Αφηρημένο

Ταυτοποίηση των CD8

επιτόπων + Τ κυττάρων που μπορεί να προκαλέσει Τ κύτταρα να σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα είναι ένα θεμελιώδες βήμα για την ανάπτυξη ενός εμβολίου καρκίνου του πεπτιδίου. ΠΟΤΕ πρωτεΐνη είναι ένα πρόσφατα ταυτοποιημένο αντιγόνο καρκίνου που βρέθηκε να εκφράζεται σε μια ευρεία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, του μαστού, των ωοθηκών και του παγκρέατος. Εδώ, προσδιορίσαμε HLA-A2.1-περιορισμένων κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (CTL) επίτοπους στην πρωτεΐνη ΠΟΤΕ, και επίσης σχεδιασμένο ενισχυμένη επιτόπια με υποκαταστάσεις αμινοξέων (ΑΑ). Πέντε πεπτίδια 9-μερές αρχικά επιλεγεί και συγγένεια πρόσδεσης τους σε μόρια HLA-A2 μετρήθηκε με την δοκιμασία σύνδεσης Τ2. ΠΟΤΕ 272-280 και 323-331 ΠΟΤΕ έδειξε την ισχυρότερη συγγένεια δέσμευσης HLA-A2. AA υποκατεστημένων πεπτιδίων ΠΟΤΕ 252-9V (με βαλίνη στη θέση 9), ΠΟΤΕ 553-1Y (με τυροσίνη στη θέση 1) και ΠΟΤΕ 323-3F (με φαινυλαλανίνη στη θέση 3) ανατίθενται υψηλότερη συγγένεια για HLA-A2, και διεγείρονται CTL αποκρίσεις διασταυρούμενη αντίδραση με αντιγόνα τύπου άγρια. Ενώ ΠΟΤΕ 252-9V ήταν η ισχυρότερη από αυτή την άποψη, ΠΟΤΕ 323-3F είχε τη μεγαλύτερη αύξηση στην ανοσογονικότητα σε σύγκριση με τον άγριο τύπο. Είναι σημαντικό, δύο τροποποιημένα επιτόπια (ΠΟΤΕ-553-1Y και ΠΟΤΕ-323-3F) που προκαλείται από τα CTL που σκότωσε NCI-Η522, ένα ΠΟΤΕ εκφράζουν HLA-A2

+ ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκίνο κυτταρική σειρά, αναφέροντας τα φυσικά ενδογενή επεξεργασία αυτών των επιτόπων. Συμπερασματικά, η ανοσογονικότητα των επιτόπων ΠΟΤΕ μπορεί να ενισχυθεί με πεπτίδιο τροποποίηση να επάγει Τ κύτταρα που σκοτώνουν ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Ένας συνδυασμός ΠΟΤΕ 553-1Y και ΠΟΤΕ 323-3F επιτόπων μπορεί να είναι μια ελκυστική στρατηγική εμβόλιο για ασθενείς με καρκίνο του HLA-A2 για να ξεπεραστεί η ανοχή που προκαλείται από όγκους και να αποτρέψει τη διαφυγή

Παράθεση:. Huang YH, Terabe Μ, Πέντλετον CD, Stewart Khursigara D, Bera TK, Pastan I, et al. (2013) Ταυτοποίηση και Ενίσχυση του HLA-A2.1-περιορισμένα CTL επιτόπων σε ένα νέο ανθρώπινο καρκινικό αντιγόνο ΠΟΤΕ. PLoS ONE 8 (6): e64365. doi: 10.1371 /journal.pone.0064365

Συντάκτης: Vladimir Brusic, Dana-Farber Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 του Ιανουαρίου 2013? Αποδεκτές: 13 Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 4 Ιουν, 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση: Δρ. Yi-Hsiang Huang υποστηρίχθηκε από την Ταϊβάν Merit Scholarship (TMS-094-2-B-015) και ΝΟΙ εντός των τειχών χρηματοδότηση από η NCI Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, ΝΙΗ, Bethesda, Maryland, USA? και με χρηματοδότηση από Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων (V97S5-002, V100C-104 και V101C-147). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι περισσότεροι καρκίνοι δεν μπορεί να εκτομή θεραπευτικά εκτός εάν ανιχνεύεται νωρίς. Άλλα χειρουργική προσεγγίσεις, όπως ραδιοθεραπεία ή χημειοθεραπεία, επηρεάζουν επίσης τα φυσιολογικά κύτταρα και να οδηγήσει σε παρενέργειες που περιορίζουν τη θεραπεία. Επιπλέον, όλες οι θεραπείες για υποτροπιάζοντα ή μεταστατικό καρκίνο είναι παρηγορητική. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων συστημικών προσεγγίσεων για την αντιμετώπιση του προχωρημένου, υποτροπιάζοντα ή μεταστατικό καρκίνο είναι απαραίτητη. Η ανοσοθεραπεία μπορεί να έχει μεγάλες δυνατότητες ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία για ασθενείς με καρκίνο, λόγω της ιδιαιτερότητας και της ελευθερίας του από τις τοξικές επιδράσεις των χημειοθεραπειών. Από sipuleucel-T έγινε το πρώτο εμβόλιο του καρκίνου άδεια στις Ηνωμένες Πολιτείες [1], [2], εκεί έχει ανανεωθεί σε μεγάλο βαθμό το ενδιαφέρον σε εμβόλια καρκίνου [3] – [5]. Έτσι, τα νέα αντιγόνα όγκου για ειδικούς τύπους καρκίνου είναι μεγάλο ενδιαφέρον.

CD8

+ CTLs μπορούν να αναγνωρίσουν και ειδικά να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν πεπτίδια από αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους που παρουσιάζονται από μόρια MHC τάξης Ι. Ως εκ τούτου, οι περισσότερες στρατηγικές ρεύμα καρκίνος ανοσοθεραπεία επικεντρωθεί στην επαγωγή των CTLs ότι λύουν κύτταρα όγκου [6]. Αντιγόνου-ειδική ανοσοθεραπεία του καρκίνου συχνά βασίζεται σε ταυτοποίηση των επιτόπων που εκφράζονται από τα καρκινικά κύτταρα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως στόχοι για CD8

+ Τ κύτταρα. Ωστόσο, τα φυσικά επιτόπια CTL καρκίνων δεν είναι πάντοτε η βέλτιστη επειδή η ρεπερτόριο CTL κατά επιτόπων υψηλής συγγένειας συχνά ανεκτικά [7]. Βελτίωση επιτόπιο, μέσω της τροποποίησης της αλληλουχίας ΑΑ επιτόπων, αναπτύχθηκε για να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα των εμβολίων κατά κύριο λόγο μέσω της αύξησης συγγένεια των πεπτιδίων για μόρια MHC [3], [8]. πεπτιδικά εμβόλια έχουν δείξει πρόσφατα σημαντική υπόσχεση σε κλινικές δοκιμές [9].

