Αφηρημένο

Πρόσφατες μελέτες υπογραμμίζουν τον σημαντικό ρόλο των microRNAs (miRNA) στην ανάπτυξη των πνευμόνων Καρκίνος. Οι κύριοι ρυθμιστές των miRNA βιογένεση είναι οι ριβονουκλεάσες Drosha, Dicer και ago2. Εδώ αξιολογήθηκε ο ρόλος των πρωτεϊνών πυρήνα του miRNA μηχανήματα βιογένεσης στην απόκριση του ανθρώπινου μη μικροκυτταρικού και μικρές κυτταρικές γραμμές καρκινώματος του πνεύμονα σε θεραπεία με ιοντίζουσα ακτινοβολία. Βρήκαμε ότι Drosha και Dicer εκφράστηκαν σε υψηλότερα επίπεδα σε ραδιοανθεκτικά αλλά όχι σε ευαίσθητες κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, κάτω ρύθμιση είτε Dicer ή Drosha δεν είχε καμία επίδραση επί της ευαισθησίας των κυττάρων σε ακτινοβολία. Εξάλειψη των συστατικών του συμπλόκου σίγηση του RNA επαγόμενη ago2 και Tudor σταφυλοκοκκική νουκλεάση, επίσης, δεν ευαισθητοποιήσει κύτταρα στην ίδια μεταχείριση. Έτσι, η διαμόρφωση των miRNA μηχανημάτων βιογένεση δεν είναι αρκετή για να αυξήσει τη ραδιοευαισθησία των όγκων του πνεύμονα και άλλες στρατηγικές που απαιτούνται για την καταπολέμηση του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Surova O, Akbar NS, Zhivotovsky Β (2012) Knock-Down των πυρήνα Πρωτεΐνες ρύθμιση microRNA βιογένεση έχει καμία επίδραση στην ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε ιοντίζουσα ακτινοβολία. PLoS ONE 7 (3): e33134. doi: 10.1371 /journal.pone.0033134

Συντάκτης: Eric J. Bernhard, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Νοέμβρη του 2011? Αποδεκτές: 5 Φεβρουαρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 30, Μάρτη 2012

Copyright: © 2012 Surova et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας, της σουηδικής και της Στοκχόλμης Καρκίνος Εταιρειών, το Ίδρυμα Καρκίνου σουηδική παιδική ηλικία, σουηδική Εταιρεία Ιατρικής Έρευνας, το ρωσικό Υπουργείο υψηλής Παιδείας και Επιστημών (11.G34.31.0006), το FP- ΕΚ 6 (Chemores), καθώς και τα προγράμματα (APO-SYS) του 7ου ΠΠ. OS υποστηρίζεται από μια υποτροφία από το Σουηδικό Ινστιτούτο και του Ινστιτούτου Καρολίνσκα και NA από την τριτοβάθμια εκπαίδευση της Επιτροπής του Πακιστάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα (LC) είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο και στις γυναίκες και τους άνδρες. Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι αυτής της νεοπλασίας, καρκίνωμα μικρών κυττάρων του πνεύμονα (SCLC) και μη μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα (NSCLC), τα οποία διαφέρουν σημαντικά ως προς ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά και τις απαντήσεις στη θεραπεία τους. Η ιονίζουσα ακτινοβολία, μόνο του ή σε συνδυασμό με χειρουργική επέμβαση ή χημειοθεραπεία, είναι μια αποτελεσματική θεραπεία για πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων LC. Ωστόσο, τόσο εγγενούς και επίκτητης ραδιοαντοχή όγκου μειώσει σημαντικά την αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας για NSCLC και SCLC και συχνά οδηγούν σε υποτροπή και μετάσταση. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό για να εξερευνήσετε των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την αντίσταση των LC κυττάρων στην ακτινοβολία.

Τα microRNAs (miRNA), μη-πρωτεΐνη κωδικοποίηση, μονόκλωνο RNA των 19-25 νουκλεοτιδίων, αποτελούν ένα μυθιστόρημα κατηγορία των ρυθμιστικών γονιδίων και έχουν αναφερθεί να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο στη μεταμόρφωση του καρκίνου [1]. Πρόσφατες μελέτες απέδειξαν την παρεκκλίνουσα έκφραση των miRNAs σε LC [2] – [5]. Η παραγωγή miRNAs απαιτεί μια σειρά πρωτεϊνών που αναφέρονται συλλογικά ως μηχανήματα miRNA. Η ανώμαλη έκφραση των συστατικών της μηχανής miRNA έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση, συμπεριλαμβανομένων LC [6], [7]. Up-ρύθμιση του Dicer σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και ο ρόλος της στην ανάπτυξη περιφερειακών αδενοκαρκινώματα έχουν αναφερθεί [7]. Υψηλή έκφραση άλλων RNA επαγόμενη φίμωση σύμπλεγμα πρωτεϊνών (RISC), εύθραυστου Χ διανοητική καθυστέρηση σύνδρομο σχετίζεται πρωτεΐνη 1 (FXR1), Tudor-SN (TSN) και πρωτεΐνη ενεργοποιητή της ιντερφερόνης-επαγόμενη πρωτεϊνική κινάση (PACT), έχει αποδειχθεί σε SCLC [7]. Μια άλλη ομάδα που περιγράφεται η σύνδεση μεταξύ μειωμένη έκφραση Dicer και κακή πρόγνωση σε ασθενείς με LC [8]. Έτσι, οι πρόσθετες έρευνες που απαιτείται για να διευκρινιστεί περαιτέρω ο ρόλος των μηχανημάτων miRNA στην μοριακή παθογένεση του LC. Πρόσφατα, το δυναμικό θεραπευτικό αποτέλεσμα της εξάντλησης Dicer στην χημειοευαισθησία και του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του μαστού έχει αναφερθεί. Η knock-down του Dicer με siRNA οδήγησε σε σημαντική G1 σύλληψη και αυξημένη ευαισθησία στο DNA που βλάπτουν παράγοντα, σισπλατίνη, στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MCF-7 [9]. Λαμβανομένων υπόψη των θεμελιωδών και πολλαπλούς βιολογικούς ρόλους των miRNAs σε διαφορετικές κυτταρικές διεργασίες, η διαμόρφωση της έκφρασης των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην miRNAs βιογένεση μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση για την περαιτέρω κλινική εφαρμογή. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν στοιχεία σχετικά με το ρόλο των πρωτεϊνών miRNA που παράγουν μηχανισμούς αντοχής /ευαισθησίας των κυττάρων LC σε θεραπεία. Συνεπώς, διερευνήσαμε αν η εξάντληση του πυρήνα πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην βιογένεση miRNAs επηρεάζει την αντίσταση του LC στην ακτινοθεραπεία. Παραδόξως, knock-down της έκφρασης των Drosha, Dicer, Argonaute2 και Tudor-SN από την RNA παρεμβολής δεν αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων NSCLC που ήταν ανθεκτικοί στη θεραπεία με ιονίζουσα ακτινοβολία.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και θεραπείες

