Αφηρημένο

προαγγειογόνος ένζυμο θυμιδίνης φωσφορυλάσης (ΤΡ) είναι ένας υποσχόμενος στόχος για την αντικαρκινική θεραπεία, ακόμη δράση της σε μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) δεν είναι πλήρως κατανοητός. Για να διαλευκανθεί ο ρόλος του στην ανάπτυξη του όγκου NSCLC, κύτταρα καρκινώματος βλεννοεπιδερμοειδής ΝΟΙ-Η292 πνεύμονα και ενδοθηλιακά κύτταρα τροποποιημένα ώστε να υπερεκφράζουν ΤΡ με μεταγωγή ιικό φορέα. κύτταρα NSCLC με αλλαγμένη έκφραση του παράγοντα μεταγραφής Nrf2 ή γονιδίου-στόχου αίμης οξυγενάσης-1 της (ΗΟ-1) χρησιμοποιήθηκαν για να μελετηθεί η ρύθμιση των ΤΡ και τα ευρήματα από την προ-κλινικά μοντέλα σχετίζονταν με δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από κλινικά δείγματα NSCLC. Η υπερέκφραση του Nrf2 ή ΗΟ-1 είχε σαν αποτέλεσμα προς τα πάνω ρύθμιση του ΤΡ σε κύτταρα ΝΟΙ-Η292, ένα αποτέλεσμα μιμήθηκε με κατεργασία με ένα αντιοξειδωτικό Ν-ακετυλοκυστεΐνη και μερικώς αντιστράφηκε από ΗΟ-1 knockdown. Η υπερέκφραση του TP εξασθενημένο πολλαπλασιασμό κυττάρου και μετανάστευση

in vitro

, αλλά ταυτόχρονα ενισχύεται αγγειογενετική δυναμικό των καρκινικών κυττάρων συμπληρωμένου με θυμιδίνη. Το τελευταίο παρατηρήθηκε επίσης για SK-MES-1 καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων και κυττάρων καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου NCI-Η460. TP-υπερεκφράζουν ΝΟΙ-Η292 όγκους

in vivo

εμφάνισαν καλύτερη οξυγόνωση και υψηλότερη έκφραση της IL-8, IL-1β και IL-6. TP υπερέκφραση σε ενδοθηλιακά κύτταρα επαυξημένης αγγειογενετικές ιδιότητες τους, η οποία συνδέθηκε με αυξημένη παραγωγή του ΗΟ-1 και του VEGF. Συσχέτιση TP με την έκφραση της ΗΟ-1 και φλεγμονώδεις κυτοκίνες επιβεβαιώθηκε σε κλινικά δείγματα του NSCLC. . Συνολικά, η αυξημένη έκφραση της IL-1β και IL-6 μαζί με προ-αγγειογόνος επιδράσεις της TP-εκφράζουν NSCLC στο ενδοθήλιο μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη του όγκου, υποδηλώνοντας ΤΡ ως στόχος για την αντιαγγειογένεση σε NSCLC

Παράθεση: Tertil M , Skrzypek Κ, Florczyk U, Weglarczyk Κ, ήταν Η, Collet G, et al. (2014) Ο κανονισμός και η νέα δράση φωσφορυλάσης θυμιδίνης σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα: Διαφωνία με Nrf2 και ΗΟ-1. PLoS ONE 9 (5): e97070. doi: 10.1371 /journal.pone.0097070

Επιμέλεια: Soumitro Pal, Νοσοκομείο Παίδων της Βοστόνης & amp? Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28, Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 14 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: May 12, 2014

Copyright: © 2014 Tertil et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από οι επιχορηγήσεις αριθ 311 /N-COST /2008/0, 347 /N-INCA /2008/0 και N N301 314.837 από το Εθνικό Κέντρο Επιστημών (NCN). Αλίσια Jozkowicz ήταν μια διεθνής Senior Research Fellow από το Wellcome Trust. Μ Tertil και Κ Skrzypek υποστηρίχθηκαν από Conseil Περιφερειακής du Centre, μισθό για συν-φροντιστήριο διδακτορικής διατριβής. Το Τμήμα Βιοχημείας, Βιοφυσικής και Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Jagiellonian είναι δικαιούχος των διαρθρωτικών κονδυλίων από την Ευρωπαϊκή Ένωση και το πολωνικό Υπουργείο Επιστημών και Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης (χορηγεί αριθ: POIG.02.01.00-12-064 /08, 02.02. 00-00-014 /08, 01.01.02-00-109 /09 και 01.01.02-00-069 /09). Η έρευνα που διεξάγεται στο πεδίο της MiR-TANGO Διεθνές Associated Εργαστήριο (LIA). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή όγκοι

πνεύμονα κατατάσσονται ως η κορυφαία αιτία θανάτων από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο, με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) είναι η πιο διαδεδομένη. Οι ασθενείς με ΜΜΚΠ συχνά διαγιγνώσκονται με προχωρημένη νόσο, όταν συστηματική χημειοθεραπεία είναι η κύρια θεραπευτική επιλογή. Από την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση εξαρτώνται από την αγγειογένεση, οι μηχανισμοί που διέπουν τον σχηματισμό νέων αιμοφόρων αγγείων έχουν στόχο για παρέμβαση στον καρκίνο του πνεύμονα [1]. Ωστόσο, η προσθήκη του αντι-VEGF παράγοντες στη συμβατική χημειοθεραπεία οδήγησε μόνο σε ελαφρά βελτίωση της μέσης επιβίωσης [1], [2] με τους ασθενείς που βιώνουν υποτροπή του όγκου λόγω της εμφάνισης αντίστασης στα φάρμακα να αντιαγγειογενετικές παράγοντες, υπογραμμίζοντας την επείγουσα ανάγκη για νέους στόχους για συνδυαστική θεραπείες.