Η ανακάλυψη όγκου-ειδικά αντιγόνα είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών ανοσοθεραπεία του καρκίνου [5]. Πρόσφατα, μία νέα που σχετίζεται με όγκο αντιγόνο, ΠΟΤΕ, ταυτοποιήθηκε από μια ποικιλία καρκίνων του ανθρώπου [10], [11]. Αυτό το αντιγόνο του όγκου ονομάζεται ΠΟΤΕ επειδή ήταν σε διαπιστώθηκε πρώτα να εκφράζεται σε φυσιολογικό προστάτη, ωοθήκη, όρχεις, πλακούντα και ιστών, καθώς και στον καρκίνο του προστάτη [10]. Η οικογένεια γονιδίων ΠΟΤΕ βρέθηκε διασπείρεται μεταξύ οκτώ διαφορετικά χρωμοσώματα (2, 8, 13, 14, 15, 18, 21, και 22) με διαφορετικό μήκος των mRNAs [12]. Παρ ‘όλα αυτά, η αλληλουχία cDNA ΠΟΤΕ μεταξύ διαφόρων χρωμοσώματα είναι εξαιρετικά ομοιογενής με την απόκλιση μικρότερη από 10% [11]. Μετέπειτα μελέτες αποκάλυψαν ότι τα γονίδια εκφράστηκαν ΠΟΤΕ όχι μόνο στον καρκίνο του προστάτη αλλά και σε μια ευρεία ποικιλία ανθρώπινων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, των ωοθηκών και του παγκρέατος [11]. Υπάρχουν διακριτά πρότυπα έκφρασης των ΠΟΤΕ σε φυσιολογικούς ιστούς και καρκίνων [11]. Μεταξύ των διαφόρων μορφών καρκίνου, τα παράλογα ΠΟΤΕ στο χρωμόσωμα 2 (ΠΟΤΕ-2γ) είναι τα πλέον συχνά εκφρασμένα.

Επειδή ΠΟΤΕ mRNA είναι ανιχνεύσιμο μόνο σε έναν περιορισμένο αριθμό κανονικών ανθρώπινων ιστών (προστάτη και όρχεις στο αρσενικό, και των ωοθηκών και πλακούντα στο θηλυκό), η πρωτεΐνη ΠΟΤΕ θεωρείται ως μέλος της οικογένειας καρκινικού αντιγόνου-όρχεων [11]. Η έκφραση των αντιγόνων καρκίνου όρχεων στον πλακούντα ή όρχεις δεν πρέπει να οδηγήσει σε ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων λόγω του πολύ χαμηλή έκφραση του MHC τάξης Ι μορίων σε αυτούς τους ιστούς [13], [14]. Για τους ασθενείς με καρκίνο, κάποια αντιδραστικότητα έναντι του προστάτη ή του μαστού ιστού είναι αποδεκτή, καθώς δεν είναι ζωτικής σημασίας ιστούς. Επιπλέον, για τον καρκίνο του μαστού ή καρκίνου του προστάτη ασθενών, ο προστάτης στο αρσενικό και του μαστού στο θηλυκό θα έπρεπε να έχουν τη χειρουργική εκτομή ή ακτινοβοληθεί. Οι ανησυχίες του αυτοάνοση αντίδραση σε δύο ιστούς δεν θα αποτελούσε εμπόδιο στη θεραπεία των απειλητικών για τη ζωή του καρκίνου. Ως εκ τούτου, το αντιγόνο ΠΟΤΕ θα πρέπει να είναι ένας ελκυστικός στόχος για την ανοσοθεραπεία αυτών των καρκίνων.

Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε πρώτα HLA-A2-περιορισμένους επίτοπους από ΠΟΤΕ (2γ), και ανοσογονικότητες τους δοκιμάστηκαν σε AAD διαγονιδιακά ποντίκια που έχουν ένα χιμαιρικό MHC τάξης Ι μόριο που αποτελείται από α1 και α2 περιοχές από HLA-A2 και το domain α3 από d

d [15]. Στη συνέχεια, ενισχυμένη δέσμευση τους σε μόρια HLA-A2.1 από την ενίσχυση επιτόπου για να κάνουν τα επιτόπια περισσότερο ανοσογόνα, χωρίς να χάσει την ικανότητα του ειδικού CD8

+ Τ κύτταρα να αναγνωρίζουν το επίτοπο άγριου τύπου σε σημαντικό βαθμό. Τέλος, επιβεβαίωσε τα τροποποιημένα επιτόπια προκαλείται από τα CTL που σκότωσε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα

ποντίκια ΔΣΕ [15] που εκφράζει ένα χιμαιρικό HLA-A2.1 διαγονίδιο με τις α1 και α2 περιοχές από HLA-A2.1 και την περιοχή α3 από H-2D

d, για να επιτρέψει σύνδεση προς CD8 ποντικού, σε C57BL /6 υπόβαθρο, χρησιμοποιήθηκαν σε αυτά τα πειράματα. Τμήματα των πειράματα επαναλήφθηκαν σε ΗΗΟ-2 ποντικοί (ένα δώρο από τον Dr. François Lemmonier, Institut Pasteur), τα οποία εκφράζουν χιμαιρικό ανθρώπινο HLA-Α2.1 με την ομοιοπολική ανθρώπινο β2m, χωρίς καμία τάξη ποντικού Ι μόριο [16] – [ ,,,0],18]. Τα ποντίκια εκτράφηκαν και στεγάζονται σε κατάλληλες εγκαταστάσεις φροντίδα των ζώων. Όλες οι διαδικασίες με ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα εγκεκριμένα πρωτόκολλα του ιδρύματος.

Τα πεπτίδια

Τα πεπτίδια σε αυτή τη μελέτη συντέθηκαν σε ένα μοντέλο Symphony Peptide Synthesizer (Perkin-Elmer, Boston, MA) με τη χρήση συμβατικών φθορενυλμεθοξυκαρβονυλ (f-MOC) χημεία και διασπάται από τη ρητίνη με τριφθοροξικό οξύ. Η καθαρότητα και η μοριακή συγκέντρωση αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσης σε μία στήλη C18 χρησιμοποιώντας βαθμίδα 0,1% τριφθοροοξικό οξύ σε νερό και 0.1% τριφθοροξικό οξύ σε ακετονιτρίλιο και καθαρίστηκε περαιτέρω με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης παρασκευαστική ανάστροφης φάσης χρησιμοποιώντας μια παρόμοια κλίση.

