Abstract

Η έκφραση από κύτταρα όγκου των πρωτεϊνών με τους λογαριασμούς παρεκκλίνουσα δομή, έκφραση ή διανομής για την ανάπτυξη μιας χυμικής ανοσολογικής απόκρισης. Τα αυτοαντισώματα (ΑΑΒ) που κατευθύνονται έναντι αντιγόνων που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΑ) μπορεί έτσι να είναι ιδιαίτερα σημαντικό για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου. Ορολογική ανάλυση πρωτεώματος (SERPA) έχει ως στόχο να εντοπίσει αυτές που κυκλοφορούν Aab μέσω της ανοσοαποτύπωση των 2D διαχωρισμένων κυττάρων όγκου των πρωτεϊνών με ορό ασθενούς με καρκίνο και στη συνέχεια η ταυτοποίηση MS πρωτεϊνών σε αντιδραστικά σημεία. Αυτή η μέθοδος έχει το πλεονέκτημα να χρησιμοποιούν μετα-μεταφραστικά τροποποιημένων πρωτεϊνών ως πηγή δυνητικών ΤΑΑ. Εδώ, έχουμε εφαρμόσει αυτή τη στρατηγική χρησιμοποιώντας κύτταρα όγκου του ορθού προ-εκτέθηκαν σε υποξία, ώστε να προωθήσει την έκφραση της διαμόρφωσης των ΤΑΑ πιο πιθανό να αντιπροσωπεύει

in vivo

συνθήκες. Χρησιμοποιήσαμε δύο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές HCT116 και ΗΤ29 παχέος εκτίθεται για 48 ώρες σε 1% O

2. Κηλίδες θετική μετά ανοσοστύπωμα 2D-διαχωρισμένα προϊόντα λύσης των υποξικών κυττάρων με τους ορούς των ποντικών που φέρουν όγκο, συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με MS για ταυτοποίηση πρωτεϊνών. Μεταξύ των υποξία ειδικές ανοσογονικές πρωτεΐνες, εντοπίσαμε μια φωσφορυλιωμένη μορφή των ευκαρυωτικών παράγοντα επιμήκυνσης μετάφρασης 2 (φωσφο-Thr56 eEF2). Επιβεβαιώσαμε την αυξημένη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης αυτής σε υποξικά κύτταρα όγκου του ορθού, καθώς και σε όγκους ποντικού. Χρησιμοποιώντας μια ειδική ανοσοδοκιμασία, θα μπορούσαμε να ανιχνεύσει την παρουσία του αντίστοιχου αντι-φωσφο-Thr56 eEF2 ΑΑΒ στον ορό των ποντικών που φέρουν όγκο (

vs

υγιή ποντίκια). Εμείς τεκμηριώνεται περαιτέρω ότι η ανίχνευση αυτών των ΑΑΒ προηγήθηκε την ανίχνευση ενός ψηλαφητή μάζα του όγκου σε ποντικούς και επικύρωσε την παρουσία αντι-φωσφο-Thr56 eEF2 ΑΑΒ στον ορό των ασθενών με αδενωματώδεις πολύποδες και ορθοκολικό καρκίνωμα. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη επικυρώνει μια φωσφορυλιωμένη μορφή της eEF2 ως νέο ΤΑΑ και γενικότερα, παρέχει ενδείξεις ότι η ένταξη υποξία πριν από SERPA προσφέρει μια πιο σχετική ρεπερτόριο του ΤΑΑ σε θέση να ξεσκεπάσουν την παρουσία των κυκλοφορούντων ΑΑΒ.

Παράθεση : Grandjean M, Sermeus Α, branders S, Defresne F, Dieu Μ, Dupont P, et al. (2013) υποξία Ένταξη στο ορολογικής Proteome Ανάλυση ξεσκεπάζει όγκου αντιγόνα και προωθεί την ταυτοποίηση των αντι-φωσφο-eEF2 αντισώματα ως πιθανοί Καρκίνου Biomarkers. PLoS ONE 8 (10): e76508. doi: 10.1371 /journal.pone.0076508

Επιμέλεια: Masaharu Seno, Πανεπιστήμιο Okayama, Japan

Ελήφθη: 24 Μάρτη 2013? Αποδεκτές: 27 Αύγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Grandjean et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Fonds National de la Recherche Scientifique (FRS-FNRS), το Fonds de la Recherche Scientifique Médicale (FRSM), μια δράση de Recherche Concertée από την Communauté française de Belgique (ARC 09 /14-020), η Διαπανεπιστημιακό πόλο έλξης (πρόγραμμα IUAP P7.03), και το Ίδρυμα Ι Maisin. Μ Grandjean είναι ένα FRIA (Fonds pour la σχηματισμό à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture) Research Fellow. Η εγκατάσταση MS του URBC-NARILIS υποστηρίχθηκε από την FNRS (Βρυξέλλες, Βέλγιο). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η συμβολή της μικροπεριβάλλον του όγκου να εξέλιξης του καρκίνου είναι σήμερα αναγνωρίζεται ευρέως [1]. Η υποξία είναι μια από αυτές τις παραμέτρους μικροπεριβάλλοντος που αντιπροσωπεύουν φαινοτυπικές αλλαγές στους όγκους [2] – [4]. Χαμηλή συγκέντρωση οξυγόνου σε όγκους προκύπτει από μια ανισορροπία μεταξύ της προσφοράς και της κατανάλωσης οξυγόνου κυρίως λόγω της ανωριμότητας της αγγείωσης του όγκου και του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων ταχεία, αντίστοιχα [5]. Σε απάντηση στην υποξία του όγκου, τα καρκινικά κύτταρα θα επιβραδύνει τους μηχανήματα πρωτεϊνικής σύνθεσης, ενώ την ίδια στιγμή, η επαγωγή παραγόντων μεταγραφής όπως HIF (παράγοντας υποξία) θα προωθήσει ειδικά προγράμματα γονιδιακή έκφραση [6], [7]. Υποξικά κύτταρα όγκου θα παρουσιάσει έτσι μια πρωτεομική προφίλ διακριτό από ορθοξικές κυττάρων όγκου, με την προτιμησιακή έκφραση πρωτεϊνών που απαιτούνται για την υποστήριξη προσαρμοστικών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που οδηγούν σε αγγειογένεση και γλυκολυτικά διακόπτης [8] – [10]. Είναι ενδιαφέρον, υποξία παίζει επίσης ρόλο στην καρκινογένεση ως συνέπεια του πολλαπλασιασμού των κυττάρων όγκων σε πρώιμο στάδιο επί επιθηλιακές επιφάνειες οι οποίες διαχωρίζονται από το υποκείμενο παροχή αίματος από ένα ανέπαφο βασικής μεμβράνης [11]. Επίσης, η σχέση μεταξύ της φλεγμονής και του καρκίνου προτείνεται να ενσωματώσει το περιβάλλον υποξίας οφείλεται στην αύξηση του μεταβολισμού και των κυττάρων του κύκλου εργασιών, ενώ το δίκτυο μικροαγγειακή δεν είναι (ακόμη) προσαρμοσμένο [12]. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε ορθοκολικό καρκινογένεση, η αλληλουχία αδένωμα-καρκίνωμα αναφέρθηκε ότι σχετίζεται με την επαγωγή του HIF-1α σε προκαρκινικές αλλοιώσεις [13], καθώς και με δυσπλασία [14]? HIF-2α αναφέρθηκε επίσης να προωθήσει την εξέλιξη από αδένωμα σε καρκίνωμα [15].

