εμβόλια

Αφηρημένο

δενδριτικών κυττάρων (DC) στοχεύει μόνο τα καρκινικά κύτταρα έχουν παραχθεί περιορισμένη αντικαρκινική δραστηριότητα περισσότερες κλινικές μελέτες. Στόχευση του καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες (CAFS) εκτός από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να ενισχύσει επιδράσεις κατά του όγκου, αφού CAFS, το κεντρικό συστατικό του στρώματος του όγκου, υποστηρίζουν άμεσα την ανάπτυξη του όγκου και να συμβάλλει στην ανοσοκατασταλτική μικροπεριβάλλον του όγκου. Να συν-στόχο CAFS και καρκινικά κύτταρα έχουμε αναπτύξει μια νέα ένωση DC εμβόλιο που κωδικοποιεί ένα Α20-ειδική shRNA για την ενίσχυση της λειτουργίας DC, και στοχεύει πρωτεΐνη ενεργοποίησης ινοβλαστών (FAP) που εκφράζεται σε CAFS και το αντιγόνο όγκου τυροσίνης που σχετίζονται με πρωτεΐνη (ΤΚΡ) 2 (DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2). DC-shA20-FAP-TRP2 εμβολιασμού που προκαλείται ισχυρή FAP- και TRP2-ειδικές αποκρίσεις των Τ-κυττάρων, με αποτέλεσμα μεγαλύτερη δραστικότητα κατά του όγκου στο μοντέλο μελανώματος Β16 σε σύγκριση με μονοσθενείς εμβόλια ή ένα εμβόλιο που κωδικοποιεί αντιγόνα και ένα στοιχείο ελέγχου shRNA. DC-shA20-FAP-TRP2 εμβολιασμός ενισχυμένη διείσδυση του όγκου των CD8-θετικών Τ κυττάρων, και επαγόμενη από αντιγόνο εξάπλωση με αποτέλεσμα ισχυρή αντικαρκινική δράση. Έτσι, συν-στόχευση των καρκινικών κυττάρων και CAFS αποτελέσματα στην επαγωγή της ευρείας αποκρίσεις Τ-κυττάρων του όγκου-ειδικά και έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει τις τρέχουσες εμβόλιο προσεγγίσεις για τον καρκίνο

Παράθεση:. Gottschalk S, Yu F , Ji M, Kakarla S, Τραγούδι XT (2013) Ένα εμβόλιο που Co-Στόχοι κύτταρα όγκου και καρκίνος Associated ινοβλάστες οδηγεί σε αυξημένη Αντικαρκινική Δραστηριότητα με την πρόκληση αντιγόνου Διάδοση. PLoS ONE 8 (12): e82658. doi: 10.1371 /journal.pone.0082658

Επιμέλεια: Νικόλας Κ Haass, Πανεπιστήμιο του Queensland Institute Diamantina, Αυστραλία

Ελήφθη: May 31, 2013? Αποδεκτές: 25η Οκτωβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 του Δεκέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Gottschalk et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από DAMD W81XWH-10-1-0281, ΝΙΗ χορηγεί P50 CA126752 και 1R01CA148748-01A1. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

δενδριτικών κυττάρων (DC) εμβόλια έχουν δείξει περιορισμένη αντικαρκινική δράση στην πλειονότητα των κλινικών δοκιμών [1]. Αυτή η έλλειψη αποτελεσματικότητας οφείλεται πιθανότατα στην παρουσία ανοσοκατασταλτικών κυττάρων εντός του όγκου, καθώς επίσης τον όγκο που υποστηρίζουν στρώμα περιορίζοντας σταυρό παρουσίαση και την επαγωγή της ευρείας βάσης του όγκου αποκρίσεις Τ-κυττάρων ειδικών για το αντιγόνο [2], [3].

ινοβλάστες Cancer συνδέονται (CAFS) αποτελούν το βασικό κυτταρικό συστατικό του στρώματος του όγκου και είναι παρόντα στην πλειονότητα των κοινών επιθηλιακών καρκίνων όπως του πνεύμονα, του μαστού, του προστάτη και του καρκίνου, καθώς και σάρκωμα και το μελάνωμα [4] – [7]. CAF διαμεσολαβούν αντίσταση σε χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία και η ανοσοθεραπεία, και CAF περιεχόμενο όγκου ή γονίδια που εκφράζονται σε CAFS συσχετίζονται με αποτέλεσμα [5], [8] – [10]. CAFS εκφράζουν οι ινοβλάστες πρωτεΐνη ενεργοποίησης (FAP) [11] και τη στοχευμένη διαγραφή του FAP-θετικών CAFS σε διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών έχει ισχυρές αντικαρκινικές δράσεις υπογραμμίζοντας τον κεντρικό ρόλο τους στην ογκογένεση [12]. Επιπλέον, FAP-στοχευμένες εμβόλια μειωμένη περιεκτικότητα σε κολλαγόνο του όγκου και διαμορφωμένο τον όγκο ανοσοποιητικό μικροπεριβάλλον σε προκλινικά μοντέλα [13], [14].

