Αφηρημένο

Αξιολογήσαμε το μηχανισμό της καψαϊκίνης μεσολάβηση γενιά ROS σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Η παραγωγή ROS ήταν περίπου 4-6 φορές περισσότερο σε σύγκριση με τον έλεγχο και το νωρίτερο 1 ώρα μετά καψαϊκίνη θεραπεία σε BxPC-3 και τα κύτταρα AsPC-1, αλλά όχι σε φυσιολογικά HPDE-6 κύτταρα. Η γενιά των ROS αναστέλλεται από την καταλάση και EUK-134. Για να οριοθετηθούν το μηχανισμό της παραγωγής ROS, ενζυματικές δραστηριότητες του μιτοχονδριακού συμπλόκου-Ι και συμπλόκου-III προσδιορίστηκαν σε καθαρά μιτοχόνδρια. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η καψαϊκίνη αναστέλλει περίπου 2,5 έως 9% και 5-20% της δραστικότητας συμπλόκου-Ι και 8-75% του συμπλόκου-ΙΙΙ δραστηριότητας BxPC-3 και τα κύτταρα AsPC-1 αντίστοιχα, το οποίο ήταν attenuable με SOD, καταλάσης και EUK-134. Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία καψαϊκίνη απέτυχε να αναστείλει συμπλόκου-Ι ή σύμπλοκο-ΙΙΙ δραστηριότητες σε φυσιολογικά HPDE-6 κύτταρα. Τα επίπεδα ΑΤΡ δραστικά κατασταλεί από καψαϊκίνη θεραπείας και στις δύο BxPC-3 και AsPC-1 κύτταρα και εξασθενημένα από καταλάση ή EUK-134. Οξείδωση των μιτοχονδρίων ειδικών καρδιολιπίνης ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καψαϊκίνη επεξεργασμένα κύτταρα. BxPC-3 που προέρχεται ρ

0 κύτταρα, τα οποία στερούνται μιτοχονδριακού DNA, ήταν πλήρως ανθεκτικά στην καψαϊκίνη μεσολάβηση παραγωγή ROS και την απόπτωση. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και διάσπαση των δύο κασπάσης-9 και κασπάσης-3 λόγω διακοπής του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης ήταν σημαντικά μπλοκαριστεί από την καταλάση και EUK-134 σε BxPC-3 κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν περαιτέρω ότι η θεραπεία με καψαϊκίνη όχι μόνο αναστέλλουν την ενζυματική δραστικότητα και έκφραση SOD, καταλάσης και γλουταθειόνης υπεροξειδάσης, αλλά επίσης να μειώσει το επίπεδο της γλουταθειόνης. Υπερ-έκφραση του καταλάσης με παροδική επιμόλυνση προστάτευσε τα κύτταρα από καψαϊκίνη μεσολάβηση παραγωγή και την απόπτωση ROS. Επιπλέον, οι όγκοι από ποντικούς που τροφοδοτείται από το στόμα με 2,5 mg /kg καψαϊκίνη δείχνουν μειωμένη δραστικότητα SOD και μια αύξηση στα επίπεδα GSSG /GSH σε σύγκριση με τους ελέγχους. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η συμμετοχή του μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι και ΙΙΙ στην καψαϊκίνη μεσολάβηση γενιάς και μείωση ROS στα επίπεδα αντιοξειδωτικών με αποτέλεσμα σοβαρή μιτοχονδριακές βλάβες που οδηγούν σε απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Παράθεση:. Pramanik KC, Boreddy SR, Srivastava SK (2011) Ο ρόλος του μιτοχονδριακού Electron Transport Συγκροτήματα Αλυσίδα σε καψαϊκίνη, μέσω οξειδωτικού στρες που οδηγεί στην απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (5): e20151. doi: 10.1371 /journal.pone.0020151

Επιμέλεια: Μιχαήλ Polymenis, Texas A & amp? Μ University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Μαρτίου του 2011? Αποδεκτές: 19η Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 25 του Μάη, 2011

Copyright: © 2011 Pramanik et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας R01 CA129038? R01 CA106953. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο θανατηφόρες όλων των στερεών κακοηθειών στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Οι προσπάθειες έχουν κατευθυνθεί προς την ανάπτυξη του επικουρικού και εισαγωγική θεραπείες σε μια προσπάθεια να βελτιώσει το ποσοστό επιβίωσης [1]. Καρκίνοι του παγκρέατος συνήθως ανταποκρίνονται καλά στη συμβατική τρόπους θεραπείας όπως η χημειοθεραπεία και η ακτινοβολία [2]. Δυστυχώς, η τοξικότητα και την εγγενή αντοχή του χημειοθεραπευτικού παράγοντα όπως 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και γεμσιταβίνη σε καρκίνο του παγκρέατος είναι ακόμη λόγοι για την κακή πρόγνωση [3]. Δεν υπάρχει ομοφωνία σχετικά με τη βέλτιστη θεραπευτικά μέσα για τον καρκίνο του παγκρέατος, ως εκ τούτου η ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος είναι μια σημαντική αποστολή. Επιδημιολογικές μελέτες συνεχίζουν να υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η διατροφή πλούσια σε φρούτα, λαχανικά και ορισμένα μπαχαρικά μπορεί να είναι προστατευτική έναντι διαφόρων ανθρώπινων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παγκρέατος και ότι η κατανάλωση πιπεριές τσίλι μπορεί να προστατεύσει από τους καρκίνους του γαστρεντερικού που σχετίζονται [4], [5], [6 ], [7], [8], [9], [10].

