Αφηρημένο

Τα καρκινικά κύτταρα ανταποκρίνονται στο στρες ενεργοποιώντας μια ποικιλία από μονοπάτια σηματοδότησης επιβίωσης. Ένα disintegrin και μεταλλοπρωτεϊνασών (ADAM) 9 ρυθμίζεται αυξητικά κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου και ορμονοθεραπεία, λειτουργώντας εν μέρει μέσω της αύξησης των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου. Εδώ, παρουσιάζουμε

in vitro

και

in vivo

απόδειξη ότι η θεραπευτική στόχευση της έκφρασης του γονιδίου ADAM9 από φακοϊό υπολειπόμενων μικρό φουρκέτα RNA (shRNA) αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών καρκίνου ανθρώπινου προστάτη και αποκλείστηκαν την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού της μετάστασης του προστάτη του οστού του καρκίνου. Μελέτες κυτταρικού κύκλου επιβεβαίωσε μια αύξηση στην G1 φάση και μείωση του πληθυσμού S-φάση των καρκινικών κυττάρων κάτω από συνθήκες στρες πείνας, η οποία συσχετίζεται με αυξημένα επίπεδα ενδοκυτταρικού υπεροξειδίου. δεδομένων των μικροσυστοιχιών έδειξαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα της αναγέννησης νησίδα που προέρχονται από μέλος της οικογένειας 4 (REG4) έκφραση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη με νοκ ντάουν της γονιδιακής έκφρασης ADAM9. Αυτή η ρύθμιση προς τα κάτω REG4 είχε επίσης ως αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης του p21

Cip1 /WAF1, η οποία ρυθμίζει αρνητικά την κυκλίνη D1 και μπλοκάρει το G1 /S μετάβαση. Τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ένα νέο μοριακό μηχανισμό του ADAM9 στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, και προτείνει μια συνδυασμένη τροπικότητα της γονιδιακής θεραπείας ADAM9 shRNA και κυτταροτοξικών παραγόντων για ορμονοάντοχο και οστών μεταστατικό καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Liu CM , Hsieh CL, Ο YC, Lo SJ, Liang JA, Hsieh TF, et al. (2013) In Vivo Στόχευση των ADAM9 Gene Expression Χρησιμοποιώντας φακοϊό Δημοσιεύθηκε shRNA Καταστέλλει προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου με τη ρύθμιση REG4 Εξαρτημένων εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. PLoS ONE 8 (1): e53795. doi: 10.1371 /journal.pone.0053795

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6, Σεπ 2012? Αποδεκτές: 3 Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Γενάρη του 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από NSC99-2320-B-039-029-my3 του Εθνικού Συμβουλίου Επιστήμης, Ταϊβάν (https://web1.nsc.gov.tw)? NHRI-EX99-9902BI, NHRI-EX100-9902BI και NHRI-EX101-9902BI του Εθνικού Ερευνητικού Ινστιτούτου Υγειονομικής, Ταϊβάν (https://www.nhri.org.tw). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

εμφανίζονται σε περισσότερους από το 80% του προχωρημένου σταδίου περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη, σκελετικές μεταστάσεις συσχετίζεται με υψηλό ποσοστό νοσηρότητας? ένα ποσοστό επιβίωσης 5 ετών από 25% και μέση επιβίωση περίπου 40 μήνες [1]. Σκελετικές μεταστάσεις, λόγω της ανάπτυξης του πόνου των οστών, που σχετίζεται με καρκίνο κατάγματα των οστών και της σπονδυλικής συμπίεσης, καθώς και κρανιακή νευροπάθεια, αναιμία και λοίμωξη, μπορεί να μειώσει σημαντικά την ποιότητα ζωής των ασθενών με καρκίνο του προστάτη [2], [3]. Επί του παρόντος, στέρηση ανδρογόνου είναι η πρώτη γραμμή θεραπείας για μεταστατικό καρκίνο του προστάτη? Ωστόσο, ο καρκίνος του προστάτη θα προχωρήσει συχνά σε ένα στάδιο με οστά μεταστατικό ανεξάρτητου από ανδρογόνο. Μόλις συμβεί αυτό εξέλιξης, η χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία είναι οι κύριες θεραπευτικές επιλογές, οι οποίες προκαλούν δυσάρεστες παρενέργειες και παρέχουν μόνο ένα περιορισμένο όφελος με την ποσότητα και την ποιότητα της ζωής [4]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να αναζητήσουμε νέες θεραπευτικές τους παράγοντες που μπορεί να έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει την επιβίωση των ασθενών με ορμονοάντοχο και οστά μεταστατικό καρκίνο του προστάτη.

