Αφηρημένο

Επιγενετική γεγονότα είναι κρίσιμης σημασίας παράγοντες για την παθογένεση του καρκίνου, και η στόχευση επιγενετικών μηχανισμών αντιπροσωπεύει μια νέα στρατηγική στην αντικαρκινική θεραπεία. Κλασικό παράγοντες απομεθυλίωσης, όπως η 5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (Decitabine), κρατήστε το δυναμικό για reprograming σωματικών κυττάρων καρκίνου αποδεικνύοντας υψηλή θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε αιματολογικές κακοήθειες. Από την άλλη πλευρά, επιγενετική θεραπεία των συμπαγών όγκων συχνά δημιουργεί ανεπιθύμητες κυτταροτοξικές παρενέργειες. Κατάλληλα συστήματα παροχής μπορούν να εμπλουτίσουν Decitabine στο σημείο της δράσης και βελτίωση της βιοδιαθεσιμότητας της θα μειώσει τη συχνότητα εμφάνισης τοξικότητας σε υγιείς ιστούς. Στην εργασία αυτή παρέχει προκλινικές αποδείξεις ενός ασφαλούς, ευέλικτο και αποτελεσματικό στοχευμένη επιγενετικών θεραπεία για την αντιμετώπιση ευαίσθητων ορμόνη (LNCap) και ορμονοάντοχο (DU145) καρκίνοι του προστάτη. Μία νέα Decitabine σκεύασμα, που βασίζεται στη χρήση των μηχανικής ερυθροκυττάρων (ερυθρο-μαγνητο-αιμαγλουτινίνη ιοσώματα, EMHVs) σύστημα παροχής φαρμάκου (DDS) που φέρει αυτό το φάρμακο, έχει τελειοποιηθεί. Μέσα στα EMHVs, το φάρμακο προστατεύεται από το περιβάλλον και φωσφορυλιώνεται σε δραστική μορφή της. Η νέα μαγνητική EMHV DDS, προικισμένο με συντηκογόνα πρωτεΐνη, βελτίωσε τη σταθερότητα του φαρμάκου μεταφέρονται και επέδειξε μία υψηλή απόδοση σε περιορίζοντας την παράδοσή του στο σημείο της δράσης

in vivo

εφαρμόζοντας ένα εξωτερικό στατικό μαγνητικό πεδίο. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι Decitabine φορτώνονται σε EMHVs προκαλεί μια σημαντική μείωση της μάζας του όγκου σε μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου του προστάτη σε μια συγκέντρωση, η οποία είναι επτακόσιες φορές χαμηλότερη από τη θεραπευτική δόση, γεγονός που υποδηλώνει βελτιωμένη φαρμακοκινητική /φαρμακοδυναμική του φαρμάκου. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σημαντικά για και συζητούνται υπό το πρίσμα της ανάπτυξης εξατομικευμένων αυτόλογες θεραπείες και καινοτόμο κλινική προσέγγιση για τη θεραπεία των συμπαγών όγκων

Παράθεση:. Ν & ΐάί Ι, Τάραντα M, L Gherardini, Πελόζι G, Viglione F, Grimaldi S , et al. (2014) Μυθιστόρημα Επιγενετική Στόχος θεραπεία για καρκίνο του προστάτη: προκλινική μελέτη. PLoS ONE 9 (5): e98101. doi: 10.1371 /journal.pone.0098101

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30ης Δεκεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 28, Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: May 22, 2014

Copyright: © 2014 Ν & ΐάί et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) χρηματοδότηση και από την Ευρωπαϊκή κοινοτική χρηματοδότηση για POR Creo FESR 2007-2013, BANDO UNICO R & amp? S-ANNO 2012 ακρωνύμιο Regione Toscana-Τίτλος Έργου: ACTILA. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφέας Κατερίνα Cinti είναι μέλος του διοικητικού συμβουλίου ΕΝΑ συντακτικής Plos αλλά αυτό δεν αλλάζει τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές και τα κριτήρια σύνταξης.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PC) είναι συνήθως διαγιγνώσκεται κακοήθεια στις ανεπτυγμένες χώρες και η συχνότητα του αυξάνει δραματικά με την ηλικία [1], [ ,,,0],2]. Παρά την αποδεδειγμένη επιτυχία της ορμονικής θεραπείας, ο χειρουργικός ευνουχισμός [3], [4] και ραδιοθεραπεία [5] – [7], ωστόσο, αφού διαχειρίζεται ένα υποσύνολο των ασθενών εξέλιξης πρόδηλη νόσου και έγινε αντίσταση σε περαιτέρω ορμονικό χειρισμό [8] – [10]. Έως 20% των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με PC ριζική προστατεκτομή έχουν την πιθανότητα να εξελιχθεί σε διηθητικό καρκίνο με υποτροπιάζον μεταστατικό συνθήκες μέσα σε 5 έως 10 έτη [11]. Η διάμεση επιβίωση των ασθενών με μεταστατικό PC είναι 12-16 μήνες από τη στιγμή της διάγνωσης σε θάνατο [12]. Δεν ιαματικές θεραπείες είναι διαθέσιμες σε αυτό το στάδιο της νόσου. Παρά τις εντατικές ερευνητικές προσπάθειες, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα γίνονται ανθεκτικά σε ορμονοθεραπεία παραμένει κακώς χαρακτηρίζεται.

επιγενετικές διαταραχές, που περιλαμβάνουν υπερμεθυλίωση των γονιδίων σε κρίσιμες οδούς, όπως η επισκευή του DNA, το μεταβολισμό, και εισβολή /μετάσταση, έχουν βρεθεί σε καρκίνο του προστάτη παρέχει νέα στοιχεία της παθογένεσης αυτού του όγκου [13], [14]. Μετα-μεταφραστική αλλαγές εξασθενεί τη δομή της χρωματίνης μεταβάλλουν έκφραση γονιδίου και να οδηγήσει κυττάρων σε μεταστατική διασπορά. Ωστόσο, όπως επιγενετικές τροποποιήσεις δεν απαιτούν την αλλαγή στην αλληλουχία DNA που είναι δυνητικά αναστρέψιμες. μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs) που συμμετέχουν στην επιγενετικές σίγηση της γονιδιακής έκφρασης γίνει ως εκ τούτου ένας κατάλληλος στόχος για επιγενετικές θεραπείες [15] – [17].

