Abstract

Twist πρωτεΐνη που σχετίζεται με 1 (Twist1), επίσης γνωστή ως τάξη Μια βασική πρωτεΐνη έλικας-βρόχου-έλικας 38 (bHLHa38), έχει ενοχοποιηθεί για τον προσδιορισμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων γενεαλογία. Προηγούμενες μελέτες αποδεικνύουν ότι η έκφραση Twist1 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε γαστρικό καρκίνο με κακή κλινική έκβαση. Εκτός αυτού, Twist1 προτείνεται να εμπλέκονται στην εξέλιξη του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου. Ωστόσο, βιολογικές λειτουργίες του παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητες. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι Twist 1 υπερέκφραση οδηγεί σε σημαντική αυξητική ρύθμιση του FOXM1, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Σε αντίθεση, knockdown του Twist 1 μειώνει την έκφραση FOXM1, γεγονός που υποδηλώνει ότι FOXM1 μπορούσε να είναι μια άμεση μεταγραφική στόχος του Twist 1. Στο μοριακό επίπεδο, αποκαλύπτουν περαιτέρω ότι Twist 1 θα μπορούσε να συνδεθεί με την περιοχή του υποκινητή του FOXM1, και στη συνέχεια προσλαμβάνουν P300 για να προκληθεί μεταγραφή FOXM1 mRNA. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας αποκαλύψει μια προηγούμενη άγνωστο Twist 1 /FOXM1 ρυθμιστικές μονοπάτι, το οποίο μπορεί να βοηθήσει στην κατανόηση των μηχανισμών του γαστρικού καρκίνου πολλαπλασιασμό

Παράθεση:. Qian J, Luo Υ, Gu Χ, Zhan W, Wang Χ ( 2013) Twist1 Προωθεί τον καρκίνο του γαστρικού κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω Up-κανονισμός του FOXM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10.1371 /journal.pone.0077625

Επιμέλεια: Devanand Sarkar, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 31, 2013? Αποδεκτές: 3 Σεπ 2013? Δημοσιεύθηκε: 24 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Qian et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά-μετάβασης (EMT) είναι ένα διαδικασία κατά την οποία τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν πολικότητα και κυττάρου-προς-κύτταρο προσκόλληση, και υφίστανται δραματικές αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού [1,2]. Ταυτόχρονη με απώλεια των επιθηλιακών κυττάρων και προσκόλλησης κυτοσκελετικά συστατικά, κύτταρα που υφίστανται ΕΜΤ αποκτούν έκφραση των συστατικών μεσεγχυματικών και μεταναστευτικών φαινότυπο [2,3].

Πολλοί βασικοί επαγωγείς του EMT είναι μεταγραφικοί παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων Twist 1, σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκα, τα οποία καταστέλλουν την έκφραση Ε-καδερίνης [4,5]. Twist1 ανήκει στην βασική έλικα-βρόχος-έλικα οικογένεια παράγοντα μεταγραφής [6]. Αρχικά, Twist1 προτάθηκε να είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του μεσοδερμικά προέρχονται ιστούς, συμπεριλαμβανομένου μυός και οστεογόνων κυτταρικών γραμμών [7,8]. Μετέπειτα μελέτες έχουν δείξει ότι Twist 1 προάγει ΕΜΤ και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετάσταση σε αρκετά μοντέλα όγκων [9,10]. Έκφραση Twist 1 έχει επίσης εμπλακεί σε προαγωγή μετάστασης και επεμβατική παθολογικών υποτύπων σε διάφορους τύπους καρκινώματος [11]. Ως εκ τούτου, Twist 1 έχει προταθεί για να έχουν ογκογόνες ιδιότητες. Για παράδειγμα, η υπερέκφραση του Twist σε ραβδομυοσάρκωμα αναστέλλει Myc-επαγόμενη απόπτωση και παρεμβαίνει με την καταστολή όγκου ρ53 [12]. Up-ρύθμιση του Twist σχετίζεται με κακοήθη μετασχηματισμό σε λέμφωμα Τ-κυττάρων [13]. Εξαναγκασμένη έκφραση του Twist πυροδοτεί αντίσταση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων σε φάρμακα που αναστέλλουν το σχηματισμό μικροσωληνίσκων [14].