Παρά τις πρόσφατες προόδους στην θεραπευτικές στρατηγικές, πολλοί κακοήθεις καρκίνοι συνεχίσουν να αναπτύσσουν ανθεκτικότητα σε ακτινοβολία και στοχευμένες θεραπείες [5], [6]. Αντίσταση εμφανίζεται ως αποτέλεσμα της απόκρισης στρες, επιτρέποντας κακοήθη κύτταρα για να ξεπεραστεί η κυτταροτοξική δράση πολλών θεραπειών [7]. Ένα disintegrin και μεταλλοπρωτεϊνασών (ADAM) 9 είναι ένα σημαντικό μέλος μιας οικογένειας γονιδίων disintegrin και μεταλλοπρωτεϊνασών. Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από την οικογένεια αυτή μεσολαβούν κυτταρικές αποκρίσεις σε περιβαλλοντικό στρες από την αλληλεπίδραση με μία ποικιλία πρωτεϊνών κυτταρικής επιφανείας και για τη ρύθμιση διάφορες κυτταρικές διεργασίες που συμπεριλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, εξωκυτταρική δεσμευτική μήτρα, και εξωτερικό τομέα ρίχνοντας [8] – [12]. Προηγούμενο έργο που επιτέλεσε η ομάδα μας [13] και άλλοι [14] έχουν αποδειχθεί σε κλινικές μελέτες ότι τα υψηλότερα επίπεδα ADAM9 συσχετίζονται με μικρότερη περίοδο ύφεσης του καρκίνου του προστάτη. Δείξαμε επίσης μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ του όγκου χρώση ADAM9 και τον κίνδυνο υποτροπής του καρκίνου του προστάτη και του θανάτου σε ασθενείς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξητική ορμόνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι μια προοδευτική αύξηση στην έκφραση ADAM9 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για φτωχή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη μετά από θεραπεία ορμονικής [15]. Επιπλέον, νοκ ντάουν της ADAM9 αποτελέσματα έκφρασης σε αυξημένη ραδιοευαισθησία και χημειοευαισθησία για θεραπευτικούς παράγοντες [16], υποδεικνύοντας ότι η υπερέκφραση ADAM9 από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι πιθανός μηχανισμός διαφυγής για την αντιμετώπιση του στρες που προκαλείται από τον καρκίνο κυτταρικό θάνατο? Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τις κατάντη ρυθμιστικούς μηχανισμούς με τους οποίους ADAM9 προάγει επιβίωση των καρκινικών κυττάρων σε απάντηση στο στρες. Δεδομένου ότι η αυξημένη έκφραση ADAM9 παρατηρείται σε πολλές προηγμένες όγκους, αυτό αυξάνει την πιθανότητα ότι ADAM9 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για τον καρκίνο στοχευμένη γονιδιακή θεραπεία, αν και απαιτείται περαιτέρω έρευνα.

Στην παρούσα μελέτη, να αξιολογήσει τη σκοπιμότητα της φορέα λεντοϊού-παραδοθεί μικρό RNA φουρκέτας (shRNA) έναντι ADAM9 για τη θεραπεία του μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα και μεταστατικό καρκίνο των οστών ανθρώπινου προστάτη σε ένα πειραματικό ζωικό μοντέλο. Ο μοριακός μηχανισμός που υπογραμμίζει την θεραπευτική δράση της ADAM9 στοχοθετημένη γονιδιακής θεραπείας επίσης διευκρινιστεί.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

λήφθηκαν ρετροϊικούς φορείς που περιέχουν shRNA που στοχεύει ADAM9 και ελέγχου shRNA από το Open Biosystems (Lafayette, CO). Φορέα λεντοϊού ADAM9 shRNA και τους ελέγχους ελήφθησαν από το Μηχανισμό Εθνικού RNAi πυρήνα στο Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας /Genomic Research Center, Academia Sinica, Ταϊβάν. Τα αντισώματα αντι-ADAM9 ελήφθησαν από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). Αντι-ανθρώπινο EF1-α που ελήφθη από την Millipore (Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε ως αντίσωμα ελέγχου.

Κυτταροκαλλιεργειών

Το μεταστατικό καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή ανεξάρτητου από ανδρογόνα, PC3 και εξαρτώμενων από ανδρογόνα προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή, LNCaP, χρησιμοποιήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες [13], [17] και καλλιεργήθηκαν σε Τ-μέσο (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 5% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 50 IU /ml πενικιλλίνη και 50 μg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen) και διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C.

Φορείς και παρεμβολή RNA

Ο ρετροϊικός πλασμίδιο pSM2C και shRNA ειδικό για ADAM9, καθώς και το πλασμίδιο ελέγχου pGIPZ και shRNA ειδικά REG4 στόχευσης ελήφθησαν από Open Biosystems. Η λεντοϊού pLKO, τον έλεγχο shGFP και shRNA με στόχο το mRNA της ακολουθίας κωδικοποίησης ADAM9 ελήφθησαν από το Μηχανισμό Εθνικού RNAi πυρήνα στο Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας /Genomic Research Center, Academia Sinica, που υποστηρίζεται από το Εθνικό Πρόγραμμα Έρευνας για Γονιδιωματική Ιατρική Επιχορηγήσεις NSC (NSC 97-3112-B-001-016). πληροφορίες Target παρατίθενται στο Σχήμα S1. Αυτοί οι φορείς shRNA δομήθηκαν με εισαγωγή ανοπτημένα ολιγονουκλεοτίδια που περιέχουν την αλληλουχία shRNA εντός EcoRI και AgeI θέσεις καθοδικά του υποκινητή U6 στον φορέα pLKO.1. Η ανασυνδυασμένη lentivirus μεταφέρουν shRNA παρήχθη με συν-επιμόλυνση 293FT κυττάρων με ένα μίγμα πλασμιδίου DNA που αποτελείται από PMD-G (VSV-G φακέλου), pCMV-ψR8.91 (Gag /Pol /Rev), και φορείς pLKO /1-shRNA χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TurboFect (Fermentas, Glen Burnie, ΜΑ) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Virus περιέχουν υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν 2 ημέρες μετά την επιμόλυνση και χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν PC3, LNCaP, και τα κύτταρα RCC52 σε συνδυασμό με 8 μg /mL πολυβρένιο (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Σταθερές κυτταρικές γραμμές επιλέχθηκαν με καλλιέργεια κυττάρων σε 2,5 μg /mL πουρομυκίνη (Calbiochem, La Jolla, CA) για μία εβδομάδα. κηλίδα Western, FACS, ή qPCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του knockdown γονιδιακής έκφρασης.