Decitabine (5-Αζα-2′-dC) είναι ένα κλασικό απομεθυλίωσης παράγοντα εγκριθεί από το FDA για τη θεραπεία ασθενών με μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα και οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ALM) [18]. Ωστόσο, η ευεργετική της θεραπείας Decitabine παραμένει αβέβαιο για τους ασθενείς με συμπαγείς όγκους, όπως η έλλειψη χημικής σταθερότητας σε υδατικό διάλυμα και υψηλή συχνότητα εμφάνισης της ουδετεροπενίας έχουν συσχετιστεί με τη χρήση του.

Πρόσφατα η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του Decitabine έχει έχουν δοκιμαστεί σε διαφορετικές histotypes όγκου όπως όρχεων [19], του πνεύμονα [20], του μαστού [21], ορθοκολικό καρκίνο κυττάρων [22], οι όγκοι του ΚΝΣ [23] και του καρκίνου του προστάτη [24] – [26]. Αυτά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα υπέδειξαν ότι Decitabine μπορούσε να είναι αποτελεσματική στην αναστολή της εξέλιξης του καρκίνου και την επαγωγή κυτταρικής διαφοροποίησης. Ανεξάρτητα από αυτές τις

in vitro

εκθέσεις, τονίστηκε η ανάγκη για βελτίωση της σταθερότητας του φαρμάκου σε διάλυμα και παράδοση αποτελεσματικότητα, να ελαχιστοποιηθούν οι τοξικές παρενέργειες και να παρατείνει επιγενετικές αποτελέσματα

in vivo

.

Το αξιοσημείωτο θεραπευτικό δυναμικό των Decitabine στην πραγματικότητα παρεμποδίζεται από συστημική αστάθεια της [27]. χαμηλό θεραπευτικό δείκτη και η δυσκολία για τη βαθμονόμηση συγκέντρωσης σταθερής κατάστασης στο αίμα έχουν επηρεάσει αρκετές κλινικές μελέτες.

Τα τελευταία χρόνια, τα συστήματα χορήγησης φαρμάκων (DDSs) έχουν αναπτυχθεί για να βελτιωθεί η συγκεκριμένη και εντοπισμένη παράδοση των θεραπευτικών παραγόντων για τη στόχευση του όγκου ιστό, αποφεύγοντας σοβαρές τοξικές παρενέργειες σε υγιή όργανα [28], [29]. συστήματα παροχής φαρμάκου κυττάρων που βασίζονται όπως ερυθροκύτταρα είναι ιδιαίτερα ελκυστικές εργαλεία για την παράδοση διάφορες κατηγορίες θεραπευτικών. Τα ερυθροκύτταρα είναι ασφαλούς και βιοσυμβατού φορείς που μπορούν να φιλοξενήσουν μόρια διαφορετικού μεγέθους, της φύσης και της σταθερότητας και είναι ιδιαίτερα χρήσιμα για εκείνους τους παράγοντες που δείχνουν διείσδυση περιορισμένη ιστό ή απενεργοποιούνται γρήγορα κατόπιν ί.ν.

in vivo

διοίκηση [30] – [32]. Επιπλέον, ερυθροκύτταρα λειτουργούν επίσης ως κυκλοφορούν βιοαντιδραστήρες μετατροπή ενός προ-φάρμακα σε ενεργές μορφές της.

Ένα νέο σύστημα παροχής φαρμάκου ερυθροκυττάρων που βασίζεται, προικισμένο με τα δύο υπερ-παραμαγνητικά νανοσωματίδια (NPs) μέσα στα ερυθροκύτταρα και συντηκογόνα γλυκοπρωτεΐνη , η νηματώδης αιμοσυγκολλητίνη (FHA), εισάγονται μέσα στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των ερυθροκυττάρων (ερυθρο-μαγνητο-αιμαγλουτινίνη ιοσώματα, EMHVs), πρόσφατα κατοχυρωμένη με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας (WO2010 /070620 (Α1)).

έχει αποδειχθεί ότι αυτά EMHV βελτιωμένη κινητική των θεραπευτικών ενώσεων σε κύτταρα-στόχους

in vitro

. Αποτελεσματική φάρμακο ενδοκυτταρική απελευθέρωση επιτυγχάνεται σε κύτταρα-ξενιστές λόγω της παρουσίας του συντηκογόνα γλυκοπρωτεΐνης επί EMHV μεμβράνες [33], [34].

Η μαγνητική φύση αυτού του συστήματος χορήγησης φαρμάκου επιτρέπει EMHV να κατευθύνεται προς τα επιθυμητά ιστούς /όργανα

in vivo

με την εφαρμογή ενός εξωτερικού μαγνητικού πεδίου.

Εδώ έχουμε δοκιμαστεί ως στόχο «επιγενετική θεραπεία» βασίζεται στην χρήση χαμηλής δόσης 5-Aza-2′-dC φορτώνονται σε EMHVs σε δύο μοντέλα καρκίνου του προστάτη. Ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του προστάτη LNCap, ανταποκρίνεται σε ορμονοθεραπεία, και DU145, ορμονοάντοχο κύτταρα, έχουν χρησιμοποιηθεί [35]

in vitro

και

in vivo

σε μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου. Δείχνουμε ότι η φαρμακολογική αντικαρκινική δράση της 5-Aza-2′-DC είναι ιδιαίτερα αυξημένη από το σύστημα παροχής EMHVs μας, τόσο

in vitro

και

in vivo

γεγονός που υποδηλώνει πιθανή εφαρμογή του στο μέλλον κλινικές δοκιμές .