Ωστόσο, το αποτέλεσμα και ο μηχανισμός του γονιδίου Twist στον πολλαπλασιασμό του γαστρικού καρκινώματος παραμένει αινιγματική. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι Twist1 ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκίνο του στομάχου σχετίζεται με ινοβλάστες με κακή κλινική έκβαση [15]. Εκτός αυτού, τα κάτω ρύθμιση του γονιδίου Twist 1 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων με αρνητικά τη ρύθμιση της δραστηριότητας του ΑΡ-1 με αποτέλεσμα την έκφραση της κυκλίνης D1 μειώνοντας [16]. Στην παρούσα εργασία, δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του στομάχου χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνήσει την επίδραση και το μηχανισμό της Twist 1 γονιδίου στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Τέσσερις επιθηλιακές κυτταρικές γραμμές (NCI-Ν87, AGS, HGC-27 και MGC80-3) που προέρχεται από γαστρικό καρκίνωμα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, Πεκίνο). Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA, RNA εκχύλιση και ανάλυση σε πραγματικό χρόνο

Τα κύτταρα σπάρθηκαν στους 6- φρεατίων στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με 50ηΜ siRNA ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν την ανθρώπινη Twist 1 (Dharmacon, USA). Το μόριο ειδικό siRNA για πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Ολικά RNAs εκχυλίσθηκαν από τα κύτταρα με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ, και αντίστροφη μεταγραφές πραγματοποιήθηκαν με κιτ Takara RNA PCR (Takara, Κίνα) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για να ποσοτικοποιηθούν οι μεταγραφές των γονιδίων ενδιαφέροντος, σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα SYBR Green Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara, Japan) επί Light Cycler 480 (Roche, Ελβετία).

παροδικές επιμολύνσεις και λουσιφεράσης Δοκιμασίες

Ανθρώπινο υποκινητή FOXM1 ενισχύθηκε από το γονιδιωματικό εκμαγείο ανθρώπινου DNA και εισάγεται εντός pGL4.15 βασικό φορέα (Promega). μοτίβο δέσμευσης Mutant Twist1 δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ μεταλλαξογένεσης PCR (Toyobo) με έναν εκκινητή (θέσεις μετάλλαξης υπογραμμισμένες): 5′-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 ‘και έναν αντίστροφο εκκινητή συμπληρώματος. Όλες οι παροδικές επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Σαγκάη), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τους προσδιορισμούς λουσιφεράσης ανταποκριτή, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, λουσιφεράση δραστηριότητες μετρήθηκαν με τη χρήση του Luciferase Assay System Διπλή Reporter (Promega, USA).

συνανοσοκαθίζησης

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει 50 mM Τρις- HCl (ρΗ 7.3-7.5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, αναστολείς 0.5% Triton Χ-100) και πρωτεάση. Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν με 2,5 μg του ρ300 ή IgG όλη τη νύκτα στους 4 ° C. σφαιρίδια Πρωτεΐνης Α προστέθηκαν για επιπλέον 4 ώρες. Σφαιρίδια που περιέχουν ανοσοσύμπλοκα πλύθηκαν με 1 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης για τέσσερις φορές. Τα ιζήματα μετουσιώθηκαν σε Laemmli (φόρτωση γέλη) ρυθμιστικό διάλυμα στους 95 ° C για 10 λεπτά.

Western Blot

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Laemmli, μετουσιωμένο για 10 λεπτά στους 80 ° C, και να επιλυθούν σε πήγματα SDS /PAGE. Μετά ανοσοστύπωση, οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε PBS /0.1% Tween-20 με 7,5% άπαχο ξηρό γάλα, και πρωτεύοντα αντισώματα επωάστηκαν σε PBS /0.1% Tween-20 με 0,1% -5% άπαχο ξηρό γάλα. Αντισώματα που κατευθύνονται έναντι Twist 1, FOXM1 αγοράστηκαν από Santa Cruz Biotechnology (USA). Anti-p300 και τα αντισώματα GAPDH ελήφθησαν από Abcam Company (ΗΠΑ). Anti-p21, p27, κυκλίνη Β1, κυκλίνη D1, κυκλίνη D2, κυκλίνη Ε και Ε-cadherin αντισώματα ήταν από Cellsignaling (ΗΠΑ).