η καψαϊκίνη, ένα παράγωγο ομοβανιλικού οξέος (Ν-βανίλλυλο-8-μεθυλ-νονεναμίδιο) είναι ένα ενεργό συστατικό και πικάντικες ζεστού τσίλι πιπέρι (Εικ. 1Α) [11], [12] και έχει χρησιμοποιηθεί ως πρόσθετο τροφίμων για μεγάλο χρονικό διάστημα σε όλο τον κόσμο, ιδιαίτερα στις χώρες της Νότιας Ασίας και της Λατινικής Αμερικής [13], [14], [15], [16 ], [17]. Αυτό αλκαλοειδές έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του πόνου και της φλεγμονής, που συνδέεται με μια ποικιλία ασθενειών [18], [19], [20], [21]. Αρκετές πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η καψαϊκίνη έχει αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα σε ηπατική [22] γαστρικού [23] του προστάτη [24] του παχέος εντέρου [25] και λευχαιμικά κύτταρα [26]. Η καψαϊκίνη εξασκεί γενικά φυσιολογική απόκριση του διεγείροντας βανιλλοειδούς 1 (TRPV-1) υποδοχέα, ωστόσο, υποδοχέας ανεξάρτητες επιδράσεις της καψαϊκίνης έχουν παρατηρηθεί σε καρκινικά κύτταρα [25], [26], [27]. Η καψαϊκίνη καταστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με NF-kB αδρανοποίηση, ROS γενιές, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και ρυθμίζοντας EGFR /μονοπάτια HER-2 [28], [29], [30], [31], [32], [33 ]. Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός με τον οποίο η καψαϊκίνη προκαλεί το οξειδωτικό στρες και την απόπτωση παραμένει ασαφής. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι επάγεται καψαϊκίνη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος σχετίστηκε με την παραγωγή ROS και μιτοχονδριακή διάσπαση [34]. Ωστόσο, η ακριβής μηχανισμός με τον οποίο η καψαϊκίνη προκαλεί παραγωγή ROS και ο κυτταρικός θάνατος δεν ήταν σαφές.

(

A

) Δομή της καψαϊκίνης. Η απόπτωση που προκαλεί επιδράσεις της καψαϊκίνης (150 μΜ, 24 ώρες) σε (

Β

) BxPC-3, (

C

) AsPC-1 και (

D

) HPDE- 6 κύτταρα, προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αννεξίνης-ν /FITC και ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν με cytometery ροής. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (η = 4) τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο, όπως αναλύθηκαν από έλεγχος τ (

P & lt? 0,05

). (

E

) BxPC-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις καψαϊκίνης για 24 ώρες και (

F

) Cell υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα με 150 μΜ καψαϊκίνη και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση για διάσπαση της κασπάσης-9, κασπάσης-3 και PARP όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Κάθε στύπωμα απογυμνώθηκε και ξαναϊχνηθετούνται με αντίσωμα αντι-β-ακτίνης για να εξασφαλιστεί η ίση πρωτεΐνη φόρτωσης. Αυτά τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα με παρόμοια παρατήρηση που έγινε σε κάθε πείραμα.

Η

Στην παρούσα μελέτη, αποδεικνύει ότι η καψαϊκίνη προκαλεί ROS (ριζική υπεροξειδίου και υπεροξείδιο του υδρογόνου) παραγωγή από την αναστολή του μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι και δραστηριότητα συγκρότημα-III και τα επίπεδα ATP στα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές AsPC-1 BxPC-3 και, χωρίς να επηρεάζει BxPC-3 που προέρχεται ρ

0 και κανονική HPDE-6 κύτταρα. Ταυτόχρονα καταλάσης και υπεροξειδάσης γλουταθειόνης δραστηριότητα και έκφρασης καταστέλλεται από καψαϊκίνη θεραπεία. Η συμπλήρωση των κυττάρων με PEG-καταλάση, PEG-SOD, EUK-134 (καταλάση μιμούνται) ή επιμόλυνση των κυττάρων με καταλάση σχεδόν πλήρως αποκλεισμένη καψαϊκίνη διαμεσολαβείται παραγωγή και την απόπτωση ROS. Επιπλέον, οι όγκοι από τα επεξεργασμένα /kg καψαϊκίνη ποντίκια 2,5 mg εμφάνισαν μειωμένη δραστηριότητα SOD και μια αύξηση στο επίπεδο GSSG /GSH. Η μελέτη αυτή παρέχει μια άμεση ένδειξη του πώς καψαϊκίνης χρησιμοποιεί μιτοχόνδρια για να προκαλέσει οξειδωτικό στρες που οδηγεί στην απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Αποτελέσματα

Η καψαϊκίνη προκαλεί απόπτωση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε φυσιολογικά HPDE-6 κύτταρα

η απόπτωση προσδιορίστηκε με cytometery ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη-V /FITC και ιωδιούχο προπίδιο. Θεραπεία της BxPC-3 και AsPC-1 κυττάρων με 150 μΜ καψαϊκίνη για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα περίπου 2,5-5 πτυχώσεις αύξηση στην απόπτωση (Σχ. 1Β-C). Είναι ενδιαφέρον ότι, η καψαϊκίνη απέτυχε να επάγει απόπτωση σε κανονικά HPDE-6 κύτταρα (Σχ. 1D). Η απόπτωση επαγωγική δράση της καψαϊκίνης επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με western αποτύπωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Ε, θεραπεία καψαϊκίνη προκάλεσε σημαντική ενεργοποίηση της κασπάσης-9, κασπάσης-3 και PARP όπως είναι εμφανές από τις αντίστοιχες διασπάσεις τους σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία καψαϊκίνη δεν προκάλεσε καμία διασπάσεις κασπασών ή PARP σε φυσιολογικά HPDE-6 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε μια μελέτη που εξαρτάται από τον χρόνο, η διάσπαση της κασπάσης 9/3 και PARP ήταν εμφανής από 16 και 24 ώρες της θεραπείας καψαϊκίνη (Εικ. 1 F).