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Υπερπαραμαγνητικό νανοσωματίδια (NPS) αγοράστηκαν από νανο-screenMAG, Chemicell, Βερολίνο, Γερμανία. Νηματώδη αιμοσυγκολλητίνη από

Bordetella pertussis

(FHA), 5-αζα-2′-deoxicytitidine (5-Αζα-2′-dC), βαθμού HPLC ακετονιτρίλιο, Ν ‘, Ν’-dimethylhexylamine (DMHA), κυτιδίνης -5′-τριφωσφορική άλας δινατρίου (CTP) και 2′-δεοξυουριδίνη (dU) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, Μιλάνο, Ιταλία. Η μεθανόλη και οξικό αμμώνιο αγοράστηκαν από Carlo Erba, Μιλάνο, Ιταλία.

Παρασκευή 5-Αζα-2′-άΟ-φορτωμένο EMHVs (Α-EMHVs)

Ανθρώπινα ερυθροκύτταρα παρασκευάστηκαν με κλίση φυγοκέντρηση στα 400 g για 30 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές σε 1Χ PBS (1,37 Μ NaCl, 57 mM KCl, 54 mM Να

2HPO

4, 45 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4 ρΗ 7,4). 2 × 10

9 ερυθροκύτταρα λύθηκαν σε 250 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης 1 (10 mM TRIS, 0,1 mM EDTA, 1 mM MgCl

2 ρΗ 7.2) για 60 λεπτά στους 0 ° C. Η ισοτονικότητα ακολούθως αποκαταστάθηκε με την προσθήκη 130 μΙ επανασφράγισης ρυθμιστικό (65 μΐ ​​10Χ PBS ρΗ 7,4 και 65 μΐ ​​15 mM MgCl

2 ρΗ 7.4), συμπληρωμένο με 2 μg FHA, 0.1 mg από 100 nm υπερ-παραμαγνητικά NPs και 75 μg 5-Αζα-2′-dC.

Το εναιώρημα επωάστηκε για 45 λεπτά στους 37 ° C υπό ήπια ανάδευση για την προώθηση και την επανασφράγιση απόκτηση μηχανικής ερυθροκύτταρα φορτωμένα με 5-Αζα-2 ‘ dC (Α-EMHVs). Α-EMHVs μετά συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 8000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Διαδοχικά το αιώρημα ερυθροκυττάρων εκπλύθηκε δύο φορές με 1Χ PBS με φυγοκέντρηση στα 8000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C, αιωρούνται εκ νέου σε 1Χ PBS και διατηρήθηκαν στους 4 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθεί.

Κυτταρική καλλιέργεια

LNCap και DU145 κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) και διατηρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2 mM L-γλουταμίνη, με την παρουσία 100 U /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη, σε αναλογία διαχωρισμού των 1:03 δύο φορές την εβδομάδα. Αυτά τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη χρησιμοποιήθηκαν τόσο για

in vitro

και

in vivo πειράματα

.

Ομοεστιακή Laser Scanning Microscopy (CLSM) ανάλυση

DU145 κυττάρων στο μια πυκνότητα της τάξης του 1,5 × 10

5 σπάρθηκαν σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 6 φρεατίων. Στο κάτω μέρος των γυάλινων καλυπτρίδων πλάκες καλλιέργειας τοποθετήθηκαν επί των οποίων τα κύτταρα αφέθηκαν να μεγαλώσουν μέχρι 60-80% συρροή. Μετά από 24 ώρες, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με μέσο που περιέχει 1.5 × 10

8 A-EMHVs. Σε ένα δείγμα, φρέσκο ​​μέσο αντικαταστάθηκε χωρίς την προσθήκη του EMHVs να απεικονίσει αφελή κυτταρική δομή (έλεγχος). Μετά από 6, 24 και 48 ώρες επώασης, καλυπτρίδες ανακτώνται και τα κύτταρα πλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με μετρητή ϋΑΡΙ, πλένεται με 1Χ PBS και το σύνολο καλυπτρίδα τοποθετείται επί ενός ολισθητήρα χρησιμοποιώντας μέσο αντι-ξεθωριάζει. Φθορισμού και φωτεινού πεδίου εικόνες συλλήφθηκαν από CSLM, Leica TCS SP5 σύστημα ανεστραμμένο μικροσκόπιο εφοδιασμένο με πηγές που εκπέμπουν από την υπεριώδη στο ορατό. DAPI φθορισμός ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας διέγερση στα 405 nm και καταγραφή εκπομπή στα 454 nm ενώ το κόκκινο φθορισμό του υπερ-παραμαγνητικού NPs διεγέρθηκε στα 543 nm και η εκπομπή του ανιχνεύθηκε στα 613 nm.

Φασματομετρία

Υγρή χρωματογραφία μάζας ( HPLC-MS) ανάλυση των 5-Αζα-2′-άΟ φορτώνονται σε EMHVs

Για να προσδιοριστεί ποσοτικά η συνολική ποσότητα της 5-Αζα-2′-άΟ εντός των τροποποιημένων ερυθροκυττάρων, 2 × 10

9 προσφάτως ετοίμασε-EMHVs λύθηκαν σε 200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης 2 (155 mM ΝΗ

