια κλίση και περιστροφή. Το μίγμα τοποθετήθηκε σε ένα μαγνητικό επί 5 λεπτά και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε προσεκτικά. Στη συνέχεια, τα αντισώματα να CD45 συζευγμένο με FITC (BD Biosciences, USA) προστέθηκαν και αναμίχθηκαν με συλληφθέντα κύτταρα για 30 λεπτά στους 0 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με ένα διάλυμα από 0,2% Triton Χ-100 για 10 λεπτά και αναμιγνύεται με αντισώματα προς κυτοκερατίνης συζευγμένη με φυκοερυθρίνη (C-11, Abcam, UK) για 1 ώρα. Μετά από αυτό, συλληφθέντα κύτταρα αναμίχθηκαν με διάλυμα DAPI για 20 λεπτά. Τέλος, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με ένα διάλυμα 1% παραφορμαλδεΰδη επί 20 λεπτά. Μετά από κάθε στάδιο επεξεργασίας, συλληφθέντα κύτταρα πλύθηκαν με PBS ρυθμιστικό για απομάκρυνση της περίσσειας των αντιδραστηρίων σε ένα μαγνητικό. Η μέθοδος ταυτοποίησης και απαρίθμηση ΚΜΑ ήταν παρόμοια με εκείνη του microfluidic συσκευή, σύμφωνα με την λεκιασμένη χρώμα και μορφολογικά χαρακτηριστικά, όπως το μέγεθος των κυττάρων, το σχήμα και την πυρηνική μέγεθος. Τα κύτταρα που βάφτηκαν κυτοκερατίνη + /CD45-/DAPI + και πληρούνται οι φαινοτυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά βαθμολογήθηκαν ως ΚΜΑ. Ένας έμπειρος παθολόγος ο οποίος ήταν τυφλός στα κλινικά αποτελέσματα αξιολογούνται διεξοδικά κάθε δείγμα αίματος για τον προσδιορισμό της CTC.

Ηθική Δήλωση

Όλες οι διαδικασίες εγγραφής πραγματοποιήθηκαν σε συμμόρφωση με τους σχετικούς νόμους και θεσμικές κατευθυντήριες γραμμές και τις σχετικές θεσμικές επιτροπή (Επιτροπή Δεοντολογίας της Fudan Πανεπιστήμιο της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου) ενέκρινε την έρευνά μας. Όλοι οι ασθενείς και υγιείς εθελοντές υπέγραψαν τη γραπτή συγκατάθεση πριν από την εγγραφή.

Στατιστική Ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS (έκδοση 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Όλα τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσο ± τυπικές αποκλίσεις (SD). αποδοτικότητα Capture υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των συλληφθέντων κυττάρων στόχων από τον αριθμό των συνολικών κυττάρων στόχων εισάγεται εντός της συσκευής. Η καθαρότητα των κυττάρων συλλαμβάνονται προσδιορίστηκε με διαίρεση του αριθμού των συλληφθέντων κυττάρων στόχων από τον αριθμό του συνόλου των συλληφθέντων κυττάρων. Η ανάλυση παλινδρόμησης διεξήχθη για να εκτιμηθεί η ακρίβεια της ανίχνευσης καρκινικών κυττάρων. Μια Mann-Whitney U και δοκιμή Kruskal-Wallis H χρησιμοποιήθηκαν σε περιπτώσεις 2 ανεξάρτητα δείγματα και περισσότερα από 2 δείγματα, αντίστοιχα, ενώ οι συγκρίσεις των σχετικών μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια Wilcoxon rank test υπογραφεί. Κατάταξη συσχέτιση Spearman χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της συσχέτισης του ρυθμού δέσμευσης μεταξύ microfluidic συσκευή και μέθοδος EpCAM-based. Όλες οι δοκιμασίες ήταν δύο όψεων και πραγματοποιήθηκαν σε επίπεδο σημαντικότητας 5%.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Η Επίδραση του ύψους της Μάγχης και της ταχύτητας ροής σε CTC Σύλληψη απόδοση

για τη βελτιστοποίηση των πειραματικών παραμέτρων αυτής της συσκευής, που κορυφώθηκαν ΗΤ-29 κύτταρα με γνωστούς αριθμούς σε δείγματα αίματος από υγιείς δότες για τη μέτρηση της αποτελεσματικότητας σύλληψη και την καθαρότητα των κυττάρων.

