Αφηρημένο

Ιστορικό

Ογκογόνες μεταλλάξεις είναι ισχυρά πρόβλεψης βιοδείκτες για μοριακά στοχευμένες θεραπείες του καρκίνου. Για μετάλλαξη ασθενείς ανίχνευσης πρέπει να υποβληθούν σε επεμβατικές βιοψίες των όγκων. Εναλλακτικά, αρχειακό δείγματα που χρησιμοποιούνται τα οποία δεν μπορούν πλέον να αντικατοπτρίζουν την πραγματική κατάσταση του όγκου. Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTC) θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια εναλλακτική πλατφόρμα για την ανίχνευση σωματικών μεταλλάξεων σε ασθενείς με καρκίνο. Επιδιώξαμε να αναπτύξει μια ευαίσθητη και ειδική δοκιμασία για την ανίχνευση μεταλλάξεων στο

EGFR

γονιδίου σε CTC από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

Μέθοδοι

Έχουμε αναπτύξει μια νέα δοκιμασία με βάση τις πραγματικές -Time αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και ανάλυση καμπύλης τήξης για να ανιχνεύσει την ενεργοποίηση

EGFR

μεταλλάξεις σε κλάσματα των κυττάρων του αίματος εμπλουτισμένα σε CTC. καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρών κυττάρων (NSCLC) επιλέχθηκε ως μοντέλο ασθένειας με πληροφορίες, πολύ χαμηλά επίπεδα CTC. Η δοκιμασία προοπτικά επικυρωθεί σε δείγματα από ασθενείς με

EGFR

μεταλλαγμένου και

EGFR

-wild είδος ΜΜΚΠ αντιμετωπίζεται μέσα σε μια τυχαιοποιημένη κλινική δοκιμή. Διαδοχική αναλύσεις διεξήχθησαν για την παρακολούθηση των σημάτων CTC κατά τη διάρκεια της θεραπείας και να συσχετίσει την ανίχνευση μεταλλάξεων στο CTC με την έκβαση της θεραπείας.

Αποτελέσματα

Δοκιμασία ευαισθησίας βελτιστοποιηθεί ώστε να καταστεί δυνατή η ανίχνευση ενός ενιαίου

EGFR

μεταλλαγμένου CTC /mL περιφερικού αίματος. CTC ανιχνεύθηκαν σε δείγματα αίματος προ της αγωγής από όλα τα 8

EGFR

μεταλλαγμένου ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα που μελετήθηκαν. Απώλεια

EGFR

μεταλλαγμένου σήματα CTC συσχετίζεται με ανταπόκριση στη θεραπεία, και επανεμφάνιση του προηγηθεί υποτροπής.

Συμπεράσματα

Παρά την χαμηλή αφθονία της CTC, σε NSCLC ογκογόνων μεταλλάξεων μπορούν να ανιχνευθούν επαναλήψιμα εφαρμόζοντας μια αμερόληπτη στρατηγική εμπλουτισμού CTC και εξαιρετικά ευαίσθητη PCR και ανάλυση καμπύλης τήξης. Αυτή η στρατηγική μπορεί να επιτρέψει μη επεμβατική, ειδικά διαγνωστικά βιοδεικτών και την παρακολούθηση σε ασθενείς που υποβάλλονται σε στοχευμένες θεραπείες του καρκίνου

Παράθεση:. Breitenbuecher F, Hoffarth S, Worm Κ, Cortes-Incio D, Gauler TC, Köhler J, et al . (2014) Ανάπτυξη ενός ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική μέθοδος για την ανίχνευση των κυκλοφορούντων όγκων κυττάρων που φιλοξενούν Σωματικές Μεταλλάξεις σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς. PLoS ONE 9 (1): e85350. doi: 10.1371 /journal.pone.0085350

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 1η Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 4 Δεκ 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Breitenbuecher et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από ένα Ογκολογικό Κέντρο αριστείας χορηγήσει από τη γερμανική Καρκίνο Βοήθειας (Deutsche Krebshilfe, www.krebshilfe.de) προς τη Δύση γερμανικό Κέντρο Καρκίνου, εντός των τειχών των ερευνητικών κονδυλίων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Duisburg-Essen (IFORES στο MS ), και μια θεσμική επιχορήγηση για έρευνα από την Boehringer Ingelheim (www.boehringer-ingelheim.com) στο FB και Φ.Μ.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις. FB: Θεσμική χρηματοδότηση της έρευνας (Boehringer Ingelheim). TG: Ταξίδια υποστήριξη, αμοιβές και αμοιβές συμβούλων (Boehringer Ingelheim, η Pfizer, Roche, Lilly). JK: Αμοιβές, υποστήριξη ταξίδια (Boehringer Ingelheim, Amgen, Roche). SK: Συμβουλευτικές αμοιβές, αμοιβές, ταξίδια υποστήριξης (Merck-Serono, Amgen, Roche). MS: Θεσμική χρηματοδότηση της έρευνας, συμβουλευτικών αμοιβών (Boehringer Ingelheim). Όλοι οι υπόλοιποι συγγραφείς έχουν δηλώσει δεν υπάρχει καμία σύγκρουση συμφερόντων. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ενεργοποίηση