4Cl, 10 mM KHCO

3, 0,1 mM EDTA, ρΗ 7.2) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε ένα φυγοκεντρικό φίλτρο Microcon συσκευή με MWCO 30.000 Da (Amicon ΥΜ-10, Millipore, Vimodrone ΜΙ, Ιταλία) και κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 g για 2 ώρες στους 4 ° C. Φιλτραρισμένο δείγματα διατηρήθηκαν στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση. Το σύστημα HPLC που χρησιμοποιήθηκε ήταν ένα Dionex 3000 Ultimate σειρά LC (Sunnyvale, CA, USA) που συνδέεται με μία γραμμική παγίδα ιόντων LTQ-Orbitrap φασματογράφο μάζας (Thermo Fisher Scientific, USA), εξοπλισμένο με μία πηγή ιόντων ηλεκτροψεκασμού. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν και επεξεργασία με Excalibur 2.1 του λογισμικού. Οι ενώσεις διαχωρίστηκαν σε μία στήλη Mediterranea Sea18 ανάστροφης φάσης (150 mm, 2,1 mm ΙΌ και μέγεθος σωματιδίων 5 μm) από Teknokroma (Analytical Technology S.r.l., Brugherio Μιλάνο, Ιταλία). Η στήλη ορίστηκε σε ένα ρυθμό ροής 0.25 ml /λεπτό, σε θερμοκρασία 36 ° C, και όγκοι δείγματος των 10 μΐ ενέθηκαν. Η κινητή φάση αποτελείτο από 5 mM οξικού αμμωνίου (διαλύτης Α) και ακετονιτρίλιο (διαλύτης Β). Τα πρώτα 13 λεπτά ήταν μια ισοκρατική τρέξιμο με ένα διαλύτη? μεταξύ 13 και 20 λεπτά το ποσοστό κινητή φάση Β αυξήθηκε σε 35%, διατηρήθηκε για 2 λεπτά και στη συνέχεια η αρχική η κινητή φάση αποκαθίσταται μέσα σε 2 λεπτά. Το φασματόμετρο μάζας λειτούργησε σε θετικό ηλεκτροψεκασμό αναμονής και η ενέργεια σύγκρουσης ήταν 35 eV. Οι μεταβάσεις παρακολουθούνται ήταν m /z 229 — & gt? 113 για 5-Αζα-2′-dC? m /z 219 — & gt? 103 για τα παράγωγα γουανυλουρία? m /z 247 — & gt? 131 για τυποποιημένα παράγωγα του 5-Αζα-2′-DC. Για την αναζήτηση πιθανών φωσφορυλιωμένες μορφές του 5-Αζα-2′-dC, 2 × 10

9 φρεσκοπαρασκευασμένο A-EMHVs αφέθηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Διαδοχικά, τα δείγματα υπέστησαν λύση και διηθείται όπως περιγράφηκε παραπάνω και 400 ng του CTP προστέθηκαν στα δείγματα ως εσωτερικά πρότυπα. Η κινητή φάση αποτελείτο από 20 mM DMHA ρΗ 7,0 (διαλύτης Α) και μεθανόλη-νερό 80:20 (διαλύτης Β). Τα πρώτα 12 λεπτά ήταν μια ισοκρατική τρέχει με 10% διαλύτη Β? μεταξύ 12 και 15 λεπτών το ποσοστό των κινητή φάση Β αυξήθηκε σε 80%, διατηρείται για 1 λεπτό και στη συνέχεια η αρχική η κινητή φάση αποκαθίσταται μέσα σε 2 λεπτά. Το φασματόμετρο μάζας λειτούργησε σε αρνητικό τρόπο ηλεκτροψεκασμού και η ενέργεια σύγκρουσης ήταν 15 eV. Οι μεταβάσεις παρακολουθούνται ήταν m /z 482 — & gt? 384 για CTP? m /z 467 — & gt? 369 για 5-Αζα-2′-dC τριφωσφορική? m /z 387 — & gt? 289 για 5-Αζα-2′-dC διφωσφορική? m /z 307 — & gt? 208 για 5-Αζα-2′-άΟ μονοφωσφορική αντιστοιχεί στην εξάλειψη ενός ουδέτερου μορίου H

3PO

4. Για την καμπύλη βαθμονόμησης, χρησιμοποιήθηκαν έξι διαφορετικά πρότυπα CTP λύσεις. Η αναλογία των εμβαδών των κορυφών του δείγματος /CTP χρησιμοποιήθηκε για την ψηφιοποίηση.

κυτταροφθορισμομετρικής (FACS) ανάλυση

LNCap και DU145 κύτταρα σε πυκνότητα 1,5 × 10

5 σπάρθηκαν σε 6- φρεατίων για δοκιμασίες κυτταρικού κύκλου. Μετά από 24 ώρες, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με μέσο που περιέχει: όχι φάρμακο (CTRL)? ελεύθερο 5-Αζα-2′-dC σε δόσεις 6,8 μg ή 120 ng? 1,5 × 10

8 A-EMHVs (που περιέχει περίπου 120 ng 5-Αζα-2′-dC).

Μετά από 24, 48 και 96 ώρες επώασης, τον έλεγχο και τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με FACS. Οι πυρήνες βάφτηκαν με 10 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) σε υποτονικό διάλυμα (1Χ PBS που περιέχει 0.1% κιτρικό νάτριο και 0,1% Triton Χ-100) για 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι για την αξιολόγηση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου.

τα αποπτωτικά ανιχνεύτηκαν με τη δοκιμή αννεξίνη V (BioVision). Τα κατεργασμένα και μη κατεργασμένα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό σύνδεσης 1Χ και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά με Annexin V-FITC και ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) προστέθηκε για χρώση των πυρήνων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Becton-Dickinson ΡΑΟδοβη CentroII και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό FlowJo.

Ζώα

για τα πειράματα που πραγματοποιούνται στην εγκατάσταση ζώων του Πανεπιστημίου Marshall, συγγενή αθυμικά BALB /c γυμνά ποντίκια, ομόζυγα για η

nu

/

nu

αλληλόμορφο, είχαν εκτραφεί στο σπίτι. Η αποικία των 8 έως 12 εβδομάδων αρσενικά ποντίκια αναπτύχθηκε από τα εκτρεφόμενα ζώα που προέρχονται από Charles Rivers Laboratories (Wilmington, ΜΑ). Αυτά τα ζώα χρησιμοποιήθηκαν για LNCap ξενομοσχεύματος πειράματα.

Τα ζώα χρησιμοποιούνται σε πειράματα που πραγματοποιούνται στις εγκαταστάσεις των ζώων «Toscana Επιστημών Ζωής» ήταν αφαιρεθεί ο θύμος αδένας-Foxn1

nu

αρσενικά ποντίκια, ηλικίας 6 εβδομάδων, που αγοράστηκαν από Harlan Laboratories (Ούντινε, Ιταλία). Αυτά τα ζώα χρησιμοποιήθηκαν για ξενομοσχεύματα DU145.

Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, τα ζώα στεγάστηκαν σε μικρο-απομονωτές σε αυτόκλειστο κλουβιά με καλύμματα φίλτρου πολυεστερικής ίνας, υπό συνθήκες χωρίς μικρόβια. Όλα τα τρόφιμα, το νερό και κλινοσκεπάσματα ήταν αποστειρωμένα και τα ζώα διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 23 ± 2 ° C σε δωμάτια που έχουν σκότους /12 ωρών φωτός.

Απεικόνισης

X-ray

αθυμικά BALB /c γυμνά ποντίκια ενέθηκαν με 1,5 × 10

8 EMHVs αιωρήθηκε σε 150 μΙ 1Χ PBS.

Μετά EMHVs ένεση σε φλέβα ουράς, μία ομάδα ζώων εκτέθηκαν σε εξωτερικό μαγνητικό πεδίο με την τοποθέτηση δύο μαγνήτες γη στην κάτω πλευρική κοιλιακή περιοχή για 30 λεπτά (EMHVs-MF), ενώ ποντικοί κρατήθηκαν κάτω από 2% ισοφλουράνιο αναισθησία. Neodinium μαγνήτες (στρογγυλό σχήμα 5,0 χιλιοστά) με περίπου καταναγκασμού δύναμη των 1.000 KOersted, χρησιμοποιήθηκαν. Μια ομάδα ελέγχου ποντικών ήταν φλέβας της ουράς με ένεση EMHVs όπως περιγράφηκε προηγουμένως, αλλά όχι εξωτερικό μαγνητικό πεδίο εφαρμόστηκε (EMHVs-NMF). Μία ώρα μετά την αγωγή, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με CO

2 ασφυξία και τη συσσώρευση των σιδηρούχων σφαιριδίων εκτιμήθηκε με απεικόνιση με ακτίνες Χ. Η ανάλυση απεικόνισης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα άμεσης ψηφιακής ακτινογραφίας Philips DigitalDiagnost με επίπεδη τεχνολογία ανιχνευτή (Philips, Αμβούργο, Γερμανία) με μία δόση των 60 kVp σε 5 Mas.

ξενομόσχευμα διαδικασίες όγκου

Και οι δύο αθυμικοί BALB /c Γυμνό και Γυμνό-Foxn1

nu

ποντίκια αναισθητοποιούνται με 2,5% ισοφλουράνιο κατά το χειρισμό

Η ρύθμιση των μοντέλων:. LNCap ή DU145 κύτταρα συμπυκνώθηκαν σε 7 × 10

6 ή 4,5 × 10

6 αντίστοιχα σε 1Χ PBS και ενέθηκαν υποδορίως 1:01 με μήτρα βασικής μεμβράνης MatrigelTM (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) στο αριστερό πλευρό κάθε ποντικού (συνολικός όγκος 200 μl) του. Μόλις ξενομοσχεύματα άρχισε να αυξάνεται, τα μεγέθη τους (mm

3) μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα με την ψηφιακή δαγκάνα και ο όγκος υπολογίστηκε με τη χρήση του τυποποιημένου μαθηματικού τύπου: μήκος x πλάτος

2/2. ξενομοσχεύματα όγκου αφέθηκαν να αναπτυχθούν περίπου μέχρι 100 mm

3 και αυτός ο όγκος επιλέχθηκε ως το αρχικό στάδιο για την έναρξη της θεραπείας. Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν (n = 6), αναισθητοποιούνται και προετοιμάζονται για ένεση στη φλέβα της ουράς με την επιλεγμένη θεραπεία. Πριν από κάθε ένεση, οι όγκοι μετρήθηκαν και συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες αρχικές ποσότητες, ώστε να κανονικοποίηση των δεδομένων (Χ = 100 χ όγκος

1 /όγκος

0). Η τυχαιοποίηση: Οι ποντικοί χωρίστηκαν σε επτά διαφορετικές ομάδες και στις δύο πειραματικές ρυθμίσεις (LNCap ή DU145 ξενομοσχεύματα) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ως εξής: 1Χ PBS (CTRL)? 85 μg 5-Αζα-2′-dC (2,5 mg /kg) (Α1)? 120 ng 5-Αζα-2′-dC (Α2)? 1,5 × 10

8 εκφορτώνονται EMHVs απουσία του στατικού μαγνητικού πεδίου (EMHVs-NMF)? 1,5 × 10

8 εκφορτώνονται EMHVs και στατικό μαγνητικό πεδίο εφαρμόζεται σε όγκο (EMHVs-MF)? 1,5 × 10

8 EMHVs περιέχει 120 ng 5-Αζα-2′-dC (Α-EMHVs-NMF)? 1,5 × 10

8 EMHVs περιέχει 120 ng 5-Αζα-2′-DC και στατικό μαγνητικό πεδίο εφαρμόζεται επί του όγκου (Α-EMHVs-MF)

πρωτόκολλο έγχυσης:. Ποντικοί δύο φορές την εβδομάδα χορηγείται ενδοφλεβίως με 150 μl θεραπεία ανά εμβολιασμό, πάνω από 3 εβδομάδες. Μετά από κάθε ένεση σε αυτές τις ομάδες που επιλέγονται να αντιμετωπίζονται επίσης με στατικό μαγνητικό πεδίο (EMHVs-MF και Α-EMHVs-MF), δύο μαγνήτες γη (1000 KOersted) εφαρμόστηκαν στη μάζα ξενομοσχεύματος για 30 λεπτά για να εξασφαλιστεί η συσσώρευση ενδο-όγκου. Τα ποντίκια ήταν τότε επιτρέπεται ανάκτηση και παρακολουθούνται για συμπτώματα δυσφορίας. Στο τέλος της πορείας της θεραπείας ή όταν ο όγκος όγκου έφθασε περίπου 400 mm

3, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με CO

2 ασφυξία και η μάζα του όγκου του προστάτη, του ήπατος, των νεφρών συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι πρόσθετη ανάλυση.

Μορφολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση των ξενομοσχευμάτων όγκου

κατεψυγμένα δείγματα αποθηκεύονται στους -80 ° C ήταν ισορροπήσει στους -20 ° C για μία νύχτα πριν από την κοπή του κρυοστάτη (Microm HM 500 W) μετά την ενσωμάτωση σε OCT.

