Αφηρημένο

Στόχος

Ο ρόλος της Quercetin στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών παραμένει αμφιλεγόμενη, και ο μηχανισμός είναι άγνωστη. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να ερευνήσει τα θεραπευτικά αποτελέσματα του Quercetin σε συνδυασμό με cisplatin και άλλα αντι-νεοπλαστικά φάρμακα σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και τα δύο

in vitro

και

in vivo

, μαζί με το μοριακό μηχανισμός δράσης.

Μέθοδοι

θεραπεία Κερσετίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις εξετάστηκε σε συνδυασμό με σισπλατίνη, ταξόλη, πιραρουβικίνη και 5-FU σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκίνο των ωοθηκών C13 * και κύτταρα SKOV3. δοκιμασία CCK8 και δοκιμασία αννεξίνης V ήταν για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάλυση απόπτωσης, δοκιμασία ανοσοφθορισμού, χρώση DCFDA και σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιήθηκαν για αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) επαγόμενη ανίχνευση της ζημίας και ενδογενή αντιοξειδωτικά ένζυμα έκφρασης. Αθυμικά BALB /c γυμνά ποντίκια-nu ενέθηκαν με C13 * κύτταρα για να ληφθεί ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος για

in vivo

μελέτες. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση πραγματοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η ROS προκαλούμενη ζημία και SOD1 δραστικότητα του ξενομοσχεύματος όγκων.

Αποτελέσματα

Σε αντίθεση με την προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα της υψηλής συγκέντρωσης (40 μΜ-100 μΜ) του Quercetin, χαμηλές συγκεντρώσεις (5 μΜ-30 μΜ) της κερκετίνης οδήγησε σε διάφορους βαθμούς εξασθένησης της κυτταροτοξικότητας της θεραπείας Σισπλατίνη όταν συνδυάζεται με σισπλατίνη. Παρόμοια αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν Quercetin συνδυάστηκε με άλλους αντι-νεοπλασματικούς παράγοντες: ταξόλη, πιραρουβικίνη και 5-φθοριοουρακίλη (5-FU). Χαμηλές συγκεντρώσεις Quercetin παρατηρήθηκαν να καταστείλει ROS προκαλούμενη ζημία, να μειώσει την ενδοκυτταρική επίπεδο ROS και να αυξήσει την έκφραση των ενδογενών αντιοξειδωτικών ενζύμων, γεγονός που υποδηλώνει ROS μεσολάβηση μηχανισμό εξασθένησης αντι-νεοπλασματικές φάρμακα. Σε ξενογονιδιακό μοντέλο, Κερσετίνη οδήγησε σε σημαντική μείωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητα της σισπλατίνης μαζί με την ενίσχυση της ενδογενούς έκφρασης αντιοξειδωτικών ενζύμων και τη μείωση των ROS που προκαλείται από βλάβη στον ιστό ξενομοσχεύματος όγκου.

Συμπέρασμα

Στο σύνολό τους, Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η κερκετίνη σε χαμηλές συγκεντρώσεις εξασθενούν τα θεραπευτικά αποτελέσματα σισπλατίνης και άλλων αντι-νεοπλασματικών φαρμάκων στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με τη μείωση βλάβης ROS. συμπλήρωση Κερσετίνη κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου των ωοθηκών μπορεί να επηρεάσει αρνητικά θεραπευτική ανταπόκριση

Παράθεση:. Li Ν, Sun C, Zhou Β, Xing Η Ma D, Chen G, et al. (2014) χαμηλή συγκέντρωση Quercetin ανταγωνίζεται την κυτταροτοξικά αποτελέσματα του αντι-νεοπλασματικές Drugs στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (7): e100314. doi: 10.1371 /journal.pone.0100314

Επιμέλεια: Ruby John Άντο, Rajiv Gandhi Κέντρο Βιοτεχνολογίας, Ινδία

Ελήφθη: 11 Δεκέμβρη 2013? Αποδεκτές: 26η Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 7 Ιούλη, 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (973 Προγράμματος, 2009CB521808)? Εθνική Φύση και Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (81230038? 81272859? 81025011? 81090414? 81000979? 81101962)? Φύση και Επιστημονικό Ίδρυμα της επαρχίας Hubei (2011CBD542)? Βασική Έρευνα Ταμείων για την Κεντρική Πανεπιστήμια (HUST: 2012TS058). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο συχνή επεμβατική κακοήθεια του γυναικείου γεννητικού συστήματος στις Ηνωμένες Πολιτείες, με κατ ‘εκτίμηση 22.240 περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο. Περίπου 14.030 γυναίκες πεθαίνουν κάθε χρόνο από καρκίνο των ωοθηκών, που αντιπροσωπεύει την πιο κοινή αιτία θανάτου μεταξύ των γυναικών με γυναικολογικό κακοήθειες [1]. φάρμακα Platinum, όπως σισπλατίνη και η καρβοπλατίνη, είναι πρώτης γραμμής χημειοθεραπευτικών παραγόντων για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Αν και οι περισσότεροι ασθενείς εμφανίζουν χημειοευαισθησία όταν αρχίζει η θεραπεία, η επίκτητη αντίσταση των ναρκωτικών έχει γίνει ένα σημαντικό εμπόδιο στη θεραπεία του καρκίνου. Οι παράγοντες που μπορεί να ενισχύσει ή να καταστείλει την αντικαρκινική δράση των αντι-νεοπλασματικών φαρμάκων φαίνεται να είναι σημαντική για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