EGFR

μεταλλάξεις καθορίζουν μια ομάδα γενετικά εξαρτάται από πνευμονική αδενοκαρκινώματα , τα οποία είναι εξαιρετικά ευαίσθητα σε αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR (EGFR-ΤΚΙ). Οι θεραπευτικές αποφάσεις σε ασθενείς με μεταστατικό ΜΜΚΠ καθοδηγείται από το

EGFR

κατάσταση μετάλλαξης, η οποία καθορίζεται σε βιοψίες όγκων [1]. Απόκτηση της βιοψίας μπορεί να είναι επικίνδυνα για τον ασθενή. Επιπλέον, ένα ενιαίο βιοψία του όγκου μπορεί να μην αντικατοπτρίζουν πλήρως την ιδιότητα του μεταστατικού καρκίνου. Οι μη επεμβατικές μέθοδοι για επαναλαμβανόμενες προσδιορισμό των προγνωστικών και προγνωστική γενετική βιοδεικτών θα μπορούσε να διευκολύνει εξατομικευμένη θεραπεία του καρκίνου.

κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTC) έχουν περιγραφεί σε διάφορες οντότητες του καρκίνου. Καταμέτρηση της CTC έχει συσχετιστεί με κλινικές εκβάσεις και την ανταπόκριση στη θεραπεία [2] – [6]. Οι μελέτες αυτές έχουν εφαρμοστεί ανοσοκυτταροχημική ανίχνευση των πρωτεϊνικών δεικτών, ως επί το πλείστον παραμελώντας γονιδιωματική βιοδείκτες, όπως

EGFR

κατάσταση μετάλλαξης. Σε αντίθεση με λευχαιμίες, όπου τα κακοήθη κύτταρα είναι άφθονα στο περιφερικό αίμα, CTC είναι σπάνιες σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους και μεγάλη μεταβλητότητα των αριθμήσεων CTC έχει παρατηρηθεί [3], [5], [7] – [9]. ανίχνευσης CTC βασίζεται σε επιθηλιακά δείκτες όπως EpCAM ή κερατίνες (CK) μπορεί να παραβλέψει τα καρκινικά κύτταρα υποβάλλονται σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) [10].

Εδώ περιγράφουμε μία νέα εξαιρετικά ευαίσθητη και συγκεκριμένη στρατηγική για την ανίχνευση CTC υπόθαλψη σωματικές μεταλλάξεις σε ασθενείς με NSCLC. Ως μοντέλο απόδειξη της ιδέας που έχουμε χρησιμοποιήσει διαγραφές εντός πλαισίου στο

EGFR

εξόνιο 19 (DelEx19), τα οποία αποτελούν περίπου το 48% του συνόλου

EGFR

μεταλλάξεις [11]. Ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει

EGFR

DelEx19-μεταλλαγμένο CTC πριν από τη θεραπεία σε όλους τους ασθενείς με

EGFR

κατάστασης μεταλλάξεων γνωστή από βιοψίες των όγκων που αξιολογήθηκαν. Επιπλέον, η κάθαρση της μετάλλαξης θετικών CTC συσχετίζεται με ανταπόκριση στη θεραπεία και τον έλεγχο της νόσου.

Υλικά και Μέθοδοι

Γονιδιωματική προετοιμασία DNA

Το γονιδιακό DNA απομονώθηκε από PBMNC και κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας η NucleoSpin® αίμα Kit (Macherey-Nagel, Düren, Γερμανία). Εάν είναι απαραίτητο, γονιδιακό DNA ενισχύθηκε με τη χρήση της REPLI-g Midi Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Γονιδιακού DNA από τις κυτταρικές σειρές ή πλασμιδιακό DNA (pcDNA3.1V5 /HisTOPO, Clontech, Mountain View, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) που κωδικοποιεί ένα ανθρώπινο

EGFR

εξόνιο ακολουθία 19 cDNA που φιλοξενεί ένα 15 bp διαγραφή (delE746-A750) αραιώθηκαν διαδοχικά. Οι κυτταρικές σειρές Α431 (

EGFR

άγριου τύπου, κβ) και NCI-HCC-827 (

EGFR

delE746-A750) ελήφθησαν από την DSMZ (Braunschweig, Γερμανία) και

EGFR

κατάσταση μετάλλαξης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας Sanger.

ενίσχυση PCR και

EGFR

DelEx19

ανίχνευση μετάλλαξης

EGFR

μεταλλάξεις DelEx19 ανιχνεύτηκαν από ανάλυση καμπύλης τήξης για ένα LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Germany). Βέλτιστη ευαισθησία ανίχνευσης μετάλλαξης επιτεύχθηκε με ένα συνδυασμό από ειδικά σχεδιασμένες ανιχνευτών υβριδισμού ατελώς σύνδεση με EGFR εξόνιο 19 αλληλουχίες που φέρει μία διαγραφή στη θέση αμινοξέος 746 ή 747, κλειδωμένα νουκλεϊκά οξέα-(LNA) καταστέλλοντας την ενίσχυση του wildtypic