η φωσφορυλάση θυμιδίνης (TP, EC2.4.2.4) είναι πυριμιδίνη διάσωσης ένζυμο οδό σύνθεσης, η οποία είναι επίσης γνωστή για προ-αγγειογόνος ιδιότητες. TP καταλύει αναστρέψιμη φωσφορόλυσης θυμιδίνης σε θυμίνη και 2-δεοξυ-D-ριβόζη-1-φωσφορικό άλας (DRP), το οποίο περαιτέρω αποφωσφορυλιώνεται σε 2-δεοξυ-D-ριβόζη (DR). Το ένζυμο και τα προϊόντα ζάχαρης διεγείρουν μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και το σχηματισμό του σωλήνα

in vitro

και την ενίσχυση της αγγειογένεσης σε διάφορα μοντέλα

in vivo

[3]. TP συχνά υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους όγκους, συμπεριλαμβανομένου του NSCLC [3], [4], και έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με υψηλότερη πυκνότητα μικροαγγείων, πιο προχωρημένο στάδιο του όγκου, τη μετάσταση και φτωχή πρόγνωση [3]. Προ-αγγειογόνος δράση του ΤΡ σε όγκους, εκτός από την άμεση δράση των προϊόντων της επί των ενδοθηλιακών κυττάρων, μπορεί επίσης να περιλαμβάνει τη διέγερση της έκφρασης άλλων αγγειογόνων παραγόντων, όπως ο VEGF, ιντερλευκίνη-8 (IL-8) ή αίμης οξυγενάσης-1 (ΗΟ- 1) [5], [6]. Κατά συνέπεια, η ΤΡ στόχευσης με αναστολείς μικρού μορίου επί του παρόντος διερευνάται ως νέου αντιαγγειογενετική στρατηγική [7]. Παρ ‘όλα αυτά, για την ανάπτυξη αποτελεσματικών συνδυαστικών χημειοθεραπευτικών, διατηρώντας την ενζυματική δραστηριότητα του TP μπορεί να είναι απαραίτητη, δεδομένου ότι καταλύει ένα σημαντικό βήμα για την ενεργοποίηση των παραγόντων βασισμένη σε φθοριοπυριμιδίνη όπως καπεσιταβίνη, το οποίο έχει προταθεί ως εναλλακτική θεραπεία για προχωρημένο NSCLC [8]. Αυτή η διπλή λειτουργία του ΤΡ στην ανάπτυξη και θεραπεία όγκου συνεπάγεται ότι αναστολή protumoral επιδράσεις του ενζύμου μπορεί να απαιτήσει τη στόχευση κατάντη μεσολαβητών της. Η διαλεύκανση των μηχανισμών ρύθμισης και δράσεων προαγωγής του καρκίνου της TP εκ τούτου, είναι ζωτικής σημασίας.

Nrf2 (πυρηνικού παράγοντα (ερυθροειδή προερχόμενο 2) -όπως 2) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την κυτταρική αντιοξειδωτικές αντιδράσεις [9]. Είναι συχνά ουσιαστικά δραστική σε όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, και μπορεί να προκληθεί περαιτέρω με αντικαρκινικές θεραπείες. Οδηγεί έκφραση γονιδίων κυτταροπροστατευτικών οδηγεί στην ανάπτυξη αντοχής σε κυτταροτοξικών παραγόντων [10]. Ένας από τους στόχους Nrf2 είναι ΗΟ-1, η οποία μετατρέπει αίμης σε CO, δισθενούς σιδήρου και μπιλιβερδίνη, και η οποία έχει αποδειχθεί ότι μεσολαβεί Nrf2 με γνώμονα την αντίσταση των κυττάρων NSCLC σε χημειοθεραπεία [11], [12]. Είναι ενδιαφέρον ότι, και οι δύο πρωτεΐνες παίζουν ρόλους στην προαγωγή της αγγειογένεσης: η δράση του ΗΟ-1 ανάντη και κατάντη αγγειογόνο VEGF και SDF1α είναι καλά εδραιωμένη [13], και η συμμετοχή των Nrf2 στη ρύθμιση της αγγειογόνου IL-8 έχει αποδειχθεί [14] – [16].

Εδώ έχουμε ερευνήσει το βιολογικό ρόλο του ΤΡ με επίκεντρο την αγγειογένεση και την αλληλεπίδραση με Nrf2 και ΗΟ-1 σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν τα αποτελέσματα της TP υπερέκφραση σε κύτταρα NSCLC

in vitro

και

in vivo

και να τονίσει τη σημασία της προ-αγγειογόνος δράση του ενζύμου.

Υλικά και Μέθοδοι

πλασμίδια και φορείς ιού

πλασμίδιο ρΒΚ-RSV-TP φιλοξενούν ανθρώπινου ΤΡ cDNA παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. S. Liekens (Rega Ινστιτούτο Ιατρικής Έρευνας, KU Leuven, Βέλγιο). Πλασμίδιο pEF (Μπλε) -Nrf2 περιέχει ανθρώπινη Nrf2 cDNA ήταν ευγενικά προικισμένος από τον Δρ Ι.Α. Johnson (Τμήμα Φαρμακευτικής Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Wisconsin-Madison, USA) [17]. Κατασκευή ρετροϊικών φορέων (RVs) RV-TP και RV-Nrf2 διεξήχθη όπως περιγράφεται στο συμπληρωματικές μέθοδοι (S1 File). Ρετροϊική πλασμίδιο pMSCV-Luc που περιέχει λουσιφεράση κασέτα έκφρασης για την παραγωγή του RV-Luc ελήφθη από Addgene. Όλα RVs συμπεριλαμβανομένου ενός ελέγχου RV-κενό φορέα (LNCX2) παρήχθησαν όπως περιγράφεται στο [18].