Αν και υποξία αναγνωρίζεται ως σήμα κατατεθέν των όγκων που αντιπροσωπεύουν τις αλλαγές στο φαινότυπο των κυττάρων του όγκου, έχει μέχρι στιγμής σε μεγάλο βαθμό υποτιμηθεί ως πηγή διαφοροποίησης του τρόπου διεξαγωγής των αντιγόνων επιρρεπείς να προκαλέσουν μία ανοσογόνο απόκριση. Τα αντιγόνα όγκων που σχετίζονται με (ΤΑΑ) περιγράφονται ως πρωτεΐνες που απελευθερώνονται από κύτταρα του όγκου ή πεπτίδια εκτίθενται στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων ή κυττάρων που παρουσιάζουν το αντιγόνο με MHC τάξης Ι και II μόρια, αντίστοιχα [16] – [19]. Μετάλλαξη, κολόβωση, εσφαλμένη αναδίπλωση, υπερ-έκφραση και έκτοπη έκφραση πρωτεϊνών σε κύτταρα όγκου προτείνονται να λογοδοτήσει για την ανοσογονικότητα αυτών των ΤΑΑ [20] – [22]. Είναι ενδιαφέρον, αυτοαντισώματα (ΑΑΒ) που κατευθύνεται έναντι αυτών των τροποποιημένων πρωτεϊνών εκπροσωπούν τους δυνητικούς βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου ή ακόμη και πρόγνωση [23] – [26]. Η εξειδίκευση και η σταθερότητα των αντισωμάτων μαζί με μια σχετική ευκολία ανίχνευσης αντιπροσωπεύουν βασικά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με άλλα συστατικά που κυκλοφορούν στο αίμα [19]. Η SERPA (ορολογική Proteome Analysis) τεχνική εκμεταλλεύεται το διαχωρισμό των προϊόντων λύσης πρωτεϊνών που προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα σε δισδιάστατο τζελ και η συνακόλουθη ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας ορούς που συλλέχθηκαν από ασθενείς με καρκίνο [25], [27], [28].

Εδώ, για τους λόγους που εκτίθενται παραπάνω, επιλέξαμε να ενσωματώσουν υποξία ως περιβαλλοντική παράμετρος στη ροή εργασίας SERPA με προ-επώαση του παχέος καρκινικά κύτταρα στο 1% O

2, προκειμένου να ξεσκεπάσουν ΤΑΑ απουσιάζει ή μη ανιχνεύσιμη σε λύματα της ορθοξικές κύτταρα όγκου. Εντοπίσαμε διαφορετικά από όγκο και υποξία-ειδικά αντιγόνα, συμπεριλαμβανομένης της φωσφορυλιωμένη μορφή Thr56 του ευκαρυωτικού παράγοντα επιμήκυνσης 2 (eEF2). Μια ειδική ανοσολογική δοκιμή αναπτύχθηκε και μας έδωσε τη δυνατότητα να επικυρώσει φωσφο-eEF2 ως

καλόπιστους

υποξία που προκαλείται ΤΑΑ και τα αντίστοιχα Aab ως πιθανούς βιοδείκτες του καρκίνου σε ποντίκια και ανθρώπους.

Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πειράματα με ποντίκια και τα καρκινικά κύτταρα έλαβε την έγκριση του

Comité d’Ethique Facultaire

του

Université Catholique de Louvain

(UCL) ( ID έγκρισης 2012 /UCL /MD005)? μελέτες του ποντικιού πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους εθνικούς κανονισμούς φροντίδα των ζώων.

Όλοι οι ασθενείς που νοσηλεύονται στο Universitair Ziekenhuis Brussel (Βέλγιο) και έδωσε γραπτή συγκατάθεση συμφωνώντας με την πολιτική του νοσοκομείου. Αυτό περιλαμβάνει την ανώνυμη χρήση του υπολειμματικού υλικού σώματος για την επιστημονική έρευνα με σκοπό αυστηρά σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και το άρθρο 20.2 του βελγικού νόμου (19-12-2008) σχετικά με την προμήθεια και χρήση ανθρώπινων σωματικά υλικά για τα Ανθρώπινα Ιατρικές Εφαρμογές και Επιστημονικής Έρευνας. Αυτό το άρθρο του νόμου ορίζει ότι η συγκατάθεση για την έρευνα χρήση ανθρώπινων βιολογικών υλικών θεωρείται ότι έχει δοθεί αν ο δότης δεν επικοινωνούν αντίρρηση για την εν λόγω χρήση. Πρακτικά, όλοι οι ασθενείς που υποβάλλονται σε κολονοσκόπηση υποβληθεί σε ανάλυση αίματος για την αξιολόγηση αιματός και πήξης τους? Η διαδικασία αυτή είναι υποχρεωτική για να επιτρέψει ενδοσκοπική εκτομή σε περίπτωση πολύποδες βρίσκονται. Κανένας από τους συγγραφείς συμμετείχε στις συλλογές δειγμάτων:. Εναπομένουσα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν από μια νοσοκόμα και απο-προσδιορίζονται από έναν διαχειριστή δεδομένων πριν από την αποστολή στο εργαστήριο για την αυστηρή Σκοπός της παρούσας μελέτης

