Αφηρημένο

WNT5A, ένα μέλος της οικογένειας WNT της εκκρίνεται γλυκοπρωτεϊνών λιπίδια τροποποιημένα, είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστή του μια σειρά από αναπτυξιακές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων των άκρων σχηματισμού, του πνεύμονα μορφογένεση, εντερική επιμήκυνση και ανάπτυξη του μαστικού αδένα. Η αλλαγμένη έκφραση WNT5A έχει συσχετιστεί με έναν αριθμό καρκίνων. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε ορισμένους τύπους καρκίνων, όπως αιματολογικές κακοήθειες και ορθοκολικό καρκίνωμα, WNT5A αδρανοποιείται και ασκεί μια λειτουργία κατασταλτική του όγκου, ενώ σε άλλους καρκίνους, όπως μελάνωμα και γαστρικό καρκίνωμα, WNT5A υπερεκφράζεται και προωθεί την εξέλιξη του όγκου. Ο μηχανισμός με τον οποίο WNT5A επιτυγχάνει αυτούς τους διακριτές δραστηριότητες σε καρκίνους είναι ελάχιστα κατανοητή. Εδώ, θα παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το

WNT5A

γονίδιο παράγει δύο ισομορφές της πρωτεΐνης, WNT5A μήκους (WNT5A-L) και WNT5A-short (WNT5A-S). Αμινο-τερματικής αλληλουχίας και ένα ειδικό αντίσωμα WNT5A-L δείχνουν ότι τα ώριμα και εκκρίνεται ισομορφές είναι διακριτές, με WNT5A-L φέρει ένα επιπλέον 18 Ν-τερματικά αμινοξέα. Βιοχημική ανάλυση δείχνει ότι και οι δύο καθαρισμένες πρωτεΐνες είναι παρόμοιες όσον αφορά την σταθερότητα, υδροφοβία τους και δραστικότητα σηματοδότησης WNT /β-κατενίνης. Παρ ‘όλα αυτά, η διαμόρφωση αυτών των δύο

WNT5A

ισομορφές, είτε μέσω έκτοπη έκφραση ή knockdown, αποδεικνύει ότι ασκούν διακριτές δραστηριότητες σε κυτταρικές σειρές καρκίνου: ενώ WNT5A-L αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών γραμμών όγκου, WNT5A-S προάγει την ανάπτυξη τους . Τέλος, δείχνουμε ότι η έκφραση αυτών των δύο ισομορφών WNT5A μεταβάλλεται σε μαστού και του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα, καθώς και στις πιο επιθετικούς όγκους νευροβλαστώματος. Σε αυτούς τους καρκίνους, WNT5A-L είναι συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω, ενώ WNT5A-S βρίσκεται υπερεκφρασμένη σε ένα σημαντικό κλάσμα των όγκων. Συνολικά, η μελέτη μας παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι οι διακριτές δραστηριότητες της WNT5A στον καρκίνο μπορεί να αποδοθεί στην παραγωγή των δύο

WNT5A

ισομορφές.

Παράθεση: Bauer Μ, Benard J, Gaasterland Τ, Willert Κ, Cappellen D (2013)

WNT5A

κωδικοποιεί δύο ισομορφές με διακριτές λειτουργίες σε καρκίνους. PLoS ONE 8 (11): e80526. doi: 10.1371 /journal.pone.0080526

Επιμέλεια: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Ιούλη 2013? Αποδεκτές: 14 Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 18, Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Bauer et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από την Ένωση pour la Recherche sur le Καρκίνο (DC), το Institut National du Cancer (JB), Société Française des καρκίνοι de l’Enfant (JB), η Ευρωπαϊκή συνδετικού ιστού Δίκτυο για τον Καρκίνο (DC και MB) και από το California Institute for αναγεννητικής Ιατρικής (CIRM, RB1-01406, KW). MB απονεμήθηκε υποτροφίες από το Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche και από CIRM (TG2-01154). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το