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) θα δοκιμασία

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση ( ChIP) κιτ δοκιμασίας χρησιμοποιήθηκαν (Upstate, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 1% φορμαλδεΰδη και περαιτέρω επεξεργασία χρησιμοποιώντας κιτ προσδιορισμού ChIP Upstate του. Διαλυτό χρωματίνη ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-Twist 1 και IgG αντισώματα. Μετά τον καθαρισμό, τα δείγματα του DNA ποσοτικοποιείται με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που περιλαμβάνει εγγύς περιοχή του ανθρώπινου υποκινητή FOXM1.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM. Οι στατιστικές διαφορές προσδιορίζονται δια δύο ουρών t τεστ. Η στατιστική σημαντικότητα δείχνεται ως * (Ρ & lt? 0,05), ** (Ρ & lt? 0,01) ή *** (Ρ & lt? 0.001).

Αποτελέσματα

Επίδραση των Twist1 στη γαστρική πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

Κατά την πρώτη, για να εξερευνήσετε το λειτουργικό ρόλο της Twist 1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, που μετάγονται NCI-Ν87 ή AGS κυττάρων με αδενοϊούς που περιέχουν Twist 1 ή κενό φορέα (Σχήμα 1Α και 1Β). Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, η έκφραση της Ε-καδερίνης, ένας βιοδείκτης της διαδικασίας ΕΜΤ [4,5], ήταν κάτω-ρυθμίζονται από Twist 1 υπερέκφραση (Σχήμα S1A-1Β). Εκτός αυτού, Twist 1 υπερέκφραση οδήγησε σε σημαντική αύξηση του αριθμού των κυττάρων όλων των κυττάρων που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 1 C και 1 D). Σταθερά, βρωμοδεοξυουριδίνης ανάλυση (BrdU) επιβεβαίωσε επίσης ότι Twist 1 υπερέκφραση προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 1Ε και 1F). Εκτός αυτού, Twist 1 κύτταρα που υπερεκφράζουν είχαν σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό κυττάρων στην /φάση G0 G1 και αυξημένο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S, σε σύγκριση με κενό φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 1G-1 Η).

( ΑΒ) αντιπροσωπευτική ανάλυση western blot των Twist 1 έκφραση σε κύτταρα NCI-Ν87 (Α) ή AGS (Β) επιμολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν κενό φορέα (EV) ή Twist 1.

(CD) Η καμπύλη ανάπτυξης του NCI -N87 (C) ή AGS (D) κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα (EV) ή Twist 1.

(EF) Το κυτταρικό πολλαπλασιαστικού δυναμικού (BrdU) προσδιορίστηκε σε NCI-Ν87 (Ε) ή AGS κύτταρα (F) επιμολυσμένα με άδειο φορέα (EV) ή Twist 1.

(GH) Η φάση του κυτταρικού κύκλου του NCI-Ν87 (G) και κύτταρα AGS (H) επιμολυσμένα με άδειο φορέα (EV) ή Twist 1 αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα σημάνθηκαν για 15 λεπτά με ΡΙ και αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής. Ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου (G0 /G1, S και G2 /M).

Η

Στη συνέχεια, NCI-Ν87 ή AGS κύτταρα επιμολύνθηκαν με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA ) στόχευσης Twist 1. Το ολίγο siRNA έδειξε αποδοτική Twist 1 knockdown σε αυτά τα δύο κύτταρα, σε σύγκριση με GFP siRNA-μεταδιηγερμένα κύτταρα (Σχήμα 2Α-2D). Ως αποτέλεσμα, τα κάτω ρύθμιση Twist 1 οδήγησε σε μια αξιοσημείωτη μείωση του αριθμού των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 2Ε-2Η). Επιπλέον, αποσιώπηση Twist 1 αύξησε σημαντικά το ποσοστό κυττάρων στην φάση Ο0 /Ο1 και μείωσε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S (Σχήμα 2I-2J). Αξιοσημείωτα, συγκρίναμε την δραστικότητα πολλαπλασιασμού ΝΟΙ-Ν87 και τα κύτταρα AGS με ή χωρίς την επιμόλυνση του κενού φορέα ή GFP siRNA. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ούτε άδειο φορέα ή GFP siRNA επηρεάζουν τη δραστηριότητα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα S2A). Εκτός αυτού, η ικανότητα ανάπτυξης των κυττάρων που εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα Twist 1 (κύτταρα NCI-Ν87 και AGS) είναι σχετικά υψηλότερη από άλλες (HGC-27 και MGC80-3 κύτταρα) (Σχήμα S2C). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η Twist 1 θα μπορούσε να είναι ένα σημαντικό θετική ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των γαστρικών καρκινικών κυττάρων.

