Αφηρημένο

Ιστορικό

Επιγενετική ορίζεται ως κληρονομικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που δεν βασίζονται σε αλλαγές στο η αλληλουχία DNA. Μετα-μεταφραστική τροποποίηση των πρωτεϊνών ιστόνης είναι ένας κύριος μηχανισμός επιγενετική ρύθμιση. Η PRK1 κινάση (πρωτεϊνική κινάση C σχετίζονται κινάση 1, επίσης γνωστή ως PKN1) φωσφορυλιώνει ιστόνης Η3 στη θρεονίνη 11 και εμπλέκεται στη ρύθμιση του ανδρογόνου σηματοδότηση υποδοχέα. Έτσι, έχει αναγνωριστεί ως στόχο μυθιστόρημα ναρκωτικά, αλλά λίγα είναι γνωστά για τους αναστολείς PRK1 και τις συνέπειες της αναστολής της.

Μεθοδολογία /Principal εύρεση

Χρησιμοποιώντας μια εστιασμένη προσέγγιση ελέγχου της βιβλιοθήκης, εντοπίσαμε το κλινική υποψήφιος lestaurtinib (επίσης γνωστή ως CEP-701) ως ένα νέο αναστολέα του PRK1. Με βάση ένα δημιουργούνται 3D μοντέλο της κινάσης PRK1 χρησιμοποιώντας το ομόλογο ΡΚΟ-Θ ​​(πρωτεϊνική κινάση C θήτα) πρωτεΐνη ως πρότυπο, το κλειδί αλληλεπίδραση του lestaurtinib με PRK1 αναλύθηκε μέσω μελετών μοριακής σύνδεσης. Περαιτέρω, οι επιδράσεις στην φωσφορυλίωση θρεονίνη ιστόνης Η3 και έκφραση γονιδίου εξαρτώμενων από ανδρογόνα αξιολογήθηκε σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Lestaurtinib αναστέλλει PRK1 πολύ ισχυρά in vitro και in vivo. Εφαρμόζεται σε κυτταρική καλλιέργεια αναστέλλει φωσφορυλίωση θρεονίνη ιστόνης Η3 και έκφραση γονιδίου εξαρτώμενων από ανδρογόνα, ένα χαρακτηριστικό που δεν έχει γίνει γνωστό ακόμη. Έτσι, τα ευρήματά μας έχουν επιπτώσεις τόσο για την κατανόηση της κλινικής δραστηριότητας των lestaurtinib, καθώς και για τις μελλοντικές αναστολείς PRK1

Παράθεση:. Köhler J, Erlenkamp G, Eberlin Α, Rumpf Τ, Slynko Ι, Metzger E, et al . (2012) Lestaurtinib Αναστέλλει ιστόνης φωσφορυλίωση και ανδρογόνα γονιδίου που εξαρτάται από την έκφραση στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (4): e34973. doi: 10.1371 /journal.pone.0034973

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9η Φεβρουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 10 Μάρτη 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Köhler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία χρηματοδότηση ή υποστήριξη στην έκθεση

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Επιγενετική ορίζεται ως κληρονομείται αλλαγές στη γονιδιακή ρύθμιση, ότι δεν καθορίζονται από μεταβολές στο γονιδίωμα [1]. Επιγενετικές διεργασίες έχουν σαφείς επιπτώσεις για την παθολογία της νόσου στον άνθρωπο [2], και ως εκ τούτου νέους αναστολείς αυτοί είναι εξαιρετικά ενδιαφέροντα για την ανακάλυψη φαρμάκων [3]. Μεταξύ ποικιλόμορφη ιστόνης τροποποιήσεις [4], η φωσφορυλίωση των ιστονών δεν είναι τόσο καλά μελετηθεί, ιδίως όσον αφορά την ανακάλυψη φαρμάκων. Οι περισσότερες αναφορές είναι σχετικά Aurora κινάσες οι οποίες μάλλον εμπλέκονται στον έλεγχο της μίτωσης [5]. Μια άλλη κινάση που εμπλέκονται στην μίτωση που ενεργεί για ιστόνες είναι haspin [6], [7]. Οι κινάσες PKC-betaI [8] και PRK1

α (ονομάζεται επίσης PKN1) [9] παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση μεταγραφής γονιδίου [10] κατά τη διάρκεια του ανδρογόνου σηματοδότηση υποδοχέα και θεωρείται PRK1 να είναι ένα υποσχόμενο στόχο για την θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Στην αναζήτηση νέων αναστολέων PRK1 πραγματοποιήσαμε μια επικεντρωμένη διαλογή βιβλιοθήκη να εντοπίσει νέες επιτυχίες και την αξιολόγηση αναστολείς κινάσης αναφοράς σε σύγκριση. Εντοπίσαμε την κλινική υποψήφιο lestaurtinib (επίσης γνωστή ως CEP-701) ως ένα νέο ισχυρός αναστολέας της επιγενετικής PRK1 κινάσης.