Πρώτον, μελετήσαμε τις επιδράσεις του καναλιού φίλτρου ύψος για συλληπτήρια και την καθαρότητα των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2α, η αποδοτικότητα δέσμευσης του ΚΜΑ με το ύψος του καναλιού 8 μm ήταν προφανώς χαμηλότερη από εκείνη με 2 μm και 5 μm ύψος, ενώ παρόμοιες υψηλότερη αποδοτικότητα δέσμευσης του 98% θα μπορούσε να παρατηρηθεί για 2 μm και 5 μm. Επιπλέον, η καθαρότητα των κυττάρων βελτιώθηκε σταδιακά με την αύξηση του ύψους του καναλιού, όπως καταδεικνύεται στο σχήμα 2β. Έτσι, με βάση τα δεδομένα στο Σχήμα 2α και 2β, επιλέξαμε ένα ύψος 5 μπι ως το καλύτερο συμβιβασμό μεταξύ της αποτελεσματικότητας σύλληψης και την καθαρότητα των κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχε στενή σχέση μεταξύ του μεγέθους της κοιλότητας του φίλτρου και την απόδοση της δέσμευσης της ΚΜΑ, και κάποιες άλλες μελέτες που έγιναν επίσης σε παρόμοια συμπεράσματα: Hosokawa Μ et al. [24] χρησιμοποιείται ένα μέγεθος διαλογής array μικροκοιλότητας να απομονώσει ΚΜΑ και την αποτελεσματικότητα σύλληψη του παρουσίασε πτωτική τάση με την αύξηση του μεγέθους μικροκοιλότητας. Sheng W. et al. [25] κατασκευαστεί ένα απταμερές δυνατότητα μικροσυσκευή και ανέφερε επίσης ότι η απόδοση της δέσμευσης της ΚΜΑ θα κατέβει σταδιακά, αλλά η καθαρότητα είχε μια ανοδική τάση, όταν αυξάνεται το βάθος του καναλιού.

Α) Η σχέση μεταξύ του ύψους καναλιού και συλληπτήρια : Η αποδοτικότητα δέσμευσης υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των κυττάρων στόχων συλλαμβάνονται από τον αριθμό των κυττάρων στόχων εισάγεται εντός της συσκευής. Β) Η σχέση μεταξύ του ύψους καναλιού και καθαρότητα των κυττάρων: Η καθαρότητα των κυττάρων συλλαμβάνονται προσδιορίστηκε με διαίρεση του αριθμού των κυττάρων στόχων συλλαμβάνονται από τον αριθμό των συνολικών κυττάρων συλλαμβάνονται. Ο ρυθμός ροής ήταν 0.5 mL /h για Α) και Β). C) Η σχέση μεταξύ ρυθμού ροής και αποδοτικότητα δέσμευσης: η αποδοτικότητα δέσμευσης υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των κυττάρων στόχων συλλαμβάνονται από τον αριθμό των κυττάρων στόχων εισάγεται εντός της συσκευής. Το ύψος του καναλιού ήταν 0,5 μm. Οι ράβδοι σφάλματος που αντιπροσωπεύεται μία τυπική απόκλιση 4 πειραμάτων επανάληψης. D) Ανάκτηση των γνωστών αριθμών αιχμηρών ΗΤ-29 κυττάρων από πλήρες αίμα. Παλινδρομική ανάλυση των παρατηρούμενων αριθμός καρκινικών κυττάρων σε σχέση με τον αναμενόμενο αριθμό καρκινικών κυττάρων που παράγεται μια κλίση 0,986 και συντελεστή συσχέτισης (R

2) 1.