κυτταρικές Γραμμές

Η κυτταρική σειρά Τ2 είναι ελλειμματικό για τις πρωτεΐνες ΤΑΡ1 και ΤΑΡ2 μεταφορέα και εκφράζει χαμηλά επίπεδα του HLA-A2 [19]. Η κυτταρική γραμμή C1R.AAD προέρχεται από την ανθρώπινη Β λεμφοβλαστοειδή HMYC1R κυτταρική σειρά επιμολυσμένη με το χιμαιρικό μόριο HLA που περιέχει α1 και α2 τομέων από την ανθρώπινη HLA-A2.1 και α3 από H-2D

d ποντίκι, ένα δώρο από τον Δρ . V. Engelhard (Πανεπιστήμιο της Βιρτζίνια, Charlottesville, VA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Η C1R.A2.1 κυτταρική σειρά (ένα δώρο του Δρ William Biddison, NINDS, ΝΙΗ) προέρχεται επίσης από HMYC1R επιμολυσμένα με HLA-A2.1 [20], [21]. C1R.AAD και C1R.A2.1 κύτταρα διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο που αποτελείται από 10% FCS-RPMI 1640, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, μη απαραίτητα αμινοξέα (Βιορευστομηχανική, Rockville, MD), 4 mM γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 50 μΜ 2-ΜΕ. NCI-Η522 (ΠΟΤΕ

+ /HLA-A2

+) διατηρήθηκε σε πλήρες μέσο. ΗΤΒ-19 (ΠΟΤΕ

+ /HLA-A1

+) διατηρήθηκε σε ελάχιστο βασικό μέσο Eagle (ΕΜΕΜ) με 5% FCS. MDA-MB-231 (ΠΟΤΕ

– /HLA-A2

+) διατηρήθηκε σε 10% FCS-DMEM

δοκιμασία σύνδεσης Τ2

Το πεπτίδιο ικανότητα σύνδεσης με το.. HLA-A2 μόριο μετρήθηκε με τη χρήση της κυτταρικής γραμμής Τ2 σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [19], [22]. Τ2 κύτταρα (3 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) επωάστηκαν για μία νύχτα σε πλάκες 96 φρεατίων με μέσο καλλιέργειας (1:01 μίγμα από RPMI 1640 /Eagle-του Hank αμινοξέων που περιέχει 2.5% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) με 10 μg /ml β2-μικροσφαιρίνη (Sigma) και διαφορετικές τιτλοποιείται συγκεντρώσεις πεπτιδίων (ξεκινώντας από 100 μΜ με 2-φορές σειριακή αραίωση) όπως φαίνεται στα σχήματα για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση που δίδει 50 % αύξηση στη δέσμευση (βλέπε παρακάτω). Τα κύτταρα πλύθηκαν μια φορά με κρύο HBSS που περιείχε 0.1% BSA και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-HLA-A2.1 (κλώνος ΒΒ7.2) (αραίωση 1:40 από υπερκείμενο υβριδώματος). Μετά την πλύση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο κατσίκα αντι-ποντικός ανοσοσφαιρίνη (BD, San Jose, CA), και το επίπεδο έκφρασης HLA μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. έκφραση HLA-A2 ποσοτικοποιήθηκε ως δείκτης φθορισμού (FI) σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: FI = (γεωμετρικός μέσος ένταση φθορισμού με πεπτίδιο – γεωμετρική μέση ένταση φθορισμού χωρίς πεπτίδιο) /γεωμετρική μέση ένταση φθορισμού χωρίς πεπτίδιο. Φόντο φθορισμού χωρίς ΒΒ7.2 αφαιρέθηκε για κάθε τιμή. Για να συγκρίνετε τα διαφορετικά πεπτίδια, FI

0,5, η συγκέντρωση του πεπτιδίου που αυξάνει την έκφραση HLA-A2.1 κατά 50% σε σχέση με καμία φόντο ελέγχου πεπτιδίου, υπολογίστηκε από την καμπύλη τιτλοδότησης για κάθε πεπτίδιο. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η FI

0.5 παρέχει ένα σχετικό μέτρο του πεπτιδίου συγγένεια ή ισχύ μεταξύ των πεπτιδίων σε σύγκριση δίπλα-δίπλα, αλλά δεν μπορεί να ληφθεί ως θερμοδυναμική συγγένεια.

εμβολιασμούς

ΔΣΕ ή ΗΗΟ-2 ποντίκια ανοσοποιήθηκαν sc στη βάση της ουράς με 100 μΙ ενός γαλακτώματος που περιείχε 1:01 ατελές ανοσοενισχυτικό του Freund (Sigma) και PBS με πεπτίδια και κυτοκίνες (50 nmol του CTL επιτόπιο, 50 nmol του ιού της ηπατίτιδας Β πυρήνα 128-140 βοηθητικό επίτοπο, 5 μg ποντίκι ιντερλευκίνη 12, και 5 μg του κοκκιοκυττάρων μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικίας ποντικού). Οι κυτοκίνες αγοράσθηκαν από Peprotech (Rocky Hill, NJ). Τα ποντίκια δέχθηκαν αναμνηστική δόση 2 εβδομάδες αργότερα, και οι σπλήνες αφαιρέθηκαν 2 εβδομάδες μετά την αναμνηστική δόση. Για όλα τα πειράματα, χρησιμοποιήθηκαν ομάδες των τριών ποντικών

ιντερφερόνης-γ ELISPOT Δοκιμασία

Οι αριθμοί των IFN-γ κύτταρα που εκκρίνουν προσδιορίστηκαν με ένα κιτ ELISPOT (Mouse ΙΡΝ-γάμμα ELISpot SixPak.? R &? D, Minneapolis, ΜΑ) ή από ένα σύνολο αντι-ποντικού ΙΡΝ-επίστρωση γ (AN18) και την ανίχνευση (Κ4-6Α2) μονοκλωνικά αντισώματα (Mabtech) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δύο εβδομάδες μετά την τελευταία ανοσοποίηση, σπληνοκύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες επενδεδυμένες με αντίσωμα κατά 200.000, 100.000 και 50.000 κύτταρα /φρεάτιο και διεγέρθηκαν με 200.000 κύτταρα αφελή σπλήνα πεπτίδιο-παλμικά /φρεάτιο με ενδεικνυόμενη συγκέντρωση των πεπτιδίων επί 2 ώρες. Μετά από ολονύκτια επώαση στους 37 ° C, οι πλάκες πλύθηκαν και προστέθηκε αντίσωμα ανίχνευσης. Ένα μπλε μονάδα χρώμα ELISPOT (R & amp? D) χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη του χρώματος. Οι κηλίδες διαβάζονται από έναν αναγνώστη ELISPOT (AID). Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν.