Αποτελέσματα

Εστιασμένη Βιβλιοθήκη Screening

Ως εκκίνησης σημείο για την αναζήτηση νέων αναστολέων PRK1, χρησιμοποιήσαμε την βιβλιοθήκη Biomol κινάσης και φωσφατάσης αναστολέα (n = 84, βλέπε σχήμα S4, S5 και S6) για αρχική διαλογή στα 100 ηΜ συγκέντρωση κατωφλίου. Αυτή η διαλογή προσδιορίζονται μόνο ο bisindolyl-μηλεϊμίδιο (ΒΙΜ) Ro318220 και ο σχετίζονται δομικά σταυροσπορίνη ως επιτυχίες (σχετική σύνδεση περισσότερο από 40% σε σταυροσπορίνη στα 100 ηΜ) (βλέπε Σχήμα 1 και Πίνακας 1). Ro318220 ήταν ήδη γνωστό ότι αναστέλλουν PRK1 [9]. Έχουμε περαιτέρω διαλογή 200 ένωση in-house βιβλιοθήκη που διατίθενται στο εμπόριο και γενικά αναστολείς κινάσης, αντίστοιχα. υποψηφίους αναστολέα. Εκείνες που περιλαμβάνονται στάνταρ αναστολείς κινάσης όπως η ερλοτινίμπη, λαπατινίμπη, βαταλανίμπη, SB203580 και SB216763 (βλέπε Εικόνα 1), τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί στο προφίλ διαφορετικές κινάσες πριν. Οι αναστολείς K252a και lestaurtinib και επιπλέον SB216763 (δεδομένα αλληλεπίδρασης δεν παρουσιάζονται) επιλέχθηκαν για τη μελέτη σύνδεσης με βάση σχετικά με τις διαρθρωτικές ομοιότητάς τους με σταυροσπορίνη και Ro318220. Τα ανάλογα σταυροσπορίνη όλα δείχνουν ένα παρόμοιο μοντέλο δέσμευσης. Κ252 αναστέλλει trkA, VEGFR2 και MLK1 στο διψήφιο nM περιοχή και είναι γνωστό ότι έχουν μια επιλεκτικότητα πάνω από PKC περίπου 10-20fold [11]. Lestaurtinib αναφέρθηκε ότι αναστέλλει trkA, Β και C [12], JAK [13] και FLT3. Λόγω της αναστολής της FLT3, είναι μελετήθηκε κλινικά σε μυελοΐνωση και AML [14], [15]. Lestaurtinib και K252a δεσμεύονται και οι δύο με PRK1 με υψηλή συγγένεια (βλέπε Πίνακα 1). Lestaurtinib επιλέχθηκε για περαιτέρω βιολογική αξιολόγηση στη μελέτη μας οφείλεται σε προχωρημένη κατάσταση της ανάπτυξης της και έδειξαν αναστολή του γονιδίου των ανδρογόνων ανταποκρίνεται μεταγραφή του γονιδίου.

Η

Μοριακή Μοντελοποίηση

Ένα μοντέλο του ανθρώπινου πρωτεΐνης C που σχετίζονται με την κινάση 1 (PRK1) δημιουργήθηκε με μοντελοποίηση ομολογίας για τον εξορθολογισμό τα ευρήματά μας για περαιτέρω μελέτες βελτιστοποίησης. Το μοντέλο βασίζεται στην ομοιότητα των PRK1 να θήτα C πρωτεϊνικής κινάσης (ΡΚΟ-Θ) και χρησιμοποιήθηκε για μελέτες σύνδεσης. Δεδομένου ότι οι διαθέσιμες κρυσταλλικές δομές της PKC υποτύπων σε σύμπλεγμα με αναστολείς εμφανίζουν όλες τις ενεργή διαμόρφωση κινάση, το μοντέλο PRK1 αντιπροσωπεύει επίσης την ενεργό διαμόρφωση με την κλασική DFG-in μοτίβο (Σχήμα 2) [16]. Οι 84 ενώσεις της βιβλιοθήκης αναστολέα κινάσης Biomol, οι οποίες δοκιμάστηκαν στη δοκιμασία in-vitro, ήταν αγκυροβολημένο στο θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ της PRK1. Χρησιμοποιήσαμε τρεις διαφορετικές μεθόδους σύνδεσης (GOLD [17], γλιστράει [18] και ParaDockS [19]) και πέντε λειτουργίες διαφορετικές βαθμολόγησης (ChemScore, GoldScore, GlideScore, ParaDockS π-Score και το σκορ AMBER GBSA [20], [21]) . Συνολικά, 63 ενώσεις θα μπορούσαν να ελλιμενίζεται επιτυχώς εντός του θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ. Σε γενικές γραμμές, οι διαφορετικές μέθοδοι σύνδεσης απέδωσε παρόμοια αποτελέσματα, ακόμη και αν η κατάταξη των ενώσεων βρέθηκε να είναι διαφορετικός (Πίνακας S1). Οι δύο δραστικούς αναστολείς της από την ένωση συλλογή Biomol, σταυροσπορίνη και Ro318220, ήταν κορυφαία από ορισμένες από τις λειτουργίες βαθμολόγησης. Γενικά, σε μελέτες σύνδεσης και εικονικής διαλογής καλύτερη διάκριση μεταξύ δραστικών και δολώματα παρατηρείται με τη χρήση ενός συναινετική βαθμολογία βασίζεται σε μια ποικιλία διαφορετικών μεθόδων βαθμολόγησης [22], [23]. Στην παρούσα μελέτη, υπολογίζεται επίσης μια συναινετική βαθμολογία χρησιμοποιώντας τις πέντε κανονικοποιημένων λειτουργίες βαθμολόγησης Chemscore, Goldscore, Glidescore, ParaDockS π-σκορ και βαθμολογία GBSA. Χρησιμοποιώντας τη συναίνεση βαθμολόγησης, μια σαφής διάκριση μεταξύ της υψηλής δραστικότητας αναστολέων σταυροσπορίνη (Σχολίων 9.23) και θα μπορούσε να ληφθεί Ro318220 (Σχολίων 9,51) και οι ανενεργές ενώσεις (συμπεριλαμβανομένων των ανενεργών αναστολείς κινάσης που φαίνεται στο Σχήμα 1). Το μόνο μόριο το οποίο έδωσε ένα παρόμοιο υψηλό σκορ ήταν η σχετική δισινδολυλομηλεϊμίδης παράγωγο 31 (Αποτέλεσμα του 8,84, Πίνακας S1, Εικόνα S5), οι οποίες δεν έδειξαν οποιαδήποτε in-vitro δραστικότητα κάτω των 100 ηΜ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η μοριακή επιφάνεια του θύλακα σύνδεσης εμφανίζεται. Εκτός από τους δεσμούς υδρογόνου με την περιοχή άρθρωσης, η πρωτονιωμένη αμινομάδα της σταυροσπορίνη δωρίζει δεσμούς υδρογόνου (εμφανίζεται ως πορτοκαλί διακεκομμένες γραμμές) με Asp744 και συντηρημένο μόριο νερού (φαίνεται με κόκκινο χρώμα).