Έχουμε στο παρελθόν έχουν δείξει ότι η φίμωση Α20, ένας αρνητικός ρυθμιστής του ΝΡ κb- διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση DC, ενισχύει DC λειτουργία [15]. Η πρόθεση αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει τώρα ένα εμβόλιο που σιωπές Α20, και συν-στόχους FAP-θετικών CAFS, καθώς και καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μια τέτοια ένωση-εμβόλιο έχει ισχυρή δράση κατά των όγκων και ότι η ταυτόχρονη στόχευση CAFS και κυττάρων όγκου είναι κρίσιμη για την επαγωγή των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων ειδικών για αντιγόνα όγκων δεν κωδικοποιείται από το εμβόλιο.

Υλικά και μέθοδοι

μοντέλα DC ανοσοποίηση και όγκου

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από τις επιτροπές φροντίδας ζώων και τη χρήση των Baylor College of Medicine (BCM). C57BL /6J αγοράστηκαν από την Jackson Laboratories και διατηρείται σε μια άνευ παθογόνου εγκατάσταση του ποντικιού σε BCM, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες. DCs πλύθηκαν σε PBS και ενέθηκαν στο πίσω πέλμα αφελή C57BL /6 σε 1 × 10

6 κύτταρα /ποντικό. Τα ποντίκια θανατώθηκαν την ημέρα που αναφέρεται? βουβωνικοί λεμφαδένες και σπλήνες απομακρύνθηκαν για ενδοκυτταρική χρώση και Elispot, αντίστοιχα. Για το μοντέλο όγκου, ποντικοί C57BL /6 εγχύθηκαν με 5 × 10

5 Β16, Β16-OVA, ή καρκινικά κύτταρα EG7-OVA υποδορίως. Πέντε ημέρες αργότερα, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες (n = 5 ανά ομάδες) και εγχύθηκαν με 1 χ 10

6 φακοϊό-μεταχθέντα με LPS ωριμάσει DCs. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν δύο ή τρεις φορές την εβδομάδα με ένα παχύμετρο βερνιέρου.

διάνυσμα κατασκευή λεντοϊών, την παραγωγή και την μεταγωγή

Η αυτο-αδρανοποίηση (SIN) φορέα του HIV που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν pSIH1- διάνυσμα Η1-shRNA από SBI. Mouse αλληλουχία παρεμβαλλόμενο RNA Α20 μικρή φουρκέτα εισήχθη εντός pSIH1-H1-shRNA για να δημιουργήσει pSIH1-H1-A20-shRNA που περιέχει το Α20 shRNA (5′-CTACCTGAGTTCCTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAAGGAACTCAGGTAGTTTTT-3 ‘). εισήχθησαν εντός pSIH1-H1-shRNA FAP ή TRP-2 cDNA υπό τον έλεγχο του CMV προαγωγού για να δημιουργήσει pSIH1-H1-A20-shRNA-CMV-FAP, pSIH1-H1-A20-shRNA-CMV-TRP2, ή pSIH1-H1 -A20-shRNA-CMV-FAP-ΤΚΡ2. Ανασυνδυασμένη ψευδοτυποποιημένοι φορείς λεντοϊών δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15] και συμπυκνώνεται με PEG-it ™ λύση καθίζηση του ιού (Σύστημα Biosciences, Mountain View, CA).

δενδριτικά πολιτισμό

μυελού των οστών δενδριτικά κύτταρα (DCS) λήφθηκαν όπως περιγράφεται [16] με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια λύθηκαν με επώαση σε θερμοκρασία δωματίου σε Ερυθρά Αιμοσφαίρια ρυθμιστικό λύσης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε HyClone RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Summit, Fort Collins, CO) , μη-απαραίτητα αμινοξέα, ρυθμιστικό HEPES, glutamax, β-μερκαπτοαιθανόλη, IL-4 (20 ng /mL), και GM-CSF (20 ng /mL, Peprotech, Rocky Hill, NJ) για 5 ημέρες. DCs στη συνέχεια σε μεταγωγή με φακοϊό για 8 ώρες, στη συνέχεια καλλιεργούνται για επιπλέον 12-16 ώρες με LPS.

Η κυτταρομετρία ροής

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων DCs και Τ και διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [15], [17]. Βουβωνικούς λεμφαδένες διαχωρίστηκαν και επιστρώθηκαν σε πλήρες RPMI με φακοϊό μεταγωγή DCs για μια ολονύκτια διέγερση στους 37 ° C που ακολουθείται από ενδοκυτταρική χρώση. Βιτρώ κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα όργανο FACScalibur (Becton Dickinson (BD), Mountain View, CA) χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest (BD) για όλες τις κυτταρομετρίας ροής αναλύσεις.

Enzyme-ανοσοαπορρόφησης spot (ELISPOT)

δοκιμασίες Elispot των απομονωμένων κυττάρων Τ διεξήχθησαν όπως περιγράφεται περιγράφηκε προηγουμένως [15], [17]. Οι σπλήνες διαχωρίστηκαν και σπληνοκύτταρα καθαρίστηκαν με χρήση MACS CD4 (L3T4) ή CD8 (Ly-2) μικροσφαιρίδια (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν με OT-ΙΙ ή OT-Ι πεπτίδιο (10 μg /ml) ή αντι-CD3 /CD28 για θετικό έλεγχο. Οι πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύκτα, στη συνέχεια, την έκκριση IFN-γ αξιολογήθηκε (αντισώματα: Mabtech). Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με τυφλό τρόπο από ZellNet Consulting, Inc. (New York, ΝΥ) με ένα αυτοματοποιημένο σύστημα ανάγνωσης Elispot, χρησιμοποιώντας KS Elispot 4,3 λογισμικού.