(AD) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου και την ανάλυση κηλίδος western των Twist 1 σε NCI-Ν87 (ΑΒ) ή κύτταρα AGS (CD) επιμολυσμένα με siRNA ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν Twist 1 ή αρνητικού ελέγχου siRNA (Ctrl).

(EF) Η καμπύλη αύξησης του NCI-Ν87 (Ε) ή AGS (F) κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA oligos στόχευση Twist 1 ή αρνητικό μάρτυρα siRNA (Ctrl).

(GH) Το κυτταρικό πολλαπλασιαστικού δυναμικού (BrdU) προσδιορίστηκε σε NCI-Ν87 (G) ή AGS κύτταρα (H) επιμολυσμένα με siRNA ολιγονουκλεοτίδια στόχευσης Twist 1 ή αρνητικού ελέγχου siRNA (Ctrl).

(IJ) Η φάση του κυτταρικού κύκλου του NCI-Ν87 (Ι) και AGS (J) κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν Twist 1 ή αγωνίζομαι siRNA (Ctrl) αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Η

Twist1 επηρεάζει την έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου

Όπως Twist 1 προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εξετάσαμε τις λειτουργίες της στην έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζουν την G1 /S μετάβαση, συμπεριλαμβανομένης της CDK αναστολείς της p21

Cip1, p27

Kip1, ο ρυθμιστής CDK κυκλίνης Β1, η κυκλίνη D1, κυκλίνης D2 και κυκλίνη Ε Αποτελέσματα από πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδωση Western ανάλυση σε κύτταρα NCI-Ν87 πρότεινε ότι η έκφραση της p21

Cip1, ρ27

Kip1 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω, ενώ η κυκλίνη Β1, κυκλίνη D1, κυκλίνη D2 και τα επίπεδα κυκλίνη Ε ρυθμίζεται αυξητικά σε Twist 1-μορφομετατραπέντα κύτταρα, σε σύγκριση με τα κενά κελιά φορέα-επιμολυσμένα (Σχήμα 3Α-3Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε AGS κυττάρων (Σχήμα 3C-3D), επιβεβαιώνοντας περαιτέρω ότι το Twist 1 μπορούν να επηρεάσουν τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Με συνέπεια, νοκ ντάουν του Twist 1 αυξήθηκε p21

Cip1 και p27

έκφραση Kip1 ενώ μειώνεται κυκλίνης Β1, η κυκλίνη D1, κυκλίνης D2 και την έκφραση της κυκλίνης Ε στα κύτταρα NCI-Ν87 και AGS (Εικόνα 4Α-4D).

(AD) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου και την ανάλυση κηλίδος western των p21, ρ27, κυκλίνη Β1, Κυκλίνη D1, κυκλίνη D2 και Κυκλίνη Ε σε NCI-Ν87 (ΑΒ) ή AGS (CD) κύτταρα επιμολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν κενό φορέα (EV) ή Twist 1.

Η

(AD) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου και την ανάλυση κηλίδος western των p21, ρ27, κυκλίνη Β1, Κυκλίνη D1, κυκλίνη D2 και Κυκλίνη Ε σε NCI-Ν87 (ΑΒ ) ή) κύτταρα AGS (CD επιμολυσμένα με siRNA ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν Twist 1 ή αρνητικού ελέγχου siRNA (Ctrl).

η

Twist 1 στοχεύει άμεσα τον παράγοντα μεταγραφής FOXM1 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Προηγούμενη μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι διάφορα μεταγραφικών παραγόντων μπορεί να ρυθμίσει μια σειρά γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο, συμπεριλαμβανομένης της ρ21

Cip1, ρ27

Kip1 και Κυκλίνη Β1. Έτσι, αναλύσαμε τους πιθανούς παράγοντες μεταγραφική που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Από πέντε δοκιμάστηκαν μεταγραφικών παραγόντων, μόνο FOXM1 βρέθηκαν να αυξηθεί σημαντικά σε κύτταρα NCI-Ν87 υπερεκφράζουν Twist 1 (Σχήμα 5Α-5Β). Η επαγωγή της FOXM1 παρατηρήθηκε επίσης σε AGS κύτταρα (Σχήμα 5C-5D). Επιπλέον, η έκφραση FOXM1 μειώθηκε σε αυτές τις κυτταρικές εξαντλημένο από Twist 1 (Σχήμα 6Α-6D), υποδηλώνοντας ότι FOXM1 μπορεί να είναι ένα στόχος της Twist 1.