Διαδοχική σειριακές κατεψυγμένες τομές πάχους μm 5-6 ελήφθησαν από το μεσαίο τμήμα (το μεγαλύτερο) κάθε δειγμάτων, που διατίθενται στην θετικά φορτισμένη διαφάνειες, ξηραίνεται στον αέρα για λίγα λεπτά και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή ακετόνη . Δύο τέσσερα τμήματα βάφτηκαν με αιματοξυλίνη Mayer για ιστοπαθολογική εξέταση.

Μετά την πλύση σε 1Χ PBS και επώαση σε H

2O

2 σε θερμοκρασία δωματίου για να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης, το τμήμα επωάστηκαν με αραιωμένο φυσιολογικό ορό φραγμού παρασκευάζονται από τα είδη στα οποία γίνεται η δευτερεύον αντίσωμα. Τα πλακίδια επωάστηκαν σε υγρό θάλαμο όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτογενή ανθρώπινα αντισώματα αντιδραστικά για Κί67 (κλώνος SP6, το μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, Thermoscientific) σε αραίωση 1:200 και DNMT3b (κλώνος 52A1018, μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, Imgenex) στην αραίωση 1 :150. Μετά από 30 λεπτά δευτερεύον βιοτινυλιωμένο αντίσωμα και 30 λεπτά Vectastain Elite ABC αντιδραστηρίου Τα πλακίδια στη συνέχεια επώαση με διάλυμα υποστρώματος υπεροξειδάσης (DAB). Διαφάνειες Ακολούθησε χρώση με αιματοξυλίνη Mayer για 1 λεπτό, και τοποθετείται σε υδατικό Όρος Quick (Bioptica). Μικροσκοπική εξέταση διεξήχθη από 2x έως 40x μεγέθυνση κάτω από μικροσκόπιο φωτός της Olympus BX43 διασυνδεθεί με μια βιντεοκάμερα για την ψηφιακή απόκτηση και ανάλυση απεικόνισης (DP20 Ολύμπου). Οι τιμές των DNMT3b και Κί67 θετικών πυρήνων εκφράστηκαν ως ποσοστό των θετικών ή αρνητικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της καταμέτρησης τουλάχιστον 500 συνολικών κυττάρων σε 20χ αρχική μεγέθυνση.

Στατιστική ανάλυση

Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον n = 3. Τρία-τρόποι ANOVA εφαρμόστηκαν για να συγκριθεί η επίδραση των διαφόρων θεραπειών (CTRL, 6,8 μg 5-Αζα-2′-άΟ? 120 ng 5-Αζα-2′-dC? 1.5 × 10

8 A-EMHVs) επί φάσεις του κυτταρικού κύκλου (sub G1, G0-G1, S, G2-M) και One-Way ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η επίδραση των Α-EMHVs θεραπεία σε επιλεγμένα χρονικά σημεία (24 , 48 και 96 ώρες).

Τα αποπτωτικά κύτταρα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον n = 3. η στατιστική ανάλυση έγινε με μονόδρομη ANOVA ανεξάρτητα για πρώιμη και την όψιμη απόπτωση σε δεδομένα μετασχηματίζονται καταγραφής για τη βελτίωση ομαλοποίηση. Συγκρίσεις κατά ζεύγη εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ειλικρίνεια σημαντική διαφορά κριτήριο του Tukey.

Ο

ίη νίνο

αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM του n = 6. One-Way ANOVA εφαρμόστηκε για τη σύγκριση της μείωσης μάζας του όγκου στην αξιολόγηση του εμφυτεύματος ξενομοσχεύματος μετά επιλέγονται θεραπεία χρησιμοποιώντας τα δεδομένα που συλλέγονται κατά την τελευταία ένεση. Για να περιγράψει ρυθμός μείωσης της μάζας του όγκου (50%) σε ποντίκια μετά από επιλεγμένες θεραπείες, ανάλυση Kaplan-Meier εφαρμόστηκε ακολουθείται από δοκιμασία log-rank.

καταστάσεων Δεοντολογίας

Ανθρώπινα ερυθρά αιμοσφαίρια ελήφθησαν από τσάντες μετάγγιση συλλέγονται από ανώνυμους υγιείς εθελοντές αιμοδότες, που έχουν δώσει γραπτή συγκατάθεση τους διενεργούνται σύμφωνα με την ιταλική κυβέρνηση δίκαιο. Δεν ήταν απαραίτητη η έγκριση από την (επιτροπή δεοντολογίας) θεσμική αναθεώρηση της επιτροπής αφού έχουν προβλεφθεί ούτε άμεση ανθρώπινη συμμετοχή, ούτε τη συμμετοχή της ανθρώπινης μελέτες σε αυτό το έργο. δείγματα έχουν παρέχονται από Azienda Ospedaliera Universitaria Senese.

Η προκλινική μελέτη διεξήχθη σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Διεθνών κατευθυντήριες γραμμές σχετικά με το χειρισμό των πειραματόζωων και την εφαρμογή τα 3Rs σε πειράματα (σύμφωνα με το ΝΙΗ και τις συστάσεις της Ευρωπαϊκής Επιτροπής)

τα πρωτόκολλα για τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Μάρσαλ (Huntington, WV, USA) (Αριθμός άδειας:. # 458 /2010) και από τις επιτροπές δεοντολογίας των Toscana Επιστημών ζωής και το Istituto Superiore di Sanità (ISS) για λογαριασμό του ιταλικού Υπουργείου Υγείας (Αριθμός άδειας: # CNR-270111 Εχρ1 /PROT1). Ζώο ευημερία παρακολουθήθηκε ανάλογα με Langford et al, 2010. [36] «

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός νέων αντικαρκινικών σκευάσματος στο σύστημα χορήγησης φαρμάκων ερυθροκυττάρων που βασίζεται

Για να ενισχύσει το προφίλ απόδοσης των 5-Αζα-2′-dC προ-φαρμάκου, σε σχέση με τη χημική σταθερότητα, φαρμακοκινητική και φαρμακοδυναμική, μηχανικής μαγνητικών ερυθροκύτταρα (EMHVs) χρησιμοποιήθηκαν ως σύστημα χορήγησης φαρμάκων (DDS). η κινητική του EMHV DDS εσωτερίκευσης και την τοξικότητα της, καθώς και η αποτελεσματικότητα και η αποτελεσματικότητα αυτής της νέας αντικαρκινικής 5-Αζα-2′-άΟ σκεύασμα ελέγχθηκαν πρώτον

in vitro

σε ευαίσθητες ορμόνης (LNCap) και ανθεκτικά (DU145) κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Η εσωτερίκευση του φορέα EMHVs σε καρκινικών κυττάρων

in vitro

.