Η

Η διάταξη σύνδεσης του σταυροσπορίνης στην ενεργό θέση του PRK1 δείχνει ότι ο συνδετήρας είναι εντελώς θαμμένος στο θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ (Σχήμα 2). Το πιο σημαντικό, η λακτάμη και μια μαλεϊμιδο ομάδες σταυροσπορίνη και Ro318220, αντίστοιχα, σχηματίζουν δύο δεσμούς υδρογόνου με Glu696 και Ser698, τα οποία είναι μέρος της περιοχής άρθρωσης του PRK1 (Σχήμα 3Α και 3D). Οι Van der-Waals-αλληλεπιδράσεις που παρατηρήθηκαν με τη Met695 υπόλειμμα φύλακα, καθώς και με Val629, Phe626, Leu747, και Phe904, αντίστοιχα. Επιπλέον, μπορεί να παρατηρηθεί δεσμούς υδρογόνου μεταξύ της πρωτονιωμένης αμινομάδας σταυροσπορίνης, καθώς και η ομάδα θειουρίας του Ro318220 και Asp744. Η αμινομάδα της σταυροσπορίνης εμπλέκεται επίσης σε ένα δεσμό υδρογόνου με ένα μόριο νερού διατηρημένη και τη σπονδυλική στήλη CO του Asp744.

Κοινές αλληλεπιδράσεις των αναστολέων είναι δεσμούς υδρογόνου περιλαμβάνουν Glu696 και Ser698 της περιοχής άρθρωσης, και van- der-Waals αλληλεπιδράσεις με το φύλακα υπόλειμμα Met695, καθώς και με Val629, Phe626, Leu747, και Phe904. Επιπλέον, ορισμένα από τα αναστολέων αλληλεπιδρούν με Asp744, Asn745 και μία διατηρημένη μόριο νερού (κόκκινη σφαίρα) κοντά στην Mg

2+ θέση πρόσδεσης της κινάσης. Η ραχοκοκαλιά εμφανίζεται ως μωβ κορδέλα. Μόνο οι σχετικές αμινοξέα που εμφανίζονται. Οι δεσμοί υδρογόνου εμφανίζονται σαν διακεκομμένες χρωματιστές γραμμές πορτοκαλί.

Η

Η ανάλυση των πόζες σύνδεσης των Κ252 και lestaurtinib έδειξαν ότι και οι δύο ενώσεις αλληλεπιδρούν με τον ίδιο τρόπο με δεσμευτική η ΑΤΡ τσέπες όπως σταυροσπορίνη (Σχήμα 3Β και 3C ). Εκτός από την αλληλεπίδραση με την περιοχή άρθρωσης, τα πολικά υποκατάστατα κατά του συστήματος δακτυλίου τετραϋδροφουρανίου αλληλεπιδρούν με ένα μόριο νερού διατηρημένη δεσμευμένο στο Asp744 και Asn745.