Οι αδενοϊικοί φορείς (Advs) που φιλοξενούν ΤΡ cDNA (AdTP) αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται στο συμπληρωματικές μέθοδοι (S1 File) και φορείς ελέγχου με GFP (AdGFP), όπως έχει ήδη αναφερθεί [16]

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό τους όρους

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου NSCLC:. NCI-Η292 (βλεννοεπιδερμοειδής καρκίνωμα, που αγοράζονται από την ATCC), Α549 ( αδενοκαρκίνωμα, το οποίο λαμβάνεται από τον καθηγητή Γιακούμπ Golab, Βαρσοβία Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Βαρσοβία, Πολωνία) και ΝΟΙ-Η460 (μεγάλο καρκίνωμα, που αγοράζονται από την ATCC) καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (ΠΑΑ) και SK-MES-1 (καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, αγόρασε από την ATCC) καλλιεργήθηκε σε ΜΕΜ (Gibco), το καθένα συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (ΡΑΑ) και πενικιλλίνη (100 U /mL) /στρεπτομυκίνη (10 μg /mL) (Sigma) (pen /strep). Ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HMEC-1, που λαμβάνεται από τον Dr Francis Candal, Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων, Ατλάντα, USA) καλλιεργήθηκαν σε MCDB 131 συμπληρωμένο με 10% FBS, L-γλουταμίνη 2 mM, πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, EGF 10 ng /mL και υδροκορτιζόνη 1 mg /mL. Πρωτογενή ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC) απομονώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19] και καλλιεργήθηκαν σε Μ199 (ΡΑΑ) συμπληρωμένο με 20% FBS, pen /strep και ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων συμπλήρωμα ECGS 30 mg /L (Millipore).

Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας: 37 ° C, 5% CO

2, 95% υγρασία. Για τη διερεύνηση των επιδράσεων των κυττάρων υποξίας τοποθετήθηκαν για 24 ή 48 ώρες σε ένα θάλαμο (Biospherix USA) υπό ελεγχόμενη ατμόσφαιρα αερίου 1% O

2, 5% CO

2 και 94% Ν

2 τοποθετήθηκαν στους 37 ° C σε επωαστή καλλιέργειας κυττάρων.

Για δημιουργία κυτταρικών σειρών ΝΟΙ-Η292-Luc-TP (NCI-TP) και ΝΟΙ-Η292-Luc-Nrf2 (NCI-Nrf2) που υπερεκφράζουν σταθερά λουσιφεράση και των αντίστοιχων διαγονιδίων και ελέγχου ΝΟΙ-Η292-Luc-EV (NCI-EV) τροποποιημένο με άδειο φορέα, τα κύτταρα μεταδιεγείρονται με φορείς ρετροϊών. Πρώτον, μια μόλυνση με RV-διαγονίδιο ή RV-κενό φορέα (RV-EV) πραγματοποιήθηκε και σταθερώς μετασχηματισμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με γενετικίνη (1 mg /mL), που ακολουθήθηκε από μεταγωγή με RV-Luc και επιλογή με υγρομυκίνη (0,3 mg /mL). NCI-H292-Luc-ΗΟ-1 (NCI-HO1) κυτταρική γραμμή αναπτύχθηκε και επικυρωθεί νωρίτερα στο εργαστήριο μας [20]. Για τη συντήρηση των κυττάρων έκφρασης διαγονιδίου ρουτίνας φυλάσσονται σε πρότυπο μέσο επιπροσθέτως συμπληρωμένο με γενετικίνη (0,5 mg /mL) και υγρομυκίνη (0.1 mg /mL). Για τα πειράματα τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο χωρίς αντιβιοτικά.

Παροδική TP υπερέκφραση και διέγερση των κυττάρων με NAC ή TP υπόστρωμα

θυμιδίνης (THD) και Ν-ακετυλοκυστεϊνη (NAC) αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich . Για την παροδική υπερέκφραση ΤΡ σε ECs, HMEC-1 και HUVEC κύτταρα σε μεταγωγή με αδενοϊικούς φορείς AdTP ή AdGFP ελέγχου σε ΜΟΙ = 10 για 24 ώρες και στη συνέχεια διεγείρονται με Thd για επιπρόσθετες 24 ώρες σε πλήρες μέσο. Για την παροδική υπερέκφραση ΤΡ σε κύτταρα NSCLC, SK-MES-1 και NCI-Η460 υπέστησαν μεταγωγή σε ΜΟΙ = 20 και ΜΟΙ = 40, αντίστοιχα, και διεγέρθηκαν με 1 mM Thd σε μέσο συμπληρωμένο με 2% FBS 48 ώρες μετά την μεταγωγή.

επίπεδα σε πραγματικό χρόνο RT PCR

mRNA των γονιδίων προσδιορίστηκαν με ποσοτική RT PCR. RNA απομονώθηκε είτε με Qiazol (Qiagen) ή χρησιμοποιώντας RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 1 μα RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας oligo-dT εκκινητές με RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Real-time PCR χρησιμοποιώντας 30 ng του δείγματος με QuantiTect SYBR Green (Qiagen, ανάλυση

in vitro

πειράματα) ή SYBR Προμίγμα Ex Taq II (Takara, ανάλυση

in vivo πειράματα

) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σχετικά με LightCycler σύστημα 480 II (Roche). Η γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκε σύμφωνα με ΔCt ή ΔΔCt μεθόδους με EF2 ως ένα γονίδιο αναφοράς, με γραμμές σφάλματος υπολογίζεται ως τυπικές αποκλίσεις των μέσων, διαιρούμενο με √ (N-1), όπου Ν είναι ο αριθμός των ανεξάρτητων πειραμάτων. διάδοσης των σφαλμάτων δεν ελήφθη υπόψη, ποια είναι μερικά περιορισμός της μελέτης μας.

ανάλυση

Western blot και ELISA

κηλίδα Western για ΗΟ-1 πραγματοποιήθηκε όπως στο [19]. Για την ανίχνευση του ανθρώπινου ΤΡ ποντικού mAb Ρ-GF.44C (Calbiochem) χρησιμοποιήθηκε. Παραγωγή ανθρώπινου VEGF και IL-8 σε μέσα καλλιέργειας και τα ανθρώπινα IL-8, IL-1β και IL-6 σε προϊόντα λύσης του όγκου προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας Duoset Kits ELISA (R &? D) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης στα δείγματα μετρήθηκε με BCA μέθοδο. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με αραιώσεις προ-δοκιμασίας προϊόντων λύσης όγκου προς μια ίση συγκέντρωση 1 mg /mL.

προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς για την μέτρηση της μεταγραφικής δραστικότητας Nrf2

Δοκιμασία διεξήχθη όπως έχει ήδη περιγραφεί στο [ ,,,0],15].