(ΑΒ) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Α) και Western blot (β) ανάλυση των FOXM1, FoxO1, Stat3, ρ53 και έκφραση E2F1 σε κύτταρα NCI-Ν87 επιμολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν κενό φορέα (EV) ή Twist 1.

(CD) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου ( C) και Western blot (δ) ανάλυση των Twist 1 έκφρασης σε κύτταρα NCI-Ν87 επιμολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν κενό φορέα (EV) ή Twist 1.

Η

(ΑΒ) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Α ) και ανάλυση κηλίδος western (Β) της έκφρασης FOXM1 σε κύτταρα NCI-Ν87 επιμολυσμένα με oligos siRNA που στοχεύει Twist 1 ή αρνητικό μάρτυρα siRNA (Ctrl).

(CD) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (C) και τη δυτική blot (D) ανάλυση της έκφρασης FOXM1 στα κύτταρα NCI-Ν87 επιμολυσμένα με ολίγο siRNA που στοχεύει Twist 1 ή αρνητικού ελέγχου siRNA (Ctrl).

Η

Twist 1 απορυθμίζει την έκφραση FOXM1 μέσω πρόσληψης p300

στη συνέχεια, εστιάσαμε στο μοριακό μηχανισμό Twist 1 ρύθμιση της FOXM1 μεταγραφής. Ανάλυση αλληλουχίας έδειξε ότι η περιοχή προαγωγέα του γονιδίου της ανθρώπινης FOXM1 περιείχε μια πιθανή θέση πρόσδεσης Twist 1 (μεταξύ -357 και -352 bp) (Σχήμα 7Α). δοκιμασία λουσιφεράσης έκθεση έδειξε ότι η μεταγραφική δραστικότητα του προαγωγού FOXM1 άγριου τύπου ρυθμίζεται αυξητικά δραματικά από Twist 1, ενώ η μεταγραφική δραστικότητα καταργήθηκε στον υποκινητή που φέρει μια μετάλλαξη στο Twist θέσεις 1-πρόσδεσης (Σχήμα 7Β). Επιπλέον, οι αναλύσεις έδειξαν ότι ChIP Twist 1 θα μπορούσε μοναδικά συνδέονται με FOXM1 υποκινητή (Σχήμα 7C). Για να καθοριστεί εάν η επαγωγή της FOXM1 από Twist 1 απαιτείται για την πολλαπλασιαστική επίδρασή του, θα πραγματοποιηθεί πειράματα με FOXM1 νοκ ντάουν χρήση siRNA ολίγο στα κύτταρα NCI-Ν87 (Σχήμα S3A-S3b). Ως αποτέλεσμα, το siRNA διασωθεί κύτταρα από την πολλαπλασιαστική επίδραση της Twist 1 υπερέκφραση (Σχήμα S3C). Σταθερά, οι λειτουργίες του Twist 1 σχετικά με τα επίπεδα έκφρασης των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου επίσης αντιστρέφεται με FOXM1 siRNA ολιγονουκλεοτίδια (Σχήμα S3D), υποδηλώνοντας ότι FOXM1 απαιτείται για τους ρόλους των Twist 1 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

(Α) Διάγραμμα της περιοχής 1 δεσμευτικές Twist στον υποκινητή της ανθρώπινης FOXM1 (1 kb) και δύο λουσιφεράσης δημοσιογράφους FOXM1. WT-Luc: άγριου τύπου αναφοράς της λουσιφεράσης? Mut-Luc: λουσιφεράσης που φέρουν σημειακές μεταλλάξεις της θέσης πρόσδεσης Twist 1. Μεταλλάξεις υπογράμμισε.

(Β) Ενεργοποίηση της FOXM1 λουσιφεράσης δημοσιογράφους από Twist 1 στα κύτταρα NCI-Ν87.