Protein Detection

εκχυλίσματα πρωτεΐνης από τις κυτταρικές γραμμές αναλύθηκαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές (15 μg ανά λωρίδα ) και μεταφέρθηκε σε Hybone ECL μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (GE Healthcare Life Science, Piscataway, NJ). Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινα αντισώματα ποντικού έναντι ADAM9 (R &? Συστήματα D), ρ21, και ρ27 (ευγενική προσφορά από Dr. Yun-Lung Yu στο Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου & amp? Hospital) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κυτταρικό λύμα ΒΤ474 (κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 500 ηΜ δοξορουβικίνης τη διάρκεια της νύχτας) ελήφθη από τον Dr. Wei-Chien Huang στο Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου & amp? Νοσοκομείο. Για τον έλεγχο φόρτωσης, στυπώματα ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-EF1-α (1:10,000? Millipore). Μετά από επώαση με ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (1:5000? GE Healthcare Life Science), σήματα χημειοφωταύγειας ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ECL Plus και τα στυπώματα εκτέθηκαν σε Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Science). ποσοτικοποίηση ζώνη πρωτεΐνης διεξήχθη με τη χρήση του λογισμικού ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/, ΝΙΗ, Bethesda, USA).

Μέτρηση δραστικών ειδών οξυγόνου

Τα κύτταρα σπάρθηκαν για πιάτα στο 70-80% συρροή και πεινασμένο τη διάρκεια της νύχτας. Για ποσοτική ανάλυση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε HBSS με ή χωρίς 5% FBS (ανάλογα με το αν είχαν εκτεθεί σε ακτινοβολία ή ασιτία). Το υπεροξείδιο του υδρογόνου ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας dichlorofluorescindiacetate (DCF, 2 μΜ) (Invitrogen). Υπεροξειδίου ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας dihydroethidium (DHE, 10 μΜ) (Invitrogen). απεικόνισης υπεροξειδίου ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας MitoSox Red μιτοχονδριακής δείκτης υπεροξειδίου (Invitrogen). Τα δείγματα επωάστηκαν για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι σε περιστροφέα. Ανάλυση της DCF και DHE φθορισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την απεικόνιση των μιτοχονδρίων δημιουργία υπεροξειδίου, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής για 24 ώρες ακολουθούμενη από τη φόρτωση με MitoSOX Red, Alexa-488 WGA και ϋΑΡΙ (Invitrogen) για 30 λεπτά και την προβολή κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Η επίδραση της ADAM9 shRNA στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετρήθηκε με άμεση μέτρηση του αριθμού των κυττάρων. Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

5 σε 60-mm δίσκο. Σε καθορισμένους χρόνους, τα κύτταρα απομακρύνθηκαν με θρυψινοποίηση, και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε σε αιμοκυτταρόμετρο με χρήση κυανού τρυπάνης (0,4%) χρώση.

κλωνογονική δοκιμασία

Για την δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρου κλωνογονικού, εναιωρήματα κυττάρων παρασκευάστηκαν με κατεργασία με 0,25% θρυψίνη και 0.05% EDTA. Μετά τον υπολογισμό κυτταρική συγκέντρωση χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο, 100 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων με Τ-μεσαίες και 5% FBS για 2 εβδομάδες. Ο αριθμός των αποικιών σε κάθε φρεάτιο προσδιορίσθηκε μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων σε κάθε αποικία. Μόνο αποικίες με ≥50 κύτταρα που ορίζεται ως επιτυχής. Για την ταυτοποίηση αποικιών, το μέσο αποσύρθηκε και 3.7% φορμαλδεΰδης προστέθηκαν για 15 λεπτά, που ακολουθείται από επώαση σε 1 mL κρυσταλλικού ιώδους για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. εικόνες αποικίας ελήφθησαν και τους αριθμούς των κυττάρων υπολογίζεται χρησιμοποιώντας ImgaeJ.

Transwell εισβολή Δοκιμασία

Η εισβολής των καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας 24-καλά φρεατίων (Corning, Lowell, MA) πλάκες. Εν συντομία, 2 χ 10

5 κυττάρων σε μέσα που περιέχουν 0,5% FBS προστέθηκαν στον άνω θάλαμο που περιέχει πολυανθρακικό 8 μm πόρου επικαλυμμένα με 1 mg /mL matrigel? ο κάτω θάλαμος γέμισε με μέσα που περιέχουν 5% FBS. Μετά από 16 ώρες επώαση, η άνω επιφάνεια της μεμβράνης καθαρίζεται με ένα βαμβάκι-στυλεό. Τα εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Τυχαία πεδία (5 ανά μεμβράνη) φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση 40x για τον υπολογισμό του αριθμού των κυττάρων. Επιπλέον, τα κύτταρα ποσοτικά με μέτρηση της απορρόφησης των εκχυλισμάτων χρωστικής στα 570 nm σε 100 μΐ διαλύματος του Sorenson (9 mg κιτρικό tirsodium, 305 mL απεσταγμένο νερό, 195 mL 0.1 Ν HCl, 500 mL 90% αιθανόλη).