In vitro

Τόνωση και κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία

Τα σπληνοκύτταρα από τους ανοσοποιημένους ποντικούς διεγέρθηκαν και πάλι με φορτωμένα με πεπτίδιο σπληνοκυττάρων (1 μΜ). Την ημέρα 1 και την ημέρα 5, Rat Τ Stim (BD Bioscience) προστέθηκε ως πηγή της IL-2. Μία εβδομάδα αργότερα, η δραστικότητα CTL μετρήθηκε με τη χρησιμοποίηση ενός προσδιορισμού απελευθέρωσης 4-h

51Cr. Τα κύτταρα στόχοι (10

6) σημάνθηκαν με πεπτίδια σε 200 μΐ πλήρους μέσου κυττάρων Τ και 150 μθί

51Cr για 2 ώρες, πλύθηκαν τρεις φορές, και προστέθηκε σε 3000 κύτταρα /φρεάτιο στην 96-φρεατίων στρογγυλού -bottom πλάκες με διαφορετικές αναλογίες Ε /Τ. Το ποσοστό της ειδικής έκλυσης

51 Cr υπολογίστηκε ως 100 Χ [(πειραματική απελευθέρωση – αυθόρμητη απελευθέρωση) /(μέγιστη απελευθέρωση – αυθόρμητη απελευθέρωση)]. Η αυθόρμητη απελευθέρωση προσδιορίστηκε από κύτταρα στόχους που επωάστηκαν χωρίς κύτταρα τελεστές, και η μέγιστη απελευθέρωση προσδιορίστηκε με την παρουσία 5% triton Χ-. κυτταρικές σειρές C1R.AAD ή C1R.A2.1 με ή χωρίς πεπτίδια ή ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα χωρίς πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν ως στόχοι. C1R.AAD ή C1R.A2.1 κυτταρικές σειρές δεν εκφράζουμε οποιαδήποτε άλλη MHC μόριο, είτε κατηγορίας Ι ή κατηγορίας II, εκτός από HLA-A2, έτσι ώστε να μην υπόκεινται σε ανησυχίες σχετικά με άλλο- ή xenoreactivity. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προεπωάστηκαν με 1000 ng /ml ανθρώπινο ΙΡΝ-γ για 72 ώρες πριν από τη δοκιμασία [23].

HLA-A2 /πεπτιδίου τετραμερούς Συγκροτήματα

Η τετραμερής MHC τάξης Ι /πεπτιδίου σύμπλοκα που λαμβάνονται από το μηχανισμό ΝΙΗ τετραμερούς συντέθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24], [25]. Εν συντομία, καθαρισμένα μόρια HLA-A2 μονής αλυσίδας συντέθηκαν με ένα προκαρυωτικό σύστημα έκφρασης (ΡΕΤ? R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ). Η βαριά αλυσίδα τροποποιήθηκε περιέχει το-A Bir ενζυματική θέση βιοτινυλίωσης. Μονής αλυσίδας βαριάς αλυσίδας-β2-μικροσφαιρίνης και το πεπτίδιο αναδιπλώθηκαν με αραίωση σε ένα ρυθμιστικό σύστημα redoxshuffling. Η αναδιπλωμένη προϊόν βιοτινυλιώθηκε με Bir-Α παρουσία βιοτίνης λιγκάσης (απληστία, Denver, CO). Στρεπταβιδίνη-φυκοερυθρίνη συζευγμένο (Jackson ImmunoResearch, West Grove, ΡΑ) προστέθηκε σε μια μοριακή αναλογία 1:04. Per-CP επισημασμένο αντι-ποντικού CD8 αντίσωμα (BD Pharmingen) και τον πίνακα ελέγχου TCR νβ (BD Pharmingen) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της ρεπερτόριο TCR των CTL.

Επιτόπου Enhancement

Για να βελτιωθεί η δεσμευτική των επιτόπων ΠΟΤΕ σε HLA-A2, εξετάσαμε τις ακολουθίες για την πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια υπολείμματα άγκυρα που θα μπορούσε να είναι καλύτερο, βάσει καθορισμένων πρωτοβάθμιας και δευτεροβάθμιας άγκυρες [26], [27], και συντίθενται πεπτίδια με απλές αντικαταστάσεις ΑΑ για να διορθώσει αυτές τις ελλείψεις . Αυτά στη συνέχεια εξετάστηκαν εμπειρικά όπως περιγράφεται στο Αποτελέσματα για δέσμευση και την ανοσογονικότητα και για τη δραστηριότητα της CTL που επάγεται.

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα με ποντικούς εγκρίθηκαν από την επιτροπή φροντίδας των ζώων και Χρήση εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, ΝΙΗ και της Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων.

Αποτελέσματα

Πρόβλεψη του HLA-Α2.1-περιορισμένους επίτοπους

Το πρωτότυπο ακολουθία ΠΟΤΕ έχει 584 υπολείμματα AA (αριθμός προσχώρησης AY172978, ref [12]). Πέντε πεπτίδια 9-μερές αρχικά επιλέγονται με βάση τα κατάλοιπα ΑΑ άγκυρα που καθορίζουν δέσμευση σε μόρια HLA-A2 και τρία προγνωστική αλγορίθμων [22], [26], [28] – [32]. Το σκορ Parker βασίζεται σε μια προβλεπόμενη μισή ώρα της διάστασης σε μόρια HLA τάξης Ι χρησιμοποιώντας μία μήτρα των ΕΑ σε κάθε θέση στην αλληλουχία βασίζεται σε γνωστά πεπτίδια πρόσδεσης, και ένα σκορ μεγαλύτερο από 100 προτείνεται ως πιθανός συνδετικό. Η δεύτερη αλγόριθμος αναπτύχθηκε από τον Δρ Zhiping Weng, η οποία βασίζεται στο γραμμικό προγραμματισμό για την πρόβλεψη πεπτίδια δέσμευσης HLA-A2 (https://zlab.bu.edu/SMM/). Μια Στο (IC50) μικρότερη από 8 προβλέπεται να είναι ένα συνδετικό HLA-A2. Η βαθμολογία SYFPEITHI αναπτύχθηκε από το εργαστήριο Hans-Georg Rammensee [29] (https://www.syfpeithi.de/). Μια SYFPEITHI υψηλότερη βαθμολογία από 21 προβλέπει μια πιθανή επίτοπο HLA-A2. Αν η ακολουθία προτάθηκε ως συνδετικό υλικό με μία οποιαδήποτε από τις προβλεπτική αλγορίθμων, το πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για ακόλουθη μελέτη. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, οι προβλέψεις δεν ήταν πλήρως συνεπή μεταξύ των τριών αλγορίθμων.