γονιδιακή σίγηση πείραμα

τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ siRNA (Stealth RNAi ΗΟ-1 siRNA και ελέγχουν Stealth RNAi Αρνητικός μάρτυρας siRNA, Invitrogen) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και μετανάστευση

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με χρωματομετρική δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU (Κυτταρικού πολλαπλασιασμού ELISA, Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Προκειμένου να διερευνηθεί η μετανάστευση των κυττάρων, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρη συρροή και τον ορό επί 24 ώρες για να εμποδίσει τον πολλαπλασιασμό. Scratch έγινε με μονοστιβάδα με ένα ρύγχος πιπέτας. Η μετανάστευση ακολούθησε χρονικού διαστήματος μικροσκόπιο (Zeiss Axiovert 200 Μ) για 6-8 διαφορετικά πεδία για κάθε κατάσταση. Σημαίνει στεγασμένο χώρο υπολογίστηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία και εκφράζεται ως το ποσοστό της περιοχής μηδέν στο χρόνο μηδέν, χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

δοκιμασίες αγγειογένεση

in vitro

Η δοκιμασία

σχηματισμό του μετρό την Matrigel πραγματοποιήθηκε όπως έχει ήδη περιγραφεί [21]. κύτταρα NSCLC επωάστηκαν σε θρεπτικό μέσο που περιείχε 2% FBS σε νορμοξία και υποξία για 48 ώρες, το ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε και αναμίχθηκε σε 1:01 ο /ο με MCDB 131 συμπληρωμένο με 2% FBS και αντιβιοτικά χωρίς άλλα πρόσθετα για διέγερση του HMEC-1 ή HUVEC. Σφαιροειδές δοκιμασία σε κύτταρα HUVEC διεξήχθη όπως στο παρελθόν [19].

Τα πειράματα σε ζώα

δήλωση Δεοντολογίας.

Όλα τα ζώα αντιμετωπίζονται αυστηρά σύμφωνα με τις ορθές πρακτικές των ζώων και όλων των ζωικών το έργο εγκρίθηκε από την (national de réflexion éthique sur l’πειραματισμό animale Comité πανεπιστημιούπολη) CNRS d’Orléans Επιτροπής Δεοντολογίας CNREEA 03 στη Γαλλία.

6 εβδομάδων θηλυκούς αθυμικούς ελβετικά γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από την Charles River ( Γαλλία). Για δημιουργία NCI-TP και ελέγχου ΝΟΙ-EV ξενομοσχευμάτων όγκου, εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας Διάλυμα Διαχωρισμού Κυττάρου (Sigma) και επαναιωρήθηκαν σε PBS. 5 × 10

6 κύτταρα σε 100 μλ εγχύθηκαν υποδόρια στο δεξί πόδι του κάθε ποντικού (10 ζώα /κυτταρική σειρά). Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε για 5 εβδομάδες με μετρήσεις πάχους, ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο

V

=

D

×

d

2 χ 0,5 (

V

είναι ο όγκος του όγκου,

d

είναι η μεγαλύτερη διάσταση?.

δ

είναι η μικρότερη διάσταση)

η μέτρηση της οξυγόνωσης του όγκου

η οξυγόνωση του ιστού του όγκου μετρήθηκε με σύστημα αισθητήρων OxyLite βασίζεται σε απόσβεση φθορισμού ρουθήνιο από O

2 (Oxford Optronix).

Ανάλυση του κλινικού υλικού

δήλωση Δεοντολογίας.

μελέτες ανθρώπινου εγκρίθηκαν από την Τοπική Επιτροπή Ηθικής του Collegium Medicum του Πανεπιστημίου Jagiellonian στην Κρακοβία, Πολωνία. Οι ασθενείς που έχουν εκφράσει την έγγραφη συγκατάθεσή τους για τη συμμετοχή στη μελέτη.

Οι βιοψίες των πρωτογενών όγκων και μεταστάσεων όγκων στους λεμφαδένες (αν υπάρχει) συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης από 24 ασθενείς που έπασχαν από αδενοκαρκίνωμα NSCLC. Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία στην Κλινική Χειρουργικής Θώρακος, Jagiellonian University Medical College, 31-202 Κρακοβία, Πολωνία.

Η στατιστική ανάλυση

Εκτός αν ορίζεται διαφορετικά, τα αποτελέσματα δείχνουν μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητες πειράματα που εκτελέστηκαν εις διπλούν. t-τεστ αταίριαστο του Student χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί κατά πόσον τα μέσα της δύο ομάδες διέφεραν σημαντικά. Για τη σύγκριση των πολλαπλών ομάδων χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ANOVA ανάλυση με Tukey post-test. Διαφορές με τιμή p & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

TP είναι διαφορικά εκφρασμένο σε κύτταρα NSCLC με διαφορετικά επίπεδα Nrf2 και αίμης οξυγενάσης-1

έκφραση διερευνήθηκε ΤΡ σε NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549 και ΝΟΙ-Η292 που προέρχονται από διαφορετικά ιστολογικών τύπων όγκων – αδενοκαρκίνωμα και καρκίνωμα βλεννοεπιδερμοειδής, αντίστοιχα. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι αδενοκαρκινώματος Α549 οθόνες υψηλής βασική έκφραση του ΤΡ, ενώ το επίπεδο του ενζύμου είναι πολύ χαμηλό σε ΝΟΙ-Η292 (Εικ. 1Α). Δεδομένου ότι οι δύο κυτταρικές σειρές που είναι γνωστό ότι διαφέρουν σε δραστικότητα του παράγοντα μεταγραφής Nrf2 και γονιδίου-στόχου του ΗΟ-1, και τα δύο εκφρασμένα σε υψηλότερο επίπεδο στο Α549 από ό, τι σε ΝΟΙ-Η292 ([22], Το σχ. 1Α, Β), ερευνήσαμε εάν ο άξονας Nrf2 /ΗΟ-1 θα μπορούσε να εμπλέκεται στην ρύθμιση της ΤΡ. Πράγματι, όταν Nrf2 και ΗΟ-1 ανεξάρτητα σταθερώς υπερεκφράζεται σε κύτταρα ΝΟΙ-Η292 (Εικ. S1 Α, [20]), τα οποία έχουν χαμηλή βασική Nrf2 και ΗΟ-1, η επαγωγή της ΤΡ παρατηρήθηκε τόσο στην NCI-Nrf2 και NCI -HO1 κύτταρα (Σχ 1C & amp?. D, αντίστοιχα). Αυτό το πρότυπο έκφρασης επιβεβαιώθηκε επίσης

in vivo

στον υποδόριο ΗΟ-1-υπερεκφράζουν ξενομόσχευμα όγκων που προέρχονται από τα κύτταρα NCI-HO1 σε άτριχα ποντίκια (Εικ. 1 Ε).