WNT5A

γονίδιο κωδικοποιεί ένα από τα WNT μελών της οικογένειας συνδέτη 19. Μέσω σύνδεσης προς FZD (Frizzled) [1], ROR1 /2 (τυροσίνης υποδοχέα κινάση όπως ορφανοί υποδοχείς) [2,3] ή Ryk (Receptor-όπως κινάσης τυροσίνης) [4] υποδοχείς και LRP5 /6 (υποδοχέα της λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας -σχετικών πρωτεϊνών) συν-υποδοχείς [5,6], WNT πρωτεΐνες ρυθμίζουν την κανονική οδό σηματοδότησης WNT /β-κατενίνης, καθώς και μια σειρά από μη-κανονικών β-κατενίνης ανεξάρτητη οδούς [7,8]. WNT οδοί παίζουν σημαντικούς ρόλους κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης και ιστούς ενηλίκων ομοιόσταση με ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, πολλαπλασιασμού, επιβίωσης, προσκόλληση και μετανάστευση. Μεταβολές στη σηματοδότηση Wnt συχνά σχετίζονται με ογκογένεση [7-9]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, παρεκκλίνουσα έκφραση ορισμένων Wnts, αδρανοποίηση μεταλλάξεις των APC και αξίνη όγκου καταστολείς και ογκογόνες μεταλλάξεις ενεργοποίησης του β-κατενίνης (CTNNB1) έχουν δειχθεί ότι συμβάλλουν στην μεταμόρφωση των κυττάρων μέσω απορύθμιση των γονιδίων, όπως

c-MYC

και

CCND1

(κυκλίνη D1). Επιγενετική αποσιώπηση γονιδίων που κωδικοποιούν ανταγωνιστές WNT, όπως το διαλυτό υποδοχείς δολώματα SFRP (εκκρινόμενη Frizzled σχετική Πρωτεΐνη) ή DKK, οδηγεί επίσης σε απορρύθμιση της οδού και έχει παρατηρηθεί σε αρκετές καρκίνους [7]. Μια πρόσφατη ολοκληρωμένη μελέτη των καρκίνων του παχέος εντέρου βρέθηκε ότι πάνω από το 94% των καρκίνων φέρουν μεταλλάξεις σε ένα ή περισσότερα συστατικά σηματοδότηση Wnt [10].

Μεταξύ WNT συστατικά σηματοδότησης που εμπλέκονται στην ογκογένεση, WNT5A είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα: ενεργεί τόσο ως ογκοπρωτεΐνη και ένα ογκοκατασταλτικό. Σε μελανώματα και γαστρικών και παγκρεατικών καρκινωμάτων,

WNT5A

είναι σε επαναλαμβανόμενη υπερεκφράζεται και ασκεί μια προ-ογκογόνο λειτουργία με την προώθηση του πολλαπλασιασμού και /ή την προσβολή και μετάσταση [11-16]. Σε αντίθεση,

Wnt5a

ετερόζυγα ποντίκια έχουν προδιάθεση να αναπτύξουν λέμφωμα Β κυττάρων μέσω της απώλειας της λειτουργίας Wnt5a, και

WNT5A

γονίδιο αδρανοποίηση από σωματικά διαγραφές ή υπερμεθυλίωση είναι συχνή στην ανθρώπινη λευχαιμία, το λέμφωμα και ορθοκολικού καρκινώματος [17-20]. Επιπλέον, WNT5A αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό της λευχαιμίας, του λεμφώματος και ορθοκολικό καρκίνωμα κυττάρων, καταδεικνύοντας κατασταλτικής του όγκου λειτουργία της σε αυτούς τους καρκίνους [17,19,20]. Τέλος, εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι

WNT5A

έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθρώπινα καρκινώματα του μαστού και παίζει ένα ρόλο καταστολέα όγκων με αναστολή του πολλαπλασιασμού και /ή μετάστασης [21-24]. Οι διαφορές στο ρεπερτόριο υποδοχέα WNT, και ως εκ τούτου στα μονοπάτια σηματοδότησης ενεργοποιούνται από WNT5A [3,12-14,17,21,22,25-27], θα μπορούσε να εξηγήσει αυτά τα αντιτιθέμενες δραστηριότητες του WNT5A στον καρκίνο. Εδώ, ερευνήσαμε έναν εναλλακτικό μηχανισμό με τον οποίο θα μπορούσε να ασκήσει WNT5A τις ξεχωριστές δραστηριότητες, δηλαδή μέσω της έκφρασης και η παραγωγή του διακριτές ισομορφές WNT5A. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι μια αμινο-καταληκτικώς διακλαδισμένη WNT5A ισομορφή εκθέματα όγκο προώθηση δραστηριοτήτων, ενώ η πρωτεΐνη WNT5A πλήρους μήκους εμφανίζει δραστηριότητες ογκο-κατασταλτικά.