επούλωση Δοκιμασία

κύτταρα επαναιωρούνται σε μέσο καλλιέργειας σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Μια ενιαία πληγή δημιουργήθηκε στο κέντρο της κυτταρικής μονοστιβάδας με ήπια απομάκρυνση των προσκολλημένων κυττάρων με ένα στείρο πλαστικό άκρο σωληνίσκου μετά κυτταρικές καλλιέργειες έφθασαν ≥90% συρροή. Η συντρίμματα απομακρύνθηκαν με πλύση με μέσο χωρίς ορό. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην τραυματισμένη περιοχή ή εκείνα που προεξέχουν από τα όρια του τραύματος οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο Zeiss Axioplan (Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, ΝΥ) με στόχο 10 × σε πέντε προεπιλεγμένα χρονικά σημεία (0, 2, 4 , 6, και 8 ώρες). Κάθε πείραμα εκτελέστηκε ανεξάρτητα τουλάχιστον τρεις φορές.

ανοσοϊστοχημική χρώση

Δύο micron τομές ιστού πάχους εγκλεισμένα σε παραφίνη αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν. Οι τομές ιστών επωάστηκαν για 2 ώρες με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου ADAM9 (αραίωση 1:50, R &? D Systems). Μετά την πλύση για την απομάκρυνση μη δεσμευμένου πρωτογενές αντίσωμα, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα δεξτράνης σκελετό πολυμερούς συζευχθεί με δευτερεύοντα αντισώματα και επισημαίνονται με υπεροξειδάση κρένου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (σύστημα ϋΑΚΟ Envision για αντισώματα ποντικού και πρωτογενή κουνέλι, ϋΑΚΟ Corporation, Carpinteria, CA) για 30 λεπτά . Οι τομές ιστού επωάσθηκαν στο χρωμογόνο υπόστρωμα υπεροξειδάσης, διαμινοβενζιδίνη, για 5 λεπτά? τομές κατόπιν με αιματοξυλίνη αυτοματοποίησης (ϋΑΚΟ) για 15 λεπτά. Η ειδικότητα της σήμανσης με τη διαδικασία αυτή επαληθεύθηκε με αντιδράσεις αρνητικού ελέγχου ρυθμιστικό διάλυμα για να αντικαταστήσει το πρωτογενές αντίσωμα και τον ισότυπο ειδικής IgG. χρώση τριχρωματική του Masson διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ τρίχρωμη χρώση ενός του Masson (Sigma-Aldrich) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή.

ανθεκτική σε τρυγικά όξινη φωσφατάση (TRAcP) Χρώση Bone

ανοσοχρώση με TRAcP διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Takara Bio Inc, Shiga, Japan). Εν συντομία, εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές οστού κνήμης ποντικού αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν για την αντίδραση TRAC Posteolytic. Τα τμήματα οστού επωάστηκαν με το διάλυμα υποστρώματος (0,1 όγκος του τρυγικού νατρίου σε Naphthol-AS-BI-φωσφορικού /Fast διάλυμα υποστρώματος Red Violet LB, ρΗ 5.2) στους 37 ° C για 45 λεπτά. Μετά την πλύση του slide με απεσταγμένο νερό και προσθήκη γλυκερόλης για την πρόληψη της αφυδάτωσης, τα δείγματα εξετάστηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

Προσδιορισμός του κυτταρικού περιεχομένου DNA με FACS Ανάλυση

Τα καρκινικά κύτταρα απλώθηκαν σε 1 × 10

6 κύτταρα ανά τρυβλίο των 100 mm και σε νηστεία επί είτε 24 ή 48 ώρες. Τα κύτταρα tryspinized και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρικού κύκλου με τη χρήση ιωδιούχου προπιδίου, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [18]. Η σχετική περιεκτικότητα του DNA των πυρήνων μετρήθηκε με FACSCalibur (BD Bioscience).

In Vivo Μοντέλα ξενομοσχεύματος

Πέντε-εβδομάδων αρσενικών αθυμικών γυμνών (ηυ /ηυ ) ποντίκια ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο ζώων Εργαστηρίου σε Ταϊβάν χρησιμοποιήθηκαν για υποδόρια (SC), ενδοκαρδιακή, και intratibial την εμφύτευση του όγκου. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 100% συρροή, θρυψίνη και απαριθμούνται. Τα ποντίκια ναρκώνονται με 1,7% ισοφλουράνιο αναμειγνύεται με αέρα για υποδόρια εμφύτευση του όγκου. Ξενομοσχεύματος όγκοι συστάθηκε με υποδόρια ένεση 10

6 κύτταρα PC3 κύτταρα που εκφράζουν pSM2c ή shADAM9 σε 100 μL PBS σε αμφότερες τις πλευρές του κάθε ποντικού. Τα ζώα θυσιάστηκαν μετά από 8 εβδομάδες. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στο σωματικό βάρος μεταξύ των ζώων με και χωρίς s.c. όγκων κατά το χρόνο της θυσίας. Για intratibial ένεση του όγκου, μια βελόνα 27-gauge χρησιμοποιήθηκε για μια τρύπα στην κοιλότητα του μυελού μέσα από το κνημιαίο πλάτωμα σε τόσο την αριστερή και δεξιά κνημών. Μία σύριγγα Hamilton 28-gauge χρησιμοποιήθηκε για την ένεση 5 × 10

5 κύτταρα σε όγκο 50 μι μέσα στην κοιλότητα του μυελού. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με τόσο βιοφωταύγεια και ακτινογραφίες μία φορά την εβδομάδα. Τα ζώα θυσιάστηκαν μετά από 8 εβδομάδες. Κνημιαία οστά απομακρύνθηκαν, πλύθηκαν σε PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες. δείγματα οστών πλύθηκαν με PBS ακολουθούμενο από απασβέστωση με 0,25 Μ EDTA σε PBS (ρΗ 7.4) σε θερμοκρασία δωματίου για 6 εβδομάδες. Οι λύσεις απασβέστωση EDTA άλλαξαν την εβδομάδα. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε εβδομαδιαία χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης βιοφωταύγειας (Xenogen IVIS 200 Series, Πάχος, Hopkinton, ΜΑ).