κυτταροτοξικότητας δοκιμασία

Η κυτταρολυτική δραστηριότητα του Τ κύτταρα αξιολογήθηκαν με μία πρότυπη δοκιμασία απελευθέρωσης χρωμίου, η οποία μετρά την ικανότητα των ίη vitro-επαναδιεγείρονται σπληνοκυττάρων να λύουν κύτταρα στόχους (20, 50). Σπληνοκύτταρα συγκεντρώθηκαν από ανοσοποιημένους ποντικούς επαναδιεγείρονται in vitro σε RPMI-1640 που περιέχει Β16-OVA λύματος όγκου και IL2 για 4-6 ημέρες. Β16 και Β16-OVA κύτταρα σημάνθηκαν με νάτριο

διάλυμα χρωμικού 51Cr για 60 λεπτά στους 37 ° C με ανακίνηση. Διαφορετικοί αριθμοί κυττάρων τελεστών επωάστηκαν με έναν σταθερό αριθμό κυττάρων στόχων (5 × 10

4 /φρεάτιο) σε 96 φρεατίων U πυθμένα πλάκες (200 μΙ /φρεάτιο) για 4 ώρες στους 37 ° C. Τα υπερκείμενα από τριπλές καλλιέργειες συλλέχθηκαν. Τοις εκατό λύσης υπολογίστηκε ως (πειραματική απελευθέρωση – αυθόρμητη απελευθέρωση) /(μέγιστη απελευθέρωση – αυθόρμητη απελευθέρωση). × 100

Η στατιστική ανάλυση

Για την στατιστική ανάλυση, χρησιμοποιήσαμε Student t-test με 95 όριο% εμπιστοσύνη, ορίζεται ως p & lt? 0,05. Τα αποτελέσματα συνήθως παρουσιάζονται ως μέσοι ± SEM. Για πειράματα σε ζώα, 5 ποντίκια είχαν προγραμματιστεί να ανιχνεύσει ένα μεγάλο μέγεθος επίδραση του 2, η οποία προέβλεπε τουλάχιστον 80% της ισχύος με 5% σφάλμα τύπου-Ι. Για τα πειράματα ποντικού, την επιβίωση, προσδιορίζεται από το χρόνο της ένεσης των κυττάρων του όγκου, αναλύθηκε με δοκιμασία log-rank.

Αποτελέσματα

λειτουργικός χαρακτηρισμός φορείς λεντοϊών που κωδικοποιούν shA20, FAP και TRP2

Κατασκευάσαμε 4 φορείς λεντοϊού που κωδικοποιεί shA20 και FAP (Lv-shA20-FAP), shA20 και ΤΚΡ2 (Lv-shA20-ΤΚΡ2), shA20, FAP και ΤΚΡ2 (Lv-shA20-FAP-ΤΚΡ2), ή ένα στοιχείο ελέγχου shRNA, FAP, ΤΚΡ2 (Lv-shCo-FAP-ΤΚΡ2) (Εικ. 1Α). Η διαγονιδιακή έκφραση και αποσιώπηση Α20 επιβεβαιώθηκε με RT-PCR σε προερχόμενα ΑΧ μυελού των οστών μεταγωγή με VSV-G φορείς ψευδότυποι βραδέος ιού (Σχ. 1Β, C).

(Α) Διάγραμμα λεντοικής κατασκευασμάτων. (Β και Γ) ποντίκι BM-DCs μετήχθησαν με φακοϊό και FAP και έκφραση TRP2 (Β) και Α20 έκφρασης (C) ανιχνεύθηκαν με RT-PCR ή Q-PCR μεμονωμένα. (Δ και Ε) Οι ποντικοί ανοσοποιήθηκαν με 1 × 10

6 φακοϊό-μετάγονται BM-DCs σε 25 μΐ αποστειρωμένου ελέγχου PBS ή PBS μέσω πατούσα 14 ημέρες μετά σπληνοκύτταρα εμβολιασμό παρασκευάσθηκαν και CD8 + (Δ) και CD4 + (Ε) Τ κυττάρων που επιλέγονται. Η συχνότητα των FAP- και TRP2-ειδικών Τ κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ELISPOT ΙΡΝ-γ (n = 2? Δοκιμασία εκτελέστηκε εις τριπλούν). AF, φορέα λεντοϊού συνεκφράζουν ένα Α20-ειδική μικρής φουρκέτα RNA (shRNA) και FAP? AT, φορέα λεντοϊού συνέκφραση Α20-shRNA και ΤΚΡ2? AFT, φορέα λεντοϊού συνέκφραση Α20-shRNA, FAP και ΤΚΡ2? CFT, φορέα λεντοϊού συνεκφράζουν GFP-shRNA, FAP και ΤΚΡ2? GAPDH, αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης? PBS, αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό.