Α. Βασικοκυτταρικό TP, Nrf2 και τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΗΟ-1 σε Α549 και NCI-H292 NSCLC κυτταρικές σειρές που δείχνει πιθανή συσχέτιση της έκφρασης TP με Nrf2 /ΗΟ-1 άξονα. B. Basal Nrf2 μεταγραφική δραστικότητα σε κυτταρικές γραμμές NSCLC μετρήθηκε με προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς χρησιμοποιώντας πλασμίδιο που φιλοξενεί το γονίδιο της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο του αντιοξειδωτικού στοιχείου απόκρισης (ARE) (η = 3, * ρ & lt? 0,05 ΝΟΙ-Η292

vs

Α549 ). CD. Αυξημένη TP mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-Η292 που υπερεκφράζουν σταθερά Nrf2 ή ΗΟ-1 (η = 4, * ρ & lt? 0,05 ελέγχου κενού φορέα (EV)

vs

διαγονιδίου υπερέκφρασης) Ε ΤΡ mRNA (αριστερά ) και η έκφραση της πρωτεΐνης (δεξιά, πυκνομετρική ανάλυση WB στο κάτω πάνελ)

in vivo

τον έλεγχο και ΗΟ-1-υπερεκφράζουν ξενομοσχευμάτων NCI-Η292 (ιδρύθηκε, όπως περιγράφεται στο [20]) επιβεβαιώνει το

στο vitro

δεδομένων (n = 5, * ρ & lt? 0,05 NCI-HO1

vs

NCI-EV)

η

Nrf2 δεσμευτικές θέσεις εντός του υποκινητή TP δεν έχουν εντοπιστεί. (ανάλυση δεν φαίνεται) υποδηλώνει ότι ο κανονισμός είναι έμμεση. Από ΗΟ-1 είναι ένας γνωστός στόχος της Nrf2 και ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κύτταρα NCI-Nrf2 (Εικ. S1B), μπορούμε δίπλα προσπάθησε να προσδιορίσει αν η επίδραση της Nrf2 ήταν ΗΟ-1-εξαρτώμενη. κύτταρα NCI-Nrf2 επιμολύνθηκαν με siRNA έναντι ΗΟ-1 (Σχ. S2), που οδήγησε σε μερική μειορρύθμιση της έκφρασης TP τόσο Nrf2 υπερεκφράζουν κύτταρα και κύτταρα ελέγχου μεταχθέντα με κενό φορέα (NCI-EV) (Εικ. 2Α) , υπονοώντας ότι ΗΟ-1 παίζει ένα ρόλο στην ρύθμιση της ΤΡ σε NSCLC, ακόμη συμμετοχή της στην επίδραση του Nrf2 είναι ήσσονος σημασίας. Επιπλέον, η θεραπεία των κυττάρων NCI-EV με ένα αντιοξειδωτικό Ν-ακετυλοκυστεΐνη οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη προς τα πάνω ρύθμιση του ΤΡ (Εικ. 2Β), μιμούμενη τη ρύθμιση του ενζύμου με Nrf2 /ΗΟ-1 υπερέκφραση. Δεδομένου ότι η διέγερση των κυττάρων ελέγχου με τα προϊόντα ΗΟ-1 απέτυχε να αναπαράγει το προς τα πάνω ρύθμιση του ΤΡ που βρέθηκαν σε ΗΟ-1 κύτταρα που υπερεκφράζουν (Εικ. S3), η επίδραση του Nrf2 /ΗΟ-1 θα μπορούσε να αποδοθεί στην εξασθένηση του οξειδωτικού στρες, όπως έχουν ήδη δείξει ότι τα κύτταρα NCI-HO1 έχουν χαμηλότερο επίπεδο των δραστικών μορφών οξυγόνου [20].

Α. ΗΟ-1 και ΤΡ mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε κύτταρα ΝΟΙ-Η292 με ΗΟ-1 knockdown. κύτταρα ελέγχου NCI-Nrf2 και ΝΟΙ-EV επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ siRNA έναντι ΗΟ-1 (siHO1) ή ελέγχου κωδικοποιημένο αλληλουχία (siSCR) για 72 ώρες που οδηγεί σε μειορύθμιση της έκφρασης TP εξής ΗΟ-1 σίγηση. (N = 4, * ρ & lt? 0,05 NCI-Nrf2

vs

NCI-EV, # p & lt? 0,05 siHO1

vs

siSCR). B. Επίδραση των αντιοξειδωτικών Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) στην έκφραση ΤΡ. κύτταρα NCI-EV διεγέρθηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του NAC για 24 ώρες με αποτέλεσμα μια δοσο-εξαρτώμενη αυξητική ρύθμιση του ΤΡ. (N = 3, * ρ & lt? 0,05 ελέγχου

vs

διέγερση).