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου NSCLC U1810, U1299 (τόσο από τη συλλογή UU), Α549, H661, Η157, Η23 (όλα από την ATCC)? και SCLC κυτταρικές σειρές Η69 (ECACC), Η82 (ATCC), U1906, U1690, U2020, U1285 (όλα από τη συλλογή UU) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS), γλουταμίνη ( 2 mM), πενικιλλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) (όλα ελήφθησαν από την Gibco) στους 37 ° C, 5% CO

2 και 95% υγρασία. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ακτινοβολία σε δόση των 8 Gy χρησιμοποιώντας ένα

πηγή 60Co (Karolinska Biomics Κέντρο, Karolinska University Hospital) για τις περιόδους που αναφέρονται στους θρύλους σχήμα.

Αξιολόγηση της απόπτωσης

η απόπτωση προσδιορίστηκε με την ποσότητα των κυττάρων στη φάση υπο-G1. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) που περιείχε 0.1% FBS. Ένα σύνολο 1 × 10

6 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν στις 2000 στροφές ανά λεπτό και πλύθηκαν μία φορά σε PBS. Το σφαιρίδιο επανααιωρήθηκε σε 250 μλ παγωμένο PBS και αναμίχθηκε με 2 mL παγωμένου 70% στάγδην αιθανόλη ενώ στροβιλισμό. Τα δείγματα διατηρήθηκαν στους 4 ° C για 24 ώρες και στη συνέχεια σφαιροποιήθηκαν στις 2000 στροφές ανά λεπτό και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Μετά την τελευταία πλύση τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 360 μL PBS που περιείχε 100 μg /mL RNase Α (Fermentas) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα. Σαράντα μL του διαλύματος ιωδιούχου προπιδίου (στοκ σε 0.5 mg /mL) προστέθηκε στα δείγματα που ακολουθείται από επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με ήπια αιώρησης και προστασία από το φως. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACScan, Becton Dickinson), και τα δεδομένα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Cell Quest.

Δοκιμασία δράση της κασπάσης

Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS, επαναιωρήθηκαν σε 25 μL PBS, λύθηκαν με κατάψυξη σε υγρό άζωτο, επωάζονται με κασπάση-3-σαν υπόστρωμα και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. δραστικότητα κασπάσης εκφράστηκε ως πολλαπλάσια του αύξηση σε σχέση με κατάλληλους ελέγχους.

siRNA Επιμόλυνση

siRNAs που στοχεύουν ανθρώπινη Dicer1, Drosha, Argonaute2 και μη στόχευση siRNA ως αρνητικός έλεγχος ελήφθησαν από Thermo Scientific Dharmacon® και αποθηκεύεται σε συγκέντρωση 20 μΜ. Είκοσι-τέσσερις ώρες πριν από την επιμόλυνση τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων σε μέσο ανάπτυξης χωρίς αντιβιοτικά. siRNAs αραιώθηκαν σε 100 μι RPMI 1640 (Gibco) και αναμιγνύεται με το Αντιδραστήριο 1 μL DharmaFECT®1 siRNA Επιμόλυνσης (Thermo Scientific Dharmacon®). Μετά από 20 λεπτά επώασης, τα σύμπλοκα προστέθηκαν στα κύτταρα για να δώσει μία τελική συγκέντρωση του siRNAs στο μέσο του 50 ηΜ. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο αντικαταστάθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ακτινοβολία.