RNA Εκχύλιση και DNA Microarray Analysis

Ολικό RNA απομονώθηκε από καλλιεργημένα κύτταρα (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. δείγματα καθαρισμένου RNA υποβλήθηκαν σε φάλαγγα Biotech για ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας το V5 Ανθρωπίνων ολόκληρο το γονιδίωμα OneArray® μικροσυστοιχιών (Φάλαγγα Biotech Group, Inc., Hsinchu, Ταϊβάν). Κάθε μικροσυστοιχιών περιέχει 29.187 ανθρώπινο ανιχνευτές γονιδιώματος και 1088 πειραματικούς ανιχνευτές ελέγχου. Λεπτομερής περιγραφή των διαδικασιών μικροσυστοιχιών και ολόκληρο το γονίδιο του γονιδιώματος & amp? κατάλογοι καθετήρας είναι διαθέσιμα από https://www.phalanxbiotech.com/tech_support/general.php.

Η υπερέκφραση του REG4

Το πλήρους μήκους κωδικοποιητική περιοχή REG4 ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές που παρατίθενται στο Υλικά και Μέθοδοι S1, και υποκλωνοποιήθηκε σε pcDNA3.1 (Invitrogen) φορείς p3XFLAG-CMV-7,1 (Stratagene, Santa Clara, CA) ή. Τα κατασκευάσματα REG4 επιμολύνθηκαν παροδικά σε PC3

shADAM9 χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) ακολουθώντας το τυπικό πρωτόκολλο. Υπερεκφράζεται REG4 επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση (R & amp? D System). Εκκρίνεται REG4 στο ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε και συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας Centricon ΥΜ 3-φίλτρα φυγοκέντρησης (Millipore).

Δήλωση Ηθικής

Οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις του Οδηγού για τη Φροντίδα και Χρήση ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από τις Instituional κατευθυντήριες γραμμές και μια επιτροπή των ζώων Ερευνών της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου ακολουθήθηκε για τις μελέτες του ποντικιού (IACUC # 99 – 68-N). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις διεξήχθη υπό Zoletil (τιλεταμίνη-ζολαζεπάμη) σε δόση 20 mg /kg αναισθησία με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση, και απεικόνιση βιοφωταύγειας ελήφθη υπό έλεγχο από αναισθησία ισοφλουρανίου. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα από το

in vitro

οι μελέτες που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την δύο-tailed του Student

t-test

ή όπως υποδεικνύεται στην λεζάντα σχήματος. Ένα

σ

τιμή μικρότερη του 0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική. Στις μελέτες του ποντικιού, το τεστ rank-sum Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση.

Αποτελέσματα

Νοκ ντάουν της ADAM9 Έκφραση Μειωμένη του καρκίνου του προστάτη Πολλαπλασιασμός κυττάρων

Για να επικυρώσετε το ρόλο του ADAM9 στην πρόοδο του καρκίνου του προστάτη, έχουμε σταθερά μειωτικά την έκφραση ADAM9 σε ανδρογόνα ανεξάρτητο, των οστών μεταστατικό PC3 κυττάρων καρκίνου του προστάτη και εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη LNCaP κυττάρων είτε με ρετροϊικούς ή βραδέος ιού φορείς που φέρουν ADAM9-ειδικό shRNA. Το προκύπτον ADAM9 knockdown κυτταρικές σειρές PC3

shADAM9 και LNCaP

shADAM9, η οποία έδειξε μια μείωση περίπου 88% και 76% αντίστοιχα σε έκφραση πρωτεΐνης ADAM9 σε σύγκριση είτε με κενό φορέα (pSM2C ρετροϊικού φορέα) ή τον έλεγχο shRNA (lentiviral- shGFP) (Εικ. S2), επιλέχθηκαν για την ακόλουθη μελέτη. Μια βραχυπρόθεσμη δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων 3-ημερών έδειξαν ότι και οι δύο PC3

shADAM9 (Σχ. 1α) και LNCaP

shADAM9 (Σχ. 1β) κύτταρα παρουσίασαν σημαντική μείωση σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Αυτή η καθυστερημένη ανάπτυξη των κυττάρων νοκ ντάουν ADAM9 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από κλωνογενείς δοκιμασίες στις οποίες η μείωση 40-50% στα PC3

κύτταρα shADAM9 παρατηρήθηκε μετά από 2 εβδομάδες κυτταρικής καλλιέργειας (Σχ. 1γ και 1δ).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μειώθηκε αρχίζοντας 2 ημέρες μετά την σπορά (1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) του ADAM9-knockdown PC3 (α) και LNCaP (β) (* έλεγχος τ,

σ

≤0.05) . (Γ) Κλωνογόνος προσδιορισμούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού των PC3, PC3

shGFP, PC3

pLKO και PC3

shADAM9-46978 αποκάλυψε μειώθηκε αποικίες σε PC3

shADAM9-46978. (Δ) Quatitative αναλύσεις των κλωνογόνων μελέτες έδειξαν ότι ο αριθμός των αποικιών των κυττάρων ήταν χαμηλότερη σε λεντοϊού knockdown έκφρασης ADAM9 σε σύγκριση με άγριου τύπου, ψευδο-μολυσμένα, και τους ελέγχους που δεν αποτελούν στόχο (** έλεγχος τ,

ρ

≤0.001).