Η

TP υπερέκφραση μειώνει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων ΝΟΙ-Η292, αλλά ενισχύει την αγγειογενετική δυναμικό των κυτταρικών σειρών NSCLC

in vitro

Η

στη συνέχεια, έχουμε ως στόχο να ερευνήσει τις άμεσες επιδράσεις της ίδιας της TP για τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων ΝΟΙ-Η292. Μια σταθερή γραμμή κυττάρων που υπερεκφράζουν τόσο λουσιφεράσης και TP (NCI-TP) ιδρύθηκε από ρετροϊική μεταγωγή και επικυρωθεί για την έκφραση TP (Εικ. 3Α). Απροσδόκητα, πολλαπλασιασμό κυττάρων NCI-TP ανεστάλη (Σχήμα 3Β). δοκιμασία ξυστό έδειξε ότι τα μεταναστευτικά δυναμικό των κυττάρων NCI-TP επίσης εξασθενημένος (Σχ 3C, File S2 & amp?. S3). Προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων mRNA των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-2 παρατηρήθηκε επίσης (Σχ. S4) που θα μπορούσαν να επηρεάσουν αρνητικά δυνητικά ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων ΝΟΙ-Η292

in vivo

.

Ένα. Επικύρωση του μοντέλου – ρύθμιση προς τα άνω του TP mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η292 που υπερεκφράζουν σταθερά TP, καθορίστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι (n = 3). B. Σχετική βασικούς ρυθμούς πολλαπλασιασμού των ΝΟΙ-EV και ΤΡ-κύτταρα που υπερεκφράζουν μετρήθηκε με ενσωμάτωση βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU) (n = 4). Γ Βασικό ποσοστά μετανάστευσης των κυττάρων NCI-EV και NCI-TP προσδιορίζεται με δοκιμασία μηδέν (n = 4) (κλίμακα bar – 200 μm) * p & lt? 0,05 NCI-TP vs NCI-EV

Η

Δεδομένου ότι το σημαντικό ρόλο της ΤΡ στην ανάπτυξη όγκου πιστεύεται ότι σχετίζεται μάλλον με προ-αγγειογόνος ιδιότητες [23], από την επόμενη επικεντρώθηκε στην αποσαφήνιση του ρόλου των TP στη ρύθμιση της αγγειογένεσης στο μοντέλο μας NCSLC. Κάτω από κανονικές συνθήκες καμία επίδραση της υπερέκφρασης ΤΡ /ΤΡ προϊόντα για αγγειογόνων δυναμικό των καρκινικών κυττάρων μπορούσε να παρατηρηθεί (Εικ. S5). Παρ ‘όλα αυτά, η κύρια σκανδάλη αγγειογενετικών διακόπτη

in vivo

είναι στέρηση οξυγόνου. Ως εκ τούτου, για να μιμηθεί καλύτερα το περιβάλλον του αυξανόμενου όγκου, τοποθετήσαμε τα κύτταρα υπό υποξίας και τους έδωσε την θυμιδίνη, η οποία μπορεί να απελευθερωθεί από το νεκρωτικό πυρήνα του όγκου. Ενώ τα ανασταλτικά αποτελέσματα της TP υπερέκφρασης στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων NSCLC δεν επηρεάστηκαν είτε υποξία ή /και θυμιδίνης (Σχ. S6), αλλοιωμένη συνθήκες αποκάλυψε ενισχυμένη αγγειογενετική δυναμικό των κυττάρων NCI-TP, όπως αποδεικνύεται με τη δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα Matrigel με κατάλληλα προετοιμασμένο μέσα (Σχ. 4Α). Συνδέθηκε με την προς τα πάνω ρύθμιση του IL-8 παραγωγή πρωτεϊνών από τα κύτταρα όγκου (Εικ. 4Β) και την επαγωγή της ΗΟ-1 (Σχ. 4C) που θα μπορούσαν να είναι ενδεικτικά αυξημένων οξειδωτικού στρες σε TP-υπερεκφράζουν κύτταρα, τα οποία είναι συνεπής με τα ευρήματα από τους άλλους τύπους όγκων [5]. Σημαντικά, TP-κύτταρα που υπερεκφράζουν εμφάνισαν ενισχυμένη αγγειογόνο δυναμικό παρουσία θυμιδίνης επίσης υπό νορμοξικές συνθήκες (Εικ. S7).

A. Αυξημένη αγγειογενετική δυναμικό των ΤΡ υπερεκφράζουν κυττάρων σε υποξία παρουσία θυμιδίνης. ΝΟΙ-Η292 κύτταρα διεγέρθηκαν με 1 mM Thd για 48 ώρες κάτω από 1% οξυγόνο και ρυθμισμένα μέσα εφαρμόστηκαν επί HMEC-1 κύτταρα εμβολιάζονται σε Matrigel. Ο αριθμός των branchpoints σχηματίζονται από HMEC-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ρυθμισμένα μέσα από είτε κενός-φορέα μεταδιηγερμένα κύτταρα ΝΟΙ-Η292 (NCI-EV) ή ΤΡ-μεταχθέντα (NCI-ΤΡ) έχει υπολογιστεί (κλίμακα bar – 200 μm) (n = 3). B. παραγωγή αγγειογόνων παραγόντων σε TP-κύτταρα που υπερεκφράζουν ΝΟΙ-Η292 υπό υποξία σε παρουσία 1 mM Thd για 24 ώρες ποσοτικά με ELISA ανίχνευσης προς τα πάνω ρύθμιση της IL-8 σε κυτταρική γραμμή NCI-TP (n = 4). C. Αυξημένη ΗΟ-1 mRNA (αριστερά) και πρωτεΐνη (δεξιά) σε κύτταρα ΤΡ-υπερεκφράζουν σε παρουσία 1 mM Thd σε υποξία μετά από 24 h (n = 3). * P & lt? 0,05 NCI-TP vs NCI-EV. D-I. Ενισχυμένη αγγειογενετική δυναμικό του πλακώδους καρκινώματος πνεύμονα SK-MES-1 και μεγάλα κύτταρα καρκινώματος ΝΟΙ-Η460 μετά από παροδική υπερέκφραση ΤΡ. SK-MES-1 (D-F, η = 3) και ΝΟΙ-Η460 (G-I, n = 4) κύτταρα μετάγονται με AdTP ή AdGFP ελέγχου για 48 ώρες, διεγέρθηκαν με 1 mM Thd για επιπλέον 48 ώρες υπό 1 % οξυγόνο (D-Ε & amp? G-Η) ή νορμοξία (F & amp? Ι). Ρυθμισμένα μέσα χρησιμοποιήθηκαν σε Matrigel δοκιμασία σε κύτταρα HUVEC (D & amp? G) και μέτρηση της παραγωγής IL-8 (Ε & amp? Η) και ΗΟ-1 έκφραση αναλύθηκε σε κυτταρολύματα (F & amp? Ι). * P & lt? 0,05 AdTP vs AdGFP