Quercetin (3,3 ‘, 4’, 5,7-pentahydroxyflavone, Quer) ανήκει σε μία κατηγορία φλαβονοειδών ενώσεων, και είναι σε διάφορα λαχανικά, φρούτα, σπόρους, ξηρούς καρπούς, το τσάι, και το κόκκινο κρασί [2]. Είναι η κύρια φλαβονοειδών στη διατροφή του ανθρώπου, με εκτιμώμενη ημερήσια διαιτητική πρόσληψη 25 mg στις Ηνωμένες Πολιτείες [3]. Ως αποδεδειγμένη αντιοξειδωτική, κερκετίνη συνιστάται η λήψη από το στόμα για την υγειονομική πρόληψη και την υγεία του καρκίνου [4]. Κατά τα τελευταία έτη, διάφορες μελέτες έχουν επισημάνει ότι Quercetin μπορεί να δρα ως ένα δυνητικό αντικαρκινικό φάρμακο με την ενίσχυση της τοξικότητας της θεραπείας Σισπλατίνης στο ηπατώματος ΗΑ22Τ /νθΗ και κύτταρα καρκίνου του Α2780 ωοθήκης [5] – [7]. Παρ ‘όλα αυτά, υπάρχουν μελέτες ανέφεραν ότι σε αντίθεση με υψηλές συγκεντρώσεις φλαβονοειδών μειωμένη επιβίωση των κυττάρων και τη βιωσιμότητα, χαμηλές συγκεντρώσεις αυξημένη ολική αντιοξειδωτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων και την πρόληψη του κυτταρικού θανάτου που οφείλεται σε κυτταροτοξικά φάρμακα, όπως η σισπλατίνη και 5-FU σε Α549 καρκίνου του πνεύμονα και ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα HCT116 [8], [9]. Ο ρόλος των Quercetin στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών είναι αμφιλεγόμενη, και ο μηχανισμός δράσης παραμένει άγνωστος.

Cisplatin και άλλους αντι-νεοπλασματικούς παράγοντες οδηγούν σε αυξήσεις του ενδοκυτταρικού αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), που μπορούν να συμβάλλουν στην θεραπευτική τους δράση . Αντιοξειδωτικό όπως συμπληρώματα βιταμίνης C μπορεί να εξασθενήσει την αντι-νεοπλασματική δραστικότητα των φαρμάκων που αυξάνουν ROS [10]. Quercetin είναι γνωστό ότι μειώνει τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS σε διάφορους τύπους κυττάρων, με την προώθηση της ενδοκυτταρικής σύστημα ROS παγίδευσης, η οποία περιλαμβάνει τη διαμόρφωση ένζυμα αποτοξίνωσης, όπως υπεροξειδική δισμουτάση 1 (SOD1) και καταλάσης (CAT). Αυτό μας ώθησε να αμφισβητήσει ότι αν Κερσετίνη θα μπορούσε επίσης να εξουδετερώσει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα των αντι-νεοπλασματικών φαρμάκων που αυξάνεται ROS. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθούν οι επιδράσεις του Quercetin σε συνδυασμό με cisplatin και άλλα αντι-νεοπλαστικά φάρμακα σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και τα δύο

in vitro

και

in vivo

, μαζί με το μοριακό μηχανισμό της δράσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση ζώων Εργαστηρίου του National Institutes of Health. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της Tongji Medical College, Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (Αριθμός Άδειας: S292). Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων

Χημικά και αντιδραστήρια

Κερσετίνη (& gt? 99% καθαρό)., Cis-διαμινολευκόχρυσος (ΙΙ) διχλωριούχο (σισπλατίνη), ταξόλη (πακλιταξέλη) ήταν αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ), διαλύθηκε σε DMSO, κλασματοποιήθηκε και αποθηκεύθηκε στους -20 ° C. Πιραρουβικίνη (Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Κίνα) και 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) (Σαγκάη Σουντόνγκ Haipu Pharmaceutical Co Ltd, Κίνα) διαλύθηκαν σε φυσιολογικό ορό.

Κυτταρική καλλιέργεια

η ανθρώπινη επιθηλιακή καρκινική κυτταρική σειρά ωοθηκών C13 * [11] είναι η Σισπλατίνα ανθεκτικό κλώνος Ον2008 κυτταρική γραμμή η οποία προέρχεται από ένα ανθρώπινο καρκίνωμα ωοθηκών. Αυτή η κυτταρική σειρά C13 * ήταν ένα δώρο από τον καθηγητή Rakesh στην Οτάβα Περιφερειακό Κέντρο Καρκίνου, Οτάβα, Καναδάς [3]. SKOV3 καρκινική κυτταρική σειρά ωοθηκών ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC). Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 37 ° C με 5% CO

2.

Κυτταρική βιωσιμότητα

Κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με CCK8 δοκιμασίας (kit μέτρηση κυττάρων-8, Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan). Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν σε τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας των 96 φρεατίων σε κυτταρική πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Quercetin /φάρμακα αντι-νεοπλασματική (σισπλατίνη, ταξόλη, πιραρουβικίνη και 5-FU) ή φορέα (DMSO με το ίδιο ποσοστό αραίωσης, όπως τα φάρμακα) στους 37 ° C για 48 ώρες. Η κυτταρική μονοστιβάδα πλύθηκε τρεις φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) που περιέχει 1,2 mM ΟαΟ

2 και 0.7 mM MgCl

2, τότε ένα διάλυμα αραιωμένος 1:10 CCK8 σε RPMI 1640 προστέθηκε στα κύτταρα και επωάζονται για 2 ώρες στους 37 ° C. Τα αποτελέσματα μετρήθηκαν με έναν αναγνώστη μικροπλάκας σε 450 nm και εκφράζονται ως ποσοστά του τιμές ελέγχου (που λαμβάνονται για τα κύτταρα σε αγωγή με φορέα).