η

για να εκτιμηθεί η διαφορά ανάπτυξης μεταξύ ADAM9-καλά και ADAM9 ανεπάρκεια καρκινικών κυττάρων στα οστά, η κύρια μεταστατική περιοχή για τον καρκίνο του προστάτη, λουσιφεράσης-tagged PC3

shGFP και PC3

shADAM9 είχαν ενδοκνημιακά εγχέεται στο ίδιο γυμνό ποντικό αλλά σε διαφορετικά σκέλη (Σχ. 2α, η = 10). Οι συλλογικές δεδομένα απεικόνιση βιοφωταύγειας έδειξαν ότι η συχνότητα εμφάνισης της PC3

ανάπτυξη όγκων shGFP ήταν 80%, και οι όγκοι ήταν ανιχνεύσιμη ήδη 15 ημέρες μετά την ένεση. Σε αντίθεση, μόνο το 10% των ποντικών που ενέθηκαν με κνημών PC3

shADAM9 είχαν ανιχνεύσιμη ανάπτυξη όγκου. Η ένταση βιοφωταύγεια ήταν περίπου μία log μικρότερη από τα περισσότερα από τα PC3

όγκων shGFP σε 40 ημέρες μετά την ένεση (Σχ. 2β). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη επίσης με υποδόρια ξενομοσχεύματα (Εικ. S3), η οποία έδειξε ένα σημαντικό ρόλο του ADAM9 στον προστάτη του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων και ανάπτυξη όγκου.

(α) PC3

shGFP και PC3

shADAM9 εγχύθηκαν μέσα στην αριστερή και δεξιά κνήμη του ίδιου ποντικού (n = 10). (Β) απεικόνιση βιοφωταύγεια σε 40 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Μαύρα βέλη δείχνουν το μόνο σήμα που ανιχνεύεται σε PC3

shADAM9 οστική αλλοίωση. (Γ) Μηχανογραφημένη ακτινολογική σάρωση της περιοχής της βλάβης. Άνω εικόνα: η καταστροφή των οστών είναι εκτεταμένες στο αριστερό πόδι σε σύγκριση με το δεξί πόδι? Κάτω εικόνα: ποντίκι με καταστροφική βλάβη του οστού στο αριστερό πόδι και καμία βλάβη στο δεξί πόδι. (Δ) Η ιστολογική απεικόνιση που δείχνει ότι τόσο δοκιδωτό και φλοιώδες οστό αντικαταστάθηκε από το PC3

shGFP όγκου. Σε αντίθεση, δοκιδωτό και φλοιώδες οστό ήταν ακόμα άθικτο στο PC3

shADAM9 όγκου (amp H &? Ε). χρώση τριχρωματική μέθοδος του Masson έδειξε μόνο ίχνη των οστών αριστερά στο PC3

shGFP σε σύγκριση με PC3

όγκων shADAM9 (τριχρωμία). (Ε) TRAcP ανάλυση της δραστηριότητας των οστεοκλαστών. Το βέλος δεικνύει οστεοκλάστες που παρατηρούνται σε ένα PC3

shGFP όγκου. Κόκκινο highlight δείχνει τόπους των 40 × Μεγέθυνση.

Η

ADAM9 γονιδιακή σίγηση Μειωμένη in vivo Οστεολυτικές οστικές αλλοιώσεις που προκαλούνται από PC3 όγκων σε ποντίκια

Δεδομένου ότι, τα κύτταρα PC3 είναι γνωστό ότι προκαλούν βλάβες οστεολυτικές

in vivo

, θα καθοριστεί αν νοκ ντάουν της έκφρασης ADAM9 θα μπορούσε να εξασθενήσει την προκαλούμενη από όγκο οστική απορρόφηση. Computerized ακτινογραφική σάρωση των επηρεαζόμενων ποδιών αποκάλυψε σοβαρές γενετικές οστεολυτική οστού στην αριστερή κνήμη (ένεση με PC3

shGFP), ενώ η μάζα εμφανίστηκε κανονικός στη δεξιά κνήμη (ένεση με PC3

shADAM9) (Σχ. 2c). χρώση τριχρωματική του Masson του αριστερού ποδιού επιβεβαίωσε ότι και οι δύο δοκιδωτό και φλοιώδες οστό στην εγγύς κνημιαία μετάφυση είχε καταστραφεί, και η κοιλότητα του μυελού είχε αντικατασταθεί από όγκους. Σε αντίθεση, τα δοκιδωτό και φλοιώδες οστά παρέμεινε ανέπαφη σε PC3

shADAM9 ένεση δεξιά κνήμη και, εκτός από ένα περιστατικό στο οποίο αδύναμα σήματα βιοφωταύγεια είχε συγκριτικά μικροί όγκοι στο χώρο του μυελού με ήπια καταστροφή των οστών (Εικ. 2d). Επιπλέον, ο αριθμός και η έκταση των ώριμων οστεοκλαστών στη διεπαφή οστό των όγκων PC3

shGFP ένεση κνημών ήταν πολύ υψηλότερες από εκείνες των PC3

shADAM9 ένεση κνημών, όπως προσδιορίζεται με φωσφατάση ανθεκτική σε τρυγικά οξύ (TRAcP) χρώση (