Η

επόμενο διερευνηθεί αν TP ρυθμίζει την αγγειογενετική δυναμικό των καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από άλλες ιστολογικών τύπων NSCLC, δηλαδή πλακώδες καρκίνωμα SK-MES-1 κυτταρική γραμμή και NCI-Η460 μεγάλες καρκίνωμα. Ρυθμισμένα μέσα που συλλέγονται από υποξικά κύτταρα παροδικά υπερεκφράζουν TP εξής αδενοϊικού μεταγωγή φορέα και διέγερση με Thd προκαλείται ενισχυμένη διακλάδωση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο AdGFP-μεταδιηγερμένα κύτταρα για τους δύο τύπους κυττάρων (Σχ. 4D, G), η οποία συνοδεύτηκε από αυξημένη παραγωγή IL-8 από SK-MES-1 κύτταρα (Σχ. 4Ε). Επαγωγή της ΗΟ-1 από ΤΡ παρατηρήθηκε υπό ορθοξικές συνθήκες (Σχ. 4F, Ι).

TP ρυθμίζει την έκφραση φλεγμονωδών κυτοκινών

in vivo

Η

Για να προσδιορίσετε πώς το συγκρότημα επιδράσεις της υπερέκφρασης TP στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και αγγειογόνων δυναμικό των ΝΟΙ-Η292 κυττάρων παρατηρήθηκε

in vitro

θα επηρεάσει την ανάπτυξη όγκου

in vivo

, τα καρκινικά κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς και η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε για 5 εβδομάδες. TP υπερέκφραση έτειναν να επιταχύνει την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων NSCLC (Σχήμα 5Α.) (P & lt? 0.1 NCI-TP

vs

NCI-EV σε 4 και 5 εβδομάδες). Επιπλέον, NCI-TP όγκων έδειξε μια ασήμαντη τάση (p = 0,2) για την ενισχυμένη εισβολή του όγκου-αποστράγγιση των λεμφαδένων (εικ. S8). Όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετανάστευση είναι μειωμένη από TP υπερέκφραση (Σχ. 3Β-C), εμείς τεκμαίρεται τις διαφορές στις αγγειογόνες ιδιότητες. Πράγματι, η μέτρηση της οξυγόνωσης όγκου διεξήχθησαν στο τέλος του πειράματος έδειξαν ότι NCI-ΤΡ όγκους ήταν σημαντικά καλύτερα οξυγονωμένο από τους όγκους που προέρχονται από τα κύτταρα ελέγχου, η οποία συνέπεσε με την αύξηση της παραγωγής του hIL-8 στο πρώην όγκους (Σχ. 5Β, C) . Είναι σημαντικό ότι, σε προηγούμενες ερευνητικές μας χρησιμοποιώντας τα ξενομοσχεύματα ΝΟΙ-Η292 έχουμε δείξει ότι η ενισχυμένη οξυγόνωση του όγκου επιβεβαιώνει αυξημένη αγγείωση του όγκου σε αυτό το μοντέλο [20]. Παρ ‘όλα αυτά, αν και η υπερέκφραση ΤΡ επιβεβαιώθηκε να συγκρατείται σε ξενομοσχεύματα (Σχ. 5D, E), διαφορές στα επίπεδα είτε ΗΟ-1 ή άλλους αγγειογόνους παράγοντες θα μπορούσαν να ανιχνευθούν σε σύγκριση με όγκους ελέγχου (Εικ. 5D, Σχ. S9A -ΡΕ). Για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού που διέπουν τη δράση της TP υπερέκφραση σε NSCLC

in vivo

, προσδιορίσαμε την έκφραση των φλεγμονωδών κυτοκινών στους όγκους. Ανθρώπινη ιντερλευκίνη-1β και της ιντερλευκίνης-6 επίπεδα ήταν σημαντικά αυξημένα σε NCI-TP όγκους (Σχήμα 5F & amp?. G). Επίσης, η έκφραση του TNFα έτεινε να είναι υψηλότερη σε όγκους TP-υπερεκφράζουν, αλλά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Εικ. S9E).

Α. Μέτρηση του όγκου του όγκου με παχύμετρο. NCI-EV και ΝΟΙ-TP κύτταρα ξενο-μεταμόσχευσις σε γυμνούς ποντικούς όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. B. Μέτρηση της οξυγόνωσης του όγκου σε 5 εβδομάδες ανάπτυξης του όγκου (η = 7 για NCI-EV, η = 9 για NCI-ΤΡ). C-G. mRNA (αριστερά) και πρωτεΐνη (δεξιά) έκφραση της ανθρώπινης IL-8 (C), ΗΟ-1 (D), ΤΡ (D, E) και φλεγμονώδεις κυτοκίνες (F-G) σε ξενομοσχεύματος όγκους δείχνει προς τα πάνω ρύθμιση της έκκρισης της IL- 8, IL-1β και IL-6 σε ξενομοσχεύματα ΝΟΙ-TP (η = 5, * ρ & lt? 0,05 NCI-TP vs NCI-EV). H-J. mRNA έκφραση του ΤΡ (Η) και φλεγμονώδεις κυτοκίνες (Ι-Ι) σε βιοψίες από ανθρώπινα πρωτογενή και δευτερογενή αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα.