(C) Η σύνδεση του Twist 1 στις περιοχές των υποκινητών των γονιδίων του ανθρώπου FOXM1 ήταν αναλύθηκαν με προσδιορισμούς chip και ποσοτικοποιείται με PCR πραγματικού χρόνου. Η περιοχή που περιέχει -2000 να -1800 bp χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος.

(D) Συν-ανοσοκαταβύθιση p300 και Twist 1 στα κύτταρα NCI-Ν87.

(Ε) Ενεργοποίηση της FOXM1 λουσιφεράσης δημοσιογράφους από Twist 1 και p300 σε κύτταρα NCI-Ν87.

(F) Εκπρόσωπος ανάλυση Western blot της έκφρασης ρ300 σε κύτταρα NCI-Ν87 επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει p300 ή αρνητικό μάρτυρα (Ctrl).

(GH) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (G) και τη δυτική blot ανάλυση (H) της έκφρασης FOXM1 σε κύτταρα NCI-Ν87 επιμολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν κενό φορέα (EV) ή Twist 1. Τα κύτταρα προ-επιμολύνθηκαν με siRNA ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν ρ300 ή αρνητικό μάρτυρα siRNA (Ctrl) για 24 ώρες.

Ως μεταγραφικός παράγοντας, Twist 1 μπορεί να προσλάβει συνενεργοποιητές στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στόχου. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η ρ300 θα μπορούσε να δράσει ως συνενεργοποιητή για πολλούς παράγοντες μεταγραφής. Είμαστε συνεπώς, να εξετασθεί αν P300 θα μπορούσε να είναι ένα συνενεργοποιητή για Twist 1 ρύθμιση της έκφρασης FOXM1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7D, Twist 1 θα μπορούσε να αλληλεπιδράσει με ρ300 με Συνανοσοκατακρήμνιση. Η μεταγραφική δραστικότητα του προαγωγού FOXM1 περαιτέρω ρυθμίζεται αυξητικά με συν-επιμόλυνση του ρ300 και Twist 1 (Σχήμα 7Ε). Επιπλέον, καταργούνται περαιτέρω έκφραση P300 με τη χρήση siRNA ολίγο στα κύτταρα NCI-Ν87 (Σχήμα 7F). Όπως ήταν αναμενόμενο, Twist 1-επαγόμενη έκφραση FOXM1 σημαντικά αμβλύνθηκε από τη σιωπή του Ρ300 (Σχήμα 7G-7Η). Τα παραπάνω δεδομένα κατέδειξαν ότι Twist 1 υπερέκφραση FOXM1 μέσω προσλήψεων μεταγραφικών συμπλόκων συνενεργοποιητή, συμπεριλαμβανομένων P300.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν Twist 1 ως κρίσιμο ρυθμιστή του γαστρικού εξέλιξης του καρκίνου. Αυτό προτείνεται από διάφορες αποδείξεις. Πρώτον, Twist 1 υπερέκφραση προωθεί ενώ η έλλειψή του παρεμποδίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όπως φαίνεται από BrdU και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Δεύτερον, Twist 1 επηρεάζει γονίδια έκφραση των ρυθμιστών κυτταρικού κύκλου, περιλαμβανομένων των αναστολέων p21Cip1 CDK, p27kip1, ο ρυθμιστής CDK κυκλίνης Β1, Κυκλίνη D1, κυκλίνη D2 και Κυκλίνη Ε Τρίτον, Twist 1 ρυθμίζει προς τα πάνω έκφραση άμεσα FOXM1 στο μεταγραφικό επίπεδο, μέσω πρόσληψη P300. Επιπλέον, knockdown έκφρασης ενδογενούς FOXM1 εξασθενεί την πολλαπλασιαστική επίδραση του Twist 1, γεγονός που υποδηλώνει ότι FOXM1 είναι απαραίτητη για τους ρόλους των Twist 1 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