Η

Καθορίστε τη συγγένεια δέσμευσης ΠΟΤΕ πεπτιδίων σε HLA-A2 μόρια

Η συγγένεια δέσμευσης των προβλεπόμενων πεπτιδίων με HLA-A2 μόριο μετρήθηκε με την δοκιμασία σύνδεσης Τ2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, ΠΟΤΕ 323-331 και 272-280 ΠΟΤΕ έδειξε την ισχυρότερη συγγένεια δέσμευσης για το μόριο HLA-A2 με FI

0,5 0,8 μΜ και 0,9 μΜ, αντίστοιχα. ΠΟΤΕ 252-260 και ΠΟΤΕ 553 έως 561 ήταν ενδιάμεσα συνδετικά με FI

0,5 1,6 μΜ και 5,6 μΜ, αντίστοιχα. Επειδή ΠΟΤΕ 222-230 είναι ένα αδύναμο συνδετικό υλικό με μια FI

0,5 περίπου 42,4 μΜ, αυτή η ακολουθία έχει μικρή πιθανότητα να δεσμεύσει και να παρουσιάζεται από μόρια HLA-A2 σε CD8

+ Τ κύτταρα. Καλό και ενδιάμεσα συνδετικά επιλέχθηκαν για μελέτες ανοσογονικότητας σε HLA-A2 διαγονιδιακά ποντίκια.

(Α). Η συγγένεια δέσμευσης HLA-A2 του 5 προβλεπόμενης ΠΟΤΕ επιτόπων επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία σύνδεσης Τ2. Η υπολογιζόμενη FI

0,5 για ΠΟΤΕ 222, 252, 272, 323 και 553 ήταν περίπου 42,4 μΜ, 1.6 μΜ, 0.9 μΜ, 0.8 μΜ και 5,6 μΜ, αντίστοιχα. Η συγγένεια δέσμευσης των υποκατεστημένων ΠΟΤΕ 252 πεπτίδια (Β), τα υποκατεστημένα ΠΟΤΕ 553 πεπτίδια (C) ή τα υποκατεστημένα ΠΟΤΕ 323 πεπτίδια (D) σε μόρια HLA-A2. Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και τα δεδομένα σε αυτό το σχήμα είναι αντιπροσωπευτικά δύο πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. Η ανοσογονικότητα του επιτόπου ΠΟΤΕ 272 σε ποντικούς AAD (Ε). Οι ποντικοί ανοσοποιήθηκαν με 50 nmol του ΠΟΤΕ 272 σε 100 μΙ γαλακτώματος, και οι στόχοι σημάνθηκαν με 1,0 μΜ POTE272. Οι κηλίδες μετρήθηκαν με έναν αναγνώστη ELISPOT (σύστημα ανάγνωσης AID ELISPOT). Οι αριθμοί δείχνουν τον αριθμό των κηλίδων ανά εκατομμύριο κύτταρα. (F) CTL αντιδραστικότητα σε ΠΟΤΕ 272 πεπτίδιο. Σε 4 ώρες

δοκιμασία απελευθέρωσης 51Cr, τα κύτταρα CIR.AAD σημάνθηκαν με 1,0 μΜ ΠΟΤΕ 272 πεπτίδιο και επισημαίνεται με

51Cr. Μετά από πλύση τρεις φορές, τα κύτταρα στόχοι αναμίχθηκαν με διαφορετικούς αριθμούς κυττάρων-τελεστών και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 4 ώρες πριν από τη συγκομιδή.

Η

Επιτόπου Enhancement να αυξήσει τη συγγένεια σύνδεσης του ΠΟΤΕ πεπτίδια για HLA-A2 μόρια

Τ κύτταρα ειδικά για αυτο-πεπτίδια με καλή ικανότητα να δεσμεύει με μόριο MHC τάξης Ι είναι συχνά αρνητικά επιλέγονται [7]. Tumor πεπτίδια που σχετίζονται εμφανίζοντας ενδιάμεσο MHC τάξης Ι συγγένειες δέσμευσης μπορεί να είναι προτιμότερη ως υποψήφια εμβόλια. Επιπλέον, το MHC τάξης Ι πρόσδεσης και ανοσογονικότητα αυτών των συνδετικών ενδιάμεση συγγένεια μπορεί να βελτιωθεί με αντικατάσταση του πρωτογενούς ή δευτερογενούς άγκυρα ΑΑ με περισσότερο βέλτιστη αυτά δέσμευσης, μια διαδικασία που ονομάζεται εξάρτημα επίτοπο. Κάναμε πεπτίδια με υποκαταστάσεις ΑΑ για να εισάγετε γνωστό καλό υπολείμματα πρωτοβάθμιας ή δευτεροβάθμιας άγκυρα όταν αυτά δεν υπήρχαν ήδη, με βάση τις προηγούμενες εκθέσεις [26], [27]. Ως εκ τούτου, κάναμε τέτοιες τροποποιήσεις του ενδιαμέσου συνδετικά, ΠΟΤΕ 252 και ΠΟΤΕ 553, και πάλι προσδιορίζεται η συγγένεια δέσμευσης με μόρια HLA-A2 από τη δοκιμασία σύνδεσης Τ2. Εκτός από τα ενδιάμεσα συνδετικά, κάναμε επίσης υποκαταστάσεις ΑΑ σε ένα από τα καλύτερα συνδετικά, ΠΟΤΕ 323, να εξετάσει εάν η τροποποίηση θα μπορούσε να βελτιώσει περαιτέρω την συγγένεια δέσμευσής του σε μόρια HLA-A2. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, υποκαταστάσεις AA σε πρωτογενείς (θέση 2 και το άκρο C) ή δευτερογενή (θέση 1, 3 και 7) κατάλοιπα πρόσδεσης για τα μόρια HLA-A2 πραγματοποιήθηκαν εάν τα φυσικά υπολείμματα δεν ήταν ήδη βέλτιστη [22], [ ,,,0],26], [28], [30]. Εμείς δεν προσπάθησε να ενισχύσει ΠΟΤΕ 272 ως κρίναμε ότι ήταν απίθανο να βελτιωθεί σημαντικά.

Η

Πέντε τροποποιημένα πεπτίδια που παράγονται με βάση το ενδιάμεσο συνδετικό, ΠΟΤΕ 252. Όπως έδειξε στο Σχήμα 1Β, τόσο ΠΟΤΕ 252-9V και ΠΟΤΕ 252-1Y είχαν καλύτερη συγγένεια σύνδεσης με τα μόρια HLA-A2 από τον άγριο τύπο, ΠΟΤΕ 252. Η FI

0.5 των ΠΟΤΕ 252-9V και ΠΟΤΕ 252-1Y ήταν 0,8 μΜ και 0,9 μΜ, αντίστοιχα . Και οι δύο ήταν σχεδόν 2 φορές μικρότερη (υψηλότερη συγγένεια) από εκείνη του πεπτιδίου ΠΟΤΕ 252.