EGFR

αλληλουχίες και την πρόληψη υβριδοποίηση των ανιχνευτών να wildtypic

EGFR

εξόνιο 19 αλληλουχιών και τελικά την εφαρμογή ασύμμετρη PCR συνθήκες προτίμηση ενισχύοντας οι ανιχνευτές υβριδοποίησης κλώνο DNA προσδένονται σε. Όλες οι παράμετροι εμπειρικά βελτιστοποιηθεί για να επιτευχθεί η βέλτιστη ευαισθησία της ανάλυσης. Κάθε αντίδραση (20 μΐ) περιείχε 50 ng γενωμικού DNA, 2 pmol προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή 2 pmol (Eurofins MWG, Ebersberg, Γερμανία? Ex19S: 5′-GTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGG-3 ‘, Ex19R: 5′-GGGCCTGAGGTTCAGAGC-3′), 2 μl LightCyclerFastStart DNA Μάστερ HybProbe (Roche, Mannheim, Γερμανία), 3 pmol ανιχνευτή υβριδισμού 1 ( «άγκυρα»: 5′-LC640-ATTTTAACTTTCTCACCTTCTGGGATCCAG-PH) και 3 pmol ανιχνευτή υβριδισμού 2 ( «αισθητήρας»: 5′-TAATTCCTTGATAGCGACGGG-FL) (TIBMolbiol, Βερολίνο, Γερμανία). Όλες οι PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν με και χωρίς την προσθήκη 6 pmol κλειδωμένη-νουκλεϊκού οξέος (LNA: 5’-TAATTCCTTGATAG-ΝΗ2? TIBMolbiol, Βερολίνο, Γερμανία).

ανοσομαγνητικά εμπλουτισμό των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων από το περιφερικό αίμα

περιφερικού αίματος (20 mL) συλλέχθηκε σε σωλήνες κιτρικό νάτριο (Sarstedt, Nümbrecht, Γερμανία). PBMNC απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας. Η διάμεση εμπλουτισμός των WBC με φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας ήταν περίπου τριπλάσια. ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων και CD45-αρνητικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν σε δύο παράλληλες αντιδράσεις χρησιμοποιώντας αντι-EpCAM (CD326) και μικροσφαιρίδια αντι-CD45 (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Γερμανία). Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τα προκύπτοντα τέσσερα κλάσματα δείγματος (CD45

+, CD45

-, CD326

+ και CD326

-) και υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο PCR και ανάλυση καμπύλης τήξης

.

ανίχνευση μετάλλαξης με ανάλυση αλληλουχίας

για την ανάλυση αλληλουχίας, γονιδιωματικό DNA των επιλεγμένων δειγμάτων ενισχύθηκε με ολόκληρο ενίσχυση γονιδιώματος (WGA) χρησιμοποιώντας το REPLI-g Midi Kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τον κατασκευαστή οδηγίες. Όλα ακολουθία διαβάζει δημιουργήθηκαν από μια εμπορική υπηρεσία αλληλουχίας (LGC Genomics, Βερολίνο, Γερμανία) σε μια Roche 454 GS FLX + τιτανίου (Roche, Branford, USA) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας CLC γονιδιωματικής πάγκο εργασίας (CLCbio, Aarhus, Δανία). Διαβάζει εισήχθησαν CLC γονιδιωματικής πάγκο εργασίας (χρήση * .fna και * .qual δεδομένων), κομμένα και αντιστοιχίζονται με αναφορά συμπεριλαμβανομένων των

EGFR

εξόνιο 19 ακολουθίας καθώς και 50 bp ανάντη και κατάντη σειρές ιντρόνης. Η μεσαία κάλυψη για το εξόνιο 19 ακολουθίες ήταν 7.316 διαβάζει (εύρος 3,717-17,368).

δείγματα ασθενών /δήλωση Δεοντολογίας

δείγματα περιφερικού αίματος ελήφθησαν από ασθενείς με

EGFR

μεταλλαγμένα και

EGFR

κ.β. NSCLC μετά από γραπτή συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Duisburg-Essen (Α-Ω. 10 – 4359).

Στατιστικά

Διερευνητική στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 4 (GraphPad λογισμικού, La Jolla, USA) και η IBM SPSS Statistics έκδοση 19 (ΙΒΜ, Armonk, USA).

Αποτελέσματα

Η ευαισθησία και η ειδικότητα της

ανίχνευσης μετάλλαξης

για να προσδιοριστεί το όριο για

EGFR

DelEx19 ανίχνευσης μετάλλαξης με ανάλυση καμπύλης τήξης, που αρχικά σπούδασε διαδοχικές αραιώσεις του γονιδιακού DNA από το

EGFR

κ.β. κύτταρα Α431 και NCI HCC-827-κύτταρα που φέρουν ένα

EGFR

DelEx19 μετάλλαξη (Σχήμα 1α). Με τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων της PCR και της ένταξης των κβ

EGFR

-ειδικά LNA η ευαισθησία της ανίχνευσης ενισχύθηκε στο 0,1%

EGFR

DelEx19-μεταλλαγμένων αλληλουχιών (Σχήμα 1β). Σε περαιτέρω σειριακές αραιώσεις του πλασμιδιακού DNA (pcDNA3.1.EGFRdelE746-A750) το όριο ανίχνευσης μετάλλαξης ήταν τόσο χαμηλή όσο 0,01% (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α)

EGFR

ανίχνευση μετάλλαξης DelEx19 σε σειριακά αραιωμένο DNA (50 ng /αντίδραση) από κύτταρα Α431 (

EGFR

-wild πληκτρολογήστε control) και NCI-HCC-827 κύτταρα (

EGFR

DelEx19 μεταλλαγμένο ελέγχου 1). Τήξη κορυφές ενδεικτικές του

EGFR

-wild τύπου DNA (δεξιά) και

EGFR

DelEx19 (αριστερά) μπορεί να διακρίνονται σαφώς. Real-time PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν χωρίς προσθήκη κλειδωμένα νουκλεϊκά οξέα (LNA) και σε σειριακές αραιώσεις DNA μέχρι έως 1:16. Νερό (H