Western Blot Detection

Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας πλήρες ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Roche) συν αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (PIC, πλήρης-M, Roche). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης BCA (Pierce). Μετά την ανάμειξη με ρυθμιστικό Laemmli, το δείγματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και κηλίδωση Western. Για ανοσοανίχνευση, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: anti-Dicer, αντι-διασπασμένη PARP, αντι-διασπασμένη κασπάση 3, αντι-διασπασμένη κασπάση-9 (όλα αποκτήθηκαν από την Cell Signaling Technology), αντι-ago2, αντι-Drosha (και τα δύο από Millipore), αντι-XPO5, αντι-PRKRA (PACT) (και τα δύο από Abnova), αντι-FXR1 (Santa Cruz Biotechnology), αντι-β-ακτίνης (Sigma-Aldrich), και αντι-GAPDH (Trevigen). Υπεροξειδάση αρμορακίας σημασμένα δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού (Pierce) και μια ενισχυμένη κιτ χημειοφωταύγειας (αντιδραστήριο Western blot ανίχνευση, GE Healthcare UK Limited) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των αναγνωρισμένων πρωτεϊνών. Η πυκνομετρική ανάλυση για την ποσοτικοποίηση του σχετικού επιπέδου έκφρασης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

RNA ήταν απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας PureLink ™ RNA Mini Kit (Invitrogen). Μεταγραφεί αντίστροφα cDNAs από τα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα. Argonaute2 (ago2-αριστερά ctaccttcccctggaggtctg και ago2 δεξιά cgacctagcagtcgctctga) και 18S ριβοσωμικό RNA (18S-1 cgctactaccgattggatggtt και 18S-2 agtcaagttcgaccgtcttctc) εκκινητές (Invitrogen) έχουν σχεδιαστεί για να ταιριάζει με την αλληλουχία cDNA στόχου. Είκοσι ng του ανάστροφα μεταγραφέντος cDNA εκμαγείο αναμίχθηκε με SYBR® Πράσινο PCR Master Mix (Applied Biosystems) και ενισχύθηκαν με χρήση 7500 PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems) με το ακόλουθο πρόγραμμα: 40 κύκλοι, με κάθε κύκλο να αποτελείται από ένα στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 s και ένα στάδιο ανόπτησης /επέκτασης στους 60 ° C για 1 λεπτό.

Στατιστική αξιολόγηση

Τα αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM Στατιστική αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια μη-paired t-test.

Αποτελέσματα

Η έκφραση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην miRNA Βιογένεση στον NSCLC και SCLC

Για να προσδιορίσει μοριακοί στόχοι για η ραδιοευαισθητοποίηση των κυττάρων LC μεταξύ των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην βιογένεση miRNA πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης επτά βασικών συστατικών miRNA μηχανήματα σε ένα πάνελ NSCLC και SCLC (έξι κυτταρικές γραμμές σε κάθε πίνακα). Για κάθε LC υπότυπο επιλέχθηκαν οι κυτταρικές γραμμές με βάση την ακτινοευαισθησία τους, όπως μετράται από το κλάσμα που επιβιώνουν μετά από έκθεση σε 2 Gy (SF2) σε μια δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση, και ομαδοποιούνται σε ακτινοευαίσθητα (RS) με SF2 & lt? 0.3 Gy ή ραδιοανθεκτικά (RR) με SF2 ≥ 0,3 Gy [11] – [14]. Τα βασικά επίπεδα όλων των πρωτεϊνών (Drosha, Dicer, exportin-5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), πρωτεΐνη ενεργοποιητή της ιντερφερόνης-επαγόμενη πρωτεϊνική κινάση (PACT), εύθραυστου Χ διανοητική καθυστέρηση σύνδρομο σχετίζεται πρωτεΐνη 1 (FXR1) και Argonaute2 (ago2) εκτιμήθηκαν με κηλίδα Western σε όλες τις επιλεγμένες κυτταρικές σειρές πριν από την ακτινοβολία (Σχήμα 1Α). και τα δύο ένζυμα RNase III (Drosha και Dicer) εκφράστηκαν σε σχετικά υψηλά επίπεδα σε κύτταρα NSCLC σε σύγκριση με SCLC. Ένα μέλος της karyopherins οικογένεια πρωτεϊνών, XPO5, το οποίο εμπλέκεται στην πυρηνική εξαγωγή του miRNAs, εκφράστηκε σε υψηλότερο επίπεδο σε H661 ενώ χαμηλά επίπεδα έκφρασης παρατηρήθηκαν σε Η69 και U1690 σε σύγκριση με τις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές. το επίπεδο έκφρασης του TSN, PACT, πρωτεΐνες FXR1 και ago2 δεν διέφεραν ριζικά μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών σειρών, με την εξαίρεση του Η69, που επέδειξε χαμηλότερη έκφραση όλων των υπό μελέτη πρωτεϊνών. όπως πάνελ μας αποτελείτο από δύο RS και κυττάρων RR, η κυτταρική γραμμή Η23 επιλέχθηκε ως ο εκπρόσωπος της ακτινοευαίσθητα κυττάρων, και U1810 και H661 χρησιμοποιήθηκαν ως εκπρόσωποι των ακτινοανθεκτικά κυττάρων σε περαιτέρω έρευνες. Πυκνομετρική ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης αποκάλυψε ότι Dicer, Drosha και XPO5 εκφράστηκαν σε υψηλότερα επίπεδα σε RR κυττάρων σε σύγκριση με την RS, ενώ δεν υπήρχε σαφής συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των ago2, TSN, PACT και FXR1 και SF2 τιμές (Εικόνα 1Β) .