Τέσσερις υποκατεστημένο πεπτίδια έγιναν για μια άλλη ενδιάμεση συνδετικό, ΠΟΤΕ 553. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1Γ, όλα τα τροποποιημένα πεπτίδια, ΠΟΤΕ 553-1Y, ΠΟΤΕ 553-2L, ΠΟΤΕ 553-7A και ΠΟΤΕ 553-3F είχαν καλύτερη συγγένεια σύνδεσης με τα μόρια HLA-A2 από τον άγριο τύπο ΠΟΤΕ 553 πεπτίδιο. Η FI

0,5 αξίες ΠΟΤΕ 553-1Ywas 0,024 μΜ.

Τέσσερα πεπτίδια επίσης τροποποιηθεί από το καλύτερο συνδετικό υλικό, ΠΟΤΕ 323. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Δ, μόνο ΠΟΤΕ 323-3F θα μπορούσε να ενισχύσει τη συγγένεια πρόσδεσης σε μόρια HLA-A2, με την FI

0.5 0.09 μΜ, περίπου 3 φορές καλύτερη από την άγριου τύπου πεπτιδίου.

η ανοσογονικότητα μιας καλής HLA-A2.1 Binder, ΠΟΤΕ 272

Για να ελέγξετε την ανοσογονικότητα του πεπτιδίου ΠΟΤΕ 272, ομάδες των 3 ΣΔΕ διαγονιδιακά ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με ΠΟΤΕ 272 πεπτίδιο υποδορίως. Δύο εβδομάδες μετά την αναμνηστική δόση, τα σπληνοκύτταρα από 3 ποντικούς ομαδοποιήθηκαν για να μετρηθεί η ανοσογονικότητα τους

ex vivo

ΙΡΝ-γ ELISPOT δοκιμασίας και με δοκιμασία CTL μετά από μία εβδομάδα

in vitro

διέγερση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Ε, ΠΟΤΕ 272 επάγεται σημαντικές αποκρίσεις ΙΡΝ-γ εξής ΠΟΤΕ 272 διέγερση. Μετά από μία εβδομάδα

in vitro

διέγερση, τα CTL που επάγεται με ΠΟΤΕ 272 λυμένα κύτταρα στόχους παλλόμενα με ΠΟΤΕ 272 (Σχήμα 1 F). Ως εκ τούτου, ΠΟΤΕ 272 είναι ένα ανοσογόνο επίτοπο στην πρωτεΐνη ΠΟΤΕ. Ωστόσο, CD8

+ Τ κύτταρα ειδικά για αυτο-αντιγόνου με καλή συγγένεια πρόσδεσης μπορεί να επιλέγεται αρνητικά ή μη ανεκτική, έτσι ΠΟΤΕ 272 δεν μπορεί να είναι ένας καλός υποψήφιος ως εμβόλιο καρκίνου για την πρωτεΐνη ΠΟΤΕ, αν και αυτό παραμένει να είναι δοκιμαστεί.

η ανοσογονικότητα του άγριου τύπου και Ενισχυμένη ΠΟΤΕ 252 επιτόπιων και CD8

+ Τ-κυττάρων Cross-αντιδρώσα απαντήσεις

Τόσο ΠΟΤΕ 252-9V και ΠΟΤΕ 252-1Y είχαν καλύτερη σύνδεση συγγένεια σε μόρια HLA-A2 από το ΠΟΤΕ 252 (Εικόνα 1Β). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, και οι δύο ΠΟΤΕ 252 και ΠΟΤΕ 252-9V προκάλεσε μια σημαντική σειρά ΙΡΝ-γ κηλίδες με διασταυρούμενη αντιδραστικότητα τόσο ΠΟΤΕ 252 και ΠΟΤΕ 252-9V. Παρά το γεγονός ότι ΠΟΤΕ 252-1Y είχε μια καλύτερη συγγένεια σύνδεσης με τα μόρια HLA-A2 από ΠΟΤΕ 252, δεν υπάρχουν σημαντικές αποκρίσεις ΙΡΝ-γ ανιχνεύτηκαν στην δοκιμασία, ακόμη και με την παρουσία του πεπτιδίου ΠΟΤΕ 252-1Y. Μετά από 1-εβδομάδα του in vitro διέγερση με συγγενές πεπτίδιο, CD8

+ CTLs που επάγεται με αμφότερα άγριου τύπου ΠΟΤΕ 252 και ενισχυμένη επίτοπο ΠΟΤΕ 252-9V λυμένα κύτταρα στόχους που είχαν ωθηθεί με τον άγριο τύπο ΠΟΤΕ 252 καθώς και ΠΟΤΕ 252-9V. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι η TCRs των CTL που παράγονται σε ποντικούς που έχουν ανοσοποιηθεί είτε με άγριου τύπου ή ενισχυμένη πεπτίδιο θα μπορούσε να αναγνωρίσει το πεπτίδιο άγριου τύπου (POTE 252) /MHC κατηγορίας Ι σύμπλοκο (Σχήμα 2Β).

(Α) ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με 50 nmol του ΠΟΤΕ 252 σε 100 μΙ γαλακτώματος, και οι στόχοι σημάνθηκαν με 1,0 μΜ POTE252. Οι κηλίδες μετρήθηκαν με έναν αναγνώστη ELISPOT (σύστημα ανάγνωσης AID ELISPOT). Οι αριθμοί δείχνουν τον αριθμό των κηλίδων ανά εκατομμύριο κύτταρα. (Β) CTL διασταυρούμενη αντιδραστικότητα σε κάθε πεπτίδιο. Δύο εβδομάδες μετά την δεύτερη ενίσχυση, συγκεντρώθηκαν σπληνοκύτταρα από τρία ποντίκια επαναδιεγέρθηκαν με ακτινοβολημένα σπληνοκύτταρα δονήθηκαν με 1.0 μΜ κάθε πεπτιδίου για 7 ημέρες. Στη συνέχεια, ένα 4 ώρες

δοκιμασία απελευθέρωσης 51 Cr πραγματοποιήθηκε. (C) HLA-A2 /πεπτιδίου χρώση τετραμερούς και (Δ) TCR ρεπερτόριο προσδιορισμός για ΠΟΤΕ 252- και ΠΟΤΕ 252-9V επαγόμενη CTLs σε ΗΗΟ-2 ποντικούς.