ρ

& lt? 0,01). (Εικ. 2e), υποδεικνύοντας ότι αποσιώπηση της έκφρασης ADAM9 μείωσε την ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη να επάγουν την οστεοκλαστογένεση στο οστό

Στόχευση ADAM9 έκφραση με Η ενδονεοπλασματική Παράδοση shRNA Καταστέλλει προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου σε ποντίκια

για να εξεταστεί αν shRNA διαμεσολαβούμενη αναστολή της έκφρασης ADAM9 αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου του προστάτη, PC3 κύτταρα υποδορίως εμβολιάσθηκαν σε αμφότερες τις πλευρές γυμνών ποντικών. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε μέγεθος περίπου 200 mm

3. Δέκα δεκαπέντε ποντίκια που είχαν επιλέχθηκαν οι όγκοι PC3 και στις δύο πλευρές για να λάβετε το ενδονεοπλαστική ένεση 1 × 10

5 cfu φορείς λεντοϊών (LV) που μεταφέρουν shGFP (αριστερά πλευρό ιστοσελίδα) ή shADAM9 (δεξιά πτέρυγα ιστοσελίδα) εβδομαδιαίως για συνολικά 6 εβδομάδες (Εικ. 3α), και τα υπόλοιπα 5 ποντίκια χρησίμευσαν ως μάρτυρες με χορήγηση ενέσεων PBS. Μειωμένη ανάπτυξη του όγκου του προστάτη παρατηρήθηκε σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με LV-shADAM9 σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν θεραπεία με LV-shGFP ή PBS (σχ. 3b). Το μέσο μέγεθος του όγκου μετά από 6 εβδομάδες θεραπείας με PBS ή LV-shGFP ήταν 782,7 ± 174,6 χιλιοστά

3 και 1027 ± 272,2 χιλιοστά

3, αντίστοιχα. Αντιθέτως, το μέγεθος των όγκων αντιμετωπίζεται με θεραπεία LV-shADAM9 ήταν 135,9 ± 72,4 mm

3. Το επίπεδο της έκφρασης ADAM9 μειώθηκε σε όγκους αντιμετωπίζονται με θεραπεία LV-shADAM9, όπως επιβεβαιώνεται τόσο από χρώση του ιστού (Εικ S4d-f.) Και ανοσοαποτύπωση (Εικ 3γ?.

σ

≤0.05).

(α) Σχηματική του πειράματος νοκ ντάουν θεραπείας ADAM9. Τα ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως με κύτταρα PC3 και στις δύο πλευρές, και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα μέχρις ότου το μέγεθος φτάσει περίπου 200 mm

3. Οι ποντικοί στη συνέχεια έλαβαν ενέσεις είτε PBS σε δύο τοποθεσίες όγκου (η = 5) ή shGFP φακοϊό στην αριστερή πλευρά του όγκου και shADAM9 στη δεξιά πλευρά (n = 10). Οι ιοί εγχύθηκαν και οι όγκοι μετρήθηκαν εβδομαδιαία για 6 διαδοχικές εβδομάδες. (Β) Μετά τη θεραπεία shADAM9, οι όγκοι του όγκου δεν αυξηθεί σε σύγκριση με τη θεραπεία shGFP ή ελέγχους PBS (**

σ

≤0.01, Μαθητή

t

test). (Γ) Ανοσοστύπωμα δοκιμασία της επιβεβαιώνει την έκφραση ADAM9 μειωμένη έκφραση ADAM9 μετά τη θεραπεία shADAM9. EF-1α χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης (*

σ

≤0.05? **

σ

≤0.01,

t

test του Student). (Δ) Η στατιστική ανάλυση της χρώσης Κί67. θεραπείας shADAM9 μειώθηκαν σημαντικά οι δραστηριότητες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε όγκους PC3. PBS και θεραπεία shGFP έδειξε καμία διαφορά στο δείκτη πολλαπλασιασμού (**

σ

≤0.001, One Way ANOVA). (Ε) Στατιστική ανάλυση της χρώσης TUNEL δεν έδειξε σημαντική (NS) διαφορά μεταξύ θεραπειών (

σ

≥0.05, One Way ANOVA).

Η

Για τον προσδιορισμό των κυτταρικές αποκρίσεις που σχετίζονται με LV θεραπεία -shADAM9, ο πολλαπλασιασμός του όγκου (Ki-67 index, Σχ. S4G-i) και την απόπτωση χρώση δείκτη (δείκτης TUNEL, Σχ. S4j-λ) των τμημάτων του όγκου διεξήχθησαν. Δεν βρήκαμε μια σημαντική διαφορά μεταξύ του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων σε ελέγχους και LV-shADAM9 (Σχ. 3e και το Σχ. S4j-L). Σε αντίθεση, η αγωγή με LV-shADAM9 οδήγησε σε δραματική μείωση του αριθμού των Ki-67-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με τα δύο PBS και θεραπείες LV-shGFP (Εικ. 3δ και Σχ. S4G-i). Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι

in vivo

παράδοση του LV-shADAM9 υποχωρεί αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου με αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και όχι επαγωγή αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου.