αννεξίνης V /PI χρώση

Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και πλύθηκαν με ορό που περιέχει μέσο. Τα δείγματα (5 × 10

5 κύτταρα) υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 400 χ g και το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίζονται χρησιμοποιώντας ένα κιτ αννεξίνη V-FICT /PI απόπτωση (keygen Biotech, Nanjing) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων ανιχνεύθηκε και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής.

Μέτρηση της ROS

ROS ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας Reactive Oxygen Είδος Assay Kit (Beyotime, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά το μοριακό ανιχνευτή 5- (και-6) -χλωρομεθυλο-2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (DCFH-DA) διαχέεται μέσα σε κύτταρα και διαχωρίζεται από ενδοκυτταρικά de-εστεροποίηση, η μετέπειτα αντίδραση με υπεροξείδια παράγει φθορίζον 5-χλωρομεθυλ- 2 ‘, 7’-διχλωροφθορεσκεϊνης (DCF). Εν συντομία, μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 10 mmol /L DCFH-DA, επωάστηκαν για 20 λεπτά στους 37 ° C, πλύθηκαν με PBS για να απομακρυνθεί η περίσσεια του χρώματος, και στη συνέχεια επωάστηκαν με μέσο RPMI στους 37 ° C για 10 λεπτά, τα αποτελέσματα φθορισμού ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το κανάλι FL-1 ενός Becton Dickinson FACSCalibur, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας CellQuest λογισμικού. Το ποσοστό των κυττάρων που εμφανίζουν αυξημένη πρόσληψη χρωστικής χρησιμοποιήθηκε για να αντανακλά μια αύξηση στα επίπεδα ROS.

ανοσοφθορισμού

δοκιμασία

Εν συντομία, C13 * κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 24 φρεατίων που περιέχουν ένα στείρο γυάλινο slide σε μία κυτταρική πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από αγωγή με διάφορα φάρμακα για 48 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS, και μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από αποκλεισμό με 1% άπαχο γάλα για 2 ώρες, κατσίκα αντι-8-OHdG και αντισώματα ποντικού αντι-γH2AX (Millipore) προστέθηκαν στα πλακίδια αντίστοιχα. Μετά από 4 ώρες επώαση, τα πλακίδια πλύθηκαν 3 φορές με 0,5% PBS-Tween20 (PBST) και το δευτερεύον αντίσωμα anti-mouse φλουορεσκεΐνη CY3-συζευγμένο αντι-κατσίκας δευτερογενούς αντισώματος ποντικού και ΡΙΤΟ-συζευγμένο κατσίκας (Sigma-Aldrich) προστέθηκαν στους μια αραίωση του 1:100. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 45 λεπτά στους 37 ° C. Τέλος, τα κύτταρα πλύθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (Olympus, Tokyo, Japan). Πέντε τυχαίες εικόνες πεδίο υψηλής ισχύος ελήφθησαν από κάθε ομάδα, Image J λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του αριθμού των πολύ θετικά χρωματισμένων κυττάρων.

σε πραγματικό χρόνο Αντίστροφη Μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

C13 * κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 6 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κερσετίνη και σισπλατίνης για 48 ώρες. Ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, Κίνα). Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Toyobo, Japan). Real-time PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ PRISM 7500 ανακυκλωτή με αντιδραστήριο SYBR (Toyobo, Japan). Οι συνθήκες θερμικής ανακύκλωσης είχαν τεθεί ως δεδομένο στις οδηγίες που περιλαμβάνονται με τον ανακυκλωτή, με θερμοκρασία ανόπτησης των 60 ° C. Ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του υπεροξειδική δισμουτάση 1 (SOD1), ενδονουκλεάση G (ENDOG), το κυτόχρωμα c (CYTO-c), γλουταθειόνη υπεροξειδάσης (GPx), καταλάση (CAT) και την απόζευξη πρωτεΐνη 2 (UCP2) (Πίνακας S1) σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer 5.0 και συντίθεται από Invitrogen. Ποσοτική ομαλοποίηση των cDNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αφυδρογονάσης γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής γονίδιο καθαριότητα (GAPDH) σαν εσωτερικός έλεγχος για να προσδιοριστεί η ομοιομορφία του προτύπου RNA για όλα τα δείγματα. Για κάθε δείγμα, η έκφραση του γονιδίου που μας ενδιαφέρει προήλθε από το λόγο της έκφρασης τους με την έκφραση GAPDH με τον ακόλουθο τύπο:. Σχετική έκφραση = 2- (ΔCt δείγματος ΔCt έλεγχος), ΔCt = Ct γονίδιο-Ct GAPDH

In vivo

ξενομοσχεύματος μελέτες

Ο

in vivo

αξιολόγηση των Quercetin διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ανθρώπινου C13 * κύτταρα. Αθυμικοί BALB /c-nu γυμνά ποντίκια (ηλικίας 4-6 εβδομάδων, που λαμβάνονται από το Πεκίνο HFK εταιρεία βιοεπιστημών, Πεκίνο, Κίνα) στεγάστηκαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο-ελεύθερο χώρο μέσα στις εγκαταστάσεις των ζώων στο Εργαστήριο Κέντρο Ζώων του Πανεπιστημίου Tongji Medical College . Τα ζώα αφέθηκαν να εγκλιματιστούν στο νέο τους περιβάλλον για μία εβδομάδα πριν από τη χρήση. C13 * κύτταρα (2 χ 10