Cellular Δοκιμή

κατόπιν αναλύθηκε η επίδραση του lestaurtinib επί ανδρογόνο αποκρίνεται καρκίνος του προστάτη LNCaP κύτταρα (βλέπε Σχήμα 4) [24]. Ένα αποτέλεσμα επί ανδρογόνων μεσολαβούμενη σηματοδότηση υποδοχέα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης mRNA αρκετών γονιδίων στόχων υποδοχέα που είναι γνωστός ανδρογόνων. μπλοκ Lestaurtinib η έκφραση διαμεμβρανικών πρωτεασών, σερίνη 2 (

TMPRSS2)

[25], ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας-1 (

IGF1-R27)

[25], υποδοχέα χημειοκίνης CXC 4 (

CXCR429)

[26], πρωτεΐνη ομοιοκυτίου Nkx-3.1 (

NKX3.1)

[27], αρσενικό γεννητικών κυττάρων που σχετίζονται με την κινάση

(MAK30)

[28] , μυο ινοσάρκωμα ογκογονίδιο ομόλογο (

MAF)

[

29

], υποοικογένεια πυρηνικών υποδοχέων 4, ομάδα Α, στέλεχος 1 (

N4A1)

[29], Gene ρυθμίζονται ο καρκίνος του μαστού Ι

(GREB1)

[30] και ΡΚ506 συνδετική πρωτεΐνη 5 (

FKBP5)

[31] σε 5 μΜ αλλά δεν μειώνει την έκφραση του ανεξάρτητου από ανδρογόνο αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάση (

GAPDH)

γονίδιο [31]. Στην ίδια περιοχή της συγκέντρωσης, lestaurtinib προκάλεσε hypophosphorylation σε ιστόνης Η3 θρεονίνη 11 (Σχήμα S7).

Η έκφραση των γονιδίων-στόχων των υποδοχέων των ανδρογόνων

TMPRSS2

,

IGF1-R

,

NKX3.1

,

CXCR4

,

MAK

,

MAF

,

N4A1

,

GREB1

και

FKBP5

μετράται με qRT-PCR σε ανδρογόνων (R1881) διέγειρε τα LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη μειώνεται με την κατεργασία με lestaurtinib (τελική συγκέντρωση 5 μΜ). Η έκφραση mRNA του

GAPDH

γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή + SD (η = 5). P-value: ns = μη σημαντική? * = & Lt? 0,05? ** & Lt? 0,01? *** & Lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

τροποποιήσεις ιστονών έχουν γίνει το επίκεντρο των προσπαθειών ανακάλυψη φαρμάκων. Αναστολείς των ενζύμων που καθιερώνουν τις εν λόγω τροποποιήσεις είναι επίσης πολύτιμα εργαλεία για την ανίχνευση οδών σηματοδότησης. Έχουμε προσδιορίσει την κλινική υποψήφια lestaurtinib ως αναστολέας της κινάσης PRK1 που επηρεάζει επιγενετική ρύθμιση και ανδρογόνων σηματοδότηση του υποδοχέα. Αυτή η νέα τρόπος δράσης των lestaurtinib δεν έχει γίνει γνωστή μέχρι τώρα και θα μπορούσε να είναι σημαντικό να κατανοήσουμε τη δραστηριότητά του σε κλινικό περιβάλλον. Οι δομικές ομοιότητες των lestaurtinib σε σύγκριση με σταυροσπορίνη καταστήσει δυνατή ότι άλλες κινάσες από PRK1 μπορεί να συνεισφέρει στις παρατηρούμενες γονίδιο ρυθμιστικές επιδράσεις σε κύτταρα LNCaP. Παρ ‘όλα αυτά, είναι πολύ σημαντικό να lestaurtinib έχει επίδραση στην επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών και μειώνει εξαρτώμενη από ανδρογόνα γονιδιακή έκφραση σημαντικά σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. θα πρέπει να ληφθεί Το γεγονός αυτό υπόψη για μελλοντικές αξιολογήσεις σε κλινικό περιβάλλον.

Εκτός από τις in vivo επιδράσεις της lestaurtinib, ο προσδιορισμός των lestaurtinib και Κ252 & ως νέων αναστολέων PRK1 και την έλλειψη αναστολής των καθιερωμένων αναστολείς κινάσης με ικριώματα όπως ανιλινοκιναζολίνες, anilinophthalazines ή διαρυλιμιδαζόλες παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για το σχεδιασμό περαιτέρω και πιο εκλεκτικοί αναστολείς PRK1 ως δυνητικοί θεραπευτικοί παράγοντες για τους καρκίνους ανδρογόνο-εξαρτώμενη.