Η

Για να αποδειχθεί ότι Lv μεταγωγή DCs επάγουν FAP- και TRP2-ειδικές αποκρίσεις των Τ-κυττάρων, τα ποντίκια εμβολιάστηκαν με 1 × 10

6 DC-shA20- FAP, DC-shA20-ΤΚΡ2, DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2, ή DC-shCo-FAP-ΤΚΡ2. Δεκατέσσερις ημέρες μετά τον εμβολιασμό CD4- και CD8-θετικά σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν και η παρουσία του FAP- και TRP2-ειδικών Τ κυττάρων προσδιορίστηκε με ΙΡΝ-γ δοκιμασίες Elispot. Ποντικοί που εμβολιάστηκαν με Α20-σιγήσει εμβόλια DC επάγονται σημαντικά υψηλότερη FAP- και TRP2-ειδικά CD4- και CD8-θετικών αποκρίσεων Τ-κυττάρων (ρ & lt? 0,05) από τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με DC-shCo-FAP-TRP2, επιβεβαιώνοντας την προηγούμενη διαπίστωση μας ότι αποσιώπηση Α20 σε DCs προάγει την επαγωγή ισχυρών CD4- και CD8-θετικά αντιγόνου-ειδικών αποκρίσεων Τ-κυττάρων

in vivo

(Εικ. 1 D, Ε) [15]. Δεν υπήρξε σημαντική διαφορά (ρ & gt? 0,05) στην επαγωγή FAP- ή TRP2-ειδικά Τ κύτταρα αποκρίσεις μετά τον εμβολιασμό ποντικών με δενδριτικά κύτταρα που εκφράζουν επιμέρους (DC-shA20-FAP ή DC-shA20-TRP2) ή και τα δύο αντιγόνα (DC-shA20 -FAP-ΤΚΡ2), υποδεικνύοντας την απουσία των αντιγονικών ανταγωνισμού όταν και οι δύο αντιγόνα συν-εκφράζονται.

εμβόλιο DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2 έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση

Το μοντέλο Β16 μελάνωμα είναι ιδανικό για να αξιολογήσει εάν στοχεύουν FAP-θετική στρώματος του όγκου ενισχύει την αντικαρκινική δράση από το Β16 κύτταρα δεν εκφράζουν FAP [18]. Επιβεβαιώσαμε την επαγωγή της έκφρασης FAP εντός 5 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου Β16 με RT-PCR (Σχ. 2Α). Τα ποντίκια που φέρουν 5 ημερών-old όγκους Β16 εμβολιάστηκαν με μία μόνο δόση του 1 × 10

6 DC-shA20-FAP, DC-shA20-ΤΚΡ2, DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2, ή DC-shCo-FAP- εμβόλιο ΤΚΡ2. Όλα A20-σιγήσει εμβόλια είχε αντικαρκινική δράση, ενώ οι μη-A20 σιγήσει εμβόλιο DC είχε κανένα (Εικ. 2Β). Δεν υπήρχε διαφορά στην αντικαρκινική δράση της DC-shA20-FAP και εμβολίων DC-shA20-TRP2, υποδεικνύοντας ότι Τ-κυττάρων αποκρίσεις έναντι ενός αντιγόνου μόνος στρώμα μπορεί να έχει σημαντικές επιπτώσεις κατά του όγκου (Σχ. 2Β). Στόχευση FAP και ΤΚΡ2 ταυτόχρονα με το εμβόλιο DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2 είχε ως αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη αντικαρκινική δράση (DC-shA20-ΤΚΡ2 vs DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2, σ & lt? 0,05? DC-shA20-FAP vs DC-shA20- FAP-ΤΚΡ2, σ & lt? 0,05). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση στην επιβίωση των ποντικών που έλαβαν το εμβόλιο DC-shA20-FAP-TRP2 σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες του εμβολίου (Fig.2C). Superior αντικαρκινική δραστικότητα ενός από όγκο και στρώμα με στόχευση εμβόλιο επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας ένα εμβόλιο DC-shA20-FAP-OVA σε Β16-OVA και EG7-OVA μοντέλα (Εικ. S1 Α, Β).

(Α) RT-PCR για FAP και GAPDH του Β16 κυτταρική γραμμή, και την ημέρα 5 Β16 όγκους. (Β, C) ποντίκια εμβολιάστηκαν με Β16 που ακολουθείται από ανοσοποίηση με 1 × 10

6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-ΤΚΡ2 (AT), DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2 (AFT), DC-shCo-FAP-ΤΚΡ2 (ACT) ή PBS την ημέρα 5 (n = 5 ανά ομάδα). (Β) Cotargeting FAP και ΤΚΡ2 με AFT είχε ως αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη απόκριση κατά του όγκου (AF vs AFT, σ & lt? 0,05? AT vs AFT, σ & lt? 0,05). καμπύλη επιβίωσης (C) Kaplan-Meier (AF vs AFT, σ & lt? 0,05? AT vs AFT, σ & lt? 0,05).