Η καψαϊκίνη προκαλεί γενιά των μιτοχονδριακών ROS σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

η ενδοκυτταρική ROS παραγωγή από καψαϊκίνη αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας υδροαιθιδίνη (ΗΕ) και DCFDA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, σε μια μελέτη που εξαρτώνται από το χρόνο, την επεξεργασία της καψαϊκίνης προκάλεσε περίπου 8-9 διπλώνει αύξηση της ρίζας υπεροξειδίου μέσα σε 1-2 ώρες που μειώθηκε κατά 24 ώρες, όπως μετράται από HE φθορισμού με cytometery ροής. Παρομοίως, η παραγωγή του υπεροξειδίου του υδρογόνου κατά την κατεργασία καψαϊκίνη αυξήθηκε κατά 4-7 πτυχώσεις εντός 1-2 ώρες και στη συνέχεια μειώθηκε, αλλά διατήρησαν τα επίπεδα υψηλότερα από υπεροξειδίου από 24 ώρες, όπως μετράται με φθορισμό DCF με cytometery ροής (Σχ. 2Β). Η παραγωγή ROS ήταν ήδη από 1 ώρα, σε σύγκριση με τους ελέγχους σε BxPC-3 κύτταρα. Για να δούμε αν τα αντιοξειδωτικά μπορεί να μπλοκάρει την παραγωγή ROS, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με PEG-SOD (100 U /ml), PEG-καταλάση (500 U /ml) ή 50 μΜ EUK -134 (μία κυτταρική διαπερατή καταλάση μιμητικό) πριν από την καψαϊκίνη θεραπεία. PEG-SOD αποκλεισμένη σχεδόν εντελώς ρίζα υπεροξειδίου γενεά ενώ PEG-καταλάσης εντελώς αποκλεισμένη παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου, όπως μετράται με φθορισμό HE και DCF αντίστοιχα από cyometery ροής (Σχ S1A-Β). Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα των αντιοξειδωτικών, χρησιμοποιήσαμε PEG-καταλάσης να εμποδίσει ρίζας υπεροξειδίου γενιάς. Όπως ήταν αναμενόμενο, PEG-καταλάση απέτυχε πλήρως να εμποδίσει ρίζας υπεροξειδίου γενιάς (Εικ S1c). Παρομοίως, PEG-SOD απέτυχε να εμποδίσει την παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε επόμενα πειράματα, μετρήσαμε συνολικό ROS (ρίζα υπεροξειδίου + υπεροξείδιο του υδρογόνου) γενιάς. Ομοίως, η θεραπεία με καψαϊκίνη αυξημένη συνολική παραγωγή ROS από περίπου 2,5-4,5 φορές σε κύτταρα AsPC-1 με μέγιστη στις 2 ώρες της θεραπείας (Εικ. 2C). θεραπεία Καψαϊκίνη δεν προκάλεσε καμία σημαντική παραγωγή ROS σε φυσιολογικά HPDE-6 κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα φυσιολογικά κύτταρα είναι ανθεκτικά στις επιδράσεις της καψαϊκίνης (Σχ. 2D). Σε μια θεραπεία συνδυασμού, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η PEG-SOD, PEG-καταλάσης και EUK-134 ανέστειλε σημαντικά καψαϊκίνη μεσολάβηση συνολική παραγωγή ROS στα BxPC-3 κύτταρα (Σχ. 2F).

(

A

) και (

Β

) κύτταρα BxPC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO ή 150 μΜ καψαϊκίνης για διαφορετικά χρονικά σημεία και βάφτηκαν με ΗΕ και DCFDA και αναλύθηκαν για ρίζα υπεροξειδίου και υπεροξείδιο υδρογόνου αντίστοιχα από cytometery ροής. (

C

) AsPC-1, (

D

) HPDE-6, (

E

) BxPC-3 ρ

0 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 150 μΜ καψαϊκίνη για 2, 4 και 24 ώρες και αναλύθηκαν για τη συνολική παραγωγή ROS (υπεροξειδίου και υπεροξείδιο του υδρογόνου) με κυτταρόμετρο ροής μετά από χρώση των κυττάρων με HE και DCFDA. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (η = 3) από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα και τα δεδομένα που αντιπροσωπεύει διπλάσια αύξηση της παραγωγής ROS σχέση με τον έλεγχο. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο όπως αναλύεται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από post-hoc δοκιμασία Bonferroni για

P & lt? 0,05

). (

F

) Επίδραση των αντιοξειδωτικών στη μεσολάβηση καψαϊκίνη συνολική παραγωγή ROS σε BxPC-3 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με PEG-SOD (100 U /ml), PEG-καταλάση (500 U /ml) ή EUK-134 (50 μΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από 150 μΜ καψαϊκίνης για 2 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (η = 3) από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο (

P & lt? 0,05

) και ** στατιστικά διαφορετικά σε σύγκριση με την αγωγή με καψαϊκίνη (

P & lt? 0,05

), όπως αναλύεται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από μετα Bonferroni για διενέργεια εξειδικευμένων τεστ.