Αποτελέσματα

Η

WNT5A

γονίδιο κωδικοποιεί δύο ισομορφές της πρωτεΐνης

Για να διαπιστώσετε εάν

WNT5A

κωδικοποιεί διάφορες ισομορφές της πρωτεΐνης, αναλύσαμε ακολουθίες εναποτίθενται σε βάσεις δεδομένων και έψαξε για πιθανές εναλλακτικές μεταγραφές. Βρήκαμε το

WNT5A

γονίδιο παράγει τουλάχιστον 3 πιθανά

WNT5A

μεταγραφές από εναλλακτικά έναρξης της μεταγραφής sites. Ένα μεταγράφημα εκκινεί στο εξόνιο 1 [19,20,28] και προβλέπεται για να κωδικοποιεί ένα πρόδρομο 380 αμινοξέων πρωτεΐνη WNT5A, από εδώ και στο εξής αναφέρεται ως WNT5A-L (Long) (Σχήματα 1Α, Β? Σχήματα S1A και S1B). Οι άλλες δύο μεταγραφές κινήσει 718 και 578 νουκλεοτίδια ανοδικά του εξονίου 2, σε μια εναλλακτική εξόνη 1β (Σχήμα 1Α? Σχήματα S1A και S1B). Και οι δύο εξόνιο 1β-κινηθεί μεταγραφές προβλέπεται ότι κωδικοποιεί μια 365 ή 360 αμινοξέων (ανάλογα με τη χρήση του κωδικονίου έναρξης στην θέση 16 ή 21 σε σχέση με το κωδικόνιο έναρξης του WNT5A-L) πρόδρομη πρωτεΐνη, που αναφέρεται ως WNT5A-S (Short), και στερούνται τα πρώτα 15 ή 20 Ν-τελικά αμινοξέα σε σύγκριση με τον πρόδρομο WNT5A-L ([29]? Σχήματα 1Α, Β? Σχήματα S1A και S1B).

Α. Δομή του ανθρώπινου

WNT5A

γονίδιο και εναλλακτικές μεταγραφές. Αριθμημένα κουτιά δείχνουν τα εξώνια, με 5 ‘και 3’ αμετάφραστες (UTR) περιοχές σε γκρι και κωδικοποίησης περιοχές σε μαύρο χρώμα. nt: νουκλεοτίδια, kb: βάση κιλό. Μπλε και κόκκινα βέλη και διακεκομμένες γραμμές υποδεικνύουν αντιστοίχως τις θέσεις των διαφόρων θέσεων έναρξης της μεταγραφής στο εξόνιο 1 και το εξόνιο 1β και μάτισμα του εξονίου 1 και εξονίου 1β-κινηθεί μεταγραφές. Μπλε και κόκκινα αστέρια δείχνουν τα κωδικόνια έναρξης μετάφρασης για τις ισομορφές WNT5A-L και WNT5A-S βρίσκεται στο εξόνιο 1 και το εξόνιο 2, αντίστοιχα. Μπλε και βέλη κόκκινο κεραυνό δείχνουν τη θέση των ακολουθιών στόχων του

WNT5A-L

και

WNT5A-S

συγκεκριμένες σύντομης παρεμβολής RNA (siRNA). B. ευθυγράμμιση αλληλουχίας πολλαπλών αμινοξέων του Ν-άκρου των πρόδρομων WNT5A πρωτεΐνες. Το μπλε Μ δηλώνει το κωδικόνιο πιο πιθανή έναρξη της WNT5A-L, ενώ το κόκκινο κα χαρακτηρίζει τις περισσότερες πιθανότητες να ξεκινήσει κωδικόνια του WNT5A-S. Τα γκρίζα βέλη υποδεικνύουν τις θέσεις των θέσεων διάσπασης πεπτιδίου σήματος και για τις δύο ισομορφές όπως προβλέπεται από SignalP 4.1 (https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Μπλε και κόκκινα βέλη δείχνουν τη θέση των παρατηρούμενων πρώτα αμινοξέα της ώριμης WNT5A-L και πρωτεΐνες WNT5A-S, αντίστοιχα, και έτσι τη θέση της παρατηρούμενης θέση διάσπασης πεπτιδίου σήματος για κάθε ισομορφή. Γ Ανίχνευση καθαρισμένες ισομορφές WNT5A. Αριστερό πλαίσιο: ανοσο-κηλίδα για WNT5A αποδεικνύει ότι και οι δύο ισομορφές είναι παρόμοιου μοριακού βάρους (