Η

Από την άλλη πλευρά, ερευνήσαμε επίσης τη σχέση μεταξύ του ρυθμού ροής και CTC απόδοση της δέσμευσης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2c, με ταχύτητα ροής κυμαινόμενη από 0,2 και 0,5 ml /h, η αποδοτικότητα δέσμευσης δεν άλλαξε προφανώς. Αλλά από την επιτόκιο πάνω από 0,5 mL /h, η απόδοση της δέσμευσης μειωθεί δραματικά. Η αποδοτικότητα δέσμευσης μειώνεται με την αύξηση του ρυθμού ροής πιθανώς λόγω ενός μεγαλύτερου πίεση σε ένα υψηλότερο ρυθμό ροής. Κάποιες άλλες μελέτες [24] – [26] επίσης επισημάνει ότι η αποτελεσματικότητα σύλληψης κυττάρων ήταν αντιστρόφως ανάλογη προς τον ρυθμό ροής του αίματος. Ως εκ τούτου, λαμβάνοντας υπόψη το χρόνο επεξεργασίας των δειγμάτων αντλείται μέσα στη συσκευή και την απόδοση της δέσμευσης, εμείς επιλέξαμε 0.5 mL /h ως η καλύτερη παράμετρος για την ανίχνευση, στο οποίο θα μπορούσε να παρατηρηθεί ροή επαρκή απόδοση.

Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε η βέλτιστη ύψος κανάλι 5 μm και ποσοστό 0.5 mL /h ροή για ανίχνευση CTC, και αυτές οι πειραματικές συνθήκες χρησιμοποιήθηκαν για όλα τα μετέπειτα πειράματα.

η ανάκτηση των κυττάρων όγκου ανίχνευσης

για να προσδιοριστεί η ευαισθησία ανίχνευσης των καρκινικών κυττάρων, ΗΤ-29 κύτταρα σε διαφορετικές γνωστές αριθμούς, εμπλουτίστηκαν σε 5 ml δείγματα αίματος από κάθε υγιούς δότη. Οι αριθμοί των κυττάρων ήταν εμπλουτισμένου 5, 9, 51, 102, 500 και 998 αντίστοιχα. Σχήμα 2d έδειξαν τον αναμενόμενο αριθμό των κυττάρων ΗΤ-29 εμβολιάζεται εντός του υγιούς δότη δειγμάτων συναρτήσει του πραγματικού αριθμού των ΗΤ-29 κυττάρων που παρατηρούνται στα δείγματα. Παλινδρομική ανάλυση των παρατηρούμενων αριθμός καρκινικών κυττάρων σε σχέση με τον αναμενόμενο αριθμό καρκινικών κυττάρων που παράγεται μια κλίση 0,986 και συντελεστή συσχέτισης (R

2) 1. Το μέσο ποσοστό των ΗΤ-29 ανακτήθηκε ήταν 94% και τα ποσοστά ανάκτησης σε διάφορες συγκεντρώσεις κυττάρων ήταν όλες πάνω από 80% (Πίνακας 1, Πίνακας S1). Έχουμε επικυρωθεί επίσης τα ποσοστά ανάκτησης των κυτταρικών γραμμών καρκίνου πνεύμονα τρία συμπεριλαμβανομένων Α549, SK-MES-1 και Η446, όλα από τα οποία ήταν υψηλότερη από 90% (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Ανίχνευση CTC του ορθού Οι ασθενείς με καρκίνο με διάφορα στάδια

Οι μετρήσεις CTC των 60 ασθενών ορθού με διάφορα στάδια και 30 υγιή άτομα εντοπίστηκαν και αναλύθηκαν σε κάθε ολικού αίματος 5 ml. Σχήμα 3 κατέδειξαν την κατέλαβε ΚΜΑ ενός τυπικού ασθενή με καρκίνο του ορθού στην μικρορροϊκή συσκευή

A /B: χρώση ΚΜΑ?. C /D: χρώση φυσιολογικά κύτταρα του αίματος. Α) θετική χρώση CK στο ΚΜΑ? Β) θετική χρώση DAPI στην ΚΜΑ? Γ) θετική χρώση CD45 σε φυσιολογικά κύτταρα του αίματος? Δ) θετική χρώση ϋΑΡΙ στα φυσιολογικά κύτταρα του αίματος.