η

BxPC-3 που προέρχεται ρ

0 κύτταρα ήταν εντελώς ανθεκτικά σε καψαϊκίνη μεσολάβηση γενιά ROS

για να παγιώσει τη συμβολή των μιτοχονδρίων στην παραγωγή ROS από την καψαϊκίνη, δημιουργήσαμε το ρ

0 παραλλαγές BxPC-3 κύτταρα. ρ

0 κύτταρα παρήχθησαν και διατηρήθηκαν με επώαση BxPC-3 κύτταρα με 60 ng /ml βρωμιούχου αιθιδίου και 50 mg /ml ουριδίνης για 12 εβδομάδες και χαρακτηρίστηκαν με PCR για να επιβεβαιωθεί η εξάντληση του mtDNA και κανονική οξειδωτική phosphosrylation όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [35]. Η επιβίωση του ρ

0 κύτταρα εξαρτάται από ΑΤΡ που προέρχεται από την αναερόβια γλυκόλυση. ρ

0 κύτταρα δεν είναι σε θέση να παράγουν ROS από σύνθετα ETC καθώς δεν έχουν κανονική οξειδωτική φωσφορυλίωση [35], [36]. Σε σύγκριση με το αγρίου τύπου κύτταρα BxPC-3, η συνολική παραγωγή των ROS δεν ήταν καθόλου παρατηρήθηκε σε BxPC-3 ρ

0 κύτταρα κατά την αγωγή με καψαϊκίνη (Σχ. 2Ε). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι BxPC-3 ρ

0 κύτταρα ήταν εντελώς ανθεκτικά στις επιδράσεις της καψαϊκίνης σε σύγκριση με άγριου τύπου κύτταρα BxPC-3.

θεραπεία καψαϊκίνη αναστέλλει ETC Complex-Ι και Complex -III δραστηριότητες

μιτοχονδριακού ETC συγκροτήματα είναι οι μεγάλες γεννήτριες των ROS στα κύτταρα και τους ιστούς. Από τη στιγμή που παρατηρείται παραγωγή ROS από καψαϊκίνη, θελήσαμε να δούμε αν έχουν μιτοχόνδρια που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία. Ως εκ τούτου, καθορίζονται οι ενζυματικές δραστηριότητες και την έκφραση του μιτοχονδριακού συμπλόκου-Ι, σύμπλοκο-ΙΙ, σύμπλοκο-ΙΙΙ και πολύπλοκες-IV σε καψαϊκίνη αντιμετωπίζονται ρ

0 κύτταρα BxPC-3, AsPC-1, HPDE-6 και-3 BxPC. θεραπεία καψαϊκίνη αναστέλλει δραστικότητα συμπλόκου-Ι από περίπου 5-20% σε BxPC-3 και 2,5 έως 9% σε κύτταρα AsPC-1 αντίστοιχα, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους (Σχ. 3Α-Β). Από την άλλη πλευρά, όπως ήταν αναμενόμενο, η καψαϊκίνη απέτυχε να αναστείλει συμπλόκου-Ι δραστηριότητα BxPC-3 ρ

0 κύτταρα (τα οποία στερούνται μιτοχονδριακού DNA) και φυσιολογική HPDE-6 κύτταρα (Σχ. 3C). Στη συνέχεια, θελήσαμε να διερευνήσουμε αν αυτή η μείωση στη δραστικότητα συγκρότημα-I μπορεί να ελαττωθεί με αντι-οξειδωτικά. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι προκατεργασία των κυττάρων με καταλάση ή EUK-134 μπλοκάρει ουσιαστικά τις μειώσεις στο συγκρότημα-Ι δραστηριότητα με καψαϊκίνη (Σχ. 3D). Περαιτέρω καψαϊκίνη θεραπεία μείωσε σημαντικά τα επίπεδα πρωτεΐνης του συμπλόκου-Ι πρωτεϊνικό σύμπλεγμα μετά από 4 ώρες της θεραπείας σε μία μελέτη εξαρτώνται από το χρόνο και η καταλάση ή EUK 134 απέτρεψε αυτή την αλλαγή (Σχ. 3Ε-F). Παρομοίως, σύμπλοκο-ΙΙΙ δραστηριότητας από καψαϊκίνη ανεστάλη κατά 8-75% και στις δύο BxPC-3 και AsPC-1 κύτταρα (Σχ. 4Α-Β). Παρ ‘όλα αυτά, η καψαϊκίνη απέτυχε να μειώσει συγκρότημα-III δραστηριότητα BxPC-3 ρ

0 κύτταρα (Εικ. 4C). Μια μέτρια μείωση της δραστηριότητας συγκρότημα ΙΙΙ ωστόσο παρατηρήθηκε σε HPDE-6 κύτταρα με καψαϊκίνη θεραπεία (Εικ. 4C). Η μείωση σε πολύπλοκες-ΙΙΙ δραστηριότητας BxPC-3 κύτταρα με καψαϊκίνη εξασθένισε με καταλάση και EUK-134 (Εικ. 4D). Σε συμφωνία με τα δεδομένα δραστηριότητας, η έκφραση της συμπλόκου πρωτεΐνης συμπλόκου-ΙΙΙ δραστικά μειωμένη σε BxPC-3 κύτταρα μετά από θεραπεία καψαϊκίνη (Εικ. 4Ε). Η επίδραση της καψαϊκίνης στο επίπεδο πρωτεΐνης του συμπλόκου-ΙΙΙ καταργήθηκε με καταλάση και EUK-134 (Σχ. 4F). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μιτοχονδριακή συγκρότημα-III είναι πιο ενεργά σε διαμεσολαβείται καψαϊκίνη παραγωγή ROS σε σύγκριση με σύμπλοκο-Ι. Καψαϊκίνη δεν είχε καμία επίδραση σε πολύπλοκες-ΙΙ και IV (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή του μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι και πολύπλοκες-ΙΙΙ από την καψαϊκίνη αιτία παραγωγή ROS.