2O, κάτω γραμμή) και 50 ng μη αραιωμένου γονιδιακού DNA

EGFR

-wild τύπου (Α431) και

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα (NCI-HCC-827) συμπεριλήφθηκαν ως έλεγχοι (αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των διπλών αντιδράσεις). Β) Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν όπως στο (Α), αλλά με την προσθήκη του LNA (6 pmol). Σημείωση καταστολή του

EGFR

-wild σήμα τύπου, η οποία επέτρεψε τις διακρίσεις του

EGFR

μετάλλαξη DelEx19 σηματοδοτούν μέχρι αραίωση 1:1,024 (& lt? 0,1%). C, D) Κανονική δείγματα περιφερικού αίματος εμπλουτίστηκαν με ορίζονται αριθμούς (0, 1, 10, 100 κύτταρα /mL) του

EGFR

DelEx19 μεταλλαγμένα κύτταρα NCI-HCC-827. Μετά ανοσομαγνητικά εμπλουτισμός γενωμικό DNA εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε PCR πραγματικού χρόνου και η καμπύλη τήξεως ανάλυση συμπεριλαμβανομένων των ελέγχων όπως στο (Β). Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα του γονιδιακού DNA που απομονώθηκε από κυτταρικά κλάσματα λευκών αιμοσφαιρίων (CD45

-, C) είναι ή κλάσματα κυττάρου CD326-εμπλουτισμένου (CD326

+, D) απεικονίζεται. Και στις δύο κλάσματα κυττάρων

EGFR

σήματα μετάλλαξη DelEx19 μπορεί να διακρίνεται σαφώς από το

EGFR

-wild φόντο τύπου έως ένα όριο ευαισθησίας 1 κυττάρων /mL. Δεν σήματα μετάλλαξη ανιχνεύθηκαν σε CD45

+ ή CD326

– κλάσματα κυττάρων (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

Η

Στη συνέχεια, εμβολιασμένα δείγματα αίματος από υγιείς εθελοντές με καθορισμένες αριθμούς των κυττάρων του NCI-. HCC-827 κύτταρα. Τα δείγματα υπέστησαν επεξεργασία όπως περιγράφεται για τον εμπλουτισμό εμβολιασμένο καρκινικά κύτταρα και όλα τα προκύπτοντα κλάσματα των κυττάρων υποβλήθηκαν σε γονιδιωματικό απομόνωση DNA, PCR σε πραγματικό χρόνο και την ανάλυση καμπύλης τήξης. Σε αυτά τα πειράματα η αναπαραγώγιμη κατώτερο όριο ανίχνευσης ήταν 1

EGFR

μεταλλαγμένου κυττάρου ανά 1 mL περιφερικού αίματος (Σχήμα 1 c, d). Αυτό το πρωτόκολλο στη συνέχεια εφαρμόστηκε σε δείγματα αίματος από τρία NSCLC ασθενείς με

EGFR

wildtypic όγκους και δύο υγιείς εθελοντές. DNA που απομονώθηκε από όλα τα κλάσματα κυττάρων βρέθηκαν αρνητικά για

EGFR

μεταλλάξεις DelEx19 (Συμπλ. Σχήμα S1 α-ε).

Έλεγχος καταλληλότητας της δοκιμασίας σε κλινικά δείγματα

Για την επικύρωση της στρατηγικής μας για την CTC-εμπλουτισμό και την ανίχνευση μετάλλαξης που προοπτικά λαμβάνονται δείγματα περιφερικού αίματος από 8 ασθενείς με μεταστατικό ΜΜΚΠ υπόθαλψη

EGFR

DelEx19 μεταλλάξεις, αντιμετωπίζονται στο κέντρο μας στο 3 μελέτη LUX-Lung (EudraCT-αριθ. 2008-005615-18 ? [12]). Ανά κριτήρια ένταξης μελέτη όλοι οι ασθενείς είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένο, ιατρικά μη επεξεργασμένο στάδιο IIIB /IV πνευμονικό αδενοκαρκίνωμα (Πίνακας 1). Όλα

EGFR

μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν από την κεντρική ανάλυση.

Η

Ένα δείγμα αίματος ονομάσθηκε «αρνητικά» για το

EGFR

μεταλλαγμένου CTC, αν δεν υπάρχει σήμα μετάλλαξη λήφθηκε με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση του γονιδιακού DNA που απομονώθηκε από όλα τα κλάσματα των κυττάρων (CD45

+, CD45

-, CD326

+ και CD326

-) που ελήφθη στο αντίστοιχο χρονικό σημείο. Βασισμένο σε πειράματα τιτλοδότησης μας, αυτό έδειξε ότι

EGFR

μεταλλαγμένου CTC πέσει κάτω από 1 κύτταρο /mL αίματος. Σε περίπτωση που ένα

EGFR

μετάλλαξη DelEx19 ανιχνεύθηκε σε γονιδιακό DNA από τουλάχιστον ένα κλάσμα των κυττάρων, το δείγμα κρίθηκε «θετική» για

EGFR

μεταλλαγμένου CTC.