Η

Όπως καταδεικνύεται στην Εικόνα 4, θετικά κύτταρα μπορούσαν να παρατηρηθούν σε 3 από 30 υγιή άτομα, αλλά κανένας από αυτούς δεν είχε περισσότερο από 3 θετικά κύτταρα ανά δείγμα . Αυτά τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια με εκείνα στις προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι έως και τρία CTCs ανιχνεύθηκαν σε ένα μικρό πληθυσμό από υγιείς δότες ή μη κακοήθη ασθενείς [27] – [28]. Ο λόγος για μια τέτοια «ψευδώς θετικά» αποτελέσματα είναι άγνωστη ακόμα, αλλά προφανώς λόγω διάφορους λόγους ως εξής: (α) μόλυνση των επιθηλιακών κυττάρων σε δείγματα αίματος οφείλεται σε κάποιο εσφαλμένη επεξεργασία όπως ακατάλληλη δειγματοληψία αίματος? (Β) ανακριβή απόφαση αναγνώρισης της ΚΜΑ από τους ερευνητές? (Γ) η παρουσία της παρεκκλίνουσας αιματολογικών κυττάρων που εκφράζουν επιθηλιακά αντιγόνα σε δείγματα αίματος? (Δ) το δυναμικό ασθενείς με καρκίνο οι οποίοι δεν μπορούν να διαγνωσθούν νωρίς με συνήθεις κλινικές τεχνικές.

Το οικόπεδο κουτί καταδεικνύει τη μέση, άνω και κάτω τεταρτημόρια (25ο, 75ο εκατοστημόριο). Τα δεδομένα σημεία που είναι έξω από τα 10ο και 90ο εκατοστημόριο εμφανίζεται ως ακραίες τιμές.

Η

Παρά το γεγονός ότι οι δείκτες όγκου, όπως η CEA στον ορό χρησιμοποιείται ευρέως για τη διάγνωση και την παρακολούθηση των ασθενών με γαστρεντερικούς καρκίνους, η έλλειψη ευαισθησίας τους παραμένει άλυτο. Συμβατικές μέθοδοι απεικόνισης και καρκινικών δεικτών είναι μερικές φορές ανακριβείς για τη διάγνωση και την παρακολούθηση των αποκρίσεων θεραπεία του καρκίνου, με αποτέλεσμα καθυστέρηση στην εξέλιξη της νόσου κρίνουμε νωρίς. Σε αυτή τη μελέτη, CTCs θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε όλους τους 60 ασθενείς των οποίων ο καρκίνος του ορθού μετρήσεις CTC ήταν όλες πάνω από 3 κύτταρα ανά δείγμα. Οι μετρήσεις CTC των ασθενών με καρκίνο του ορθού ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή σε υγιή άτομα (167,33 ± 212,76 έναντι 0,17 ± 0,59, P & lt? 0,05). Επιπλέον, οι ασθενείς με απομακρυσμένες μεταστάσεις είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα CTC από τους ασθενείς με σταδίου ΙΙ-ΙΙΙ ή εκείνοι με τοπική υποτροπή (385,30 ± 245,86 έναντι 39.40 ± 19.23 έναντι 115.20 ± 69.15, Ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, οι μετρήσεις CTC των τοπικών επαναλαμβανόμενων ασθενείς ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερα από ό, τι τα άτομα με σταδίου ΙΙ-ΙΙΙ (P & lt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ποσότητα CTC συσχετίζεται αρκετά καλά με το φορτίο του όγκου και τη σοβαρότητα των ασθενών με διάφορα στάδια. Ως εκ τούτου, η CTC θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη βιοδείκτης για να καλυφθεί η ανεπάρκεια των συμβατικών τρόπων κλινικής ανίχνευσης. Sastre et al. [29] κατέδειξε μια στενή σχέση μεταξύ μετράει CTC και διαφορετικά κλινικά στάδια για ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, η οποία ήταν παρόμοια με τα αποτελέσματα μας. Cohen et al. [30] έδειξε ότι η CTC μετράει πριν από τη θεραπεία και σε μετέπειτα χρονικά σημεία ήταν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για την επιβίωση χωρίς εξέλιξη και η συνολική επιβίωση. Allen-Mersh et al. [31] έδειξε ότι η CTC μετρά μέσα σε 24 ώρες μετά από τον αρχικό του παχέος εκτομή του καρκίνου του ήταν ένας ισχυρός προγνωστικός δείκτης της υποτροπής του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η ανίχνευση των CTCs θα μπορούσε επίσης να εφαρμοστεί σε στοχευμένη γονιδιακή θεραπεία. Yen et al. [32] διαπιστώθηκε ότι η ανίχνευση της κατάστασης μεταλλάξεων του KRAS στην ΚΜΑ είχε δυνατότητες για κλινική εφαρμογή στην επιλογή ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου είναι πιθανότερο να ωφεληθούν από τη θεραπεία με cetuximab. Έτσι, η ανίχνευση της ΚΜΑ μπορεί να έχει εφαρμογή σε ευρεία γκάμα στις κλινικές ρυθμίσεις, όπως η διάγνωση των ασθενειών του καρκίνου, την παρακολούθηση των απαντήσεων επεξεργασία, αξιολόγηση πρόγνωση και ακόμη και η διαδικασία λήψης αποφάσεων της εξατομικευμένης θεραπείας. Περαιτέρω αναλύσεις συμπεριλαμβανομένου του ρόλου της ΚΜΑ για την πρόβλεψη και την αξιολόγηση της μακροπρόθεσμης επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο, χρησιμοποιώντας microfluidic συσκευή μας θα πραγματοποιηθεί στο προσεχές μέλλον.