(Α) ανάλυση Western blot του επιπέδου της πρωτεΐνης έκφρασης του Drosha, Dicer, exportin 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), πρωτεΐνη ενεργοποιητή της ιντερφερόνης-επαγόμενη πρωτεϊνική κινάση (PACT), εύθραυστου Χ νοητική υστέρηση πρωτεΐνη του συνδρόμου που σχετίζονται με 1 (FXR1) και Argonaute 2 (ago2) σε ένα πίνακα του NSCLC (U1810, U1299, Α549, H661, Η157, Η23) και SCLC (U1285, Η82, Η69, U1690, U1906, U2020 ) κυτταρικές σειρές. (Β) Ανάλυση πυκνομετρική των σχετικών επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης σε Η23, κυτταρικές γραμμές Η1299, U1810 και H661. Οι κυτταρικές σειρές που διανέμονται σύμφωνα με ακτινοευαισθησία, μετρούμενη ως το κλάσμα επιβιώνουν σε 2 Gy (SF2). Ίση φόρτωση πιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντι-β-ακτίνης αντισώματα. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Επίδραση των Ιοντιζουσών Ακτινοβολιών στην miRNA Μηχανήματα σε NSCLC

Για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου των εξαρτημάτων μηχανών miRNA στην απόκριση των κυττάρων LC σε ακτινοβολία, δύο RR κυτταρικές γραμμές (U1810 και H661) και ένα RS γραμμή (H23) από τον πίνακα του NSCLC υποβλήθηκαν σε ακτινοβολία γάμμα και η έκφραση πρωτεΐνης αναλύθηκε 6, 24 και 48 ώρες μετά την αγωγή. Όπως ήταν αναμενόμενο, μαζικό θάνατο αποπτωτικού κυτταρικού παρατηρήθηκε σε Η23 σε 6 ώρες μετά την ιονίζουσα ακτινοβολία, όπως εκτιμάται από τη διάσπαση της PARP, ενώ H661 και U1810 ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία μετά από 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα (Σχήμα 2). Δεν υπάρχουν ορατές μεταβολές στην έκφραση οποιασδήποτε από τις μελετηθείσες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν είτε σε RR ή κύτταρα RS, όπως μετράται με κηλίδα Western στις 6, 24 και 48 ώρες μετά την αγωγή IR (Σχήμα 2). Ετσι, η γάμμα ακτινοβολία δεν επηρεάζει την έκφραση του πυρήνα πρωτεΐνες του μηχανήματος miRNA σε NSCLC, ανεξάρτητα από το RR ή RS φαινότυπος αυτών των καρκινικών κυττάρων.

Η διάσπαση της PARP και το επίπεδο της έκφρασης του Drosha, Dicer, exportin 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), πρωτεΐνη ενεργοποιητή της ιντερφερόνης-επαγόμενη πρωτεϊνική κινάση (PACT), και εύθραυστου Χ νοητική υστέρηση πρωτεΐνη σύνδρομο σχετίζεται 1 (FXR1) σε U1810, H661 και H23 κύτταρα ανιχνεύθηκαν με Western κηλίδα στις 6, 24 και 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση με 8 Gy. Ίση φόρτωση πιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντι-β-ακτίνης αντισώματα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Νοκ-κάτω της Πυρήνα πρωτεϊνών που εμπλέκονται στο πρώτο βήμα του miRNA Βιογένεσις δεν αρκεί για να ευαισθητοποιήσει NSCLC κύτταρα σε ακτινοβολία

Δεδομένου ότι το επίπεδο της πρωτεΐνη έκφραση τουλάχιστον τρία συστατικά μηχανημάτων miRNA, Dicer, Drosha και XPO5, συσχετίσθηκε θετικά με την ραδιοαντοχή των κυττάρων NSCLC, το υψηλό επίπεδο έκφρασης τους μπορεί να συμβάλει στην αντιμετώπιση των καρκινικών κυττάρων »σε επεξεργασία σε miRNA-καθοδηγούμενη μόδας. Για να διερευνήσουν τη δυνατότητα αυτή, αποφασίσαμε να διερευνήσει την πιθανή επίδραση ευαισθητοποίησης των κάτω ρύθμιση των πρωτεϊνών Dicer και Drosha στην U1810 κυτταρική σειρά. Η πυρηνική ριβονουκλεάση Drosha και η κυτταροπλασματική Dicer ριβονουκλεάση είναι οι δύο κύριοι ρυθμιστές του πρώτου σταδίου της παραγωγής miRNA και να προωθήσει τη διάσπαση των μεγάλων πρωτογενών μεταγραφές στα ενδιάμεσα φουρκέτα (προ-miRNAs) και την επακόλουθη διάσπαση σε ώριμη miRNAs. Έτσι, με την εξάλειψη είτε αυτών των δύο πρωτεϊνών πυρήνα περιμέναμε να μειώσει την παραγωγή miRNA και να επηρεάσουν την ραδιοαντοχή των κυττάρων NSCLC.