Υλικά και Μέθοδοι

Δοκιμασία κινάσης

αναστολείς κινάσης αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Lestaurtinib) και Biomol (Ro318220) και χρησιμοποιήθηκαν όπως λήφθηκαν. Η καθαρότητα ήταν & gt? 93% (w /w) σε όλες τις περιπτώσεις όπως υποδεικνύεται από τον προμηθευτή. διαλογή αναστολέα διεξήχθη με τη LanthaScreen ™ Eu Κινάσης Δέσμευσης κιτ δοκιμασίας (Invitrogen) με τελικές συγκεντρώσεις κατά τον προσδιορισμό 5 ηΜ για PRK1 (Proqinase, Freiburg), 2 ηΜ LanthaScreen Ευ-αντι-GST αντισωμάτων (Invitrogen) και 10 ηΜ Κινάσης Tracer 236 (Invitrogen). Η δοκιμασία διεξήχθη σε πλάκες μικροτίτλου 384 φρεατίων (Perkin Elmer, Rodgau). Ο τελικός όγκος δοκιμασίας ήταν 15 μί. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με EnVision 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer, Rodgau, διέγερση: 340 nm, 1

ου εκπομπής: 665 nm, 2

ου εκπομπής: 615 nm, Delay Time 100 μs, Χρόνος Ολοκλήρωσης 200 μs). Η βιβλιοθήκη αναστολέας της κινάσης αγοράστηκε από την Biomol (ακαδημαϊκό μέγεθος, n = 84 – πρώην CAT # 2831A, Σχήμα S4, S5, S6). IC

50 προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν τρεις ανεξάρτητες φορές, το καθένα εις τριπλούν.

Υπολογιστικές Μέθοδοι

υπολογισμοί Al0l πραγματοποιήθηκαν σε ένα Pentium IV 2.2 GHz με βάση cluster Linux. Δεδομένου ότι η κρυσταλλική δομή του ανθρώπινου κινάσης PRK1 (UniProt Q16512 εισόδου) δεν είναι γνωστή, ένα μοντέλο ομολογίας παρήχθη. Μια αναζήτηση BLASTP [32] εκτελέστηκε για την ανθρώπινη αλληλουχία PRK1 αμινοξέων. Η υψηλότερη ομοιότητα βρέθηκε για το σχετικό PKCtheta κινάσης. Η συνολική ταυτότητα αλληλουχίας μεταξύ της ανθρώπινης αλληλουχίας PRK1 και την αλληλουχία που προέρχεται από ΡΚΟ-Θ ​​είναι 49% με μόνο μικρά κενά ή ενθέσεις στην στοιχισμένη περιοχή. Η ευθυγράμμιση αλληλουχίας έγινε με ClustalW [33] (Εικόνα S1). Το μοντέλο δημιουργήθηκε με το μοντελιστής πρόγραμμα χρησιμοποιώντας τις συντεταγμένες της δομής με ακτίνες Χ PKC-Θ 2jed (Ψήφισμα 2.32 α) στην ενεργό διαμόρφωση. Η υπέρθεση του μοντέλου PRK1 και τη δομή ΡΚΟ-Θ ​​ακτίνων Χ απέδωσε μια τιμή RMSD 0,73 Α για τα άτομα του σκελετού που απεικονίζει την υψηλή δομική ομοιότητα των δύο κινασών. Η στερεοχημική ποιότητα του προκύπτοντος μοντέλου PRK1 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα PROCHECK [34]. άτομα υδρογόνου και AMBER μερική επιβαρύνσεις είχαν ανατεθεί. Το μοντέλο ήταν ενέργειας ελαχιστοποιείται χρησιμοποιώντας το πεδίο ισχύος ΠΟΡΤΟΚΑΛΙ [35]. Η βελτίωση οδήγησε σε ένα μοντέλο με εξαιρετική στερεοχημική ποιότητα με 90,1% των τιμών γωνίας φ και psi στις πιο μειονεκτικές περιφέρειες, και 8,5% σε επιπλέον επιτρεπόμενες περιοχές (Εικόνα S2). Κανένα υπόλειμμα στο μοντέλο βρίσκεται στην αρθεί περιοχή.

ρίζας σύνδεσης

Χρησιμοποιήσαμε τρία διαφορετικά προγράμματα σύνδεσης (GOLD 4.1 [17], γλιστράει [18] και ParaDockS [19]) για να δέσει όλα τα μόρια στην θέση δέσμευσης PRK1 ΑΤΡ. Για όλα τα docking τρέχει χρησιμοποιήθηκαν οι προεπιλεγμένες ρυθμίσεις του προγράμματος. Η θέση σύνδεσης για PRK1 ορίστηκε σε Glu696 με ακτίνα 15 Å καλύπτει το θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ. Μία συντηρημένη μόριο νερού που παρατηρείται στις δομές ακτίνων-Χ του PKCbeta και PKCtheta θεωρήθηκε να είναι μέρος της πρωτεΐνης. Goldscore, Chemscore, Glidescore, ParaDockS π-Score και AMBER GBSA [20], [35] βαθμολογίας επελέγησαν ως λειτουργίες γυμναστήριο. Για κάθε μόριο, διεξήχθησαν 30 τρεξίματα σύνδεσης. Τα προκύπτοντα διαλύματα συγκεντρωμένα επί τη βάσει των τιμών RMSD βαρύ άτομο (1 Α). Πρώτον, ελέγξαμε αν τα προγράμματα σύνδεσης είναι σε θέση να αναπαράγει την λειτουργία δέσμευσης των δεσμευμένων συνδετών NVP-XAA228, Biomol 33 (Ro318220) και σταυροσπορίνη όπως παρατηρείται στις δομές ακτίνων Χ του ΡΚΟ-Θ ​​και PKC-βήτα, αντίστοιχα ( ΠΣΠ κωδικούς 2jed.pdb, 1xjd.pdb [36] και 1i0e.pdb [37]). Υψηλότερη ακρίβεια λήφθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα GOLD και Goldscore ως συνάρτηση καταλληλότητας. Οι τιμές RMSD μεταξύ του κορυφαία λύση σύνδεσης Goldscore και την κρυσταλλική δομή των αναστολέων είναι 0.78 Å, 0.71 Å και 0.49 Å (βαρέα άτομα) αντίστοιχα, γεγονός που αποδεικνύει τη χρησιμότητα των εφαρμοζόμενων προγραμμάτων σύνδεσης για την αναπαραγωγή των πειραματικά καθορίζεται δομές της κινάσης συμπλέγματα αναστολέα.

προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής

Η σταθερότητα των παράγωγων συγκροτήματα PRK1-αναστολέα εξετάστηκε με τη βοήθεια της μοριακής δυναμικής (MD) προσομοιώσεις. Το πιο ενεργό σταυροσπορίνη αναστολέα χρησιμοποιήθηκε για αυτήν την εξομοίωση. MD προσομοιώσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ΠΟΡΤΟΚΑΛΙ 10 και το πεδίο AMBER 1999 ισχύει [38], [39]. Οι παράμετροι πεδία δύναμης συνδέτη ελήφθησαν από το γενικό πεδίο δυνάμεων Amber (καμάκι), ενώ AM1 ESP ατομικής μερική επιβαρύνσεις είχαν διατεθεί για τον αναστολέα. Τα συγκροτήματα ήταν εμποτισμένο σε ένα κουτί από τα μόρια του νερού TIP3P με ένα περιθώριο 10 Α. Πριν από τις ελεύθερες προσομοιώσεις MD, δύο στάδια της χαλάρωσης διεξήχθησαν? στο πρώτο βήμα, κρατήσαμε την πρωτεΐνη σταθερό με περιορισμό των 500 kcal mol

-1 α

-1. Στο δεύτερο στάδιο, οι δομές αναστολέας ήταν χαλαρή για 0,5 ps, κατά την οποία τα άτομα πρωτεΐνης περιορίζεται στο X-ray συντονίζει με σταθερά ισχύος 500 kcal mol

-1 α

-1. Στο τελικό στάδιο, όλα τα συστήματα συγκράτησης απομακρύνθηκαν και τα σύμπλοκα χαλαρή για 1 ps. Η θερμοκρασία του συστήματος χαλαρή στη συνέχεια εξισορροπήθηκε σε 300 Κ έως 20 ps της MD χρησιμοποιώντας 2 fs χρονικά βήματα. Ένας σταθερός όγκος περιοδική σύνορο ορίστηκε να ισορροπήσει τη θερμοκρασία του συστήματος από τη δυναμική Langevin [40] χρησιμοποιώντας ένα συχνότητα σύγκρουσης των 10 ps

-1 και ένα όριο ταχύτητας 5 μονάδες θερμοκρασίας. Κατά τη διάρκεια της ρουτίνας εξισορρόπησης της θερμοκρασίας, το συγκρότημα στο πλαίσιο διαλύτης συγκρατημένη στις αρχικές συντεταγμένες με ένα αδύναμο σταθερή δύναμη 10 kcal mol

-1 α

-1. Οι τελικές συντεταγμένες της ρουτίνας εξισορρόπησης θερμοκρασίας (μετά από 20 ps) στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για να ολοκληρώσει μια 1 ns δυναμική ρουτίνα μοριακό χρησιμοποιώντας 2 fs χρονικά βήματα, κατά την οποία η θερμοκρασία διατηρείται στους 300 Κ από τη δυναμική Langevin χρησιμοποιώντας μια συχνότητα σύγκρουσης 1 ps

-1 και ένα όριο ταχύτητας των 20 μονάδων θερμοκρασίας. Η πίεση του συστήματος διαλυμένες εξισορροπήθηκε σε 1 bar σε μια ορισμένη πυκνότητα σε μία σταθερή πίεση περιοδική σύνορο με μια μέθοδο ισοτροπική κλιμάκωση της πίεσης που χρησιμοποιεί ένα χρόνο χαλάρωσης πίεση 2 ps. Ο χρόνος βήμα των ελεύθερων προσομοιώσεις MD ήταν 2 fs με αποκοπή του 9 Α για την μη-πλεγμένα αλληλεπίδραση, και ανακινείται [41] χρησιμοποιήθηκε για να κρατήσει όλα τα ομόλογα που περιλαμβάνουν άτομα υδρογόνου άκαμπτη. Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις υπολογίζονται βάσει της μεθόδου Particle Mesh Ewald [42]. Η προσομοίωση MD της PRK1-σταυροσπορίνη συγκρότημα έγινε συνολικά για 10 ns. Το οικόπεδο RMSD φαίνεται στο Σχήμα S3.