Η

DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2 αυξήσεις εμβόλιο FAP- και ΤΚΡ2 ειδικών CD8-θετικά Τ κύτταρα σε όγκους

Για να διερευνηθούν οι μηχανισμοί που διέπουν την ενίσχυση των αποτελεσμάτων αντικαρκινικών, προσδιορίσαμε πρώτα τη συχνότητα των CD4- και CD8-θετικά Τ κύτταρα σε Β16 όγκους 3 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. Ενώ δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο ποσοστό των CD4-θετικών Τ κυττάρων εντός των όγκων μεταξύ των ομάδων των εμβολιασμένων ποντικών (τα στοιχεία δεν φαίνονται), υπήρχε μια σημαντική (ρ & lt? 0,05) 4-πλάσια αύξηση στο ποσοστό των CD8-θετικών κυττάρων Τ μετά DC-shA20-FAP-TRP2 εμβολιασμό σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου (Σχ. 3Α, Β). Σε αντίθεση, τα μονοσθενή εμβόλια ή ο FAP εμβόλιο μη σιγήσει /TRP2 DC δεν αύξησε τη συχνότητα των ενδοογκική CD8-θετικών Τ κυττάρων σε σύγκριση με τους ελέγχους. Για να διερευνηθεί η εξειδίκευση των διηθητικών CD8-θετικά Τ κύτταρα, ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα (TILs) απομονώθηκαν 3 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. Ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης για ΙΡΝ-γ εκτελέστηκε μετά τη διέγερση με FAP- ή DCs TRP2 εκφράζουν. DC-shA20-FAP-TRP2 εμβολιασμός προκάλεσε την υψηλότερη συχνότητα του FAP- και TRP2-ειδικών Τ κυττάρων σε σύγκριση με τα άλλα εμβόλια (Εικ. 3C), αντανακλώντας την προηγουμένως παρατηρούμενη συνολική αύξηση στον αριθμό των CD8-θετικών Τ κυττάρων εντός των όγκων .

τα ποντίκια εμβολιάστηκαν με Β16 όγκους που ακολουθείται από ανοσοποίηση με 1 × 10

6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-ΤΚΡ2 (AT), DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2 ( AFT) ή PBS την ημέρα 5. ιστούς όγκου αποκόπηκαν 3 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό (n = 5). (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση FACS των διηθητικών CD8 + Τ κύτταρα. (Β) Περίληψη των δεδομένων όλων των ποντικών που δείχνει μια σημαντική αύξηση (ρ & lt? 0,05) των CD8 + Τ κυττάρων σε ποντικούς που εμβολιάστηκαν με AFT (η = 8 ανά ομάδα). (Γ) TILs επαναδιεγέρθηκαν με DCs μεταγωγή με FAP (DC-Lv-FAP) ή TRP2 (DC-LV-TRP2) που ακολουθείται από ενδοκυτταρική χρώση ΙΡΝ-γ. Ένα από 2 αντιπροσωπευτικών πειραμάτων φαίνονται.

Η

εμβόλιο DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2 προκαλεί αντιγόνο εξαπλώνεται

Στο προηγούμενο πείραμα παρατηρήσαμε ότι το εμβόλιο DC-shA20-FAP προκαλείται από ΤΚΡ2 -ειδικές αποκρίσεις Τ-κυττάρων (Σχ. 3C), υποδηλώνουν επιτόπου εξάπλωση και η επαγωγή του αντιγόνου διασποράς. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το εύρημα αυτό, Β16 ποντίκια που έφεραν όγκο εμβολιάστηκαν την ημέρα 5 με DC-shA20-FAP, DC-shA20-ΤΚΡ2, DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2, ή PBS. Μετά από 3 εβδομάδες, η συχνότητα των Τ κυττάρων ειδικών για το Β16-που σχετίζονται με όγκο αντιγόνα πρωτεΐνης τυροσινάσης που σχετίζονται με 1 (TRP1), τυροσινάση (Tyr), gp100, και σχετίζεται με το μελάνωμα αντιγόνο που αναγνωρίζεται από τα Τ κύτταρα (MART1) μεταξύ σπληνοκυττάρων και λεμφοκύτταρα που διηθούν όγκο προσδιορίστηκε. Ενώ όλα τα εμβόλια προκάλεσε μια σημαντική αύξηση του προαγωγείς ΤΚΡ1-, Tyr-, gp100-, και MART1-ειδικών Τ κυττάρων σε TILs σε σύγκριση με PBS-εγχυθεί ποντικούς (Εικ. 4Α), η συχνότητα του μελανώματος-ειδικών Τ κυττάρων ήταν υψηλότερος στην DC -shA20-FAP-ΤΚΡ2 εμβολιασμένα ποντίκια (p & lt? 0,05). Μόνο το εμβόλιο DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2 που προκαλείται από τις απαντήσεις συστημική Τ-κυττάρων έναντι TRP1, Tyr, gp100, και MART1 (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η στόχευση του στρώματος του όγκου, καθώς και του όγκου επιτρέπει την επαγωγή της εξάπλωσης αντιγόνου.

Ποντίκια εμβολιάστηκαν με Β16 όγκους που ακολουθείται από ανοσοποίηση με 1 χ 10

6 DC-shA20-FAP ( AF), DC-shA20-ΤΚΡ2 (AT), DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2 (AFT) ή PBS την ημέρα 5. TILs και σπληνοκύτταρα προετοιμάστηκαν τρεις εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό (n = 5). (Α) TILs επαναδιεγέρθηκαν με DC-Lv-ΤΚΡ2, DC-Lv-TRP 1, DC-Lv-Tyr, DC-Lv-gp100, DC-Lv-MART1 ή εικονικές μετάγονται ΑΧ (PBS) που ακολουθείται από ενδοκυτταρική χρώση της IFN- γ. FACS ανάλυση και μια αθροιστική ραβδόγραμμα παρουσιάζεται. TILs έχουν απομονωθεί από εμβολιασμένα ποντίκια AFT είχε την υψηλότερη συχνότητα του Β16-speciifc Τ κυττάρων (ρ & lt? 0,05). (Β) Σπληνοκύτταρα υποβλήθηκαν σε ΙΡΝ-γ δοκιμασίες Elispot. DC-Lv-ΤΚΡ2, DC-Lv-TRP 1, DC-Lv-Tyr, DC-Lv-gp100, DC-Lv-MART1 ή εικονικές μετάγονται ΑΧ (PBS) χρησιμοποιήθηκαν ως APC. Υπήρξε μια σημαντική αύξηση (ρ & lt? 0,05). Τ κυττάρων ειδικών για TRP1, TYR, gp100, και MART1 μόνο σε AFT εμβολιασμένα ποντίκια