γραμμή βάσης δείγματα ελήφθησαν εντός 7 ημερών πριν από την μελέτη της θεραπείας, διαδοχική ελήφθησαν δείγματα αίματος σε τακτά χρονικά διαστήματα υπό θεραπεία και παρακολούθηση. Κατά την κλινική πρόοδο ή /και το τέλος της θεραπείας ελήφθη ένα πρόσθετο δείγμα αίματος. Συνολικά δείγματα 148 αίματος συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 36 μηνών και αναλύθηκαν για την παρουσία του

EGFR

μεταλλαγμένου CTC (διάμεση τιμή: 12 δείγματα /ασθενή? Εύρος 7-56). Βάση δείγματα γραμμή αίματος από 8 από 8 ασθενείς (100%) ήταν «θετικά» για το

EGFR

μεταλλαγμένου CTC. Είναι ενδιαφέρον, διαδοχικά δείγματα από 4 από τους 8 ασθενείς έγινε «αρνητική» για

EGFR

μεταλλαγμένου CTC μέσα διάμεσο των 34 ημερών (εύρος: 20 έως 84 ημέρες) της αγωγής της μελέτης (Σχήμα 2 α-ι). «CTC αρνητικότητα» (δηλαδή λιγότερο από το 1

EGFR

DelEx19-μεταλλαγμένο κύτταρο ανά χιλιοστόλιτρο αίματος) επέμενε για ένα μέσο όρο 109 ημέρες (εύρος: 35-199 ημέρες). Γονιδιωματικό DNA από δείγματα που εμφανίζουν μια ισχυρή

EGFR

σήμα μετάλλαξη DelEx19 σε προσφάτως ανεπτυγμένα δοκιμασία μας (που δείχνεται στα Σχήματα 2A-2C και 2F), αναλύθηκε σε GS FLX + Titanium sequencer Roche 454. Προς έκπληξή μας, σε κανένα από αυτά τα δείγματα μία διαγραφή στο

EGFR

εξόνιο 19 θα μπορούσε να ανιχνευθεί (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα

αναλύει EGFR

μεταλλαγμένου CTC και κλινική πορεία των ασθενών του μελλοντικού ομάδα επικύρωσης. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία εντός του LUX-Lung 3 μελέτη για το στάδιο IV

EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC. διάρκεια της θεραπείας, ο χρόνος απεικόνισης σημεία (CT) και τα χρονικά σημεία των αναλύσεων CTC απεικονίζονται στην Ε και J. Στερεά βέλη δείχνουν «CTC θετικότητα», διακεκομμένη βέλη «CTC αρνητικότητα». Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν τα χρονικά σημεία της CTC αναλύσεις /αξονική τομογραφία φαίνεται στο A-D και F-I. Ανάλυση γραμμή (Α) Βάση του ασθενούς 018 έδειξαν ισχυρή

EGFR

σήματα DelEx19 σε δύο κλάσματα κυττάρων (CD326

+ και CD45

-). (Β, C) Διαδοχική αναλύει σε ασθενή 018 αποκαλύπτουν ισχυρή

EGFR

σήματα DelEx19 τουλάχιστον σε ένα σχετικό κλάσμα των κυττάρων. (Δ) Εκπρόσωπος CT εικόνες από 018 ασθενείς στη γραμμή βάσης, και την ημέρα 84 της θεραπείας της μελέτης επιβεβαιώνουν προοδευτική ασθένεια. ανάλυση (F) Βάση γραμμή των 017 ασθενών που εμφανίζουν ισχυρή

EGFR

σήματα DelEx19 σε δύο κλάσματα κυττάρων (CD326

+ και CD45

-). (G, H) Διαδοχική ανάλυση ασθενών 017 παρουσίαζαν μειωμένη (G) και αρνητικό (H)

EGFR

σήματα DelEx19 τόσο σχετικά κλάσματα κυττάρων. (Ι) Εκπρόσωπος CT εικόνες από ασθενή 017 στη γραμμή βάσης, και την ημέρα 84 της θεραπείας μελέτη επιβεβαιώνει μια μερική απάντηση.

Η

Σύλλογος EGFR μεταλλαγμένων CTC με τις κλινικές εκβάσεις

Με βάση την η παρατήρηση αυτή θα ερωτηθούν τη σύνδεση των

EGFR

μεταλλαγμένου CTC με ανταπόκριση στη θεραπεία και η διάρκεια της επικύρωσης ομάδα μας. Ορίσαμε έναν ασθενή ως «

EGFR

μεταλλαγμένου CTC εκκαθαριστεί» αν δύο διαδοχικά δείγματα αίματος ελέγχθηκαν «αρνητικό», δηλαδή

EGFR

μεταλλαγμένου μετράει CTC πέσει κάτω από 1 κύτταρο /mL. «CTC επανάληψης» ανακηρύχθηκε όταν δύο διαδοχικά δείγματα αίματος δοκιμαστεί «θετικά» για το

EGFR

μεταλλαγμένου CTC. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση μετάλλαξης CTC συσχετίστηκαν με ακτινολογική ανταπόκριση αξιολογηθεί στο πλαίσιο της μελέτης LUX-Lung 3. Όλα τα 4 ασθενείς οι οποίοι «εκκαθαριστεί»

EGFR

μεταλλαγμένου CTC επιτευχθεί ο έλεγχος της νόσου, με 3 μερικές ανταποκρίσεις (PR) και μία σταθερή νόσο (SD) ανά RECIST. Σε 4 ασθενείς με επίμονα CTC στο περιφερικό αίμα τους και οι οποίοι ως εκ τούτου δεν «σαφή»

EGFR

μεταλλαγμένου CTC μόνο μία αντικειμενική ανταπόκριση (PR) παρατηρήθηκε, ενώ 2 ασθενείς πέτυχαν SD και ένας ασθενής προοδευτική ασθένεια (PD ). Κατά την παρακολούθηση όλων των 4 ασθενών με «κάθαρση» του

EGFR

μεταλλαγμένου CTC αναπτύσσεται PD.