6) επαναιωρήθηκαν σε μέσο PBS με Matrigel μήτρα βασικής μεμβράνης (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) σε μία αναλογία 1:01 (συνολικός όγκος 100 μΐ), στη συνέχεια εγχύθηκαν υποδορίως στα πλευρά άτριχων ποντικών (ημέρα 0). Από την 10η ημέρα της ένεσης, οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες θεραπείας (η = 8 για κάθε ομάδα) και ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (ΙΡ) με φυσιολογικό ορό (NS), Quercetin (20 mg /kg σωματικού βάρους, ημερησίως), σισπλατίνη ( 4 mg /kg σωματικού βάρους, κάθε τέσσερις ημέρες), και συνδυασμένη θεραπεία κερσετίνη και Cisplatin (χρησιμοποιώντας τις παραπάνω δοσολογίες) για 21 συνεχόμενες ημέρες. Το σωματικό βάρος και η μάζα των όγκων μετρήθηκε κάθε 5 ημέρες. Ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο και υπολογίστηκαν σύμφωνα με τον τύπο (πλάτος

2 χ μήκος) /2. Τα ποντίκια θανατώθηκαν με αυχενική εξάρθρωση υπό αναισθησία μετά από τρεις εβδομάδες θεραπείας (ημέρα 30).

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Ανοσοϊστοχημικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν σε όγκους ξενομοσχεύματος μετά απομακρύνθηκαν από γυμνούς ποντικούς. Οι όγκοι μονιμοποιήθηκαν σε 40 mg /mL παραφορμαλδεϋδης, εγκλεισμένα σε παραφίνη και κόπηκαν σε 4 μm διαδοχικές τομές. Στη συνέχεια, ενδογενών υπεροξειδασών σβήστηκαν και οι τομές πλύθηκαν προσεκτικά με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) τρεις φορές. Τα τμήματα αποκλείστηκαν με 2% ορό κατσίκας και ορού κουνελιού αντίστοιχα σε PBS σε θερμοκρασία 37 ° C για 45 λεπτά, στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα ποντικού αντι-SOD1 (1:500 αραίωση, Abcam) και γίδινο αντι-8-OHdG αντίσωμα (1 :800 αραίωσης, Millipore) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με κατσικίσιο αντι- ποντικού και συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα αντι-αίγας χρένο ποντίκι χωριστά και σύμπλεγμα αβιδίνης-βιοτίνης με διαμινοβενζιδίνη ακολουθούμενη (Vector ABC, Burlingame, CA, USA). Μέσα σε 2% νερό αμμωνία, αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε για αντικηλίδωση. Οι τομές επωάστηκαν με αντίστοιχα ως αρνητικοί έλεγχοι κουνελιού και ορό κατσίκας IgG.

Θετική χρώση 8-OHdG ήταν κυρίως στους πυρήνες ενώ θετική έκφραση του SOD1 ήταν κυρίως ένα πρότυπο κυτόπλασμα τόσο σε καρκινικά κύτταρα και όχι στα στρωματικά κύτταρα . Λόγω της έντασης του 8-OHdG και SOD1 χρώση σε κάθε τμήμα ήταν ως επί το πλείστον ομογενή, η ανοσοαντιδραστικότητα των δειγμάτων ήταν ημι-ποσοτικά αξιολογηθούν χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα κριτήρια: ισχυρό θετικό (βαθμολογήθηκε ως 3), ισχυρή ένταση χρώσης (& gt? 90% τα καρκινικά κύτταρα)? μέτρια θετική (βαθμολογείται ως 2), μέτριας έντασης χρώσης (& gt? 50 – 89% των θετικών κυττάρων)? ασθενές θετικό (βαθμολογήθηκε ως 1), αδύναμη ένταση χρώσης (& gt? 10-49% των θετικών κυττάρων)? απών (βαθμολογήθηκαν ως 0), καμία ένταση χρώσης και καμία θετική ή μόνο μερικά θετικά κύτταρα [12], [13]. Η ένταση χρώσης και αναλογία κάθε τμήμα βάφονται υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας πέντε τυχαίες εικόνες πεδίο υψηλής ισχύος της κάθε ομάδας από δύο ανεξάρτητους ερευνητές.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS19.0. Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student. Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ περισσοτέρων των δύο ομάδων προσδιορίστηκαν με μονόδρομη ανάλυση ANOVA ακολουθούμενη από post hoc συγκρίσεις κατά ζεύγη.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Κερσετίνη σε χαμηλές συγκεντρώσεις προάγει την επιβίωση των καρκινικών C13 * κύτταρα ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη

με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία είναι η πιο σημαντική θεραπεία στην αντιμετώπιση του καρκίνου των ωοθηκών. Για τον προσδιορισμό του δυνητικού ρόλου Quercetin μπορεί να διαδραματίσει στην αντίσταση Cisplatin στον καρκίνο των ωοθηκών, C13 * κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις Quercetin, σισπλατίνη, ή ένα συνδυασμό των δύο. Η IC50 του Cisplatin επεξεργασμένου C13 * κυττάρων ήταν κατά προσέγγιση 80 μΜ (IC50 = 78,8 μΜ, 95% CI: 72,9 έως 85,1 μΜ) (Εικόνα S1A). Όταν C13 * κύτταρα επεξεργάστηκαν με 80 μΜ Σισπλατίνη σε συνδυασμό με αυξανόμενες δόσεις της κερκετίνης, βρήκαμε ότι η κυτταροτοξικότητα της Cisplatin μειώθηκε κατά το συνδυασμό με χαμηλές συγκεντρώσεις Quercetin (5 μΜ έως 30 μΜ), ενώ η σχετική υψηλή συγκέντρωση Quercetin (100 μΜ) αυξήθηκε Cisplatin κυτταροτοξικότητα (Εικ. 1Α). Για να προσδιοριστεί η ανταγωνιστική δράση ή ευαισθητοποίηση του συνδυασμού φαρμάκων, υπολογίσαμε το δείκτη συνδυασμού (CI) για τα φάρμακα με βάση τους Chou και Talalay θεώρημα [14]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι χαμηλές συγκεντρώσεις Quercetin ανταγωνίζεται τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του cisplatin σε C13 * κύτταρα, ενώ οι υψηλές συγκεντρώσεις Quercetin έχει αθροιστική δράση με σισπλατίνη (Πίνακας S2). Επίσης πραγματοποιούνται πειράματα συνδυασμό με μια σειρά διαφορετικών συγκεντρώσεων σισπλατίνης πλέον σταθερού συγκεντρώσεις Quercetin (20 μΜ), η οποία έδειξε ότι χαμηλές συγκεντρώσεις Quercetin αυξημένης αντίστασης των κυττάρων C13 * έναντι σισπλατίνης σε διάφορους βαθμούς (Εικόνα S2). Οι εικόνες φάσης αντίθεσης C13 * κύτταρα επεξεργασμένα με τον έλεγχο του οχήματος, σισπλατίνη, ή συνδυασμούς Quercetin (20 μΜ, 80 μΜ) σε συνδυασμό με σισπλατίνη (80 μΜ) φαίνεται στο Σχ. 1Β.

(Α), Cell βιωσιμότητα των ομάδων που εκτίθενται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις Quercetin μόνο, ή σε συνδυασμό με 80 μΜ Cisplatin για 48 ώρες μετρήθηκε με δοκιμασία CCK8 και εκφράζονται ως ποσοστό των τιμών ελέγχου. *

P

= 0.039, #

P

= 0,009, & amp?

P

= 0,027,%

P

= 0,010, δοκιμασία ANOVA ακολουθούμενο από ταχυδρομική hoc συγκρίσεις ανά ζεύγη. (Β), οι εικόνες αντίθεσης φάσης του C13 * κύτταρα επεξεργασμένα με τον έλεγχο του οχήματος (DMSO με τον ίδιο ρυθμό αραίωσης όπως τα φάρμακα), σισπλατίνη, ή συνδυασμός βαλανοκετόνης (20 μΜ, 80 μΜ) σε συνδυασμό με σισπλατίνη (80 μΜ). (C, D), Cell απόπτωση των διαφορετικών ομάδων αγωγής ανιχνεύθηκε και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν (Ν = 3 ανά πείραμα). Ομάδα Η σισπλατίνη σε συνδυασμό με VS. θεραπεία Κερσετίνη ομάδα θεραπείας σισπλατίνη, **

P

= 0.033, ***

P

= 0.043, ANOVA τεστ που ακολουθείται από post hoc συγκρίσεις ανά ζεύγη.

Η

Για την περαιτέρω ποσοτικοποίηση των αποπτωτικά αποτελέσματα του κερσετίνη και θεραπεία σισπλατίνη, C13 * κύτταρα βάφτηκαν με Annexin-V FITC και ΡΙ, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την κυτταρική απόπτωση. Εμφανή μειώσεις του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων ανιχνεύθηκαν για κύτταρα επεξεργασμένα με σισπλατίνη και 20 μΜ Quercetin ό, τι με Cisplatin μόνο του (Σχ. 1C, 1D). Αναλογίες αννεξίνης V-χρωματισμένα κύτταρα ήταν υψηλότερα σε κύτταρα κατεργασμένα με Cisplatin από εκείνα των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με επιπλέον 20 μΜ Quercetin.

Για να γενικεύσουμε τα συμπεράσματα μας, έχουμε διεξαγάγει δοκιμασίες CCK8 σε SKOV3, ένα κοινά χρησιμοποιούμενο καρκινική κυτταρική σειρά ωοθηκών. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι χαμηλές συγκεντρώσεις Quercetin μείωσε τις κυτταροτοξικές επιδράσεις της Cisplatin σε κύτταρα SKOV3 (Σχήμα S3).

Quercetin εξασθενημένα τις επιδράσεις της θεραπείας των διαφόρων αντι-νεοπλασματικές φάρμακα σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Για εξετάζει εάν Quercetin εξασθενούν οι αντικαρκινικές επιδράσεις άλλων αντι-νεοπλασματικών φαρμάκων, υποβάλλαμε σε αγωγή C13 * κυττάρων με τρία άλλα αντι-νεοπλαστικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται συνήθως στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, 5-FU, ταξόλη, και πιραρουβικίνη. C13 * κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μία σειρά αυξανόμενων δόσεων κερσετίνη και σταθερών 5-FU (5 μΜ), ταξόλη (3 μΜ) και πιραρουβικίνη (3 ηΜ) σε κατά προσέγγιση συγκεντρώσεις του IC50 αντιστοίχως (Σχήμα S1). Παρόμοια με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με Cisplatin, θεραπεία με χρήση αυτών των φαρμάκων σε συνδυασμό με κερσετίνη οδήγησε σε μεγαλύτερη αντίσταση κύτταρο από τη θεραπεία με αντι-νεοπλασματική φάρμακα μόνο (Εικ. 2.) Κατά την συγκέντρωση των 20 μΜ, Quercetin έδειξαν προφανή αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα έναντι αυτά τα τρία φάρμακα. Quercetin έδειξε χαμηλή συγκέντρωση ειδικών προστατευτικών επίδραση στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με 5-FU (Σχ. 2Α), παρόμοια με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με Cisplatin. Σε συνδυασμό με ταξόλη ή πιραρουβικίνη, ωστόσο, Quercetin διατήρησε το αποτέλεσμα προαγωγής κυττάρων Survial έναντι αντικαρκινικών φαρμάκων ακόμη και σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις (80 μΜ, 100 μΜ) (Σχ. 2Β, 2C).