Η

Antigen εξαπλώνεται σαν αποτέλεσμα αυξημένη δραστικότητα κατά του όγκου

Έχοντας δείξει ότι τα εμβόλια που αναπτύχθηκε ένωση προκάλεσε αντιγόνο B16 εξάπλωση θέλαμε να προσδιοριστεί εάν αυτές αντιγόνου-ειδικά Τ κύτταρα έχουν δραστικότητα κατά του όγκου. Οι ποντικοί εμβολιάσθηκαν με Β16-OVA και Β16 για δεξιά ή αριστερά λαγόνες τους, και μετά από 5 ημέρες εμβολιάστηκαν με DC-shA20-FAP, DC-shA20-OVA, DC-shA20-FAP-OVA, ή PBS. DC-shA20-OVA εμβολιασμός ανέστειλε μόνο την ανάπτυξη των Β16-OVA, ενώ το εμβόλιο DC-shA20-FAP αναστέλλεται Β16 καθώς και Β16-OVA ανάπτυξη του όγκου (Σχ. 5Α, Β). Το εμβόλιο DC-shA20-FAP-OVA είχε τη μεγαλύτερη αντικαρκινική δράση έναντι αμφοτέρων των κυτταρικών γραμμών όγκου (ρ & lt? 0,05? Σχ. 5Α, Β). Αυτό είναι σύμφωνο με την παρατήρησή μας που συν-στόχευση αντιγόνου όγκου και FAP επάγει συστημική Τ κύτταρα αποκρίσεις έναντι αντιγόνου όγκου που δεν υπάρχουν στο εμβόλιο (σχήμα 4Β). Ενώ DC-shA20-OVA εμβολιασμός δεν είχε ως αποτέλεσμα μία αύξηση στη συνολική επιβίωση, λόγω των αντιγόνων αρνητικών όγκων Β16, DC-shA20-FAP ή DC-shA20-FAP-OVA εμβολιασμός είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση στη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με DC-shA20-OVA (ρ & lt? 0,05? Εικ 5.γ).

(AC) ποντίκια εμβολιάστηκαν με Β16-OVA ή Β16 όγκων στη δεξιά ή αριστερά πλευρά χωριστά ακολουθούμενη από ανοσοποίηση με 1 χ 10

6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-OVA (AO), DC-shA20-FAP-OVA (AFO) ή PBS 5 ημέρες αργότερα (n = 5 ανά ομάδα). Β16-OVA (Α) και Β16 (Β) την ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε. Η AFO και το εμβόλιο AF είχαν δραστικότητα αντι-Β16 με AFO είναι ανώτερη (p & lt? 0,05). καμπύλη επιβίωσης (C) Kaplan-Meier (AO vs AF, σ & lt? 0,05? AO vs AFO, σ & lt? 0,05). (D, Ε) Τα ποντίκια εμβολιάστηκαν με Β16-OVA που ακολουθείται από ανοσοποίηση με 1 χ 10

6 AF, AO, AFO, και PBS 5 ημέρες αργότερα. 3 εβδομάδες αργότερα, τα σπληνοκύτταρα προετοιμάστηκαν και καλλιεργήθηκαν in vitro με την παρουσία Β16-OVA λύματος όγκου και IL2 για 5 ημέρες και κυτταρολυτική δραστικότητα τους αξιολογήθηκε σε πρότυπο υποβάλλεται

δοκιμασία απελευθέρωσης 51Cr έναντι Β16-OVA (D) ή Β16 ( ΜΙ). Σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν από κολπική μαρμαρυγή και AFO εμβολιασμένα ποντίκια είχαν σημαντική κυτταρολυτική Β16 δραστηριότητα. * AFO vs AF και AO, σ & lt? 0,05? ** AF και ΑΟ vs PBS, σ & lt? 0,05? *** AFO και AF vs ΑΟ, σ & lt?. 0.05)

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η συστηματική επαγωγή Τ κύτταρα ειδικά για αντιγόνα που δεν παρουσιάζουν σε το εμβόλιο, ποντίκια ενέθηκαν με Β16-OVA και εμβολιασμένων μετά από 5 ημέρες με DC-shA20-FAP, DC-shA20-OVA, DC-shA20-FAP-OVA, ή PBS. Μετά από 3 εβδομάδες σπληνοκύτταρα από ποντίκια εμβολιασμένα απομονώθηκαν και επαναδιεγέρθηκαν για 5 ημέρες

ex vivo

πριν την εκτέλεση ενός προσδιορισμού κυτταροτοξικότητας με Β16-OVA κύτταρα και Β16 ως στόχους. Σπληνοκύτταρα συλλέγονται από DC-shA20-FAP ή DC-shA20-FAP-OVA εμβολιασμένα ποντίκια έδειξαν σημαντική θανάτωση των Β16-OVA και Β16 κύτταρα (Εικ. 5D, E), όπου, όπως το εμβόλιο DC-shA20-OVA κατά κύριο λόγο προκαλείται από OVA-ειδική Τ-κυττάρων αποκρίσεις.