Ο knock-down του Dicer σε U1810 κύτταρα διεξήχθη χρησιμοποιώντας παρεμβολή RNA, μετά την οποία τα κύτταρα ήταν υπεβλήθη σε ακτινοβολία γάμμα και αναλύθηκαν 48 ώρες μετά την αγωγή. Η πλήρης αποσιώπηση της έκφρασης πρωτεΐνης Dicer επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western πριν και μετά την ακτινοβολία (Σχήμα 3Α). Κάτω ρύθμιση των Dicer ακολούθησε η μειωμένη παραγωγή αρκετών miRNAs (miR1301, miR1249, miR1227, miR532-3p, miR625, miR1827, miR324-5p) όπως αξιολογήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, τα κύτταρα U1810 με απεμπλουτισμένο Dicer παρουσίασαν ως ισχυρή απάντηση σε ιονίζουσα ακτινοβολία όπως έκανε κύτταρα άγριου τύπου. Δεν υπήρχαν διαφορές στην διάσπαση της PARP μεταξύ ελέγχου και Dicer κύτταρα νοκ-κάτω (Σχήμα 3Α). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων μετά την ακτινοβολία ήταν η ίδια σε όλες τις ομάδες μελετημένα (Σχήμα 3Β). Ανάλυση της ενεργοποίησης των κασπασών έδειξε ότι κασπάσης-3 και -9 ήταν εξίσου σε επεξεργασία μετά την ακτινοβόληση και ότι κασπάσης-3-σαν δραστικότητα ήταν σχεδόν πανομοιότυπη και στις δύο άγριου τύπου και Dicer εξαντλημένο κύτταρα (Σχήμα 3Α και C). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα επί ραδιοαντοχή ήταν εμφανής όταν Drosha εξαντλήθηκε σε U1810 κύτταρα. Δεν υπάρχουν αλλαγές σε διάσπαση PAPR (Σχήμα 3D) ή με τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων (Σχήμα 3Ε) ανιχνεύθηκαν μεταξύ ελέγχου και Drosha κύτταρα νοκ-κάτω 48 ώρες μετά την ιονίζουσα radiaiton. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν μετά την εξάλειψη του Dicer και Drosha από άλλα NSCLC κυτταρικές σειρές (Σχήμα S1 και S2). Συνολικά αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η knock-down είτε Dicer ή Drosha δεν ήταν επαρκής για να ευαισθητοποιήσει κύτταρα NSCLC σε ακτινοβολία γάμμα

(A) Το επίπεδο της έκφρασης Dicer, η διάσπαση της PARP και την επεξεργασία της κασπάσης-3 και. – 9 U1810 κύτταρα επιμολυσμένα (48 ώρες) με έλεγχο (si SCR) ή Dicer (siDicer) siRNA αξιολογείται με κηλίδα Western 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Ίση φόρτωση επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-GAPDH. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Ανίχνευση αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου σε U1810 αξιολογείται με μέτρηση του πληθυσμού υπο-G1 μετά την επιμόλυνση (48 ώρες) με ελεγχόμενη ή Dicer siRNA και θεραπεία ακτινοβολίας (48 h). (C) Κασπάση-3-παρόμοια δραστικότητα (πλάσια αύξηση σε σχέση με τον έλεγχο) σε U1810 κύτταρα μετά από επεξεργασία με είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με την επιμόλυνση του ελέγχου ή Dicer siRNA ακτινοβολία (για λεπτομέρειες βλέπε Υλικά και μέθοδοι). (Δ) Το επίπεδο της έκφρασης Drosha και διάσπαση της ΡΑΚΡ σε κύτταρα επιμολυσμένα U1810 (48 ώρες) με μάρτυρα (si SCR) ή Drosha (siDrosha) siRNA αναλύθηκαν με Western blot 48 ώρες μετά τη θεραπεία με ακτινοβολία. Ίση φόρτωση επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-GAPDH. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Απόπτωση σε U1810 μετρήθηκε με ανάλυση του πληθυσμού υπο-G1 μετά την επιμόλυνση (48 ώρες) με ελεγχόμενη ή Drosha siRNA και θεραπεία ακτινοβολίας (48 h). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± S.E.M. από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

κάτω ρύθμιση των κύριων συνιστωσών του RNA που προκαλείται Σίγαση Complex (RISC) δεν ευαισθητοποίηση NSCLC κύτταρα σε ακτινοβολία

Από την εξάντληση των βασικών πρωτεϊνών του πρώτο στάδιο της βιογένεσης miRNA δεν επηρέασε την ραδιοευαισθησία του NSCLC, είναι πιθανό ότι παρεμβολή RNA με μεσολάβηση knock-down του είτε Dicer ή Drosha αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση, αλλά όχι την πλήρη απώλεια, των ώριμων miRNA λόγω της μεγάλης ημίσειας ζωής των ώριμων μορίων. miRNAs είναι σταθερά τη στιγμή που θα εισέλθουν στο συγκρότημα του τελεστή. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να μπλοκάρει το δεύτερο βήμα των miRNA βιογένεση με νοκ-κάτω από τα δύο κύρια συστατικά του RISC, Argonaute2 και Tudor-SN, και, επομένως, ο ρόλος τους στην ραδιοαντοχή των κυττάρων LC. Η αποτελεσματική προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του ago2 στην U1810 κυτταρική γραμμή επιβεβαιώθηκε με μέτρηση mRNA έκφρασης της, η οποία μειώνεται έως και κατά 95% μετά την επιμόλυνση με αντι-ago2 siRNA (Σχήμα 4Α). Παρ ‘όλα αυτά, η αποπτωτική απόκριση (που αξιολογήθηκε με διάσπαση PARP και την επεξεργασία της κασπάσης-3 και -9) που παρουσιάζεται από τα κύτταρα ago2-εξαντλημένο μετά την ακτινοβολία ήταν τόσο ισχυρή όσο στα κύτταρα U1810 άγριου τύπου (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στο ποσοστό του πληθυσμού υπο-G1 ή την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 μετά την ιονίζουσα ακτινοβολία, αν και οι δύο παράμετροι ήταν ελαφρά μειωμένες σε ago2 ρυθμισμένα προς τα κάτω-κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου (Σχήμα 4C και D).