Στους ενήλικες, Twist 1 εκφράζεται κυρίως σε πρόδρομα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των οστεοβλαστική, μυογονικές, odontoblastic και μυελομονοκυτταρικού καταγωγές, διατηρώντας αδιαφοροποίητη κατάσταση τους [17]. Εκτός αυτού, Twist1 είναι επίσης ένας σημαντικός ρυθμιστής πολλών άλλων βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης και του μεταβολισμού των μεσεγχυματικών καφέ λίπος. Για παράδειγμα, Twist1 πιστεύεται ότι αναστέλλει τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών ρυθμίζοντας αρνητικά Runx2 [17]. Εκτός αυτού, Twist-1 εκφράζεται επιλεκτικά στο λιπώδη ιστό, αλληλεπιδρά με PGC-1α, για να καταστείλει μιτοχονδριακό μεταβολισμό και απόζευξης. Ως αποτέλεσμα, διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν Twist-1 στο λιπώδη ιστό είναι επιρρεπείς σε υψηλή σε λιπαρά δίαιτα προκαλούμενη παχυσαρκία, ενώ ετεροζυγωτικά ποντίκια knockout του είναι ανθεκτικά παχυσαρκία [18]. Επιπλέον, Twist 1 πυρηνική έκφραση παρατηρήθηκε επίσης σε μη-noncancerous επιθήλιο, υποδηλώνοντας ότι η Twist 1 μπορεί να έχει ένα φυσιολογικό ρόλο στα φυσιολογικά κύτταρα [19]. Μεταγενέστερες μελέτες καταδεικνύουν ότι η έκφραση Twist 1 συσχετίζεται με ισχυρούς διεισδυτικότητα καθώς και κακή πρόγνωση στον καρκίνο επιθηλιακής. Σε γαστρικό καρκίνο, μια πρόσφατη έκθεση έδειξε υπερέκφραση του γονιδίου Twist 1 είναι πιο συχνά σε ιστούς καρκινώματος διάχυτου τύπου με υψηλή έκφραση του γονιδίου Ν-cadherin [20]. Ωστόσο, δεν οριστικά αποτελέσματα έδειξαν Twist προάγει τον πολλαπλασιασμό του γαστρικού καρκίνου. Τα ευρήματά μας προτείνεται Twist προωθείται πιθανώς γαστρικού πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιώντας τους προσδιορισμούς ενσωμάτωσης BrdU. Επιπλέον, FOXM1 ήταν αρχικά ταυτοποιήθηκαν ως ένα καινούργιο στόχο μεταγραφική του Twist 1.

FOXM1 δεσμεύει περιοχές υποκινητή με μια προτίμηση για μια [TAAACA] αλληλουχία αναγνώρισης συναίνεση, αν και με χαμηλότερη συγγένεια από άλλες πρωτεΐνες forkhead [21]. Η έκφρασή του περιορίζεται σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, και αποκλείονται από ηρεμίας και τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα. Ελέγχει την έκφραση γονιδίων που απαιτούνται τόσο για G1 /S και G2 /M μετάπτωσης και είναι απαραίτητη για μιτωτική είσοδο και την εξέλιξη, εξασφαλίζοντας τη διατήρηση της σταθερότητας του χρωμοσώματος [22,23]. Ενισχύσεις του γονιδίου FOXM1 έχει αναφερθεί σε πολυάριθμες όγκους όπως καρκινώματα του παγκρέατος, καρκίνο του μαστού και το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [24-27]. Σε γαστρικό καρκίνο, η έκφραση FOXM1 είναι επίσης επάνω ρυθμισμένη και η αναστολή του οδηγεί σε κυτταρική γήρανση, η οποία είναι τουλάχιστον εν μέρει, εξαρτώνται από την ρ27 kip1 [28,29]. Εκτός από τις θετικές της ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, FOXM1 έχει δειχθεί ότι παίζουν ρόλους σε άλλες διεργασίες που σχετίζονται με τον καρκίνο, όπως εισβολή και μετάσταση [30]. επίπεδα έκφρασης της συσχετίζονται με κακή πρόγνωση και μετάσταση σε διάφορους όγκους συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του γαστρικού [31], υποδηλώνοντας τη δυνατότητα χρησιμοποίησης FOXM1 ως πρόγνωση ή /και δείκτη διάγνωση. Στο σύνολό τους, FOXM1 είναι μια πολλά υποσχόμενη και ελκυστικό στόχο για θεραπεία του καρκίνου. Ως εκ τούτου, είναι κρίσιμο να καταλάβουμε πώς FOXM1 ρυθμίζεται έτσι ώστε να σχεδιάσει καλύτερα θεραπευτικές προσεγγίσεις.