Συζήτηση

τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ένα εμβόλιο DC στην οποία ο εξασθενητής παρουσίασης αντιγόνου Α20 αναστέλλεται, και ότι στοχεύει FAP-θετικά CAFS και το TRP2 αντιγόνο όγκου έχει ισχυρή αντικαρκινική αποτελέσματα, δίνει τη δυνατότητα εγκάρσιας παρουσίαση αντιγόνων όγκου από ενδοογκική APCs με αποτέλεσμα την ευρεία βάση επαγωγή Τ κύτταρα ειδικά για αντιγόνα όγκων που δεν περιλαμβάνονται στο εμβόλιο.

το μικροπεριβάλλον του όγκου είναι ένα πολύπλοκο περιβάλλον και παίζει ουσιαστικό ρόλο στην έναρξη του όγκου, την εξέλιξη και τη διαμεσολάβηση θεραπευτική αντίσταση [9], [10]. Στόχευση μη κακοήθη κύτταρα που είναι παρόντα μέσα στους όγκους εκτός από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί επομένως να αυξήσει την αποτελεσματικότητα του καρκίνου-στοχευμένες θεραπείες [7], [19], [20]. FAP-θετική CAFS, η κεντρική κυτταρικό συστατικό του στρώματος του όγκου, έχουν αναδειχθεί ως βασικών παραγόντων για την προώθηση της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) αναδιαμόρφωση, αγγείωση και ανοσοκαταστολής [21]. Για παράδειγμα, σε διαγονιδιακά ποντίκια, στα οποία ο υποδοχέας της τοξίνης της διφθερίτιδας εκφράζεται υπό τον έλεγχο του υποκινητή FAP, η χορήγηση της τοξίνης της διφθερίτιδας, η οποία σκοτώνει μόνο σχετιζόμενο με όγκο FAP-θετικά στρωματικά κύτταρα, οδήγησε σε πλήρη εκτομή των στερεών όγκων [12] .

FAP είναι συνδεδεμένη με τη μεμβράνη αμινοπεπτιδάση, η οποία εμπλέκεται στην ECM αναδιαμόρφωση [22]. Η αναστολή της δραστικότητας αμινοπεπτιδάσης του FAP οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη του όγκου και συνδέθηκε με μία συσσώρευση του κολλαγόνου, μειωμένους αριθμούς μυοϊνοβλαστών και μειωμένη αγγείωση όγκων σε προκλινικά μοντέλα [21], ωστόσο κανένας αντικειμενικός κλινικές αποκρίσεις παρατηρήθηκαν σε κλινικές μελέτες [23] . Στόχευση FAP με ένα ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα, sibrotuzumab, έδειξε επίσης καμία αντικειμενική κλινική απαντήσεις? Ωστόσο, μελέτες απεικόνισης αποκάλυψε ότι το αντίσωμα κατά προτίμηση εντοπίζεται σε μεταστατικές θέσεις όγκου μετά τη χορήγηση [24].

Αρκετές ομάδες έχουν διεξαχθεί μελέτες εμβόλιο μόνο στόχευσης FAP, αποδεικνύοντας ότι S. typhimuirum-, πλασμίδια, ή DC-based εμβόλια FAP έχουν αντικαρκινική δραστικότητα σε προληπτικές ή θεραπευτικές νωρίς ρυθμίσεις, να διαμορφώνει το μικροπεριβάλλον του όγκου μέσω της προώθησης Th1 πόλωση και την ενίσχυση της διείσδυσης των CD8-θετικών Τ κυττάρων [13], [14], [18], [25]. Ενώ cotargeting της FAP-θετικών CAFS και καρκινικά κύτταρα με ένα εμβόλιο DC έδειξε σημαντική καθυστέρηση στην ανάπτυξη του όγκου σε μια προκλινική μελέτη, δεν μηχανιστικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν [18].