Η ενζυματική δραστηριότητα του μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι προσδιορίσθηκε σε καθαρά μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από τον έλεγχο, και 150 μΜ καψαϊκίνη σε επεξεργασία (

A

) BxPC-3 και (

B

) AsPC-1 κύτταρα για 2, 4 και 24 ώρες. (

C

) Σύγκριση του συμπλόκου-Ι δραστηριότητα AsPC-1, BxPC-3, BxPC-3 ρ

0 και HPDE-6 κύτταρα κατεργασμένα με 150 μΜ για 24 ώρες. (

D

) Η καψαϊκίνη που προκαλείται μείωση της δραστικότητας συμπλόκου-Ι παρεμποδίζεται από προκατεργασία του BxPC-3 κύτταρα με καταλάση (2000 U /ml) και EUK-134 (50 μΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από 150 μΜ καψαϊκίνης για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται επί έλεγχο ως μέση ± SD (η = 3) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο (

P & lt? 0,05

) και ** στατιστικά διαφορετικά σε σύγκριση με την αγωγή με καψαϊκίνη (

P & lt? 0,05

), όπως αναλύεται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από μετα Bonferroni για διενέργεια εξειδικευμένων τεστ. (

E

) έκφραση Complex-Ι πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας αγνά μιτοχονδριακή πρωτεΐνη που απομονώνεται από τον έλεγχο και 150 μΜ καψαϊκίνη αντιμετωπίζονται BxPC-3 κύτταρα για τις περιόδους που αναφέρονται χρόνου ή (

F

) 1 προ θεραπείας h με καταλάση (2000 U /ml) ή EUK-134 (50 μΜ) που ακολουθείται από 150 μΜ καψαϊκίνης για 24 ώρες. Ανοσοκηλίδωση για κάθε πρωτεΐνη διεξήχθη τρεις φορές ανεξάρτητα και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα. Οι κηλίδες απογυμνώνεται και ξαναϊχνηθετούνται με αντι-Cox-IV για μιτοχονδριακών πρωτεϊνών να εξασφαλίζεται ίση πρωτεΐνη φόρτωση.

Η

μιτοχονδριακού συμπλόκου-III ενεργότητα προσδιορίστηκε σε καθαρά μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από τον έλεγχο, και 150 μΜ καψαϊκίνη σε επεξεργασία (

Α

) BxPC-3 και (

B

) AsPC-1 κύτταρα για 2, 4 και 24 ώρες. (

C

) Σύγκριση του συμπλόκου-ΙΙΙ δραστηριότητας AsPC-1, BxPC-3, BxPC-3 ρ

0 και HPDE-6 κύτταρα κατεργασμένα με 150 μΜ καψαϊκίνη για 24 ώρες. (

D

) Η καψαϊκίνη που προκαλείται ελάττωση του συμπλόκου-ΙΙΙ ενεργότητα εξασθενημένος από την προ-επεξεργασία των BxPC-3 κύτταρα με καταλάση (2000 U /ml) ή EUK-134 (50 μΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από 150 μΜ καψαϊκίνης για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται επί έλεγχο ως μέση ± SD (η = 3) από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο (

P & lt? 0,05

) και ** στατιστικά διαφορετικά σε σύγκριση με την αγωγή με καψαϊκίνη (

P & lt? 0,05

), όπως αναλύεται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από μετα Bonferroni για διενέργεια εξειδικευμένων τεστ. (

E

) σύμπλοκο-ΙΙΙ έκφραση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αγνά μιτοχονδριακή πρωτεΐνη που απομονώνεται από τον έλεγχο, και 150 μΜ καψαϊκίνη επεξεργασμένα κύτταρα BxPC-3 για περιόδους υποδεικνυόμενο χρόνο ή (

F

) Προθεραπεία με καταλάση (2000 U /ml) ή EUK-134 (50 μΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από 150 μΜ καψαϊκίνης για 24 ώρες. Η έκφραση της πρωτεΐνης συμπλόκου-III προσδιορίσθηκε με ανοσοστύπωση από απομονωμένα μιτοχόνδρια καθαρό όπως περιγράφεται στη μέθοδο. Κάθε στύπωμα απογυμνώθηκε και ξαναϊχνηθετούνται με αντι-Cox-IV αντίσωμα να εξασφαλίζεται ίση πρωτεΐνη φόρτωσης. Αυτά τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα με παρόμοιο αποτέλεσμα που λαμβάνεται σε κάθε πείραμα.

Η

Επίδραση της καψαϊκίνης στη μιτοχονδριακή ΑΤΡ γενιά

Τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια πηγή ενέργειας για τα κύτταρα. Είμαστε δίπλα ήθελε να ξέρει αν μεσολαβεί καψαϊκίνη διαταραχή της μιτοχονδριακής αναπνευστικής συγκροτήματα που επηρεάζονται γενιάς ATP. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων του ΑΤΡ, αξιολογήσαμε δραστηριότητα συνθάσης ΑΤΡ σύμπλοκο-V στα μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από τον έλεγχο και την καψαϊκίνη αγωγή BxPC-3 και AsPC-1 κύτταρα. Η παραγωγή ΑΤΡ είναι μέσω συγκρότημα-V στα μιτοχόνδρια. θεραπεία καψαϊκίνη απεμπλουτισμένο επίπεδα ΑΤΡ κατά περίπου 75% και στις δύο BxPC-3 και AsPC-1 κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο (σχ. 5Α-Β). Παρατηρήσαμε επίσης ότι η καταλάση και EUK 134 εμπόδισε σημαντικά την μείωση των επιπέδων ΑΤΡ σε απόκριση σε θεραπεία καψαϊκίνη (Εικ. 5C). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των παρατηρήσεων, η έκφραση της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης συμπλόκου-V προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η θεραπεία με καψαϊκίνη μείωσε την έκφραση της πρωτεΐνης συγκρότημα-V, αρχίζοντας από 1 ώρα, αλλά ήταν πιο εμφανείς στα 16 και 24 ώρες (Εικ. 5D). Αυτή η μείωση στην έκφραση συγκρότημα-V ήταν εξασθενημένος από την καταλάση και EUK-134 (σχ. 5Ε). Συνολικά, τα αποτελέσματα μας αποδεικνύουν ότι η θεραπεία με καψαϊκίνη διαταράσσει δραματικά μιτοχονδριακό λειτουργίες πιέζοντας τα κύτταρα προς την απόπτωση.