Η

HLA-A2 τετραμερούς Stain και Ανάλυση TCR νβ Ρεπερτορίου

τα CTLs που επάγεται από ΠΟΤΕ 252-9V ήταν οι πιο έντονα σταυροειδώς αντιδραστική με αντιγόνο ΠΟΤΕ άγριου τύπου. Έχουμε περαιτέρω σύγκριση της απόκρισης και τη χρήση ΤΟΚ-ρεπερτόριο του ΠΟΤΕ-ειδικά CD8

+ Τ κύτταρα από ΗΗΟ-2 ποντικούς ανοσοποιημένους με ΠΟΤΕ 252 και 252-9V. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, 9,3% έναντι 6,8% του CD8

+ Τ κύτταρα ήταν τετραμερούς-θετικά στις ομάδες ανοσοποίησης POTE252 και ΠΟΤΕ 252-9V, αντίστοιχα. Με τη σύγκριση της ρεπερτόριο TCR του CD8

+ τετραμερούς

+ Τ κύτταρα μεταξύ των δύο ομάδων, τα δεδομένα (Εικόνα 2D) έδειξαν ότι η CTLs που επάγεται από ΠΟΤΕ 252 ήταν θετικά για νβ 6, 7, 8,1, 8,2, 9, 10, 11, με τα περισσότερα είναι είτε νβ 6, 9, 10 ή 11, ενώ ο CTLs που επάγεται από ΠΟΤΕ 252-9V ήταν θετικά για νβ 8, 9, 10, και 11, αλλά ήταν συντριπτικά κυριαρχείται από περίπου 80% θετικά για Vβ10 και μόνο ένα μικρό κλάσμα που εκφράζει τα άλλα. Έτσι, τα ρεπερτόρια TCR του CD8

+ τετραμερούς

+ Τ κύτταρα ήταν διακριτές μεταξύ του άγριου τύπου και βελτιωμένη πεπτίδιο ΠΟΤΕ ανοσοποιημένους ποντικούς.

Η ανοσογονικότητα του άγριου τύπου και Ενισχυμένη ΠΟΤΕ 553 επιτόπιων και CD8

+ Τ-κυττάρων Σταυρού απαντήσεις

Όλα τα υποκατασταθεί ΠΟΤΕ 553 πεπτίδια έδειξαν καλύτερη συγγένεια σύνδεσης με τα μόρια HLA-A2 από το ΠΟΤΕ 553 (Σχήμα 1C). Επιλέξαμε τις δύο καλύτερες συνδετικά μεταξύ αυτών ενισχύεται πεπτίδια, μαζί με το πεπτίδιο άγριου τύπου, για τη δοκιμή των ανοσογονικότητες και διασταυρούμενη αντίδραση CTL αποκρίσεις. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και Β, ΠΟΤΕ 553 δεν προκάλεσε οποιεσδήποτε σημαντικές αποκρίσεις ΙΡΝ-γ σε οποιαδήποτε συγκέντρωση πεπτιδίου που χρησιμοποιήθηκε για διέγερση. Μετά από μία εβδομάδα

in vitro

διέγερση, παρομοίως δεν υπήρχε καμία σημαντική ανιχνεύσιμη λύση των κυττάρων στόχων (Εικόνα 3C). Ως εκ τούτου ΠΟΤΕ 553, ως ενδιάμεσο HLA-A2 συνδετικό υλικό, δεν είναι ανοσογόνος. Τόσο ΠΟΤΕ 553-1Y και ΠΟΤΕ 553-2L επαγόμενη κάποιο επίπεδο της ΙΡΝ-γ αποκρίσεις μόνο μετά από διέγερση με το ίδιο πεπτίδιο (Σχήμα 3Α, Β). Στο Σχήμα 3Β, τα κύτταρα-στόχοι σημάνθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις πεπτιδίου για να αποδειχθεί ότι η ενισχυμένη πεπτίδιο θα μπορούσε να επάγει υψηλής συγγένειας Τ κυττάρων να σκοτώσουν κύτταρα στόχους παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων αντιγόνου. Σύμφωνα με το

ex vivo

ΙΡΝ-γ δοκιμασία ELISPOT, καμία διασταυρούμενη αντίδραση σε πεπτίδιο άγριου τύπου ανιχνεύθηκε στο CTLs που προκαλείται από ΠΟΤΕ 553-1Y ή ΠΟΤΕ 553-2L πεπτίδια. Ωστόσο, μετά από μία εβδομάδα

in vitro διέγερση

, CD8

+ CTLs που επάγεται με την ενισχυμένη επίτοπο ΠΟΤΕ 553-1Y λυμένα κύτταρα στόχους παλλόμενα με όχι μόνο ΠΟΤΕ 553-1Y, αλλά επίσης ΠΟΤΕ 553 και 553- ΠΟΤΕ 2L πεπτίδια, υποδηλώνοντας ότι η TCRs των CTL αναγνώρισαν την ΠΟΤΕ 553 /MHC τάξης Ι συγκρότημα σε κάποιο βαθμό (Εικόνα 3C). Από αυτή την άποψη, ΠΟΤΕ-553-1Y μπορούσε να είναι μια πιθανή εναλλακτική λύση εμβόλιο κατά του καρκίνου κατά του αντιγόνου ΠΟΤΕ. Αν και ΠΟΤΕ 553-2L μπορεί να διεγείρει ορισμένες ΙΡΝ-γ αποκρίσεις μετά από διέγερση με το ίδιο πεπτίδιο (Σχήμα 3Α, Β), CD8

+ CTLs που επάγεται με ΠΟΤΕ 553-2L έκανε δεν λύουν κύτταρα στόχους σε παλμούς με ΠΟΤΕ 553-2L (Εικόνα 3C).

ποντίκια ΔΣΕ ανοσοποιήθηκαν sc με ένα μείγμα πεπτιδίου και κυτοκινών σε ανοσοενισχυτικό περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. (Α, Β) Δύο εβδομάδες μετά την δεύτερη ενίσχυση, σπληνοκύτταρα συγκεντρώθηκαν από τρεις ποντικούς επαναδιεγέρθηκαν με κύτταρα σπλήνας από παρθένα ποντίκια AAD πάλλονται με 10 ηΜ έως 1000 ηΜ του κάθε πεπτιδίου σε διαφορετικές αναλογίες Ε /Τ (1000 ηΜ χρησιμοποιήθηκε στο πάνελ Α) . Οι κηλίδες μετρήθηκαν με έναν αναγνώστη ELISPOT (σύστημα ανάγνωσης AID ELISPOT). Οι αριθμοί δείχνουν τον αριθμό των κηλίδων ανά εκατομμύριο κύτταρα. (C) CTL διασταυρούμενη αντιδραστικότητα σε κάθε πεπτίδιο. Σε μια 4 ώρα

δοκιμασία απελευθέρωσης 51Cr, CIR.AAD κύτταρα δονήθηκαν με 1.0 μΜ κάθε πεπτιδίου και επισημασμένο με

51Cr. Μετά από πλύση τρεις φορές, τα κύτταρα στόχοι αναμίχθηκαν με διαφορετικούς αριθμούς κυττάρων-τελεστών και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 4 ώρες πριν από τη συγκομιδή.