(A~C ), Cell βιωσιμότητα των Quercetin σε συνδυασμό με 5-FU, ταξόλη και πιραρουβικίνη μετρήθηκε με δοκιμασία CCK8 και εκφράζονται ως ποσοστό των τιμών ελέγχου. Ν = 3 ανά πείραμα. Ομάδα Η σισπλατίνη σε συνδυασμό με Κερσετίνη 20 μΜ VS. θεραπεία Ομάδα θεραπείας σισπλατίνη, *

P

= 0,048, **

P

= 0.040, ***

P

= 0.032, Student t-test.

Quercetin μείωσε την οξειδωτική βλάβη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών που προκαλούνται από σισπλατίνη

Ερευνήσαμε το μηχανισμό με τον οποίο Quercetin εξασθενημένα τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της Cisplatin. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [15], πολλές αντι-νεοπλασματικών φαρμάκων συμπεριλαμβανομένων σισπλατίνη, να οδηγήσει σε αυξήσεις του ενδοκυτταρικού ROS που συμβάλλουν στην θεραπευτική τους δράση. Εμείς το ερώτημα κατά πόσον Quercetin μπορεί να μεταβάλει την ROS που σχετίζονται με ζημία που προκλήθηκε από αυτά τα φάρμακα. Η έκφραση του 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), ένα δείκτη του οξειδωτικού στρες DNA και το πιο συχνά ανιχνεύονται και μελετώνται βλάβη του DNA [16], εκτιμήθηκε με δοκιμασία ανοσοφθορισμό. Μετρήσαμε επίσης το επίπεδο του συνόλου των κυτταροτοξικών τραυματισμού από την ανίχνευση του γH2AX, ενός κοινού δείκτη της βλάβης του DNA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι εντάσεις φθορισμού των δύο γH2AX και 8-OHdG ήταν πολύ χαμηλότερη στην ομάδα αγωγής 80 μΜ Σισπλατίνη σε συνδυασμό με χαμηλή συγκέντρωση Quercetin (20 μΜ) από την ομάδα των 80 μΜ και μόνο Cisplatin. Σε αντίθεση με αυτό, 80 μΜ Σισπλατίνη με υψηλή συγκέντρωση (60 μΜ, 100 μΜ) του Quercetin αύξησε την ένταση του φθορισμού (Σχ. 3Α, 3Β). Μετρώντας των θετικών κυττάρων με χρήση λογισμικού J Image έδειξαν ότι η θεραπεία συνδυασμού με κερκετίνη (20 μΜ) είχε πιο προφανής μείωση του 8-OHdG από εκείνη του γH2AX, σε σύγκριση με θεραπεία Cisplatin μόνο (36,40% και 19,33% αντίστοιχα) (Εικ. 3Β) . Ανέφερε ότι χαμηλές συγκεντρώσεις Quercetin μείωσε την οξειδωτική βλάβη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών που προκαλούνται από σισπλατίνη.

(Α), 8-OHdG και έκφραση Η2ΑΧ σε C13 * κύτταρα κατεργασμένα με κερκετίνη σε συνδυασμό με σισπλατίνη ανιχνεύτηκε με ανοσοφθορισμό χημική δοκιμή. (Β), αριθμοί άκρως θετικά προετοιμασμένα κύτταρα σε πέντε τυχαία πεδία υψηλής ισχύος μετρήθηκαν από εικόνα J και εκφράζεται ως ποσοστό των τιμών ομάδας Cisplatin. Ομάδα Η σισπλατίνη σε συνδυασμό με Κερσετίνη 20 μΜ VS. θεραπεία Ομάδα θεραπείας σισπλατίνη, Ν = 3. *

P

= 0.004, #

P

= 0.001, Student t-test.

Η

Κερσετίνη μειωμένο επίπεδο ROS της τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που υποβάλλονται σε θεραπεία Cisplatin

για να καθοριστεί εάν Quercetin μείωσε τον τραυματισμό ROS με μείωση ενδοκυτταρικών ROS, Reactive Oxygen Είδος Assay Kit χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS του C13 * κυττάρων σε διαφορετικές ομάδες θεραπείας. Σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με έκδοχο ελέγχου ή Cisplatin μόνο του, η θεραπεία με ένα επιπλέον 20 μΜ Quercetin οδηγούν σε μείωση των ενδοκυτταρικών επιπέδων των ROS (Εικ. 4Α, 4C). Ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι η κερκετίνη (20 μΜ) κατεργασία έδωσε μια προφανή μείωση του επιπέδου ROS (μέση τιμή 70,4) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (μέση τιμή 99,05) (

P

& lt? 0.001). (Εικόνα 4Β, 4D ). Σε συμφωνία με τα προηγούμενα αποτελέσματα, η έκθεση στη σισπλατίνη προκάλεσε καρκίνο των ωοθηκών C13 * κύτταρα να συσσωρεύονται την ενδοκυτταρική ROS, με ένα μέσο επίπεδο ROS των 123,5. Στην ομάδα θεραπείας του Σισπλατίνη συνδυασμό με κερκετίνη, η τιμή αυτή μειώθηκε σε 83,38 (Εικ 4D.), Ακόμη χαμηλότερες από την ομάδα ελέγχου οχήματος (99,05) (