EGFR

μεταλλαγμένου CTC επέστρεψε στη «θετική» σε ένα μέσο όρο 140 ημέρες (εύρος 0-960 ημέρες) πριν από την ακτινολογικά τεκμηριωμένη PD. Ως εκ τούτου, η αύξηση του

EGFR

μεταλλαγμένου CTC μετράει πάνω από το όριο του 1 κυττάρων /mL θα μπορούσε να είναι ένας πρώιμος δείκτης της υποτροπής της νόσου και της αντίστασης σε ασθενείς που έχουν «εκκαθαριστεί» CTC. Με διερευνητική στατιστική ανάλυση παρατηρήσαμε μια σημαντική συσχέτιση (Spearman-Rho συντελεστής συσχέτισης 0,868, p & lt? 0,01) μεταξύ της διάρκειας της «CTC αρνητικότητα» και ο χρόνος αποτυχίας της θεραπείας. Οι ασθενείς που είχαν «καθαριστεί»

EGFR

μεταλλαγμένου CTC κάτω από το επίπεδο ανίχνευσης έδειξε ένα σημαντικά παρατεταμένο χρόνο αποτυχίας της θεραπείας (διάμεση τιμή: 355 ημέρες? Φάσμα: 189-1,086 ημέρες? P = 0,006, δοκιμασία log-rank ) σε σύγκριση με τους ασθενείς που παρέμειναν «θετική» για

EGFR

μεταλλαγμένου CTC (διάμεση τιμή: 116 ημέρες, εύρος:.. 84-173 ημερών? Σχήμα 3)

ανάλυση

Kaplan-Meier σύγκριση TTF των ομάδων ασθενών με και χωρίς κάθαρση της CTC κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Οι ασθενείς ομαδοποιήθηκαν σύμφωνα με την «κάθαρση» (διάμεσος TTF 355 ημέρες) ή «μη κάθαρση» (διάμεσος TTF 116 ημερών) του

EGFR

μεταλλαγμένου CTC υπό θεραπεία με afatinib ή πεμετρεξίδη /σισπλατίνη. Ομάδες συγκρίθηκαν με διερευνητική ανάλυση Kaplan-Meier (p = 0,006, δοκιμασία log-rank).

Η

Συζήτηση

Επί του παρόντος, η ανίχνευση γενετικών ανωμαλιών σε ιστούς όγκων είναι η κλινικά πιο ισχυρό βιοδείκτη για τη διαστρωμάτωση των «στοχευμένων» φαρμακοθεραπείες στο μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα [13], [14]. Η θεραπεία με gefitinib και crizotinib, καθώς και πρώτης γραμμής erlotinib, εξαρτάται από την επίδειξη του

EGFR

μεταλλάξεις και

ALK

αναδιατάξεις. ανίχνευση μεταλλάξεων εκτελείται συχνά σε μικρές ή /και αρχειακό δείγματα των όγκων, η οποία δεν μπορεί να αντανακλά την τρέχουσα γονιδιωματικής προφίλ κατά την έναρξη της θεραπείας [15]. Επιπλέον, η μεταλλακτική φάσμα ενός καρκίνου αλλάζει υπό την εκλεκτική πίεση ενός δεδομένου θεραπεία, η οποία μπορεί να αποκαλύπτεται μόνο με διαδοχική βιοψίες. Στο πλαίσιο αυτό, η ανίχνευση του καρκίνου-ειδικών μεταλλάξεων σε άλλες μορφές από βιοψίες των όγκων έχει κερδίσει το ενδιαφέρον. Στο NSCLC, επιτυχή ανίχνευση των μεταλλαγμένων αλληλουχιών DNA αναφέρθηκε σε ορό, πλάσμα ή υγρό βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος [16] – [19]. Παρ ‘όλα αυτά, οι περισσότερες από αυτές τις εκθέσεις εμφανίζεται ένα επίπεδο ευαισθησίας κάτω από τις κλινικές απαιτήσεις.