(

Α

) BxPC-3 (

Β

) κύτταρα AsPC-1 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή 150 μΜ καψαϊκίνης για 24 ώρες, και (

C

) BxPC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με καταλάση (2000 U /ml) ή EUK-134 (50 μΜ) 1 ώρα πριν από την 150 μΜ καψαϊκίνη θεραπεία για 24 ώρες και ΑΤΡ-συνθετάσης δράση προσδιορίστηκε σε καθαρή πρωτεΐνη απομονώθηκε από μιτοχόνδρια ελέγχου και επεξεργασμένα κύτταρα όπως περιγράφεται στο τμήμα μεθόδου. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (η = 3) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με τον έλεγχο ή ** στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με τη θεραπεία καψαϊκίνη, όπως αναλύεται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από post-hoc δοκιμασία Bonferroni για (

P & lt? 0,05

). (

D

) Επίδραση της θεραπείας καψαϊκίνη στην έκφραση της πρωτεΐνης συγκρότημα-V. BxPC-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 150 μΜ καψαϊκίνης για συγκεκριμένες χρονικές περιόδους ή (

E

) BxPC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με καταλάση (2000 U /ml) ή EUK-134 (50 μΜ) για 1 h πριν από τη θεραπεία με 150 μΜ καψαϊκίνη για 24 ώρες. Η έκφραση της πρωτεΐνης συμπλόκου-V προσδιορίσθηκε με ανοσοστύπωση στην καθαρή μιτοχονδριακή πρωτεΐνη, όπως περιγράφεται στην ενότητα μέθοδο. Κάθε στύπωμα απογυμνώθηκε και ξαναϊχνηθετούνται με αντι-Cox-IV αντίσωμα να εξασφαλίζεται ίση πρωτεΐνη φόρτωσης. Αυτά τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές ανεξαρτήτως με παρόμοια αποτελέσματα που ελήφθησαν σε κάθε πείραμα.

Η

Η καψαϊκίνη διαταράσσει δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και να προκαλέσει οξείδωση των μιτοχονδρίων λιπιδίων

Υπερβολική ενδοκυτταρική ROS οδηγούν τα κύτταρα σε απόπτωση με διαταράσσοντας δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Η μεταβολή στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης με καψαϊκίνη έτσι προσδιορίστηκε με χρώση του κυττάρου με μιτοχονδριακή μεμβράνη ευαίσθητη χρωστική TMRM και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Βρήκαμε ότι η καψαϊκίνη θεραπεία μείωσε σημαντικά το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε BxPC-3 κύτταρα κατά 26% σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 6Α). Για να επιβεβαιώσει εάν η καψαϊκίνη μεσολάβηση ROS προκαλεί αλλαγή στο δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης, η καταλάση και EUK-134 χρησιμοποιήθηκαν. Προκατεργασία των κυττάρων με δύο αντιοξειδωτικά που ακολουθείται από καψαϊκίνη τελείως απέτρεψε την πτώση μιτοχονδριακή μεμβράνη δυναμικό (Σχ. 6Α). Εξετάσαμε επίσης το ενδεχόμενο κατά πόσον η καψαϊκίνη προτίμηση προκαλέσουν μιτοχονδριακή λιπιδική υπεροξείδωση σε BxPC-3 κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με νονυλ πορτοκαλί της ακριδίνης (ΝΑΟ) για την ανίχνευση της οξείδωσης της καρδιολιπίνη, ένα μιτοχονδριακό λιπιδικό συστατικό της μεμβράνης, με μικροσκοπία φθορισμού και κυτταρομετρία ροής [37]. Καρδιολιπίνη είναι αποκλειστικά παρόντες στα μιτοχόνδρια και αφού επισημαίνονται με NAO και εκθέματα κίτρινο φθορισμό. Όταν αναλύσαμε τα κύτταρα μας κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού, παρατηρήσαμε ότι σχεδόν όλα τα κύτταρα από την ομάδα ελέγχου επεδείκνυαν κίτρινο χρώμα. Ωστόσο, το κίτρινο χρώση μειώθηκε και μετατράπηκε σε πράσινο σε κύτταρα κατεργασμένα καψαϊκίνη υποδεικνύοντας δραστική οξείδωση του καρδιολιπίνης (Εικ. 6Β). Παρ ‘όλα αυτά, η καταλάση και EUK 134 απέτρεψε πλήρως την οξείδωση του καρδιολιπίνης (Εικ. 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με κυτταρομετρία ροής όπου παρατηρείται ότι η καψαϊκίνη προκαλεί οξείδωση καρδιολιπίνη σε BxPC-3 κύτταρα, όπως φαίνεται από τη μετατόπιση του φθορισμού ΝΑΟ προς τα αριστερά (Σχ. 6C). Χρησιμοποιήσαμε περαιτέρω καταλάση και EUK-134 για να δούμε αν μπορεί να προληφθεί η οξείδωση της καρδιολιπίνης. Βρήκαμε ότι η προσθήκη της καταλάσης ή EUK-134 μπλοκάρει σχεδόν πλήρως την στροφή της χρώσης NAO (Εικ. 6C) γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση του φθορισμού NAO οφείλεται στην οξείδωση των λιπιδίων των μιτοχονδρίων καρδιολιπίνη από μιτοχονδριακό ROS.