Η

ανοσογονικότητα του άγριου τύπου και Ενισχυμένη ΠΟΤΕ 323 Επίτοποι και CD8

+ T Κυτταρικός Cross-αντιδρώσα Responses

ΠΟΤΕ 323-3F ήταν το μόνο τροποποιημένο πεπτίδιο με την καλύτερη συγγένεια δέσμευσης HLA-A2 από άγριου τύπου ΠΟΤΕ 323 (Εικόνα 1D). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, τόσο ΠΟΤΕ 323 και ΠΟΤΕ 323-3F επάγεται κάποια αποκρίσεις ΙΡΝ-γ μετά από διέγερση με το ίδιο πεπτίδιο. Ακόμη και αν το πεπτίδιο ΠΟΤΕ 323 ήταν το καλύτερο συνδετικό HLA-A2 εντός της αλληλουχίας ΠΟΤΕ, μόνο περιθωριακή αποκρίσεις ΙΡΝ-γ (λιγότερο από 2 φορές πάνω από το επίπεδο υποβάθρου) ανιχνεύθηκαν με την δοκιμασία ELISPOT. Μετά από μία εβδομάδα

in vitro

διέγερση, τα CTL που επάγεται από ΠΟΤΕ 323 απέτυχαν να λύουν κύτταρα στόχους παλλόμενα με ΠΟΤΕ 323. Αυτή η αρνητική απόκριση CTL μπορεί να οφείλεται στην απώλεια ενός σημαντικού μέρους των αντιδρώντων κυττάρων με υψηλής απληστίας που θα μπορούσαν έχουν σκοτωθεί κατά την διάρκεια της επώασης με μία σχετική υψηλή συγκέντρωση του πεπτιδίου (1,0 μΜ). ΠΟΤΕ 323-3F επήγαγαν σημαντικές κηλίδες ΙΡΝ-γ υπό ΠΟΤΕ 323-3F διέγερση, και κάποιο βαθμό απόκρισης ΙΡΝ-γ ανιχνεύθηκε επίσης μετά από διέγερση με άγριου τύπου ΠΟΤΕ 323 επιτόπου. Μετά

in vitro

διέγερση με το συγγενές πεπτίδιο, CD8

+ CTLs που επάγεται με την ενισχυμένη επίτοπο ΠΟΤΕ 323-3F λυμένα κύτταρα στόχους που είχαν ωθηθεί με το ΠΟΤΕ 323-3F, καθώς και άγριου τύπου ΠΟΤΕ 323, υποδηλώνοντας ότι οι TCRs των CTL θα μπορούσαν να αναγνωρίσουν το άγριου τύπου πεπτίδιο (POTE 323) /MHC κατηγορίας Ι σύμπλοκο (Σχήμα 4Β). ΠΟΤΕ 323-3F ήταν περισσότερο ανοσογόνο για την επαγωγή CTLs ειδικό για τον επίτοπο άγριου τύπου απ ‘ότι ήταν ο άγριου τύπου επιτόπιο ίδια. Ως εκ τούτου, ΠΟΤΕ 323-3F θα μπορούσε να είναι ένα εξαιρετικό υποψήφιο εμβόλιο να στοχεύουν τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν ΠΟΤΕ.

ποντίκια ΔΣΕ ανοσοποιήθηκαν υποδορίως με 50 nmol πεπτιδίου σε 100 μΐ γαλακτώματος, όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. (Α) άμεση ex vivo δοκιμασία ΙΡΝ-γ ELISPOT χρησιμοποιώντας κύτταρα στόχους που είχαν ωθηθεί με 1000 ηΜ πεπτίδιο. Οι αριθμοί δείχνουν τον αριθμό των κηλίδων ανά εκατομμύριο κύτταρα. (Β) CTL διασταυρούμενη αντιδραστικότητα σε ΠΟΤΕ 323 και ΠΟΤΕ 323-3F πεπτίδια. (C) κυτταροτοξικότητα αντι-όγκου κατά μία ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα ΠΟΤΕ εκφράζουν NCI-Η522 που προκαλείται από ΠΟΤΕ 553-1Y, 323-3F και 252-9V. ποντικοί ΗΗΟ-2 ανοσοποιήθηκαν με 50 nmol του πεπτιδίου αναφέρεται σε 100 μΐ γαλακτώματος και επαναδιεγέρθηκαν για 7 ημέρες με 1000 ηΜ πεπτίδιο πριν να δοκιμάζονται για την ικανότητα να λύουν τα κύτταρα του όγκου. (Δ) Περίληψη της κυτταροτοξικότητας κατά των όγκων σε ΠΟΤΕ εκφράζουν και μη ΠΟΤΕ εκφράζουν ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. ΝΟΙ-Η522 είναι μια ανθρώπινη γραμμή καρκίνου του πνεύμονα που εκφράζουν τόσο ΠΟΤΕ και HLA-A2, ενώ ΗΤΒ-19 είναι ένα καρκίνωμα ανθρώπινου μαστού που εκφράζει ΠΟΤΕ αλλά όχι το HLA-A2, και MDA-MB-231 είναι μια κυτταρική γραμμή καρκινώματος ανθρώπινου μαστού εκφράζουν HLA -Α2 αλλά δεν ΠΟΤΕ. Θανάτωση μόνο την πρώτη από αυτές τις επιδείξεις η εξειδίκευση για ΠΟΤΕ σε συνδυασμό με HLA-A2. (Αρνητικές τιμές οφείλονται σε πειραματικές

απελευθέρωσης 51Cr ελαφρώς κάτω από αυθόρμητη απελευθέρωση χωρίς κύτταρα τελεστές, εντός του πειραματικού σφάλματος, και έτσι θα πρέπει να θεωρηθεί ως ισοδύναμη με το μηδέν).

Η

CTL που Induced από Τροποποιήθηκε ΠΟΤΕ πεπτίδια ενάντια σε κύτταρα Human Cancer

για να χρησιμεύσουν ως εμβόλια υποψήφιος όγκου, επαγωγή της κυτταροτοξικότητας για να σκοτώσει ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα είναι απαραίτητη. Τρεις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, ΝΟΙ-Η522 (ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, ΠΟΤΕ

+ /HLA-A2

+), ΗΤΒ-19 (ανθρώπινο καρκίνωμα του μαστού, ΠΟΤΕ

+ /HLA- Α1

+) και MDA-MB-231 (ανθρώπινος καρκίνος του μαστού κύτταρο, ΠΟΤΕ

– /HLA-A2

+) επιλέχθηκαν ως κύτταρα στόχοι σε αυτή τη μελέτη. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C & amp?