Cells

HCT καρκίνωμα ανθρώπινου ορθοκολικού 116 και κυτταρικές γραμμές ΗΤ29 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC), αποθηκεύονται σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή και χρησιμοποιήθηκαν εντός 6 μηνών από την ανάνηψη από παγωμένα υποπολλαπλάσια. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε McCoy 5Α μέσο (Invitrogen, Paisley, UK) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός και αντιβιοτικά. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε νορμοξικά (21% O

2, 5% CO

2) συνθήκες που εκτίθενται σε υποξία (1% O

2, 5% CO

2) σε μία Invivo2 500 υποξική θάλαμο για 48 ώρες (Ruskinn, Βέλγιο).

ποντίκια

Άντρας 7 εβδομάδων αρσενικά NMRI ποντίκια (ηυ /ηυ) (Elevage Janvier, Le Genest Saint-Isle, Γαλλία ) εγχύθηκαν υποδορίως με 2,10

6 HCT116 ή ΗΤ29 κύτταρα? διάμετροι όγκου εβδομαδιαία παρακολουθούνται με ηλεκτρονικό παχύμετρο. Οροί συλλέχθηκαν για ορολογικές δοκιμασίες μέσω οπισθο-κογχική παρακέντηση κατά την ημέρα 0 και κάθε εβδομάδα μέχρις ότου η διάμετρος του όγκου φθάνει το 8 mm. Στο τέλος μιας σειράς πειραμάτων, τα ποντίκια θυσιάστηκαν, το αίμα συλλέχθηκε με ενδο-καρδιακή διαδρομή, ορός απομονώθηκε μετά από φυγοκέντρηση σε θερμοκρασία δωματίου και οι όγκοι κρυοσυντηρηθεί.

Ασθενείς

οροί συλλέχθηκαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε κολονοσκόπηση για πεπτικά παράπονα ή για διαλογή. Έξι υποκείμενα είχαν φυσιολογικό κολονοσκόπηση και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες, δεκατέσσερις ασθενείς είχαν αδενωματώδεις πολύποδες και εννέα είχαν καρκίνωμα? οι μέσες ηλικίες αυτών των τριών κατηγοριών των ασθενών ήταν 71 ± 4, 67 ± 3 και 71 ± 3 έτη αντίστοιχα. Το αίμα συλλέχθηκε σε σωλήνες ουδέτερο τύπου και μετά από φυγοκέντρηση, ορός δειγματίστηκε και φυλάχθηκε στους -80 ° C.

2-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση Ανάλυση και SERPA

Για την εκχύλιση των πρωτεϊνών, ορθοξικές ή κύτταρα υποξικά πλύθηκαν με 20 mM φωσφορικό νάτριο ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και αποξέστηκαν με την επισήμανση ΨΗΦΟ (DLA) ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% CHAPS και 30 mM Tris, ρΗ 8,5). Το υπερκείμενο στη συνέχεια ανακτήθηκε μετά από φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 10000 rpm και 4 ° C και η συγκέντρωση προσδιορίστηκε με δοκιμασία πρωτείνης Bradford.

Για πειράματα SERPA, 25 μα εκχυλίσματος πρωτεΐνης ελάχιστα σημασμένο με 200 pmol χρωστικής κυανίνης Cy5 (Amersham GE Healthcare) για 30 λεπτά στο σκοτάδι επί πάγου, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. αντίδραση επισήμανση διεκόπη με επώαση του μίγματος με 10 mM λυσίνη (Sigma Aldrich) για 10 λεπτά. Μη σημασμένες πρωτεΐνες προστέθηκαν για να φτάσει ένα σύνολο 250 μg των πρωτεϊνών και αραιώνεται σε ένα κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (4% 3 – [(3-χολαμιδοπροπυλο) διμεθυλαμμωνιο] -1-προπανοσουλφονικό (CHAPS), 7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 30 mM Tris, 30 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT), 1% ρυθμιστικό IPG 3-11 [GE Healthcare]). Δείγματα φορτώθηκαν επανυδατώθηκαν πρώτη διάσταση λωρίδα (Immobiline DryStrip, pH 3-11 NL, 18 cm, GE Healthcare). Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε 2 διαστάσεων γέλη, χρησιμοποιώντας ισοηλεκτρική εστίαση στην πρώτη διάσταση (300 V για 3 ώρες, κλίση βήματα 1000 V για 8 ώρες, 8000 V για 3 ώρες, και 8000 V για 45 λεπτά στους 20 ° C με ένα μέγιστο τρέχουσες ρυθμίσεις των 50 μΑ ανά λωρίδα) και SDS γέλη polyarcrylamide (10% ακρυλαμίδιο) ηλεκτροφόρηση (SDS-PAGE) στη δεύτερη διάσταση. Οι πρωτεΐνες τελικά μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF χαμηλού φθορισμού. Οι μεμβράνες επωάστηκαν για 2 ώρες σε 5% άπαχο ξηρό Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με 1% Tween (TTBS) ρυθμιστικό αποκλεισμού και μετά εκτέθηκαν όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου είτε σε έλεγχο ή ποντικούς που φέρουν όγκο ορού σε 1% μη περιέχουν γάλα λιπαρή ξηρά TTBS που περιέχει γάλα (αραίωση 1/100). Για κάθε πείραμα, χρησιμοποιήθηκε ένα συνένωμα ορών που συλλέχθηκαν από 6 διαφορετικούς ποντικούς για να εξασφαλιστεί η ευρωστία της μεθόδου διαλογής. Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση HRP-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG δευτερογενή αντισώματα και το αντιδραστήριο ECL Plus (GE Healthcare). Οι μεμβράνες σαρώθηκαν στο μήκος κύματος Cy5 σε Typhoon FLA9500 Imager (GE Healthcare) για την ανίχνευση των πρωτεϊνών και στο μήκος κύματος Cy2 για την ανίχνευση αντισωμάτων, αξιοποιώντας το HRP-καταλυόμενη παραγωγή ενός φθορίζοντος ενδιαμέσου εκπέμπει στα 503 nm από το υπόστρωμα ακριδάνη που περιέχεται στο αντιδραστήριο ECL Plus. Για την επικύρωση των πειραμάτων SERPA, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι εμπορικές eEF2 (Abcam, Cambridge, UK) και συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα (1/5000, Jackson Immunoresearch, Sufolk, UK).