Σύγκριση Microfluidic Συσκευή εναντίον EpCAM με βάση τη μέθοδο

μέθοδος Αντι-ΕρΟΑΜ μαγνητικά σφαιρίδια που βασίζονται είναι σήμερα μια από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες τεχνολογίες για την ανίχνευση CTC [9] – [10]. Ως εκ τούτου, συγκρίναμε την απόδοση των μικροσυσκευή μας για απαρίθμηση των καρκινικών κυττάρων έναντι μέθοδος εμπλουτισμού EpCAM-based. Πρώτον, ΗΤ-29 κυττάρων με γνωστούς αριθμούς εμπλουτίστηκαν σε δείγματα αίματος από υγιείς δότες, και στη συνέχεια κάθε δείγμα χωρίστηκε σε δύο αντίγραφα, το ένα για τη συσκευή μας και ένα άλλο για τη μέθοδο που βασίζεται EpCAM. Τα ποσοστά ανάκτησης αυτών των δύο μεθόδων συγκρίθηκαν και αναλύθηκαν. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, τα ποσοστά ανάκτησης των κυττάρων του όγκου χρησιμοποιώντας αυτό μικροσυσκευή ήταν όλες πάνω από 80% σε κάθε συγκέντρωση των κυττάρων του όγκου, ενώ τα ποσοστά ανάκτησης με την μέθοδο EpCAM-based ήταν συγκριτικά μικρότερη, που κυμαίνονται από 36% έως 81% (Ρ & lt? 0.05). Επιπλέον, δεν μπορέσαμε να βρούμε σημαντική συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού ανάκτησης των microfluidic συσκευή και ότι η μέθοδος της EpCAM-based (Συσχέτιση αποτελεσματική ήταν 0,07, P & gt?. 0.05). Στη συνέχεια, μπορούμε επίσης να συγκριθούν οι επιδόσεις των δύο αυτών μεθόδων με τη χρήση δειγμάτων αίματος ασθενών και τα αποτελέσματα ήταν καταδεικνύεται στον Πίνακα 2. Θα συλλέγονται και υφίστανται επεξεργασία των δειγμάτων αίματος από 60 ασθενείς με καρκίνο του ορθού, και κάθε δείγμα χωρίστηκε σε δύο κομμάτια για τα κύτταρα όγκου ανίχνευση χρησιμοποιώντας αυτές τις δύο μεθόδους (Πίνακας S2). Για τους ασθενείς ορθού με διάφορα στάδια, οι CTC μετράει ανιχνεύονται από μικροσυσκευή ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες με τη μέθοδο EpCAM-based (P & lt? 0,05). Ο αριθμός των απομονωμένων CTCs κυμαίνεται από 0 έως 100 έναντι 0 έως 12 (μικροσυσκευή έναντι EpCAM-based) ανά δείγμα για ασθενείς με σταδίου ΙΙ-ΙΙΙ (μέση ± SD, 39 ± 19 έναντι 4 ± 3), 4 έως 210 vs . 3 – 31 για επαναλαμβανόμενες ασθενείς (115 ± 69 έναντι 12 ± 9) και 47-980 εναντίον 5-55 για τη μεταστατική τους ασθενείς (385 ± 246 έναντι 24 ± 15). Για τη μέθοδο EpCAM βάση, η CTC μετρά 38 (63%) ασθενείς κυμαίνεται από 0 έως 10, ενώ η σε ένα μόνο ασθενή (2%) ήταν περισσότερο από 50. Αντιθέτως, όσον αφορά μικροσυσκευή, οι μετρήσεις CTC 3 (5 %) ασθενείς κυμαίνεται από 0 έως 10, ενώ εκείνοι σε 34 (57%) ασθενείς ήταν περισσότερο από 50. Η διαφορά μεταξύ αυτών των δύο μεθόδων ήταν ιδιαίτερα προφανές για 30 ασθενείς με καρκίνο με ορθού Στάδιο ΙΙ-ΙΙΙ: θετικούς ρυθμούς των δειγμάτων με περισσότερους από 3 ΚΜΑ ανά 5 ml αίματος με τη χρήση μικροσυσκευή ήταν 100% (30/30), ενώ μόνο το 47% (14/30) θετικά δείγματα θα μπορούσαν να παρατηρηθούν με τη μέθοδο EpCAM-based.