Οι μελέτες μας τώρα επεκτείνει αυτά τα ευρήματα και να αποδείξουν ότι φίμωση την ουμπικιτίνη Α20 λιγάσης, ένα αντιγόνο παρουσιάζει εξασθενητή σε DCs, έχει ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση στη συχνότητα των FAP-ειδικών Τ κυττάρων σε σύγκριση με ένα εμβόλιο DC με έναν έλεγχο shRNA. Αυτό τονίζει το σημαντικό ρόλο της αποσιώπησης αρνητικών ρυθμιστών, όπως Α20 σε APC να προκαλέσει Τ-κυττάρων αποκρίσεις έναντι αυτο-αντιγόνων, όπως FAP [15]. Δεν παρατηρήσαμε καμία διαφορά στην αντικαρκινική δράση της DC-shA20-FAP και DC-shA20-TRP2, υποδεικνύοντας ότι η στόχευση CAFS με FAP εμβολιασμός μπορεί να προκαλέσει ανεπιθύμητες αντικαρκινική παρόμοια με τα εμβόλια που στοχεύουν κακοήθη κύτταρα. Ωστόσο, ο εμβολιασμός με DC-shA20-FAP-ΤΚΡ2 είχε ως αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη αντικαρκινική δράση. Μηχανιστική μελετήθηκαν αποκάλυψαν ότι cotargeting του CAFS και κυττάρων όγκου οδήγησε σε αυξημένο ποσοστό των CD8-θετικών Τ κυττάρων εντός των όγκων και την επαγωγή των Τ κυττάρων ειδικών για αντιγόνα που δεν υπάρχει στο εμβόλιο με ισχυρή αντικαρκινική δράση. DC-shA20-FAP, DC-shA20-ΤΚΡ2, και DC-shCo-FAP-ΤΚΡ2 που προκαλείται από το εμβόλιο συγκρίσιμα επίπεδα CD8-positice TILs (Σχ. 3Β), ωστόσο μόνο DC-shA20-FAP και DC-shA20-ΤΚΡ2 εμβόλια είχαν αντικαρκινική δραστηριότητα (Εικ. 2Β). Είχαμε προηγουμένως δείξει ότι Α20-siRNA ανοσοενισχυμένα εμβόλια DC επάγουν ισχυρές όγκου αντιγόνου-ειδικά κυτταροτοξικά Τ κύτταρα και τα βοηθητικά κύτταρα Τ που είναι απρόσβλητη σε αναστολή Treg [15]. Έτσι, ενώ όλα τα τρία εμβόλια που επάγεται συγκρίσιμες TIL αποκρίσεις, DC-shA20-FAP και DC-shA20-TRP2 επαγόμενη TILs είναι πιθανότερο πιο αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου.

μελέτες Vaccine στον καρκίνο του μαστού, νεφρικό καρκίνωμα, και οι ασθενείς με μελάνωμα δείχνουν ότι η διασταυρούμενη παρουσίαση και επιτόπου εξαπλώνεται συσχετίζεται με βελτίωση της συνολικής επιβίωσης [26] – [28]. Επιπλέον, η επαγωγή της ευρείας βάσης αποκρίσεις Τ-κυττάρου όγκου-ειδική μετά θετή μεταφορά Τ-κυττάρων σε έναν ασθενή με μελάνωμα κατέληξε σε μία πλήρη απόκριση [29]. Αν και αυτές οι μελέτες υπογραμμίζουν τη σημασία της επιτόπου εξαπλώνεται, οι καθοριστικοί παράγοντες της αποτελεσματικά την πρόκληση πολλαπλής παρουσίαση και επιτόπου εξαπλώνεται σήμερα άρρωστη ορίζεται. Ενώ όλα τα εμβόλια που προκαλείται χαμηλά επίπεδα TILs που ήταν ειδικά για αντιγόνα που δεν υπάρχει στο εμβόλιο, μόνο οι από όγκο και στρώμα με στόχευση επαγόμενη εμβόλιο συστημικές αποκρίσεις Τ κυττάρων σε όλες τις δοκιμασμένες αντιγόνα μη-εμβολίου. Στόχευση μόνο το στρώμα όγκου με DC-shA20-FAP είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή του TRP2 ειδικών TILs και συστημικές αποκρίσεις Τ-κυττάρων TRP2-ειδική που ήταν υψηλότερα (αν και όχι σημαντική) σε σύγκριση με το εμβόλιο DC-SH-TRP2. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η στόχευση των FAP-θετικά αποτελέσματα στρώμα στην καταστροφή των κυττάρων Β16 και αναστροφή της ανοσοκατασταλτικής μικροπεριβάλλον του όγκου.

Σημαντικά, οι επαγόμενη όγκου-ειδικά Τ κύτταρα κυτταροτοξικές και είχε αντικαρκινική δραστικότητα έναντι αντιγόνου-loss παραλλαγές (ALVs), που έχουν ήδη παρατηρηθεί σε ασθενείς που συμμετείχαν στις εμβόλιο ή Τ-κυττάρων ανοσοθεραπεία μελέτες που στοχεύουν μόνο αντιγόνα του όγκου [30], [31]. Ενώ άλλες ομάδες έχουν δείξει σε προκλινικά μοντέλα που διασχίζουν την παρουσίαση των αντιγόνων επί στρωματικών κυττάρων είναι κρίσιμη για την εξάλειψη των ALVs χρησιμοποιώντας ένα υψηλής έκφρασης μοντέλο αντιγόνου [32], τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η στόχευση στρωματικά κύτταρα είναι απαραίτητη για την επαγωγή ευρεία κατά του όγκου απαντήσεις, οι οποίες θα πρέπει να ελαχιστοποιήσουν τον κίνδυνο ALVs.

συνοπτικά, η ένωση εμβόλιο έχουμε αναπτύξει επάγει CAF- και ογκο-ειδικές ανοσοαποκρίσεις και εκμαιεύει ευρεία αποκρίσεις Τ-κυττάρων έναντι αντιγόνων όγκου. Έτσι, με στόχο CAFS εκτός από την κακοήθη καρκινικά κύτταρα έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει τις τρέχουσες προσεγγίσεις εμβόλιο για τον καρκίνο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. εμβόλιο

DC-shA20-FAP-OVA έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0082658.s001

(PDF)

Ευχαριστίες

ευχαριστώ Cliona Μ Ρούνεϊ και Malcolm K Brenner για τις χρήσιμες συζητήσεις και συμβουλές.