(A) Το επίπεδο των Argonaute2 (ago2) mRNA σε U1810 κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο (scram) ή ago2 siRNA κανονικοποιούνται κατά 18S ριβοσωμικού RNA. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± S.E.M. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Διάσπαση της PARP και την επεξεργασία της κασπάσης-3 και -9 σε U1810 κύτταρα επιμολυσμένα (48 ώρες) με μάρτυρα (si SCR) ή ago2 siRNA, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ακτινοβολία επί 48 ώρες. Ίση φόρτωση επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-GAPDH. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (C) Ανίχνευση του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα U1810 μετά την επιμόλυνση (48 ώρες) με ελεγχόμενη ή ago2 siRNA και μετέπειτα επεξεργασία με ακτινοβολία (48 h). (D) Κασπάση-3-παρόμοια δραστικότητα (φορές αύξηση σε σχέση με τον έλεγχο) σε U1810 κύτταρα μετά από επεξεργασία με είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με την επιμόλυνση με τον έλεγχο ή ago2 siRNA ακτινοβολία. Όλα τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος ± S.E.M. από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Τέλος, η ίδια σειρά πειραμάτων διεξήχθη με σκοπό να χτυπήσει κάτω την έκφραση του άλλου συστατικού RISC, Tudor-SN. Εκτός από τη λειτουργία του ως ένα συστατικό του πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα που εμπλέκονται στην miRNA λειτουργία, TSN είναι γνωστό ότι δρα ως ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής και ογκογονιδίου σε πολλούς καρκίνους. Επιπλέον, διασπάται κατά την διάρκεια της απόπτωσης. Ακόμη και αν σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης TSN χρησιμοποιώντας siRNA επιτεύχθηκε το U1810 κύτταρα, όπως φαίνεται με ανάλυση κηλίδος Western, τα κύτταρα νοκ-κάτω παρουσίασαν παρόμοια διάσπαση της PARP ως άγριου τύπου μετά από επεξεργασία με ιοντίζουσα ακτινοβολία (Σχήμα 5Α). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων δεν διέφερε μεταξύ ελέγχου και TSN νοκ-κάτω ομάδες μετά την ακτινοβολία (Σχήμα 5Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για δύο άλλες κυτταρικές σειρές από τον πίνακα NSCLC (Α549 και H661) μετά από ρύθμιση προς τα κάτω του TSN (Σχήμα 5C και D).

Το επίπεδο έκφρασης Tudor-SN και διάσπαση της ΡΑΚΡ σε U1810 (Α), Α549 (C) και κύτταρα H661 (D) επιμολυσμένα (48 ώρες) με μάρτυρα (si SCR) ή Tudor-SN (si TSN) siRNA αναλύθηκαν με κηλίδα Western 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Ίση φόρτωση επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-GAPDH. (Β) Το αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα U1810 μετά την επιμόλυνση με TSN siRNA και ακτινοβολία. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

Ακτινοθεραπεία είναι ένα σημαντικό θεραπευτικό όπλο στην LC. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα αυτού του τύπου της θεραπείας περιορίζεται από την αρχική ή επίκτητη ραδιοαντοχή των καρκινικών κυττάρων. NSCLC χαρακτηρίζεται από χαμηλό ποσοστό ανταπόκρισης του όγκου σε ακτινοβολία και ένα ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μόνο το 7% έως 10% [15]. SCLCs αρχικά ανταποκρίνονται καλά στη συμβατική χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, αλλά να αναπτύξουν απέκτησε χημειοθεραπεία και ραδιοαντοχή κατά τα επόμενα 3 έως 12 μήνες, και το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι μόλις 5% [16]. Οι μηχανισμοί που οδηγούν στην ραδιοαντοχή αυτών των όγκων δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητοί.