Knockdown ADAM9 Προκαλεί κυτταρικού κύκλου σύλληψης στο G1 /S μετάβαση υπό συνθήκες πίεσης

Για να οριοθετηθούν περαιτέρω το μηχανισμό της LV-shADAM9 θεραπείας που προκαλείται από αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, την κατανομή του κυτταρικού κύκλου μεταξύ ADAM9-καλά PC3

shGFP και ADAM9 ανεπάρκεια PC3

κύτταρα shADAM9 καλλιεργείται υπό ορό ασιτίας ή (5% FBS) συνθήκες ορό συμπληρωμένο αναλύθηκαν. Ενώ PC3

shGFP και PC3

shADAM9, υπό κανονικές συνθήκες, δεν δείχνουν μια αλλαγή στο προφίλ του κυτταρικού κύκλου, ο πληθυσμός S-φάσης μειώθηκε σημαντικά με το χρόνο (24-48 ώρες) σε PC3 στέρηση ορού

shADAM9 κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη στο PC3

shGFP. Αυτή η μείωση συνοδεύτηκε από το αυξημένο ποσοστό των κυττάρων στην G1 φάση (Σχ. 4α). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη με τη χρήση κυττάρων LNCaP (Σχ. 4β). Επιπλέον, ανοσοαποτύπωση μελέτες G1 /πρωτεϊνών μετάβασης που σχετίζονται S αποκάλυψε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο της p21

Cip1 /WAF1. Επιπλέον, ένα κατώτερο επίπεδο της κυκλίνης D1 προκλήθηκε σε PC3

shADAM9 ό, τι σε PC3

shGFP υπό συνθήκες στέρησης ορού (Εικ. 4γ). Αν και στέρηση ορού δεν προκάλεσε καμία περαιτέρω αλλαγές στο επίπεδο έκφρασης του p27

Kip1 είτε PC3

shADAM9 ή PC3

shGFP, το βασικό επίπεδο του p27

Kip1 ήταν υψηλότερη σε PC3

shADAM9 . Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκθεση των PC3

shADAM9 σε ορό ασιτίας προκαλεί μία διακοπή G1 του κυτταρικού κύκλου. Αυξημένη έκφραση του p21

Cip1 /WAF1and p27

Kip1 επίσης ανιχνευθεί σε LNCaP

shADAM9 υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας (Εικ. 4δ).

Ο λιμός μείωσε τον πληθυσμό των κυττάρων S-φάσης στο ADAM9 knockdown καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη των ελέγχων σε PC3 (α), LNCaP (β). (Γ) τα επίπεδα έκφρασης του p21

Cip1 /WAF1, p27

Kip1, και κυκλίνη D1 αυξημένη στα κύτταρα shADAM9 κάτω από συνθήκες στρες πείνα στα κύτταρα PC3. (Δ) τα επίπεδα έκφρασης του p21

Cip1 /WAF1 και p27

Kip1 αυξήθηκε σε LNCaP

shADAM9 υπό κανονικές και πείνα συνθήκες.

Η

Λόγω προηγούμενο εύρημα μας ότι ADAM9 είναι ένα στρες που ανταποκρίνεται πρωτεΐνη που μπορεί να υποστηρίζει την επιβίωση των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη και την εξέλιξη κάτω από έντονο στρες οξειδωτικές συνθήκες [13], [19], επιδιώξαμε να καθοριστεί αν ασιτία ορού, ένα

in vitro

κατάσταση που μιμείται την εχθρική όγκου μικροπεριβάλλον [16], [19], μπορεί να επάγει την ενδοκυτταρική οξειδωτικό στρες στο οποίο ADAM9 κύτταρα με ανεπαρκές απέτυχε να ξεπεραστούν. Διαπιστώσαμε αύξηση των ενδογενών επιπέδων υπεροξειδίου σε αμφότερα PC3

shGFP και PC3

κύτταρα shADAM9 μετά από 24 ώρες ασιτία ορού σε σύγκριση με τα κύτταρα που αναπτύσσονται κάτω από συνθήκες συμπληρωμένο ορό όπως μετριέται από την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων με ένα MitoSox κόκκινη φθορίζουσα ανιχνευτή ( Σχ. 5α), καθώς και κυτταρομετρία ροής με τη φθορίζουσα χρωστική, dihydroethidium (DHE) (Σχ. 5β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, PC3

shADAM9 εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη περιεκτικότητα υπεροξειδίου από PC3

shGFP, είτε στο βασικό επίπεδο ή που προκαλείται από στέρηση ορού. Σε αντίθεση, καμία αλλαγή στο επίπεδο της ενδοκυτταρικής υπεροξειδίου του υδρογόνου βρέθηκαν σε είτε PC3

shGFP ή PC3

κύτταρα shADAM9, όπως προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής με DCFH-DA ανιχνευτές (Εικ. 5c). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η πείνα που προκαλείται από οξειδωτικό στρες ορού σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη διαμεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω υπεροξειδίου αλλά όχι το υπεροξείδιο του υδρογόνου, με αποτέλεσμα παρόμοια με τα προηγούμενα παρατήρηση μας περιλαμβάνουν ιονίζουσα αντιδραστικά είδη που προκαλείται από ακτινοβολία οξυγόνου (ROS) [16 ].

(α) PC3

shGFP και PC3

κύτταρα shADAM9 καλλιεργήθηκαν σε είτε 5% FBS ή υπό στέρηση ορού για 24 ώρες, ακολουθούμενη από κατεργασία με 0.5 μΜ φθορισμό MitoSOX. Ίσες ένταση φθορισμού χρησιμοποιήθηκε σε κάθε σύλληψης εικόνας για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων υπεροξειδίου.