(

A

) κύτταρα BxPC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καταλάση (2000 U /ml) ή EUK-134 (50 μΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από 150 μΜ καψαϊκίνης για 24 ώρες και η μεταβολή του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης προσδιορίστηκε με χρώση του κυττάρου με μιτοχονδριακή μεμβράνη ευαίσθητη χρωστική TMRM και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Δεξιός πίνακας δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. (

Β

) Επίδραση της καψαϊκίνης στη μιτοχονδριακή λιπιδική υπεροξείδωση. BxPC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με καταλάση (2000 U /ml) ή EUK-134 (50 μΜ) για 1 ώρα πριν από την αγωγή με 150 μΜ καψαϊκίνη για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με εννεανυλο πορτοκαλί της ακριδίνης (ΝΑΟ) για την ανίχνευση της οξείδωσης της καρδιολιπίνης, μια μιτοχονδριακή μεμβράνη των λιπιδίων συστατικό με μικροσκοπία φθορισμού, και (

D

) κυτταρομετρία ροής και το δεξί πάνελ παρουσιάζει η ποσοτικοποίηση των μιτοχονδριακών cardiolipid οξείδωσης. Αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα από τρία πειράματα που εκτελούνται ανεξάρτητα. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο (

P & lt? 0,05

) ή ** στατιστικά διαφορετικά σε σύγκριση με την αγωγή με καψαϊκίνη μόνο (

P & lt? 0,05

), όπως αναλύεται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή post-hoc Bonferroni του.

η

καψαϊκίνη απόπτωση είναι attenuable από αντι-οξειδωτικά

Παρατηρήσαμε ότι η καψαϊκίνη προκαλεί την παραγωγή ROS από διακοπή της λειτουργίας των μιτοχονδρίων. Μόλις οι μιτοχονδριακές λειτουργίες διαταράσσονται, το κυτόχρωμα-c απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα και ενεργοποιούν κασπάσης-3 καταρράκτη που οδηγεί τα κύτταρα σε απόπτωση. Έχουμε αναρωτηθεί αν η καταλάση και EUK-134 θα μπορούσε να καταργήσει την καψαϊκίνη που προκαλείται απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α, PEG-SOD, PEG-καταλάσης και EUK-134 προστατεύεται σημαντικά BxPC-3 κύτταρα από απόπτωση που επάγεται από καψαϊκίνη. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με την αξιολόγηση της απελευθερώσεως του κυτοχρώματος-c και διάσπαση της κασπάσης-3 με κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι τόσο η καταλάση και EUK 134 εμπόδισε σημαντικά την απελευθέρωση του κυτοχρώματος-c στο κυτοσόλιο και η διάσπαση της κασπάσης-3 διαμεσολαβείται από καψαϊκίνη (Σχ. 7C). Είναι αξιοσημείωτο ότι BxPC-3 ρ

0 κύτταρα, τα οποία είναι σε θέση να παράγει ROS μέσω μιτοχόνδρια, ήταν εντελώς ανθεκτικά στην απόπτωση που επάγουν επιδράσεις της καψαϊκίνης (Εικ. 7Β), επιβεβαιώνοντας την εμπλοκή των μιτοχονδρίων σε καψαϊκίνης μεσολάβηση παραγωγή ROS και απόπτωση.

(

A

) BxPC-3 κύτταρα προκατεργάστηκαν με PEG-SOD (100 U /ml), PEG-καταλάση (500 U /ml) ή EUK-134 (50 μΜ ) για 1 ώρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με DMSO ή 150 μΜ καψαϊκίνης για 24 ώρες, (

B

) BxPC-3 ρ

0 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 150 μΜ καψαϊκίνης για 24 ώρες, και η απόπτωση ήταν προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας αννεξίνη-ν /FITC και ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν με cytometery ροής. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (η = 3) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο (

P & lt? 0,05

) ή ** στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με την αγωγή με καψαϊκίνη (

P & lt? 0,05

), όπως αναλύεται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από Bonferroni για δοκιμή post-hoc. (C) Cytochrome-C και Cl-κασπάσης-3 προσδιορίστηκε με ανοσοστύπωση σε BxPC-3 κύτταρα προκατεργάστηκαν με καταλάση (2000 U /ml) ή EUK-134 (50 μΜ) για 1 ώρα πριν από την αγωγή με 150 μΜ καψαϊκίνη για 24 h. Κάθε στύπωμα απογυμνώθηκε και ξαναϊχνηθετούνται με αντίσωμα αντι-ακτίνης για να εξασφαλιστεί η ίση πρωτεΐνη φόρτωσης. Αυτά τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα.

Η

θεραπεία καψαϊκίνη διαταράσσει την ομοιόσταση κυτταρικής οξειδοαναγωγής με αποτέλεσμα το οξειδωτικό στρες