έχουν miRNAs αναφερθεί ότι είναι πιθανό διαγνωστικό ή θεραπευτικοί στόχοι στη θεραπεία του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των όγκων του πνεύμονα. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις της συσχέτισης μεταξύ της έκφρασης των miRNAs σε όγκους και χημειοθεραπείας και της ακτινοευαισθησία, τόσο όσον αφορά την πρόβλεψη και τη ρύθμιση της ευαισθησίας [17] – [20]. Μια πρόσφατη μελέτη για NSCLC εντοπίζονται ένα υποσύνολο των miRNAs που δείχνει ισχυρή αλλαγές στην έκφραση σε απόκριση σε ακτινοβολία. Έτσι, μια παγκόσμια απάντηση miRNA υπάρχει σε όλα τα κύτταρα του όγκου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, και miRNAs μπορεί να είναι συστατικά της κυτταρικής απόκρισης σε κυτταροτοξικά προσβολή [20]. Παρόμοια ευρήματα σχετικά με τις αλλαγές στην παγκόσμια έκφραση των miRNAs έχουν αναφερθεί μετά την αντικαρκινική θεραπεία με διάφορα χημειοθεραπευτικά φάρμακα σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και δείγματα ασθενών [21]. Η έκφραση των συστατικών επεξεργασίας miRNA δείχθηκε να απελευθερωθεί σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνους [8], [22], [23] και, ως εκ τούτου, θα μπορούσε να συμβάλει στην απόκριση όγκου κυττάρων σε θεραπεία σε ένα miRNA καθοδηγούμενη μόδας ή ανεξάρτητα από την μονοπάτι παρεμβολή RNA. Κάτω ρύθμιση του Dicer σε MCF-7 καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή με siRNA δείχθηκε ότι προκαλεί G1 σύλληψη και την αύξηση της ευαισθησίας με το DNA που βλάπτουν παράγοντα, σισπλατίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο συνδυασμός της στρατηγικής αντι-Dicer και παραδοσιακή χημειοθεραπεία θα μπορούσε να βελτιώσει την αποδοτικότητα της θεραπείας του καρκίνου [9]. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι Dicer τα κάτω ρύθμιση μπορεί να αυξήσει την πολλαπλασιαστική και διηθητική ικανότητα των κυττάρων του όγκου in vitro και ομοίως προάγει πολλαπλασιασμό υποδόριου ξενομοσχεύματος όγκου in vivo 24. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι miRNA μηχανήματα παίζει είτε αρνητικό ή θετικό ρόλο στην μεταμόρφωση του όγκου και ανταπόκριση στη θεραπεία σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε ως στόχο να αποσαφηνίσει το ρόλο των συστατικών βιογένεση miRNA στη ρύθμιση της απόκρισης στην ακτινοβολία των NSCLC και SCLC κυτταρικές σειρές. Προκειμένου να προσδιοριστούν μοριακοί στόχοι για ραδιοευαισθητοποίηση, η ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης των επτά βασικών πρωτεϊνών των μηχανημάτων miRNA, Drosha, Dicer, XPO5, TSN, PACT, FXR1 και ago2, πραγματοποιήθηκε σε ένα πίνακα του NSCLC και SCLC κυτταρικές σειρές. Τα ευρήματά μας έδειξαν την υψηλότερη έκφραση των πρωτεϊνών Drosha και Dicer σε κύτταρα ανθεκτικά σε ακτινοβολία σε σύγκριση με τα ευαίσθητα γραμμές. Ωστόσο, knock-down αυτών των δύο απαραίτητων πρωτεϊνών δεν επηρέασε την ευαισθησία των κυττάρων NSCLC σε θεραπεία με ακτινοβολία γάμμα. Αυτό μπορεί εν μέρει να οφείλεται στο μεγάλο χρόνο ημιζωής της ώριμης miRNA. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η παρεμβολή RNA με μεσολάβηση knock-down του Drosha, XPO5-5 ή τα αποτελέσματα Dicer σε σημαντική μείωση, αλλά όχι η πλήρης απώλεια, των ώριμων miRNA [25] – [28]. Από miRNAs φαίνεται να είναι αρκετά σταθερό τη στιγμή που θα εισέλθουν στο συγκρότημα τελεστή, διερευνήσαμε τη δυνατότητα αύξησης της ακτινοευαισθησία των κυττάρων του όγκου πνεύμονα από την εξάντληση των συστατικών κατάντη της οδού βιογένεσης miRNA, δηλαδή, δύο κύριες πρωτεΐνες RISC, ago2 και Tudor-SN. Παρ ‘όλα αυτά, προς τα κάτω ρύθμιση αυτών των πρωτεϊνών δεν επηρέασε την ευαισθησία των κυττάρων NSCLC στη θεραπεία. Έτσι, μπορεί να υπάρχουν εναλλακτικής οδού (ες) βιογένεση που μπορεί να ενεργοποιείται με διάσπαση ενός από τα πολλαπλά βήματα στην κανονική διαδικασία βιογένεσης miRNA. Ορισμένες miRNAs βρέθηκαν να δημιουργείται μέσω μιας Dicer-ανεξάρτητο μονοπάτι βιογένεση: μετά την επεξεργασία από Drosha, οι προ-miRNAs μπορούν να φορτωθούν κατευθείαν στο πριν και διασπάται από το καταλυτικό κέντρο πριν για να παράγει ένα ενδιάμεσο 3` άκρο, το οποίο περαιτέρω κομμένα [29]. Υπάρχει επίσης μια κατηγορία των μη κανονικών miRNAs που παρακάμπτουν τον μικροεπεξεργαστή Drosha, αλλά εξακολουθούν να απαιτούν Dicer για βιογένεση τους [30]. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η ανάλυση της πρωτεΐνης έκφραση όλων των βασικών εξαρτημάτων της μηχανής miRNA στην U1810 κύτταρα πραγματοποιείται μετά προς τα κάτω ρύθμιση των Dicer, Drosha, TSN ή ago2 αποκάλυψε ότι κανένας από τους knock-downs είχε σημαντική επίδραση στην έκφραση της άλλες πρωτεΐνες στο μονοπάτι, δηλαδή παρατηρήθηκε καμία αύξηση στην έκφραση των εξαρτημάτων μηχανών miRNA παρακάτω knock-downs (Σχήμα S3). Από την άλλη πλευρά, μια πρόσφατη μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε αθανατοποιημένα και πρωτογενών ενδοθηλιακών κυττάρων έδειξε ότι η παγκόσμια καταστολή της έκφρασης miRNA επιτυγχάνεται μέσω ρύθμισης προς τα κάτω είτε πρωτεΐνες ago2 ή Dicer χρησιμοποιώντας siRNA οδήγησε σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο μετά από ακτινοβόληση [31]. Αυτό υποδεικνύει ότι η συμβολή της μηχανής miRNA στην απόκριση σε ακτινοθεραπεία ενδέχεται υψηλά εξαρτώνται από τον τύπο των κυττάρων και να είναι διαφορετική σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα.