η

EpCAM- μαγνητική μέθοδος που βασίζεται σφαιρίδιο είναι σήμερα μια από τις πιο διαδεδομένες προσεγγίσεις για την απομόνωση των CTCs. Ωστόσο, αυτή η μέθοδος εξαρτάται από την έκφραση EpCAM επί των κυττάρων όγκου στόχου. Αν και το αντιγόνο EpCAM μπορεί να βρεθεί στην πλειονότητα των επιθηλιακών όγκων, αδύναμη ή αρνητική έκφραση του EpCAM έχει αναφερθεί, η οποία πιθανώς σχετίζεται με το φαινόμενο της ΕΜΤ [33] – [34]. Πολλοί παράγοντες όπως η χημειοθεραπεία μπορεί πιθανώς να προκαλέσουν EMT, η οποία μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της δέσμευσης των κυττάρων του όγκου. Στη μελέτη μας, προκειμένου να ελαχιστοποιείται η επίδραση της EMT, χρησιμοποιήσαμε μια μέθοδο που βασίζεται σε μέγεθος για την ανίχνευση CTCs αντί του EpCAM-εξαρτημένη. Ως εκ τούτου, θεωρητικά, πιο καρκινικά κύτταρα συμπεριλαμβανομένης και της θετικής EpCAM-έκφραση και αρνητικών θα μπορούσε να συλληφθεί από το μέγεθος που βασίζεται μικροσυσκευή μας. Αυτή η υπόθεση είναι σύμφωνη με τα αποτελέσματα μας ανωτέρω: Όχι μόνο σε δείγματα με καρκινικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν σε υγιή αίμα, περισσότερα CTC απομονώθηκαν με μικροσυσκευή μας, αλλά παρόμοια αποτελέσματα επικυρώθηκαν σε δείγματα ασθενών με καρκίνο του ορθού, καθώς και. Άλλες προηγούμενες μελέτες [35] – [36]., Το οποίο σε σύγκριση με το μέγεθος που βασίζεται και η μέθοδος EpCAM-based, ανέφεραν παρόμοια ευρήματα και έδειξαν ότι ένα ποσοστό των κυττάρων που απομονώνονται από την προσέγγιση με βάση το μέγεθος έλειπε επιθηλιακά χαρακτηριστικά

Από την