≈43kDa). Δεξιά πίνακα: Coomassie χρωματισμένο ζελέ δείχνει ότι οι καθαρίζεται προετοιμασίες WNT5A είναι καθαρά με μεγάλο βαθμό ανιχνεύσιμα πρωτεΐνες μολυσματικό. D. Ένα Wnt5a αντίσωμα αντι-ποντικού ανιχνεύει και τις δύο ισομορφές (αριστερό πάνελ), ενώ ένα αντι-κουνελιού WNT5A-L ειδικό αντίσωμα (δεξί πάνελ) ανιχνεύει την WNT5A-L, αλλά όχι η ισομορφή WNT5A-S.

Ε. Triton

Χ-114 διαχωρισμού φάσης καταδεικνύει ότι τόσο WNT5A ισομορφών διαμέρισμα στο υδρόφοβο /οργανική φάση. πρωτεΐνες WNT5A ανιχνεύθηκαν με ανάλυση ανοσο-στυπώματος με ένα αντίσωμα αντι-Wnt5a. F. Η επώαση του καθαρισμένου ισομορφές WNT5A στους 37 ° C για τους ενδεικνυόμενους χρόνους δείχνει ότι

σε

vitro

σταθερότητα τους είναι παρόμοια. πρωτεΐνες WNT5A ανιχνεύθηκαν όπως στο Ε και εντάσεις ζωνών ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Η

Η συνολική δομή εξονίου-ιντρονίου του ανθρώπινου

WNT5A

γονίδιο είναι εντόνως διατηρημένη σε άλλα σπονδυλωτά, συμπεριλαμβανομένων ποντίκι, κοτόπουλο και ψάρι ζέβρα (Εικόνα S2A). Η

WNT5A

γονίδιο είναι χωρισμένο σε 5 συντηρημένη εξώνια. Το μήκος, ακολουθία, και θέσεις ματίσματος στα κωδικόνια σε όλη εξώνια 2-5 είναι πολύ συντηρημένες. Η αμετάφραστη περιοχή του εξονίου 1 είναι περισσότερο αποκλίνει, αλλά η θέση ματίσματος διατηρείται. Αυτή η διάταξη εξονίου-ιντρονίου διατηρείται επίσης στην στενά συνδεδεμένη

WNT5B

γονίδιο, όπως σχολιασμένο γονιδιώματα θηλαστικών. Είναι ενδιαφέρον ότι η εναλλακτική λύση 1β εξόνιο, το οποίο είναι ενσωματωμένο στο πρώτο ιντρόνιο, είναι επίσης παρούσα σε αυτές τις σπονδυλωτά. Στα ποντίκια, το εξόνιο 1β ανιχνεύεται σε εναλλακτικές μεταγραφές Wnt5a και μοιράζεται σημαντική ομολογία με την ανθρώπινη ακολουθία. Σε μια ανά ζεύγος ευθυγράμμιση, το στοιχείο που περιλαμβάνει την προς την αντίθετη κατεύθυνση ρυθμιστική περιοχή και το εξώνιο 1 β είναι 95% διατηρημένη μεταξύ ανθρώπου και ποντικού (Σχήμα S2B). Στα πτηνά (κοτόπουλα και zebra finch), αυτή η εναλλακτική λύση δεν έχει εξόνιο επισημάνθηκαν, αλλά η παρουσία ενός εξαιρετικά διατηρημένη αλληλουχία με ένα δότη ματίσματος στο άκρο 3 ‘δείχνει ότι αυτό το εξώνιο 1β είναι παρούσα. Η ζεύγη ευθυγράμμιση μεταξύ κοτόπουλο και zebra finch αυτού του στοιχείου δείχνει τη διατήρηση 96%. Επιπλέον, δύο σύντομες αλληλουχίες εντός αυτών των στοιχείων είναι εξαιρετικά διατηρημένες μεταξύ θηλαστικών (ποντικού και ανθρώπου) και πτηνά (κοτόπουλα και zebra finch) (Σχήμα 2Β). Ψάρια (zebrafish και stickleback) περιέχουν επίσης μια εξαιρετικά διατηρημένη στοιχείο μέσα σε αυτή την περιοχή. Αν και το στοιχείο αυτό δεν έχει σχολιάζονται ως ένα εξώνιο σε οποιαδήποτε βάση δεδομένων, η αυξημένη διατήρηση (74%) υποδεικνύει την παρουσία ενός επιπλέον εξόνιο στα ψάρια (Σχήμα 2Β). Μαζί, η παρατηρούμενη υψηλός βαθμός διατήρησης της αλληλουχίας γενωμικού υποδηλώνει ότι οι εναλλακτικές μεταγραφές Wnt5a, παρόμοια με αυτά που περιγράφονται εδώ, υπάρχουν σε πολλαπλά είδη σπονδυλωτών. Τέλος, η ευθυγράμμιση των αμινο-τερματικών αμινοξέων του δείχνει ανθρώπου, ποντικού και Wnt5a κοτόπουλο που κωδικόνιο έναρξης Μ21 (θέση σε σχέση με το κωδικόνιο έναρξης του WNT5A-L) είναι πλήρως διατηρημένη (Εικόνα 1Β), υποδηλώνοντας ότι WNT5A-S εκκινεί στη θέση αυτή.