Σε Gel ενζυματική πέψη και Φασματομετρίας μάζας (MS) Προσδιορισμός

Για την ανάκτηση του δείγματος, μη επισημασμένο πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση 2D. Τα πηκτώματα υποβλήθηκαν 2D φθορισμό χρωματισμένων (Krypton πρωτεΐνη λεκέ, Pierce, Thermo Scientific) μετά από στερέωση σε νερό 50%, 40% αιθανόλη και διάλυμα οξικού οξέος 10%, 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεΐνες του ενδιαφέροντος αυτόματα συλλέγονται από τις γέλες χρησιμοποιώντας ένα Ettan Spot Picker (GE Healthcare). Μετά το ξέπλυμα, οι κηλίδες γέλη 2D αφυδατώθηκαν σε ακετονιτρίλιο στους 37 ° C. Η πέψη διεξήχθη όλη τη νύχτα στους 37 ° C με θρυψίνη (12.5 ng /ml) σε 100 mM διττανθρακικού αμμωνίου. Το στάδιο εκχύλιση διεξήχθη με μυρμηκικό οξύ 5% για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τα υπερκείμενα στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση φασματομετρία μάζας των πρωτεϊνών με νανο-LC-ESI-MS /MS Maxis 4G UHR-TOF (Bruker). Πρωτεΐνες ενδιαφέροντος εντοπίστηκαν χάρη στο λογισμικό μασκότ (Matrix Science, www.matrixscience.com). Στη συνέχεια, η βάση δεδομένων μη περιττό πρωτεΐνη NCBI ερευνήθηκε με τα θηλαστικά, όπως ταξινόμηση. Μόνο σημαντικές επιτυχίες, όπως ορίζεται από την ανάλυση μασκότ πιθανότητας (p & lt? 0.001), έγιναν δεκτές και οι βαθμολογίες Πρωτεΐνη & gt? 63 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

ανοσοαποτύπωσης και ανοσοϊστοχημείας

ανοσοκηλίδωση και ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκαν. με αντισώματα έναντι eEF2 (1/1000, Abcam), ή φωσφο-Thr56-eEF2 (1/1000, Abcam). φόρτωση Gel κανονικοποιήθηκε με αντίσωμα ακτίνης (Sigma-Aldrich). Αποκάλυψη έγινε με ένα αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση (Jackson ImmunoResearch) και ECL Plus (GE). Για ανοσοχημεία, 5 μm τομές κατεψυγμένου ξενομοσχευμένων όγκων HCT116 τοποθετήθηκαν σε τσουλήθρες για τα ανοσοχρώση. Πρωτεϊνική φωσφατάση (πρωτεϊνικής φωσφατάσης, λάμδα, Calbiochem) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για την επικύρωση της ειδικότητας του φωσφορυλιωμένου ανοσοχρώση. Μετά τη θεραπεία με φωσφατάση, τομές όγκων ανιχνεύθηκαν με αντι-eEF2 (1/50) ή αντι-Thr56 φωσφορυλιωμένο eEF2 (1/50) αντισωμάτων και ανοσοχρωματίστηκαν με αντι-κουνελιού Alexa 488 (Invitrogen).

eEF2 ανοσολογική δοκιμή

τα ποσά των κυκλοφορούντων αντισωμάτων που κατευθύνονται εναντίον φωσφορυλιωμένη Thr56 eEF2 προσδιορίστηκαν σε μια ειδική ανοσολογική δοκιμή. 96-φρεατίων (Reacti-Bind, Thermo Scientific) επικαλύφθηκαν όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου με 10 μg /ml ενός 12 αμινοξέων φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο eEF2. Η αλληλουχία φωσφοπεπτιδίου ήταν RAGETRFTDTRK, που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 50 έως 61 της πρωτεΐνης eEF2, με φωσφορυλίωση επί Thr56 (Eurogentec). Επίστρωση και τα βήματα μπλοκαρίσματος διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ELISA ρυθμιστικό επικάλυψης και ultrablock ELISA (Abd Serotec) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μειωμένα οροί (1/100 για ποντικούς και 1/200 για τον άνθρωπο) επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά την πλύση, ειδικό υβριδισμό μετρήθηκε με ένα υπεροξειδάση-συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού IgG (αραίωση 1/10 000, Jackson ImmunoResearch) και προσθήκη της 3,3 ‘, 5,5’-τετραμεθυλοβενζιδίνη (ΤΜΒ, Calbiochem). Οι πλάκες διαβάστηκαν στα 450 nm σε αναγνώστη μικροπλακός VictorX4.

Οι στατιστικές

αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσο ± s.e.m. Μαθητή

t

τεστ ANOVA test και χρησιμοποιήθηκαν ανάλογα με την περίπτωση. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 ή *** P & lt? 0.001 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική στα διάφορα πειράματα. Για κλινικά δεδομένα, υπο-πληθυσμοί των ασθενών ανιχνεύονται αυτόματα από τη λειτουργία των K-means clustering αλγόριθμο [29]? ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ των διακριτών προφίλ μέσα σε κάθε κατάσταση αξιολογήθηκαν σύμφωνα με ένα t-test συμπεριλαμβανομένης της διόρθωσης Benjamini-Hochberg FDR για πολλαπλότητα της δοκιμής [30].