P

& lt? 0.001). (Εικ. 4Β)

ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS του C13 * κύτταρα διαφορετικών ομάδων αγωγής ανιχνεύθηκαν με είδη αντιδρώντος οξυγόνου Δοκιμασία χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. (Α, Β) Τα επίπεδα ROS του C13 * κύτταρα κατεργασμένα με τον έλεγχο του οχήματος ή 20 μΜ Quercetin για 24 ώρες. (C, D) Τα επίπεδα ROS του C13 * κύτταρα επεξεργασμένα με 80 μΜ Σισπλατίνη με ή χωρίς 20 μΜ Quercetin για 24 ώρες. Ν = 3. *

P

& lt? 0.001, #

P

& lt?. 0.001, Student t-test

Η

Κερσετίνη αύξησε την έκφραση των ενδογενών αντιοξειδωτικών ενζύμων στον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα

Τα παραπάνω αποτελέσματα έδειξαν ότι Quercetin μπορεί να μειώσει την ενδοκυτταρική ROS καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, έτσι επιδιώξαμε να προσδιορίσει έναν μηχανισμό δράσης. Τα πιο σημαντικά αντιοξειδωτικά συστατικά των κυττάρων έναντι ROS είναι τα ενδογενή αντιοξειδωτικά ένζυμα, συμπεριλαμβανομένων υπεροξειδική δισμουτάση 1 (SOD1), ενδονουκλεάση G (ENDOG), το κυτόχρωμα c (CYTO-c), γλουταθειόνη υπεροξειδάσης (GPx), καταλάση (CAT), και απόζευξη πρωτεΐνη 2 (UCP2). Μετρήσαμε την έκφραση των ενδογενών αντιοξειδωτικών ενζύμων με πραγματικό χρόνο PCR. Σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με έκδοχο ελέγχου ή Cisplatin μόνο του, η θεραπεία με συνδυασμό σισπλατίνης με 20 μΜ Quercetin οδηγούν σε διάφορους βαθμούς αύξηση στην έκφραση του SOD1, ENDOG, CYTO-c, GPx, CAT και UCP2 (Εικ. 5A~F).

(A~F), Έκφραση των αντιοξειδωτικών ενζύμων του C13 * κυττάρων εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Ν = 3.

Η

Κερσετίνη προώθησε την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών με τη θεραπεία με Cisplatin

in vivo

Η

Χρησιμοποιήσαμε C13 * κύτταρα να παράγουν ξενομοσχεύματος όγκους σε αθυμικά γυμνά BALB /c -nu ποντίκια για να προσδιοριστεί αν Κερσετίνη θα μπορούσε να μετριάσει τις επιπτώσεις της χημειοθεραπείας

in vivo

. Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία με σισπλατίνη μόνο μείωσε την ανάπτυξη όγκου σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν φορέα. Η θεραπεία με Κερσετίνη και μόνο ελαφρά κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με το κανονικό έλεγχο αλατούχου διαλύματος (όγκοι του όγκου των 111,75 χιλιοστά

3 και 120,51 χιλιοστά

3, αντίστοιχα) (P = 0,015). Οι όγκοι από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με σισπλατίνη σε συνδυασμό με Quercetin ήταν περίπου 1,8 φορές μεγαλύτερες την ημέρα 30 από εκείνους που αντιμετωπίστηκαν με σισπλατίνη μόνο (

P

& lt? 0,001? Σχ. 6Α, 6Β). Συγκρίνοντας τα μέσα βάρη των όγκων που αφαιρέθηκαν από τα ποντίκια, βρήκαμε ότι οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμό της κερκετίνης και Cisplatin (72,53 ± 7,33 mg) ήταν σημαντικά βαρύτερα από ότι τα επεξεργασμένα με σισπλατίνη μόνο (41,47 ± 6,72 mg),

P

& lt? 0.001 (Εικ. 4D). Περαιτέρω, ο συνδυασμός σισπλατίνης και Quercetin θεραπεία εμφάνισαν καρκίνο προώθηση δράση σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, που μετράται τόσο του μεγέθους του όγκου και του βάρους του όγκου (Σχ. 6C).

Ποντίκια ενέθηκαν με NS, 20 /kg quercetin, 4 mg /kg σισπλατίνη, ή κουερσετίνη συν σισπλατίνη, ip. ξενομοσχεύματα κυττάρων C13 * (2 × 10

6) εμβολιάσθηκαν στο δεξί πλευρό θηλυκών αθυμικών γυμνών ποντικών ηυ /ηυ. Οι όγκοι των όγκων προσδιορίσθηκε με ένα παχύμετρο και υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο (πλάτος2 χ μήκος) /2. (Α), ο σχηματισμός όγκου σε ποντικούς της ομάδας θεραπείας Σισπλατίνη και σε συνδυασμό με την ομάδα Quercetin. (Β), μέση σχετική ανάπτυξη του όγκου όπως αναλύεται από την αύξηση του όγκου του όγκου για 8 ποντικούς ανά πειραματική ομάδα ** Cisplatin συν Quercetin VS. Σισπλατίνη,

P

& lt? 0.001? * VS. Κερσετίνη Ελέγχου,

P

= 0,015, δοκιμασία ANOVA που ακολουθείται από post hoc συγκρίσεις κατά ζεύγη? (C), το Μέσο βάρη των όγκων από κάθε ομάδα. #Cisplatin Σε συνδυασμό με Κερσετίνη VS. Σισπλατίνη,