Η

Αλληλεπίδραση των TP, ΗΟ-1 και φλεγμονωδών κυτοκινών σε κλινικά δείγματα NSCLC

Θα πραγματοποιηθεί προκαταρκτική επικύρωση των ευρημάτων μας, χρησιμοποιώντας κλινικό υλικό των πρωτογενών όγκων και όγκων-διεισδύσει στους λεμφαδένες που συλλέγονται κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης από ασθενείς που πάσχουν από αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Ενώ δεν υπήρχαν διαφορές σε είτε TP, IL-1β ή IL-6 έκφραση μεταξύ των πρωτογενών και δευτερογενών όγκων δειγμάτων (Εικ.5 HJ), αξίζει να σημειωθεί ότι η βασική έκφραση του ΤΡ ήταν υψηλό σε σχέση με συστατική γονίδιο EF2 στον ιστό του όγκου (μέση τιμή TP /EF2 = 2.202), το οποίο είναι συγκρίσιμο με τα επίπεδα TP /EF2 που λήφθηκε στο TP-υπερεκφράζουν ξενομοσχεύματα μας (μέση τιμή TP /EF2 = 1.027, βλ. 5Ε). Οι σχετικές αναλογίες του γονιδίου /EF2 είναι επίσης παρόμοια για τις ιντερλευκίνες, η οποία δείχνει ότι το μοντέλο ξενομοσχεύματος μας παραλληλίζεται στενά κλινική κατάσταση. Βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ΗΟ-1 και εκφράσεις TP (Spearman Rank συσχέτισης, r = 0.556?

σ

= 0,028). Επιπλέον, μια σημαντική συσχέτιση του ΤΡ με IL-1β (R = 0.514,

σ

= 0,001) και IL-6 (R = 0.519,

σ

= 0,002) παρατηρήθηκε έτσι επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα μας από το ζωικό μοντέλο που δείχνει μια πιθανή νέα δράση του ΤΡ αυξορρύθμιση στο καρκίνωμα του πνεύμονα.

TP υπερέκφραση ενισχύει αγγειογενετική δυναμικό των ενδοθηλιακών κυττάρων

ιντερλευκίνης-1β αποδείχθηκε ότι επάγει την έκφραση ΤΡ σε πρωτογενείς μακροαγγειακές ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC [24]. Έχουμε αναπαραχθεί αυτό το αποτέλεσμα σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά μικροαγγειακά ενδοθηλιακά HMEC-1 (Σχ. 6Α), προτείνοντας ο κανονισμός ήταν κοινή για διαφορετικούς τύπους ενδοθηλιακών κυττάρων. Η παρατήρηση αυτή θέτει ένα ερώτημα αν TP-εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα άνω των φλεγμονωδών κυτοκινών σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε ενδεχομένως να συμβάλει στη διαμόρφωση της αγγειογένεσης των όγκων μέσω της διαφοροποίησης της TP στην ενδοθήλιο. Ως εκ τούτου, το επόμενο μελετήσαμε τα αποτελέσματα της TP υπερέκφραση σε EC. Εισαγωγή TP σε HUVEC ενισχυμένη τις ικανότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων για το σχηματισμό σωληναρίων δομές σαν σε Matrigel και αγγειογόνων βλάστησης σε γέλη κολλαγόνου (Εικ. 6Β, Γ). Αυτό συνοδεύτηκε από επαγωγή προ-αγγειογόνος ΗΟ-1 (Σχ. 6D, E), το οποίο περαιτέρω ενισχύεται σε κύτταρα HUVEC παρουσία περίσσειας υποστρώματος ΤΡ (Σχ. 6Ε). Σε HMEC-1 μοντέλο, μία ταυτόχρονη αύξηση στην παραγωγή VEGF παρατηρήθηκε μετά ΤΡ υπερέκφραση (Εικ 6F.), Ενώ καμία επίδραση θα μπορούσε να παρατηρηθεί για HUVEC (Σχήμα 6G.), Που δεν μπορούν να απελευθερώσουν VEGF [25] – [27]. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν μία νέα προ-αγγειογόνος δράση του ΤΡ εντός ECs, πιθανώς μέσω επαγωγής άλλων αγγειογόνων πρωτεϊνών. Ο μηχανισμός, ωστόσο, μπορεί να είναι αυστηρά ενδοθηλιακών κυττάρων τύπου ειδικών.

Α. Επίδραση της IL-1β στην έκφραση ΤΡ σε κύτταρα HMEC-1. Η διέγερση με 0,3 ng /ml ανθρώπινης ανασυνδυασμένης IL-1β για 24 ώρες οδήγησε σε προς τα πάνω ρύθμιση του ΤΡ σε ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs). (N = 3, * ρ & lt? 0,05 ελέγχου

vs

IL-1β). Π.Χ. ECs υπέστησαν μεταγωγή με αδενοϊικούς φορείς AdTP ή AdGFP ελέγχου σε ΜΟΙ = 10 για 48 ώρες όταν Matrigel δοκιμασία σε HUVEC παρουσία VEGF (50 ng /mL) (Β) και δοκιμασία σφαιροειδών σε HUVEC (VEGF 50 ng /mL) (C ) πραγματοποιήθηκε, υποδεικνύοντας αυξημένη αγγειογενετική δυναμικό των κυττάρων TP-υπερεκφράζουν (n = 3, * ρ & lt? 0,05 AdTP

vs

AdGFP, # p & lt? 0,05 ελέγχου

vs

VEGF) (γραμμή κλίμακας – 100 μm) D-G. 24 ώρες μετά την μεταγωγή με AdV ενδοθηλιακά κύτταρα διεγέρθηκαν με 1 mM Thd για επόμενες 24 ώρες. Ανάλυση της ΗΟ-1 έκφραση με ποσοτική PCR και στύπωμα western σε HMEC-1 (Δ) και σε HUVEC (Ε) δείχνει την επαγωγή της ΗΟ-1 σε TP-υπερεκφράζουν ECs, συνδέεται με αυξημένη έκφραση VEGF σε HMEC-1 (F), ενώ δεν υπάρχει καμία επίδραση σε HUVEC (G). (N = 4, * ρ & lt? 0,05 AdTP

vs

AdGFP, $ p & lt? 0,05 ελέγχου

vs

THD).

Η

Συζήτηση

το εξέχον εύρημα της παρούσας μελέτης είναι η απόδειξη ότι TP μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ΝΟΙ-Η292 κύτταρα από την ενεργοποίηση του Nrf2 /ΗΟ-1 μονοπάτι, ενδεχομένως, μέσω βελτίωσης του οξειδωτικού στρες.