Αποτελέσματα

SERPA Ταυτοποίηση eEF2 ΑΑΒ σε ο ορός του ποντίκια που φέρουν όγκους

για να μιμούνται το μικροπεριβάλλον του όγκου, τα ανθρώπινα παχέος HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα εκτέθηκαν σε υποξία (1% O

2) για 48 ώρες, ένα χρονικό διάστημα που απαιτείται για την έκφραση του προγράμματος γονιδίου υποξία στο επίπεδο της πρωτεΐνης και για την επίτευξη μιας νέας ισορροπίας ρυθμό πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Τα κύτταρα διατηρούνται υπό νορμοξικές συνθήκες (21% O

2) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι. Στη συνέχεια εφαρμόζεται το τεχνολογία SERPA να προσδιορίσει αντιγόνα όγκων υποξία-ειδικά (Σχήμα 1Α). HCT116 και ΗΤ29 λύματα πρώτα διαχωρίστηκαν σε γέλη με 2-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες. Συγκεντρωτικά οροί από έλεγχο ή ποντικούς που φέρουν όγκο (6 οροί ανά συνθήκη) στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για να αποκαλύψουν κηλίδες που αντιστοιχούν σε ανοσογόνες πρωτεΐνες. Διαφορική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με σύγκριση 4 διαφορετικές συνθήκες: προϊόντα λύσης από νορμοξικές και υποξικών κυττάρων διερευνήθηκαν με ορούς από ποντικούς που φέρουν όγκο (Εικόνα 1Β) έλεγχο και. Αυτή η ανάλυση μας επέτρεψε να απορρίψει δύο τύπους κηλίδων: (i) εκείνες που αντιστοιχούν σε πρωτείνες που αναγνωρίζονται από τα αντισώματα από ορούς ποντικών ελέγχου και (ii) αυτές που αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες που αναγνωρίζονται από αντισώματα από ποντικούς που φέρουν όγκο, αλλά παραλείποντας να εκφράζεται κάτω από υποξία. Παραμένοντας σημεία ενδιαφέροντος στη συνέχεια αποκόπηκαν από παρασκευαστική πηκτώματα, υπέστη πέψη με θρυψίνη και αναλύθηκε με MS (Σχήματα 2 και 3). Με το συνδυασμό δύο γραμμές του HCT116 και κυτταρικές ΗΤ29, βρήκαμε 17 πρωτεΐνες με ικανοποιητική βαθμολογίες Mascot (ρ & lt? 0.001) τα οποία αναγνωρίζονται από αντισώματα από ποντίκια που φέρουν όγκο, 4 υποξία ειδικές πρωτεΐνες και 13 που αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες που εκφράζονται τόσο κάτω από υποξικές και νορμοξικές συνθήκες (βλέπε κάτω πάνελ στα Σχήματα 2 και 3). Για το υπόλοιπο της μελέτης αυτής, αποφασίσαμε να εστιάσουμε στην υποξία-ειδικό αντιγόνο αυστηρά αντιδρούν με τον ορό των ποντικών που έφεραν όγκους και που προσδιορίζονται από τα κράτη μέλη με τη μεγαλύτερη βαθμολογία μασκότ, δηλαδή eEF2 ή ευκαρυωτικό παράγοντα επιμήκυνσης 2.

Α. Ροή εργασιών της διαδικασίας SERPA συμπεριλαμβανομένων διαχωρισμού 2DE-gel προϊόντων λύσης είτε από υποξικές ή νορμοξικά κύτταρα όγκου, μεταφορά μεμβράνης, ανοσοστύπωμα με τον ορό είτε από τον έλεγχο ή ποντίκια που φέρουν όγκους, και η ανίχνευση των κηλίδων του ενδιαφέροντος. B. μοτίβα Τυπικό ανοσοαποτύπωση που προκύπτουν από την επώαση του 2D-επιλυθεί προϊόντα λύσης των κυττάρων HCT116 εκτέθηκαν σε νορμοξία ή υποξία, με την υποδεικνυόμενη ορό ποντικού. Στα πάνελ πυθμένα, οι πρωτεΐνες των προϊόντων λύσεως επισημανθεί με Cy χρωστική (κόκκινο) και στερεώνονται αντισώματα ανιχνεύονται με ένα δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού (πράσινη κηλίδα)? βέλος δείχνει την παρουσία μιας πρωτεΐνης που ανιχνεύεται αποκλειστικά στα προϊόντα λύσης των υποξικών καρκινικών κυττάρων από αντισώματα από τον ορό των ποντικών που φέρουν όγκο.

Η

Χαρτογράφηση των κηλίδων του ενδιαφέροντος που προκύπτει από τη σύγκριση που περιγράφεται στο Σχήμα 1 και κατάλογο των προσδιορισμένων πρωτεϊνών (p & lt? 0.001) λαμβάνονται με τη χρήση λύματα των HCT116 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα

η

η χαρτογράφηση των σημείων ενδιαφέροντος που προκύπτει από τη σύγκριση που περιγράφεται στο σχήμα 1 και τον κατάλογο των προσδιορισμένων πρωτεϊνών (p & lt.? 0,001) που ελήφθη χρησιμοποιώντας λύματα ΗΤ29 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα.

η

Κατ ‘αρχάς, για να επικυρώσει τη φύση της πρωτεΐνης eEF2 παρόν στα 2D πηκτές, εμείς ανιχνεύθηκαν της μεμβράνης με ένα εμπορικά διαθέσιμο αντίσωμα αντι-eEF2 και βρήκε ότι το σήμα ανοσοαποτύπωμα συμφωνημένα τον εντοπισμό του τόπου που προσδιορίζονται από την ανάλυση SERPA (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, αυτό το πείραμα έδειξε ότι η κατανομή της πρωτεΐνης σε διαφορετικά ισοηλεκτρικά σημεία (Σχήμα 4Α και 4Β, άνω πλαίσιο). Στο πείραμα SERPA ωστόσο, ένα σημείο (το τρίτο σύμφωνα με το εύρος τιμής ΡΙ) ανοσογόνο (Σχήμα 4Β, μεσαίο πλαίσιο), γεγονός που υποδηλώνει έντονα ότι μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση θα μπορούσε να προσδώσει την ανοσογονικότητα.