P

& lt? 0.001, τεστ ANOVA που ακολουθείται από post hoc συγκρίσεις κατά ζεύγη? (D), Ανοσοϊστοχημική ανάλυση 8-OHdG και SOD1 σε ξενομοσχεύματος όγκοι αφαιρούνται από γυμνούς ποντικούς. (Ε), τα δεδομένα ποσοτικοποίηση των διαφορών στην έκφραση SOD-1 και 8-OHdG, *: Ρ & lt? 0.001, **: ρ. & Lt? 0.001, δοκιμή ANOVA που ακολουθείται από post hoc συγκρίσεις κατά ζεύγη

Η

Κερσετίνη ενίσχυσε την έκφραση των ενδογενών αντιοξειδωτικών ενζύμων SOD1 του καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων em

in vivo

, και εμπόδισε ROS προκαλείται από βλάβη

για να επιβεβαιώσετε την προστατευτική επίδραση έναντι οξειδωτική βλάβη από Κερσετίνη in vivo , ανοσοϊστοχημικές δοκιμασίες διεξήχθησαν σε όγκους αφαιρεθεί από μοντέλο ξενομοσχεύματος γυμνών ποντικών. 8-OHdG, ένας δείκτης του οξειδωτικού στρες DNA, βρισκόταν κυρίως στον καρκίνο του πυρήνα του κυττάρου. Σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με vehical ή κερκετίνη μόνο, χρώση 8-OHdG έδειξαν ασθενή ένταση με τις βαθμολογίες των 0,4 και 0,6 αντίστοιχα. Στην ομάδα που έλαβε αγωγή με σισπλατίνη μόνο, σχεδόν όλα τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζονται εξαιρετικά ισχυρή χρώση 8-OHdG με σκορ 2,8. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ομάδα ποντικών που υπέστησαν αγωγή από σισπλατίνη σε συνδυασμό με Quercetin είχε ένα πολύ χαμηλότερο επίπεδο από 8-OHdG χρώσης (στείλει 1.6) σε όγκους από εκείνο θεραπεία με σισπλατίνη μόνο (Σχ. 6D-Ε).

DNA ένζυμα επισκευής εμποδίζει τη συσσώρευση των κατεστραμμένων DNA και τα αντιοξειδωτικά προστατεύουν τα κύτταρα από τις ελεύθερες ρίζες. Διαπιστώσαμε έκφραση SOD1, το οποίο είναι ένα κρίσιμο ενδογενών αντιοξειδωτικών ενζύμων για την ανοχή του οξειδωτικού στρες, για να μάθετε αν Κερσετίνη επηρεάζονται από τη δραστηριότητα των ενδογενών αντιοξειδωτικών ενζύμων. Θετική έκφραση της SOD1 ήταν κυρίως ένα σχέδιο κυτταρόπλασμα στα ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και όχι στρωματικά κύτταρα. Το αντιοξειδωτικό ένζυμο SOD1 ήταν ιδιαίτερα υπερεκφράζεται σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με κερκετίνη ή Cisplatin συν Quercetin (στείλει 2.0 και 2.6 αντίστοιχα) σε σύγκριση με τους όγκους που έλαβαν θεραπεία με όχημα ή Cisplatin μόνο (στείλει 1.2 και 0.6 αντίστοιχα) (Σχ. 6D-Ε). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κερκετίνη ενίσχυσε την ενδογενή αντιοξειδωτική έκφραση του ενζύμου SOD1 των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

in vivo

, και εμπόδισε ROS προκαλούμενη βλάβη.

Συζήτηση

Ως κλασική φλαβονοειδών ένωση , κερκετίνη συνιστάται συνήθως να λαμβάνουν από το στόμα κάθε μέρα για γενική περίθαλψη της υγείας και την πρόληψη του καρκίνου. Staedler

et al.

Βρήκαν ότι Quercetin σε συγκεντρώσεις 5 μΜ και 10 μΜ θα μπορούσαν να αυξήσουν την αποτελεσματικότητα των 100 μΜ δοξορουβικίνης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού in vitro [17], [18], ενώ άλλοι ερευνητές κατέληξαν σε διαφορετικά συμπεράσματα [8], [9]. Samuel

et al.

[8] ανέφερε ότι σε ορθοκολικό και καρκινικά κύτταρα προστάτη, τα θεραπευτικά αποτελέσματα του φαρμάκου σε συνδυασμό με Quercetin επηρεάστηκαν από τις αποτελεσματικές δόσεις και την κατάσταση της ρ53 των κυττάρων (ο συνδυασμός της 5- fu με έως 6 μΜ Κερσετίνη προωθείται cologenic επιβίωσης σε μηδενική κύτταρα p53 ενώ 50 μΜ Κερσετίνη ενήργησε αντίθετα ρόλο στα κύτταρα ρ53 άγριου τύπου). Σε αυτή τη μελέτη, Quercetin σε υψηλές συγκεντρώσεις, είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με σισπλατίνη εμφανίζεται αντι-νεοπλασματικές επιδράσεις στον καρκίνο C13 * κυττάρων των ωοθηκών, ενώ η χαμηλή συγκέντρωση (5 μΜ-30 μΜ) του Quercetin φάνηκε να ανταγωνίζονται τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα των αντι-νεοπλασματικών παραγόντων συμπεριλαμβανομένων σισπλατίνη, 5-Fu, ταξόλη, και πιραρουβικίνη. Διερευνήσαμε επίσης το μηχανισμό της αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα του Quercetin όταν συνδυάζεται με σισπλατίνη.