Database

Οι 3D δομές των ενώσεων Biomol (Σχήμα S4, S5, S6) δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Omega (OpenEye Software). Όλα τα πιθανά ισομερή και ταυτομερή παρήχθησαν, με αποτέλεσμα 265 3D δομές. Όλα παράγονται ισομερή χρησιμοποιήθηκαν για την μελέτη σύνδεσης.

AMBER GBSA Scoring

Οι αγκυροβολημένο πόζες ήταν ενέργειας ελαχιστοποιείται χρησιμοποιώντας το πεδίο δύναμης AMBER και το μοντέλο του συνεχούς GBSA [21]. Για κάθε μόριο επιλέχθηκε η καλύτερη πόζα βαθμολόγησης για τη σύγκριση με τα βιολογικά δεδομένα. Η ελαχιστοποίηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό απότομη κάθοδο και αλγόριθμος των συζυγών με ένα μέσης τετραγωνικής ρίζας από βαθμίδα σε 0.001 kcal /mol. AM1-BCC τέλη ορίστηκαν για τους αναστολείς, και το πεδίο ισχύος Amber99 εφαρμόστηκε για την πρωτεΐνη. Το μη συνδεδεμένο αποκοπής ορίστηκε σε 16 α. Όλα τα βαρέα άτομα της πρωτεΐνης ήταν δεμένοι με σταθερή δύναμη 100 kcal /mol, ενώ τα άτομα αναστολέα χαλαρή κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ελαχιστοποίησης ενέργειας. Η δέσμευση ελεύθερη ενέργεια Δ

G

υπολογίζεται ως εξής: όπου Δ

E

MM είναι η διαφορά ενέργειας μεταξύ του συγκροτήματος και το άθροισμα των ποσοτήτων ενέργειας για την ελεύθερη συνδετήρα και δωρεάν πρωτεΐνη , Δ

G

SOLV είναι η διαφορά στην ενυδάτωσης ενέργειας GBSA του συγκροτήματος και το άθροισμα των ποσοτήτων ενέργειας ενυδάτωσης για δωρεάν συνδετήρα και δωρεάν πρωτεΐνη, και Δ

G

SA είναι η διαφορά στην ενέργεια επιφάνειας του συγκροτήματος και το άθροισμα των ποσοτήτων ενέργειας επιφάνειας για δωρεάν συνδέτη και δωρεάν πρωτεΐνη.

RT-qPCR Ανάλυση

Επιδράσεις στην γονιδίων-στόχων των υποδοχέων των ανδρογόνων ήταν προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. LNCaP κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και στη συνέχεια σε νηστεία επί 24 ώρες σε ερυθρού φαινόλης-ελεύθερο RPMI1640 συμπληρωμένο με 0,5% διπλό απογυμνωμένο ορό εμβρύου μόσχου (dsFCS). Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή ή όχι με lestaurtinib (τελική συγκέντρωση 5 μΜ) όπως υποδεικνύεται. Εάν τα κύτταρα δεν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με lestaurtinib, DMSO προστέθηκε σαν ένα όχημα. 10 λεπτά μετά την προσθήκη lestaurtinib ή το όχημα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί μία νύκτα με ή χωρίς R1881 (10

-9 Μ) όπως υποδεικνύεται. DNaseI επεξεργασμένα RNA, απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen), χρησιμοποιήθηκε για ανάστροφη μεταγραφή. Ποσοτική PCR διεξήχθη σε ένα LightCycler 480 (Roche). Ο σχηματισμός προϊόντος ανιχνεύθηκε με ενσωμάτωση του SYBR Green Ι χρησιμοποιώντας ROX ως παθητική αναφορά (AbGene). Για qRT-PCR, χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές:

TMPRSS2

[25] 5′-TCACACCAGCCATGATCTGT-3 ‘και 5′-CTGTCACCCTGGCAAGAATC-3’?

IGF1-R

[25] 5′-CTGTATGCCTCTGTGAACC-3 ‘και 5′-TAGACCATCCCAAACGAC-3’?

NKX3.1

[27] 5′-AGAACGACCAGCTGAGCAC-3 ‘και 5′-AAGACCCCAAGTGCCTTTCT-3’?

CXCR4

[26] 5′-CTGTGAGCAGAGGGTCCAG-3 ‘και 5′-ATGAATGTCCACCTCGCTTT-3’?

ΜΑΚ

[28] 5′-TGGACTTGCAAGAGAATTAAGGT-3 ‘και 5′-CTTCAGGGGCACGATACC-3’?

MAF

[29] 5′-AGCGGCTTCCGAGAAAAC-3 ‘και 5′-GCGAGTGGGCTCAGTTATG-3’?

N4A1

[29] 5′-ACAGCTTGCTTGTCGATGTC-3 ‘και 5′-GGTTCTGCAGCTCCTCCAC-3’?

GREB1

[30] 5′-AAGCTGAGCAGCACAGACAA-3 ‘και 5′-GGCTTCTCTTCTCCGAGGTAG-3’?

FKBP5

[31] 5′-TTTTTGAGATTGAGCTCCTTGA-3 ‘και 5′-TTGTGTTCACCTTTGCCAAC-3’?