A. Αντιπροσωπευτικά ανοσοκηλίδωση του 2D-διαχωρισμένα προϊόντα λύσης υποξικών κυττάρων HCT116 με ένα εμπορικό αντίσωμα έναντι eEF2. Οι πρωτεΐνες των προϊόντων λύσης επισημασμένου με Cy χρωστική (κόκκινο) και δευτερογενές αντίσωμα είναι συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (πράσινα σημεία). Θετικό σήμα λαμβάνεται για διάφορα σημεία του ίδιου μοριακού βάρους αλλά που διαφέρουν κατά την αξία ρΙ τους. B. Η σύγκριση των κηλίδων eEF2 ανιχνεύεται με ένα εμπορικό αντίσωμα έναντι συνολικού eEF2 (επάνω), ο ορός από ποντίκια που φέρουν όγκο (μέση) και ένα εμπορικό αντίσωμα έναντι φωσφο-Thr56 eEF2 (κάτω). Spot 4 (δεξιότερη spot) αντιστοιχεί στο μη φωσφορυλιωμένη μορφή eEF2 ενώ τα άλλα σημεία αντιστοιχούν σε πολυ-φωσφορυλιωμένες μορφές της πρωτεΐνης? σημείο 3 (δεύτερη θέση από τα δεξιά) αντιστοιχεί στην προνομιακή monophosphorylated μορφή eEF2 (σε Thr56).

Η

Η φωσφορυλίωση της Thr56 eEF2 μετά την υποξία στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος

Δεδομένου ότι η φωσφορυλίωση της eEF2 είναι γνωστό ότι εμφανίζεται σε απάντηση στην υποξία (που οδηγεί σε eEF2 απενεργοποίηση και τη σύλληψη της μετάφρασης πρωτεϊνών), εξετάσαμε την έκταση της φωσφορυλίωσης eEF2 για Thr56 προηγουμένως περιγράφεται ως η πρώτη και κύρια υπόλειμμα τροποποιήθηκε από μια φωσφορική ομάδα στην αλληλουχία eEF2 [31]. Re-ανίχνευση η μεμβράνη που χρησιμοποιείται για 2D SERPA επιβεβαίωσε ότι η κηλίδα που αναγνωρίζεται από τον ορό των ποντικών που φέρουν όγκο ήταν επίσης θετικά χρωματισμένων από εμπορικό αντίσωμα αντι-φωσφο-Thr56 eEF2 (Σχήμα 4Β, κάτω πάνελ). Επιβεβαιώσαμε επίσης σε συμβατικά κηλίδωση Western πειράματα ότι η φωσφορυλίωση eEF2 επί Thr56 ήταν σημαντικά αυξημένη σε υποξικά κύτταρα HCT116 (ρ & lt? 0,01) και ότι μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΗΤ29 (Σχήματα 5Α και 5Β). Επίσης, η έγχυση των κυττάρων HCT116 σε ποντικούς οδήγησε στην ανάπτυξη ενός όγκου με μια ισχυρή χρώση των φωσφο-Thr56 eEF2 επιβεβαιώνει την εμφάνιση αυτού του μετα-μεταφραστική τροποποίηση

in vivo

(Σχήμα 5C, άνω πλαίσιο). Η θεραπεία των τμημάτων όγκου με λάμδα φωσφατάση κατήργησε εντελώς τη χρώση που λαμβάνεται με ένα εμπορικό αντίσωμα αντι-φωσφο-eEF2 (Σχήμα 5C, κάτω πλαίσιο).

A. Εκπρόσωπος eEF2 και φωσφο-Thr56 eEF2 ανοσοαποτύπωση των HCT116 και ΗΤ29 καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες κάτω από υποξία (Hx) ή διατηρούνται σε φυσιολογική οξυγόνωση (Nx). Β Κανονικοποιημένη έκφραση φωσφο-Thr56 eEF2 στο ορθοξικές vs υποξική HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα? n = 3, ** ρ & lt? 0,01 C. Αντιπροσωπευτικά φωσφο-Thr56 eEF2 ανοσοχρώση τομών όγκων HCT116 σε απουσία (άνω) ή παρουσία (κάτω μέρος) του λάμδα φωσφατάσης? σημειώστε την πλήρη εξαφάνιση της φωσφορυλιωμένη μορφή της eEF2 κατά την αγωγή με τη φωσφατάση.

Η

Επικύρωση της φωσφο-Thr56 eEF2 ως ένας όγκος που σχετίζεται με αντιγόνο και των αντίστοιχων Aab ως βιοδεικτών του ποντικιού Ανάπτυξης Όγκου

για να διερευνηθεί περαιτέρω η ανοσογονικότητα του φωσφο-Thr56 eEF2, αναπτύξαμε μία δοκιμασία για την ανίχνευση της παρουσίας αντιδραστικών ΑΑΒ έναντι φωσφοπεπτιδίου από 12 αμινοξέα που πλευρίζουν Thr56, που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 50 έως 61 (Σχήματα 6Α). Εμείς επικυρωθεί η γραμμικότητα αυτής της ανοσοδοκιμασίας χρησιμοποιώντας την ίδια εμπορική αντίσωμα αντι-φωσφο-Thr56 eEF2 όπως περιγράφεται ανωτέρω (Σχήμα 6Β). Σε μία πρώτη σειρά πειραμάτων, χρησιμοποιήσαμε μια δεξαμενή 6 ορούς ποντικών που φέρουν μεγάλους όγκους (δηλαδή, 28 ημέρες μετά την εμφύτευση) και βρήκε ένα 10-φορές υψηλότερο από ό, τι όταν το σήμα χρησιμοποιώντας ορούς αναφοράς (Σχήμα 6C). Σε μία δεύτερη σειρά πειραμάτων, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη χρονικής πορείας για να καθοριστούν οι αλλαγές στο σήμα φωσφο-Thr56 eEF2 ανάλογα με την ανάπτυξη των όγκων HCT116. Οι οροί συλλέχθηκαν με οπισθοκογχική παρακέντηση σε ποντικούς κατά την ημέρα 0 και μετά από 7, 14 και 21 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων HCT116 όγκου? ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε παράλληλα με ηλεκτρονικό παχύμετρο (Σχήμα 6D). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 6Ε, το σήμα φωσφο-Thr56 eEF2 είχε ήδη σημαντικά αυξημένη κατά την ημέρα 7 (ρ & lt?. 0.05

vs

ημέρα 0), ενώ αυτή τη στιγμή, ο όγκος δεν ήταν ακόμη ανιχνεύσιμη (Εικ. 6D) . Τις ημέρες 14 και 21, η έκταση της σήματος φωσφο-Thr56 eEF2 αυξήθηκε περαιτέρω παράλληλα με την ανάπτυξη των όγκων HCT116 (Σχήματα 6d και 6Ε).