Redox ομοιόστασης σε ένα κύτταρο οφείλεται σε μια λεπτή ισορροπία μεταξύ η ενδοκυτταρική ROS και ROS σαρώσεως αντιοξειδωτικά και ενζυμικά συστήματα. Μειωμένη GSH είναι ένα ενδοκυτταρικό αντιοξειδωτικό και είναι γνωστό να διατηρεί την κυτταρική ισορροπία οξειδοαναγωγής. Ως εκ τούτου, μετρούμενη ενδοκυτταρικά επίπεδα GSH, και προσδιορίζονται επίσης τα επίπεδα της οξειδωμένης μορφής της GSH (GSSG). Όπως φαίνεται στο Σχ. 8Α, θεραπεία καψαϊκίνη αύξησε σημαντικά τα επίπεδα GSSG? και μειωμένα επίπεδα GSH που υποδεικνύει τη μετατόπιση ισορροπίας οξειδοαναγωγής προς προ-οξειδωτικό κατάσταση (σχ. 8Α-Β). Τα άλλα συστήματα ενζύμων τα οποία παίζουν ρόλο στην ισορροπία οξειδοαναγωγής περιλαμβάνουν υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), η καταλάση και υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx). ρίζες υπεροξειδίου που δημιουργούνται από πολύπλοκους-Ι και σύμπλοκο-ΙΙΙ των μιτοχονδρίων και μετατρέπονται γρήγορα σε υπεροξείδιο του υδρογόνου, λόγω αποσύνθεση με δισμουτάση υπεροξειδίου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 8C, θεραπεία καψαϊκίνη ανέστειλε δραστηριότητα SOD 23-51% σε μία μελέτη εξαρτώμενη από το χρόνο. Τα άλλα δύο ένζυμα (καταλάση και GPx) που συμμετέχουν στην αποτοξίνωση ενδοκυτταρικών υπεροξειδίων συμπεριλαμβανομένου του υπεροξειδίου του υδρογόνου. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι η καψαϊκίνη μείωσε σημαντικά την ενζυμική δράση καταλάσης μέσα σε 2 ώρες από τη θεραπεία (Εικ. 8D). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν από την έκφραση της πρωτεΐνης της καταλάσης. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση καταλάση μειώθηκε μετά από 2 ώρες αγωγής καψαϊκίνης (Εικ. 8 D-E). Καθ ‘όλη μελέτες μας, παρατηρήσαμε ότι η καταλάση ή συμπλήρωση EUK 134 εμπόδισε παραγωγή ROS και προστάτευσε τα κύτταρα από τα επιβλαβή αποτελέσματα της καψαϊκίνης, υποδεικνύοντας σαφώς ότι η καταλάση διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην μεσολάβηση καψαϊκίνη οξειδωτικό στρες και απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Από γλουταθειόνης υπεροξειδάσης είναι ένα άλλο σημαντικό ένζυμο που χρησιμοποιεί GSH ως υπόστρωμα για να αποτοξινώσει το υπεροξείδιο του υδρογόνου, προσδιορίσαμε την ενζυματική δραστηριότητα και την πρωτεϊνική έκφραση. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχ. 8 F-G, η καψαϊκίνη μειωμένη δραστηριότητα GPx και έκφραση σε BxPC-3 κύτταρα σε απόκριση σε θεραπεία καψαϊκίνη. Στην πραγματικότητα, η έκφραση του GPx μειώθηκε σημαντικά μόλις μετά από 1 ώρα της θεραπείας καψαϊκίνη. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εξάντληση των επίπεδο GSH και αναστολή της SOD, καταλάσης και GPx με καψαϊκίνη διαταράσσει την ομοιοστασία κυτταρική οξειδοαναγωγική με αποτέλεσμα αυξημένο οξειδωτικό στρες.

(Α) Επίδραση της καψαϊκίνης στα επίπεδα οξειδωμένης γλουταθειόνης (GSSG). BxPC-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 150 μΜ καψαϊκίνης για 2, 4 και 24 ώρες και GSSG και (

B

) Τα επίπεδα GSH προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ. Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα που λαμβάνονται κάθε φορά. (

C

) SOD, (

D

) καταλάση, (

F

) δραστηριότητες GPx προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται στην ενότητα μέθοδο. BxPC-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 150 μΜ καψαϊκίνης για 2, 4 και 24 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (η = 3) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο (

P & lt? 0,05

) όπως αναλύεται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από post-hoc δοκιμασία Bonferroni για.

(Ε) και (Ζ)

Έκφραση καταλάσης και GPx1 προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωμα BxPC-3 κύτταρα σε επεξεργασία με DMSO ή 150 μΜ καψαϊκίνης για υποδεικνυόμενη χρονική περίοδο. Κάθε στύπωμα απογυμνώθηκε και ξαναϊχνηθετούνται με αντίσωμα αντι-ακτίνης για να εξασφαλιστεί η ίση πρωτεΐνη φόρτωσης. Αυτά τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα.

Η

έκτοπη έκφραση της καταλάσης προστατεύουν τα κύτταρα από τη μεσολάβηση παραγωγή ROS και την απόπτωση

καψαϊκίνη

Δεδομένου ότι παρατηρήσαμε ότι διαμεσολαβείται καψαϊκίνη παραγωγή ROS , μιτοχονδριακές βλάβες και απόπτωση εξασθένησαν από καταλάση ή EUK-134, είμαστε δίπλα ήθελε να δει αν έκτοπη έκφραση της καταλάσης μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από καψαϊκίνη μεσολάβηση βλάβη. Εμείς παροδικά επιμολυσμένα των κυττάρων με καταλάση εκφράζουν πλασμίδιο και ήταν σε θέση να επιτύχει περίπου 1,6 φορές η υπερέκφραση της καταλάσης σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα (Εικ. 9Α). Η μείωση στην έκφραση της καταλάσης από καψαϊκίνη αγωγή αποκλείστηκε στα κύτταρα επιμολυσμένα με καταλάση (Εικ. 9Α). Περαιτέρω, η καταλάση που υπερεκφράζουν BxPC-3 κύτταρα αποκλειστεί εντελώς η συνολική παραγωγή ROS από την καψαϊκίνη και προστάτευσε τα κύτταρα από την απόπτωση συγκριτικά με διαμολυσμένα κύτταρα διάνυσμα αγωγή καψαϊκίνη (Σχ. 9Β-C). Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και διάσπαση της κασπάσης-3 επίσης εντελώς αποκλεισμένη στα κύτταρα που υπερεκφράζουν καταλάση (Εικ. 9Α). Στο Σχ.