Η πρώιμη συστηματική διάδοση των καρκινικών κυττάρων θεωρείται από βιολογική σημασία. Χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα έναντι επιθηλιακών δεικτών, διαδίδονται καρκινικά κύτταρα και CTC έχουν ανιχνευθεί στο μυελό των οστών και το αίμα από ασθενείς με διάφορες κακοήθειες. Ανάμεσα σε μια μεγάλη ποικιλία εναλλακτικών στρατηγικών που εφαρμόζονται για CTC-εμπλουτισμό και την ανάλυση, έχει αναπτυχθεί ένα αυτοματοποιημένο σύστημα για immunocytometric ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της CTC, το οποίο ελέγχθηκε σε μαστού, του προστάτη, του παχέος εντέρου και οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα [2], [5], [8], [20] – [23]. Είναι ενδιαφέρον, το απόλυτο ποσό της CTC ανιχνεύονται σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του σταδίου διέφερε σημαντικά, ανάλογα με τις τεχνικές CTC-απομόνωσης. Ενώ ανιχνεύθηκαν υψηλοί αριθμοί CTC σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα μικρών κυττάρων, απόλυτους αριθμούς CTC και δυναμικό εύρος σε NSCLC φάνηκε πολύ χαμηλή για την ευρεία κλινική εφαρμογή. Παρ ‘όλα αυτά, έχει γίνει όλο και πιο σαφές ότι οι πληθυσμοί CTC είναι φαινοτυπικά ετερογενή και προσεγγίσεις επιθηλιακά σήμανσης ανεξάρτητη εμπλουτισμού δικαιολογείται για να εμφανίσετε την πλήρη εικόνα της CTC, σε έναν ασθενή με καρκίνο σε μια δεδομένη χρονική στιγμή. Αρκετές πρόσφατες εκθέσεις που υποστηρίζονται αυτήν την έννοια, δείχνοντας σταθερά υψηλότερους αριθμούς CTC κατά τη σύγκριση των επιθηλιακών σήμανσης-ανεξάρτητο τεχνικές εμπλουτισμού CTC (π.χ. εμπλουτισμός με το μέγεθος των κυττάρων) με την ευρέως εφαρμοσμένη απομόνωση CTC με επιλογή του EpCAM και CK-θετικά κύτταρα χρησιμοποιώντας το CellSearch σύστημα [5 ], [8], [24], [25].

σε αυτό το πλαίσιο έχουμε αιτιολογημένη αν σχολαστικά για καρκίνο συγκεκριμένες σωματικές μεταλλάξεις, αντί των παραμέτρων μικροσκοπία με βάση ενισχύει την ευαισθησία της ανίχνευσης CTC σε NSCLC. Έχουμε επιλέξει

EGFR

μεταλλάξεις DelEx19 ως πρότυπο για την ανάπτυξη ενός εξαιρετικά ευαίσθητη, ειδική και ισχυρή μέθοδο για την ανίχνευση μετάλλαξης σε μίγματα γονιδιωματικού DNA που εξήχθησαν από CTC εμπλουτισμένο αιμοσφαιρίων πληθυσμών περιφερικού. Η νέα μέθοδος εφαρμόζεται στην παρούσα μελέτη έχει σχεδιαστεί για να ανιχνεύσει την συντριπτική πλειοψηφία των

EGFR

DelEx19 μεταλλάξεις, και ειδικότερα όλες τις πιθανές μεταλλαγμένες παραλλαγές διατάραξη κωδικόνια 746 και 747 του

EGFR

γονίδιο. Σε αντίθεση με μια προηγούμενη μελέτη αναλύει μόνο EpCAM-θετικά κύτταρα του αίματος [26] έχουμε επιλέξει μια αμερόληπτη, επιθηλιακά δείκτη-ανεξάρτητη στρατηγική για τον εμπλουτισμό της CTC, όπου χωρίστηκαν τα δείγματα και τον εμπλουτισμό CTC επετεύχθη με μια διττή προσέγγιση, που καταστρέφουν τη στιβάδα λευκοκυττάρων στο ένα μισό του δείγματος και επιλογή των ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων στο άλλο μισό. Αυτό λαμβάνει υπόψη την φαινοτυπική διακύμανση της CTC, το οποίο μπορεί να χάσει ένα ή περισσότερα επιθηλιακά δείκτες ενώ ρίξει από πρωτογενή όγκο ή μεταστάσεις [27] – [29]. Σε πιλοτικά πειράματα, η χρώση ανοσοφθορισμού των επιλεγμένων δειγμάτων από ασθενείς CTC NSCLC έδειξε πράγματι ετερογενείς πληθυσμοί CTCs εμφάνιση επιθηλιακής, μεσεγχυματικά και μικτά φαινότυποι (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εφαρμόζοντας αυτή την αμερόληπτη προσέγγιση CTC-εμπλουτισμού, πετύχαμε ένα ποσοστό ανίχνευσης 100% σε μια πιλοτική ομάδα από 8 ασθενείς με

EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC. Το πιο ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μια ένωση του

EGFR

μεταλλαγμένου CTC με ανταπόκριση στη θεραπεία και την έκβαση. Αυτά τα ευρήματα είναι πιο πιθανό να αποδοθεί στην νέα και εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης μετάλλαξης που εφαρμόζεται σε αυτή τη μελέτη. Έχει αναγνωριστεί εδώ και αρκετό καιρό ότι η ανίχνευση των μεταλλάξεων σε επίπεδα κάτω από 1% δεν είναι αξιόπιστα δυνατές οι εφαρμογές επόμενης γενιάς αλληλούχιση, λόγω των εγγενών ποσοστά σφάλματος της τεχνολογίας αυτής [30]. Μόνο πολύ πρόσφατα βελτιωμένες τεχνολογίες έχουν αναφερθεί, καθιστώντας την ανίχνευση μεταλλάξεων στα επίπεδα του 0,1% και κάτω από δυνατό [31], [32]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτά, δεν ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει

EGFR

Del19 μεταλλάξεις με αλληλούχιση επόμενη γενιά στο γονιδιακό DNA των δειγμάτων εμφανίζει σαφείς ενδείξεις μετάλλαξη σε δοκιμασία νεοαποκτηθέντα ανίχνευση μεταλλάξεων μας. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η δοκιμασία ανίχνευσης μετάλλαξης νεοαποκτηθέντα μας προφανώς εμφανίζει μεγαλύτερη ευαισθησία από τις τυπικές τεχνικές αλληλούχισης επόμενης γενιάς. Ένα άλλο αξιοσημείωτο στοιχείο της δοκιμασίας ανίχνευσης μετάλλαξης μας ήταν η παρατήρηση ότι τα διαφορετικά

EGFR

μεταλλάξεις DelEx19 προκάλεσε διαφορετικές καμπύλες τήξης (βλέπε σχήμα 2 και συμπλ. Σχήμα S1). Αυτό είναι πιο πιθανό οφείλεται στα χαρακτηριστικά ενός από τους ανιχνευτές υβριδισμού, το οποίο είναι σχεδιασμένο να συνδέεται με

EGFR

εξόνιο 19 wildtypic αλληλουχίες στην περιοχή των δυνητικών διαγραφές που οδηγεί στην διάσπαση του ανιχνευτή κατά την διάρκεια ανάλυση καμπύλης τήξης σε διαφορετικές θερμοκρασίες, ανάλογα με την αλληλουχία του αντίστοιχου διαγραφή.

Ενώ αυτά τα αποτελέσματα είναι ενθαρρυντικά, γνωρίζουμε ότι ο πληθυσμός ασθενών που αναλύθηκαν εδώ είναι πολύ μικρή και επικύρωση σε μεγαλύτερους πληθυσμούς ασθενών συμπεριλαμβανομένων των πρόσθετων μεταλλάξεων είναι απαραίτητη. Επί του παρόντος, εξίσου ευαίσθητες δοκιμασίες ανίχνευσης μετάλλαξης που καλύπτουν πολλές περιοχές της θεραπείας-σχετικές του

EGFR

γονίδιο (π.χ. κωδικόνια L858 και T790) και άλλα ογκογονίδια αναπτύσσονται.

Εν ολίγοις, έχουμε περιγράψει μια νέα στρατηγική που βασίζεται στην CTC εμπλουτισμό και εξαιρετικά ευαίσθητη ανίχνευση σωματικών μεταλλάξεων, οι οποίες μπορούν να εφαρμοστούν για μεταλλακτική προφίλ και την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας σε ασθενείς με

EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC. Με τη βελτιστοποίηση δοκιμασία έχουμε δείξει ότι το πρόβλημα του εμφανώς χαμηλή CTC μετράει στο στάδιο IV NSCLC μπορεί να ξεπεραστεί. Αυτό μπορεί να είναι ένα ακόμη βήμα προς το όραμα μιας «υγρό βιοψίας» για τη μοριακή διάγνωση χωρίς κινδύνους και την παρακολούθηση της νόσου σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

EGFR

ανάλυση μετάλλαξης DelEx19 σε δείγματα αίματος από ασθενείς με NSCLC με

EGFR

-wild όγκους τύπου και υγιή άτομα ελέγχου. Περιφερικό δείγματα αίματος από τρεις ασθενείς με

EGFR

-wild τύπου NSCLC (A, B, C) και δύο υγιείς εθελοντές (D, E) εμπλουτίστηκαν, διαχωρίστηκαν σε κυτταρικά κλάσματα και υποβλήθηκε σε απομόνωση DNA όπως περιγράφεται. Μετάλλαξη ανιχνεύεται διεξήχθη με πραγματικού χρόνου PCR και ανάλυση καμπύλης τήξης παρουσία LNA. Όχι

EGFR

σήμα DelEx19 ανιχνεύθηκε. H

2O (κάτω γραμμή) και 50 ng της μη αραιωμένο γονιδιακό DNA του NCI-HCC-827 κύτταρα ( «

ελέγχου 1

«), το πλασμίδιο DNA που περιέχει ένα

EGFR

ακολουθία DelEx19 ( «έλεγχος 2») και τα κύτταρα Α431 ( «

EGFR

wildtypic ελέγχου») συμπεριλήφθηκαν ως αρνητικοί και θετικοί έλεγχοι. Για λόγους σαφήνειας μόνο μεμονωμένες τιμές των αντιγράφων εμφανίζεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085350.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε όλους τους ασθενείς για συμμετοχή σε αυτή η μελέτη. Όλα συμβάλλουν τα μέλη του προσωπικού των Τμημάτων Ιατρικής Ογκολογίας, Παθολογίας και νευροπαθολογία, της Δυτικής Γερμανίας Κέντρο Καρκίνου, στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Essen, καθώς και οι Διευθύνσεις των Θώρακος Ογκολογίας και Επεμβατικής Πνευμονολογίας, Ruhrlandklinik, οι ευχαρίστησε. Sabrina Schilling και η Σάρα-Luise Stergar αναγνωρίζεται για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια και Sabine Kasimir-Bauer για τις χρήσιμες συζητήσεις και συμβουλές. Είμαστε ευγνώμονες για την Ivonne Nel και τον Ανδρέα-Κλαύδιος Hoffmann για τις συμβουλές και την άριστη τεχνική βοήθεια με χρώσεις ανοσοφθορισμού. Το Γερμανικό Ίδρυμα Ερευνών (DFG) χορηγείται στήριξη για τα τέλη δημοσίευσης.