έκφραση FOXM1 ρυθμίζεται αυστηρά τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. αφθονία του αυξάνει κατά την είσοδο του S-φάσης, κατά τη διάρκεια κορυφές G2 και Μ, και αποικοδομείται κατά τη διάρκεια της μιτωτικής εξόδου. Ομοίως, η μεταγραφική δραστικότητα του ρυθμίζεται αυστηρά σε όλο τον κυτταρικό κύκλο με φωσφορυλίωση από τόπους διαφορετικές κινάσες και φωσφατάσες αντιμετώπιση της, φτάνοντας μέγιστη δραστικότητα του στην G2 φάση του κυτταρικού κύκλου [32]. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι η έκφραση FOXM1 μπορεί επίσης να ρυθμίζεται με microRNAs. FOXM1 έχει ταυτοποιηθεί ως άμεσο στόχο miR-134, των οποίων τα επίπεδα είναι αντιστρόφως ανάλογα με την επεμβατική δυναμικό ορισμένων κυττάρων NSCLC [33]. Επιπλέον, FOXM1 επίσης καταστέλλεται από miR-370 στο γαστρικό καρκίνο κύτταρα [29], γεγονός που υποδηλώνει ότι απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διερευνηθεί αν Twist 1 θα μπορούσαν να συνεργαστούν αυτά τα ρυθμιστικά μονοπάτια.

Εν κατακλείδι, εμείς εδώ δείχνουν ότι Twist 1 υπερέκφραση οδηγεί σε σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση της FOXM1, η οποία παίζει καθοριστικό ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Σε αντίθεση, knockdown του Twist 1 μειώνει την έκφραση FOXM1, γεγονός που υποδηλώνει ότι FOXM1 μπορούσε να είναι μια άμεση μεταγραφική στόχος του Twist 1. Έχουμε αποκαλύψει περαιτέρω ότι Twist 1 θα μπορούσε να συνδεθεί με την περιοχή του υποκινητή του FOXM1, και στη συνέχεια προσλαμβάνουν P300 για να επάγει μεταγραφή FOXM1 mRNA. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας αποκαλύψει μια προηγούμενη άγνωστο Twist 1 /FOXM1 ρυθμιστικές μονοπάτι, το οποίο μπορεί να βοηθήσει στην κατανόηση των μηχανισμών του γαστρικού καρκίνου πολλαπλασιασμό.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

(ΑΒ) mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης σε NCI-Ν87 (Α) και AGS κύτταρα (Β) επιμολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν κενό φορέα (EV) ή Twist 1.

DOI: 10.1371 /journal.pone .0077625.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

(Α-Β) Το κυτταρικό πολλαπλασιαστικού δυναμικού (BrdU) προσδιορίστηκε σε NCI-Ν87 (Α) ή AGS (Β) κύτταρα χωρίς ή με επιμόλυνση κενό φορέα (EV) ή GFP siRNA. (Γ) Η ενδογενής έκφραση Twist 1 προσδιορίστηκε με κηλίδα western σε τέσσερις γαστρικά καρκινικά κύτταρα (NCI-Ν87, AGS, HGC-27 και MGC80-3). Η καμπύλη ανάπτυξης των τεσσάρων κυτταρικών σειρών μετρήθηκε

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

(Α-Β) mRNA (Α) και πρωτεΐνη (Β) επίπεδα FOXM1 σε κύτταρα NCI-Ν87 επιμολυσμένα με siRNA ολιγονουκλεοτίδια κατά NCI-Ν87 ή αρνητικό μάρτυρα (Ctrl). (C) δραστικότητα πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασίες BrdU σε κύτταρα NCI-Ν87. Τα κύτταρα προ-επιμολύνθηκαν με siRNA ολιγονουκλεοτίδια για 24 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα (EV) ή Twist 1 για άλλες 24 ώρες. Επίπεδα

(D) mRNA του ρ21, ρ27, κυκλίνη Β1, Κυκλίνη D1, κυκλίνη D2 και κυκλίνης Ε προσδιορίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR σε κύτταρα NCI-Ν87. Τα κύτταρα προ-επιμολύνθηκαν με siRNA ολιγονουκλεοτίδια για 24 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα (EV) ή Twist 1 για άλλες 24 ώρες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s003

(TIF)