Η κινητική της EMHVs εσωτερίκευσης σε δύο καρκινικά κύτταρα του προστάτη LNCaP, ενώ ταυτόχρονα DU145 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Ομοεστιακή Laser Scanning Microscopy ( CSLM) με παρακολούθηση της κατανομής του απελευθερωμένου φθορισμού NPs (πράσινο) στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων-στόχων (Σχ. 1). Ένα παράδειγμα αφελή κύτταρα DU145 φαίνεται στο Σχ. 1Α. Εσωτερίκευση λαμβάνει ήδη χώρα στις 6 ώρες μετά τη θεραπεία, όταν EMHVs βρέθηκαν μέσα στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων DU145. Σε αυτό το στάδιο EMHVs εξακολουθούν να διατηρούν ανέπαφη μεμβράνη τους και το περιεχόμενό τους ΣΔ (Εικ. 1Β). Παρομοίως με ό, τι βρεθεί σε προηγούμενες εργασίες μας [33], μετά εσωτερικοποίηση η μεμβράνη EMHV ασφάλειες με μεμβράνη του κυττάρου-ξενιστή απελευθερώνοντας τη φθορίζουσα περιεχόμενο σε όλη την κυτταροπλασματική χώρο (Σχ. 1C-Ε). Κατά τις τελευταίες χρονικά σημεία (48-96 ώρες) μια ευρεία εξάπλωση φθορισμός της NPS είναι ανιχνεύσιμη στο κυτόπλασμα αν και κύτταρα-ξενιστές φαίνονται μορφολογικά υγιή και όχι κυτταροτοξικό αποτέλεσμα είναι ορατό (Εικ. 1 D-E).

Αντιπρόσωπος CLSM οι εικόνες των EMHVs εσωτερίκευσης και απελευθερώνεται διανομή νανοσωματιδίων (πράσινο σήμα φθορισμού, Β-Ε) εντός του κυττάρου-ξενιστή κυτόπλασμα σε διάφορα χρονικά σημεία απεικονίζονται. αφελείς κύτταρα (Α) αναφέρονται ως έλεγχος. Στο (Β), μετά από 6 ώρες θεραπείας, ένα ανέπαφο EMHV είναι παρόν στο κυτταρόπλασμα (βέλος). Σε 24 ώρες (C) τα σωματίδια φαίνεται να έχουν απελευθερωθεί από τις EMHVs. Στις φωτογραφίες που λαμβάνονται σε 48 (D) και 96 (Ε) ώρες, νανοσωματίδια φαίνεται να έχουν ομοιογενώς κατανεμημένο σε όλο το κυτταρόπλασμα. Έλλειψη τοξική επίδραση της θεραπείας με το σύστημα παροχής φαρμάκου ερυθροκυττάρων αξιολογήθηκε με ανάλυση FACS (F), όπου το προφίλ των κυττάρων των κατεργασμένων κυττάρων (EMHVs) σε επιλεγμένα χρονικά σημεία δεν δείχνουν σημαντικές μεταβολές στις διανομές υπο-φάση σε σχέση με το μάρτυρα (CTRL).

έλλειψη τοξικότητας από τους φορείς EMHV σε μοντέλα κυττάρου.

Η τοξικότητα των EMHV DDS κατά κύτταρα ξενιστές εκτιμήθηκε αναλύοντας τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων-στόχων. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με άφορτο EMHVs για 48 και 96 ώρες, δεν μετατόπιση στην κατανομή φάση κύτταρο LNCap και DU145 ήταν ανιχνεύσιμη και τα κύτταρα διατηρούνται φυσιολογικό κυτταρικό κύκλο τους κατά τη διάρκεια της θεραπείας (Εικ. 1 F). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι το σύστημα χορήγησης φαρμάκων EMHVs δεν ασκεί καμία τοξική επίδραση στα καρκινικά κύτταρα per se.

Χημική σταθερότητα της 5-Aza-2′-dC στο σύστημα βιοαντιδραστήρα EMHV (Α-EMHVs).

5-Αζα-2′-dC είναι ένα προ-φάρμακο και απαιτεί να ενεργοποιηθεί με φωσφορυλίωση σε ένα τριφωσφορικό νουκλεοζίτη πριν ασκώντας αναστολή επί μεθυλίωσης του DNA [37].

Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι ερυθροκύτταρα δρουν ως βιοαντιδραστήρες λόγω ενζυματικής συστήματά τους [34]. Αυτό τα καθιστά κατάλληλα για ενθυλάκωση των προ-φαρμάκων που στη συνέχεια θα μετατραπεί σε δραστικό φάρμακο [38]. Φόρτωση 5-Αζα-2′-dC προ-φαρμάκου σε σύστημα βιοαντιδραστήρα EMHV επιτεύχθηκε σύμφωνα με ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο (βλέπε υλικά και μέθοδοι). HPLC-MS χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί ποσοτικά η συνολική ποσότητα του φαρμάκου στο εσωτερικό του DDS (Α-EMHVs) και την ανίχνευση της παρουσίας των ενεργών φωσφορυλιωμένες μορφές της. Το χρωματογράφημα δείγματα επωάζονται για 24 ώρες στους 37 ° C επισημανθεί ένα μίγμα διαφορετικών φωσφορυλιωμένες μορφές του 5-Aza2′-dC (Εικ. 2). Δι- και μορφές τρι-φωσφορική φωσφορυλιωμένων έκλουσης 5-Aza2′-dC σε RT 16.6 και 16.5 αντίστοιχα RT (Εικ. 2Β και 2C). Το σχήμα 2D δείχνει την κορυφή της κυτιδίνης thriphosphate (CTP? RT: 16.5), ένα εσωτερικό πρότυπο που έχουμε προσθέσει στα δείγματα μας ως έλεγχος. Φαίνεται ότι η μορφή τρι-φωσφορική 5-Aza2′-άΟ overbears τα άλλα φωσφορυλιωμένες μορφές που αποδεικνύουν την υψηλή απόδοση της EMHVs ως βιοαντιδραστήρες. Βρήκαμε ότι 1,5 × 10