A. αλληλουχίες ανθρώπου και ποντικού αμινοξέων eEF2 στην περιοχή της Thr56. Τα 12 υπολείμματα που αντιστοιχούν στο συνθετικό πεπτίδιο (φωσφορυλιωμένη επί Thr56) που χρησιμοποιούνται στην ανοσοδοκιμασία μας (κόκκινο πλαίσιο)? σημειώστε την τέλεια ταυτότητα μεταξύ ποντικού και ανθρώπινες αλληλουχίες. B. Η ανίχνευση των εμπορικών αντι-φωσφο-Thr56 eEF2-αντισωμάτων χρησιμοποιώντας ανοσοδοκιμασία μας? διακεκομμένες γραμμές δείχνουν τη ζώνη εμπιστοσύνης 95% της γραμμικής παλινδρόμησης. C. Ανίχνευση αντι-φωσφο-Thr56 eEF2 ΑΑΒ στον ορό των ποντικών που φέρουν όγκο ελέγχου ή HCT116 (n = 3). *** P & lt? 0.001. Δ Χρονική πορεία της ανάπτυξης του όγκου HCT116 όπως προσδιορίζεται με μετρήσεις των διαμέτρων του όγκου (η = 7 ανά ομάδα). Ε Ανίχνευση των αντι-φωσφο-Thr56 eEF2 ΑΑΒ κατά τον προκαθορισμένο χρόνο της εξέλιξης HCT116 όγκου. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001 (n = 6-7 ανά ομάδα). Σημειώστε ότι κατά την ημέρα 7 μετά την εμφύτευση, οι όγκοι δεν είναι ανιχνεύσιμα (βλέπε πίνακα D), αλλά ένα θετικό σήμα ανιχνεύεται στην ανοσοδοκιμασία. ΣΤ Γράφημα αντιπροσωπεύει την ανίχνευση των αντι-φωσφο-Thr56 eEF2 ΑΑΒ στον ορό των ατόμων της ομάδας ελέγχου (n = 6) και οι ασθενείς με αδενωματώδεις πολύποδες (n = 14) ή καρκινώματος (n = 9). * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01. Της σημείωσης, K-means clustering εντόπισε δύο υποπληθυσμοί των ασθενών (βλέπε μαύρο και κόκκινο σύμβολα) μεταξύ των ατόμων που έχουν διαγνωστεί με αδενωματώδεις πολύποδες (P & lt? 0.001) και καρκίνωμα (Ρ & lt? 0,01)? το ίδιο διαμέρισμα παρατηρήθηκε σε 100 ανεξάρτητες διαδρομές μεταβάλλοντας την τυχαία αρχικοποίηση των K-means αλγόριθμο.

Η

Anti-φωσφο Thr56 eEF2 αυτοαντισώματα Identifiy Υπο-πληθυσμοί Ασθενείς με Colon αδενώματος και καρκινώματος

Εξετάσαμε επιτέλους τη δυνατότητα ανίχνευσης των αντι-φωσφο-eEF2 αντισώματα για να διακρίνουν τα θέματα ελέγχου και ασθενείς είτε με αδενωματώδεις πολύποδες του παχέος είτε cacinoma. Λόγω της ταυτότητας των αλληλουχιών μεταξύ ποντικού και ανθρώπου eEF2 στα κατάλοιπα Thr56 πλευρικές (βλέπε Εικόνα 6Α), χρησιμοποιήσαμε την ίδια ανοσοδοκιμασία για τους ασθενείς όπως αυτό που περιγράφεται παραπάνω για τα ποντίκια που φέρουν όγκο. Βρήκαμε ότι οι ασθενείς διαγνώστηκαν με αδενωματώδεις πολύποδες και καρκίνωμα έδειξαν αύξηση εις τον τίτλο φωσφο-Thr56 eEF2 ΑΑΒ (Ρ = 0,0015) σε σύγκριση με τους ασθενείς που προσδιορίζονται ως αρνητικός εξής κολονοσκόπηση (Σχήμα 6F). Επιπλέον, κατά τη χρήση των ομαδοποίηση κ-μέσων αλγόριθμος (29), δύο υπο-πληθυσμοί των ασθενών θα μπορούσαν να ταυτοποιηθούν μεταξύ των αδενωματώδεις πολύποδες (Ρ & lt? 0.001) και ομάδες καρκίνωμα (Ρ & lt? 0,01). (Βλέπε κόκκινα σύμβολα στην Εικόνα 6F)

Συζήτηση

Τα δύο κύρια ευρήματα της μελέτης αυτής είναι (i) ότι οι λογαριασμοί υποξία για την τροποποίηση του immunoproteome όπως αποδεικνύεται από την ανίχνευση των κυκλοφορούντων Aab στρέφεται κατά ΤΑΑ μη ανιχνεύσιμη σε καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό ορθοξικές συνθήκες, και (ii) η υποξία μεσολάβηση διέγερση των λογαριασμών φωσφορυλίωσης eEF2 για την ανάπτυξη μιας πρώιμης απόκρισης ΑΑΒ να παχέος ανάπτυξη καρκίνου.