Μια άλλη έκθεση έδειξε ότι miRNA βιογένεση είναι παγκοσμίως επάγεται μετά βλάβη του DNA σε μια αταξία -telangiectasia μεταλλαγμένο (ΑΤΜ) κινάση με τρόπο που εξαρτάται σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (ΠΜΑ) μετά από κατεργασία με ραδιομιμητικού νεοκαρκινοστατίνη φάρμακο (NCS), η οποία παράγει δίκλωνα σπασίματα (DSBs). ρυθμιστική πρωτεΐνη KH-τύπου splicing (KSRP) βρέθηκε να είναι ένας βασικός παράγοντας που μεταφράζεται σηματοδότηση βλάβη του DNA στα miRNA βιογένεση. Η κινάση ΑΤΜ συνδέεται άμεσα και φωσφορυλιώνει KSRP, οδηγώντας σε αυξημένη αλληλεπίδραση μεταξύ KSRP και pri-miRNAs και αυξημένη δραστηριότητα KSRP στην επεξεργασία των miRNA [32]. Είτε KSRP ενεργοποιείται και συμβάλλει στην επεξεργασία miRNA στον NSCLC μετά την προς τα κάτω ρύθμιση των βασικών εξαρτημάτων της μηχανής miRNA και θεραπεία με ακτινοβολία γάμμα Απομένει να διευκρινιστεί.

Επιπλέον, είναι γνωστό ότι οι περισσότεροι miRNAs έχουν δεκάδες να εκατοντάδες των στόχων, και ότι τα mRNA στόχου μπορεί να δεσμεύσει πολλαπλά miRNAs. Ίσως το μέγεθος της μείωση της παραγωγής και της δραστηριότητας που προκαλείται από την εξάλειψη ενός μόνο πρωτεΐνη από μια οδό miRNA miRNA δεν είναι αρκετό για να επηρεάσει τις μηχανισμών που ευθύνονται για την ανθεκτικότητα των κυττάρων LC σε θεραπεία ακτινοβολίας. Με άλλα λόγια, είναι πιθανό ότι μια πραγματική επίπτωση στην ραδιοαντοχή των κυττάρων NSCLC μέσω μηχανήματος miRNA δεν μπορεί να επιτευχθεί με την εξάλειψη του ενιαίου πρωτεϊνών από το μονοπάτι βιογένεση, και έτσι περαιτέρω ταυτοποίηση και τη στόχευση συγκεκριμένων miRNAs που εμπλέκονται στην απόκριση του LC κυττάρων σε θεραπεία ακτινοβολίας είναι απαραίτητη.

συνοπτικά, στην παρούσα μελέτη, η έκφραση ενός συνόλου πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην βιογένεση miRNA αξιολογήθηκε για πρώτη φορά σε μια ομάδα ανθρώπινων κυτταρικών σειρών LC. Ακόμη και αν η έκφραση του πυρήνα πρωτεϊνών της οδού miRNA συσχετίζεται με την αντίσταση των κυττάρων στην ακτινοθεραπεία, το knock-down αυτών των πρωτεϊνών δεν ήταν αρκετή για να προκαλέσει την ευαισθητοποίηση των κυττάρων LC σε αυτό το είδος της θεραπείας. Αυτό υποδηλώνει ότι ραδιοαντοχή πνεύμονα όγκος δεν μπορεί να ξεπεραστεί με τη διαφοροποίηση των μηχανημάτων βιογένεση των miRNAs και ότι οι άλλες στρατηγικές που απαιτούνται για την καταπολέμηση του καρκίνου του πνεύμονα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Η έκφραση του Dicer και διάσπασης της ΡΑΚΡ σε Α549 και H661 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο (si SCR) ή Dicer (si Dicer) siRNA αναλύθηκαν με Western blot 48 ώρες μετά τη θεραπεία με ακτινοβολία (Α). Ίση φόρτωση επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-GAPDH. (Β) Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος σε Α549 και H661 κύτταρα μετρήθηκε με ανάλυση του πληθυσμού υπο-G1 μετά την επιμόλυνση (48 ώρες) με ελεγχόμενη ή Drosha siRNA και θεραπεία ακτινοβολίας (48 ώρες)

doi:. 10.1371 /journal.pone. 0033134.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Το επίπεδο Drosha και διασπασμένη PARP σε Α549 (Α) και τα κύτταρα H661 (C) μετά από knock-down του Drosha. Ίση φόρτωση επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-GAPDH. (Β) Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε Α549 επιμολυσμένα με Drosha siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ακτινοβολία (48 h). . (D) Κασπάση-3-παρόμοια δραστικότητα (φορές αύξηση σε σχέση με τον έλεγχο) σε κύτταρα H661 μετά από επεξεργασία με είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με την επιμόλυνση με τον έλεγχο ή Drosha siRNA ακτινοβολία

DOI: 10.1371 /journal.pone.0033134. S002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Το επίπεδο των Drosha, Dicer, XPO5, TSN, PACT μετά knock-down του Dicer, Drosha, TSN και ago2 σε U1810 κύτταρα. Ίση φόρτωση επαληθεύτηκε με τη χρήση αντι-ΟΑΡϋΗ αντισώματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033134.s003

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να εκφράσουν την ευγνωμοσύνη προς Hogir Salim, Νταλί Zong και Birgitta Mörk (Karolinska Biomics Κέντρο, Τμήμα Ογκολογίας-Παθολογίας, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα) για την τεχνική βοήθεια.