8 A-EMHVs φιλοξενεί περίπου 120 ng του συνολικού φαρμάκου και ότι οι δραστικές φωσφορυλιωμένες μορφές 5-Αζα-2′-άΟ αντιπροσωπεύει το 50% της συνολικής φορτωμένου φαρμάκου εντός του Α-EMHVs.

(Α) χρωματογραφήματα για 5-Αζα-2′-dC μονο-φωσφορικής? (Β) δι-φωσφορικό (RT: 16.6)? (C) τρι-φωσφορικό (RT: 16.5) και (Δ) εσωτερικό πρότυπο CTP (RT: 16.5).

Η

Το αντι πολλαπλασιαστική δραστηριότητα της Α-EMHVs

in vitro

.

το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του Α-EMHV στην επαγωγή διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση ελέγχθηκε σε δύο μοντέλα καρκίνου του προστάτη: ορμόνη ευαίσθητα κύτταρα LNCap και ανδρογόνο-ανεξάρτητου καρκίνου του προστάτη DU145 κυτταρική γραμμή όπου οι παραδοσιακές θεραπευτικές προσεγγίσεις εμποδίστηκε από το έλλειψη ανταπόκρισης στη θεραπεία ορμονών και έκφραση αντιγόνου PSA επί της κυτταρικής μεμβράνης.

Η επίδραση του 1,5 × 10

8 αγωγή Α-EMHVs, που περιέχει περίπου 120 ng εσωτερικού 5-Aza2′-dC, υπήρξε σε σύγκριση με εκείνη των ελεύθερων 5-Αζα-2′-dC χρησιμοποιήθηκε στη δόση 2.5 μΜ (συνολικά 6,8 μg) μειωθεί από τη θεραπευτική δόση που χρησιμοποιείται σε κλινικές. Μπορούμε επίσης συνέκρινε την επίδραση της ίδιας ποσότητας του 5-Αζα-2′-dC περιέχονται εντός του Α-EMHVs (120 ng) χρησιμοποιείται ως διάλυμα ελεύθερου φαρμάκου.

Την ορμόνη αποκρίνονται LNCaP κύτταρα (Σχ. 3Α) , η θεραπεία A-EMHVs προκάλεσε μια σημαντική εμπλουτισμό σε υπο G1 γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή ενεργοποίηση της αποπτωτική απόκριση (Εικ. 3Α). Αυτή η μετατόπιση ήταν ήδη ανιχνεύσιμη σε 48 ώρες μετά την κατεργασία (Σχήμα 3Α μεσαίο πλαίσιο.) Και έφθασε στατιστική σημαντικότητα σε 96 ώρες (ANOVA ρ & lt? 0,05). Μια παρόμοια μετατόπιση προς υπο διανομής G1 ελήφθη επίσης με τη χρήση 6,8 μg του ελεύθερου 5-Αζα-2′-dC (ANOVA ρ & lt? 0,05), ωστόσο αυτή η δόση είναι πάνω από 50 φορές υψηλότερη από ό, τι η 5-Αζα-2′-dC φορτωμένο στο Α-EMHVs. Επιπλέον, το αποτέλεσμα του 6,8 μg δωρεάν θεραπεία 5-Αζα-2′-άΟ φαίνεται να έχει μια εμφάνιση αργότερα σε σύγκριση με το Α-EMHVs. Αυτό πιθανώς οφείλεται στο γεγονός ότι η 5-Αζα-2′-dC, έγκλειστα εντός του EMHVs εύκολα μετατρέπεται σε φωσφορυλιωμένες μορφές βελτίωση 5-Αζα-2′-άΟ φαρμακοκινητική /φαρμακοδυναμική. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι χαμηλές δόσεις της ελεύθερης 5-Aza-2′-dC (120 ng) δεν ασκούν υπο αποτέλεσμα μετατόπιση G1 και το προφίλ της διανομής του κυτταρικού κύκλου δεν διέφεραν από τους ελέγχους μέχρι και 96 ώρες.

1,5 × 10

8 αγωγή Α-EMHVs, που περιέχει 120 ng εσωτερικού 5-Αζα-2′-dC, συγκρίθηκε με 6,8 μg δωρεάν 5-Αζα-2′-dC και 120 ng δωρεάν θεραπείες 5-Αζα-2′-dC στους 24 (κορυφή) 48 (μέση) 96 (κάτω) ώρες. Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος (CTRL). Σε αμφότερες LNCap (Α) και DU145 (Β), κυτταρικές σειρές Α-EMHVs θεραπεία προκάλεσε μια σημαντική εμπλουτισμό σε υπο διανομής G1 κυττάρων (μαύρες ράβδοι) ήδη ανιχνεύσιμη στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία (Α και Β μεσαίο πλαίσιο, αντίστοιχα) που διαρκούν μέχρι έως 96 ώρες (* ANOVA ρ & lt? 0,05). Παρόμοια στροφή προς διανομή υπο G1 επίσης λήφθηκε με χρήση 6,8 μg του ελεύθερου 5-Αζα-2′-dC (§ANOVA ρ & lt? 0,05), αλλά μόνο να ανιχνεύεται στις 96 ώρες. Αριθ μετατόπιση στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου ανιχνεύθηκε για την ελεύθερη 120 ng 5-Αζα-2′-dC, δεν διαφέρει από μάρτυρες.

Η

Μια παρόμοια τάση φάσης υπο G1 περιγράφηκε στην ορμόνη ανθεκτική κυτταρική γραμμή DU145