ΑΑΒ είναι σήμερα αναγνωρίζονται ως δυνητικοί βιοδείκτες καρκίνου και SERPA αναπτύχθηκε για να τα ανιχνεύσουμε από τον ορό δείγματα μέσα από την αποτύπωση των 2DE διαχωρισμένων κυττάρων του όγκου λύματα. Η τεχνολογία SERPA, σε αντίθεση με SEREX και εμφάνιση φάγου, επιτρέπει την ανίχνευση των πρωτεϊνών που έχουν υποστεί μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Ωστόσο, η πρωτεώματος σε προϊόντα λύσης που απομονώνονται από κύτταρα όγκου καλλιεργούνται σε ένα συμβατικό επωαστήρα υπό φυσιολογική οξυγόνωση είναι πολύ από την εκπροσώπηση του πρωτεώματος των καρκινικών κυττάρων σε τους

in vivo

μικροπεριβάλλον. Ειδικότερα, η υποξία είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα πολλών καρκίνων που προκύπτει από ανισορροπία μεταξύ O

2 κατανάλωσης και O

2 διαθεσιμότητα σε φτωχά αγγειοποιημένου όγκους. Η επίδραση της υποξίας επί του κυττάρου όγκου μεταγραφικό και πρωτεώματος είναι διπλός: ενώ η παγκόσμια μεταφραστικό μηχανισμό επιβραδύνεται σε ανταλλακτικά ενέργεια, ειδικά προγράμματα γονίδιο ρυθμίζεται από βασικούς παράγοντες μεταγραφής, όπως η οικογένεια HIF, επάγονται να επιτρέπει την προσαρμογή των κυττάρων του όγκου [6] . Είναι σημαντικό ότι, σε επιθηλιακούς καρκίνους όπως ο καρκίνος του παχέος, υποξία Προτείνεται επίσης να εμφανιστούν νωρίς κατά τη διάρκεια καρκινογένεσης. Τα μεταλλαγμένα κύτταρα είναι πράγματι αρχικά διαχωρίζονται από τα υποκείμενα αιμοφόρα αγγεία από την ακόμα ανέπαφα βασική μεμβράνη: αυτό οδηγεί στην ανάπτυξη των προκακοήθων βλαβών σε ανάγγειο περιοχές και με κατεύθυνση προς το αντίθετο, λιγότερο περιορισμένη από περιοχές [11]

. η παρούσα μελέτη, ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται δύο αναλυτικές φίλτρα για να επιλέξετε δυναμικό ΤΑΑ για περαιτέρω επικύρωση. Πρώτον, αποκλείσαμε κηλίδες εντοπίζονται 2D μεμβράνες μετά ανοσοκηλίδωση με ορό που συλλέχθηκε από ποντικούς ελέγχου. Δεύτερον, δεν θεώρησε για τη συλλογή των πρωτεϊνών που ανιχνεύεται από τον ορό ποντικών που φέρουν όγκο, αλλά εκφράζεται μόνο σε νορμοξικά κύτταρα όγκου. Η στρατηγική αυτή επέτρεψε να μειωθεί ο αριθμός των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων και να ευνοήσουν την ανίχνευση ειδικών ΤΑΑ όπως απαντώνται στην

in vivo

συνθήκες. Χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (Ρ53-άγριου τύπου HCT116 και Ρ53-μεταλλαγμένο ΗΤ29) για να αυξηθεί περαιτέρω η ποικιλομορφία του πρωτεώματος, και ιδίως του immunoproteome. Αυτή η στρατηγική οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός συνολικά 17 υποθετικών ΤΑΑ, 13 εκφράζεται υπό τόσο υποξία και νορμοξία και 4 να εκφράζεται αποκλειστικά κάτω από υποξία (βλέπε σχήματα 2 και 3). Μεταξύ των τελευταίων, εστιάσαμε στο ευκαρυωτικό παράγοντα επιμήκυνσης μετάφρασης 2 (eEF2), ένα βασικό παράγοντα για την ριβοσωμική μετάφραση του mRNA. Η υποξία είναι γνωστό ότι προάγει eEF2 αδρανοποίηση για να εμποδίσει το υψηλό διαδικασία σύνθεσης πρωτεΐνης που καταναλώνουν ενέργεια προκειμένου να αποφεύγεται ενέργειας [9]. Η αδρανοποίηση του eEF2 απορρέει από τη φωσφορυλίωση της στην Thr56 από τον ευκαρυωτικό παράγοντα επιμήκυνσης 2 κινάσης (eEF2K) μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών που περιλαμβάνουν mTOR, ΑΜΡΚ και PHD2 [32] – [34]. Είμαστε πραγματικά χαρακτήρισε αυτήν την φωσφορυλιωμένη μορφή της eEF2 ως ανοσογόνος πρωτεΐνη. Αν και αρκετές θέσεις φωσφορυλίωσης που αναφέρθηκαν για eEF2 όπως αποδεικνύεται από τα τέσσερα σημεία με διακριτή ρΙ ανιχνεύεται από ένα σύνολο αντισωμάτων eEF2, η θέση της θετικής σημείο στο SERPA επισήμανε φωσφο-Thr56 eEF2 ως seroreactive οντότητα. Η δεύτερη θέση από τα δεξιά είναι πράγματι συμβατό με την προτιμώμενη θέση φωσφορυλίωσης προηγουμένως αναφερθεί ότι είναι Thr56 σε κινητική μελέτη για τη ρύθμιση των eEF2 [31]. Στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ενός ανοσοπροσδιορισμού με ένα τροποποιημένο πεπτίδιο φωσφορυλιωμένο επί του υπολείμματος Thr56, ότι αυτή η περιοχή αντιπροσώπευε την ανοσογονικότητα του eEF2 όπως ανιχνεύεται στη μελέτη SERPA μας. Χρησιμοποιώντας αυτή τη δοκιμασία, βρήκαμε ότι η αντι-φωσφο-Thr56 eEF2 ΑΑΒ ήταν ανιχνεύσιμα στον ορό του ποντικιού πριν όγκων θα μπορούσε να είναι προφανής. Επίσης, βρήκαμε ότι αυτά τα ΑΑΒ μπορούσε να ανιχνευθεί σε ανθρώπους με αδενωματώδεις πολύποδες και του παχέος εντέρου.