GAPDH

[31] 5′-GAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3 ‘και 5′-GTTCACACCCATGACGAACA-3’. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή + SD (η = 5). P-value: ns = μη σημαντική? * = & Lt? 0,05? ** & Lt? 0,01? *** & Lt?. 0.001

Ανάλυση Western Blot

LNCaP κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου προστάτη αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI1640 (ΡΑΑ) που περιέχει ορό εμβρύου μόσχου (ΡΑΑ) 10% (ν /ν), πενικιλλίνη (ΡΑΑ) 1% (ν /ν), στρεπτομυκίνη (ΡΑΑ) 1% (ν /ν), L-γλουταμίνη (ΡΑΑ) 1% (ν /ν) στους 37 ° C και 5% CO

2. 2.5 * 10

6 κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας ιστού (10 cm) και επωάστηκαν σε μέσο RPMI1640 (ΡΑΑ) που περιέχει απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα ορό εμβρύου μόσχου (ΡΑΑ) 10% (ν /ν), πενικιλλίνη (ΡΑΑ) 1% ( ν /ν), στρεπτομυκίνη (ΡΑΑ) 1% (ν /ν), L-γλουταμίνη (ΡΑΑ) 1% (ν /ν). 24 ώρες μετά τη σπορά lestaurtinib ή Ro318220 (τελική συγκέντρωση σε κάθε περίπτωση 4,5 μΜ) διαλυμένη σε μέσο ανάπτυξης (απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα βόειου ορού 10% (ν /ν), πενικιλλίνη 1% (ν /ν), στρεπτομυκίνη 1% (ν /ν) , L-γλουταμίνη 1% (ν /ν), DMSO 1% (ν /ν), dihydrotestesterone 0,1 ηΜ) προστέθηκαν και επωάστηκαν για 18 ώρες. LNCaP κύτταρα που επωάστηκαν με DMSO (1% (ν /ν)) χρησιμοποιήθηκαν ως ένας έλεγχος. Μετά τη θεραπεία αναστολέα, τα κύτταρα πλύθηκαν άπαξ με παγωμένο PBS, λύθηκαν με πυρήνες ρυθμιστικό απομόνωσης (Σακχαρόζη 250 mM, Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, IGEPAL-CA 630 0,1% (ν /ν), CaCl

2 0.2 mM, MgCl

2 1,5 mM, DTT 1 mM, πεπστατίνη 1 μΜ, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης Mix (Sigma), PhosStop® (Roche), ρΗ 8,0). Οι ιστόνες εκχυλίστηκαν οξύ (H

2SO

4 0,4 ​​N, DTT 1 mM, πεπστατίνη 1 μΜ, Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης Mix (Sigma), PhosStop® (Roche)) όλη τη νύχτα.

Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης του εκχυλίσματα ιστόνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας BCA Protein Assay (Pierce). 5 μg των πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση SDS-πηκτής (15% πηκτή πολυακρυλαμιδίου) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF Roti®-(Roth). Η μεμβράνη στη συνέχεια μπλοκαρίστηκε με μη λιπαρό ξηρό γάλα (Roth, 5% (w /v), TBS, Tween 20 0,1% (ν /ν)) και ανιχνεύτηκαν με αντι-H3T11ph (Active Motif) 1:1000 και αντι- Η3 (Upstate) 1:5000 ως μάρτυρας φόρτωσης. Canon CanoScan Lide 50 χρησιμοποιήθηκε για να αποκτήσουν την εικόνα της κηλίδας και το Adobe Photoshop 5.0 χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία της εικόνας.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

ευθυγράμμιση αλληλουχίας μεταξύ PKC-θήτα (Sbjct) και PRK1 (Query).

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s001

(TIFF)

Εικόνα S2. ανάλυση

PROCHECK.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s002

(TIFF)

Εικόνα S3.

RMSD οικόπεδο της προσομοίωσης MD της PRK1-σταυροσπορίνη συγκρότημα χρησιμοποιώντας AMBER10. Η γκρι γραμμή αναπαριστά το οικόπεδο RMSD για την πρωτεΐνη PRK1 Οα-άτομα, ενώ η μαύρη γραμμή δείχνει τη διακύμανση της δομής του αναστολέα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034973.s003

(TIFF)

Εικόνα S4.

ενώσεων από την βιβλιοθήκη Biomol, Ενώσεις 1-30.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s004

(TIFF)

Εικόνα S5.

Ενώσεων από τη βιβλιοθήκη Biomol, Ενώσεις 31-60.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s005

(TIFF)

Εικόνα S6.

Ενώσεων από τη βιβλιοθήκη Biomol, Ενώσεις 61 έως 84.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s006

(TIFF)

Εικόνα S7.

Επιδράσεις lestaurtinib και Ro318220 για την φωσφορυλίωση των H3T11 σε κύτταρα LNCaP μετά από 18 ώρες.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s007

(TIFF)

Πίνακα S1. τιμές

βαθμολόγησης που λαμβάνονται για 63 ελλιμενίζεται ενώσεις Βίοπιοΐ και επτά του δοκιμασμένου αναστολέα της κινάσης.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s008

(DOC)