και οι δύο πρωτεΐνες WNT5A μπλοκάρουν Wnt3A-ενεργοποίηση των β-κατενίνης /TCF με γνώμονα την μεταγραφική δραστηριότητα σε ΗΕΚ 293 (TOP-λουσιφεράση, Α) και MDA-MB-231 (TOP-GFP δημοσιογράφος, Β). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με καθαρισμένη Wnt3A και μία αυξανόμενη συγκέντρωση WNT5A για 24 ώρες (Α) ή 48 ώρες (Β). C. Μετά την επιμόλυνση, τα δύο ισόμορφα WNT5A παρεμβαίνουν με ενδογενή (MDA-MB-231, αριστερό πάνελ) και WNT1 επαγόμενη (HeLa, δεξί πάνελ) β-κατενίνης /TCF-καθοδηγούμενη μεταγραφή σε MDA-MB-231 (αριστερό πάνελ) και κύτταρα HeLa (δεξί πάνελ). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορείς ελέγχου, WNT5A-L ή έκφραση WNT5A-S μόνο, ή μαζί με έναν φορέα έκφρασης WNT1 και αναλύθηκαν για β-κατενίνης /TCF γνώμονα TOP-δραστικότητας ανταποκριτή λουσιφεράσης. Ένας φορέας έκφρασης που κωδικοποιεί μία κυρίαρχη-αρνητική μορφή του TCF4 (ΔNTCF4) χρησιμοποιήθηκε για να παρεμβαίνει με την ενδογενή δραστηριότητα ανταποκριτή σε MDA-MB-231 κύτταρα. Δ Τόσο WNT5A ισομορφές προώθηση DVL φωσφορυλίωση. κύτταρα L (αριστερό πάνελ) και κύτταρα C2C12 (δεξί πάνελ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ισομορφές WNT5A (10 ηΜ, 2 ώρες) και λύματα ολόκληρων κυττάρων ανοσο-κηλιδώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Και οι δύο ισομορφές WNT5A, καθώς και Wnt3A (10 ηΜ, 2 ώρες), οδήγησαν σε μετατόπιση κινητικότητας των πρωτεϊνών Dvl1 και Dvl2, υποδηλώνοντας ότι ϋνΙ πρωτεΐνες είναι μετα-μεταφραστικά τροποποιημένο με φωσφορυλίωση σε απόκριση τόσο κανονική (Wnt3A) και μη κανονικών Wnt (WNT5A) σηματοδότησης. Μόνο Wnt3A επαγόμενη συσσώρευση της πρωτεΐνης β-κατενίνης. Σημείωση: β-κατενίνης συσσώρευση σε απόκριση προς Wnt3A σε κύτταρα C2C12 δεν είναι ανιχνεύσιμη σε αυτές ολόκληρο κυτταρολύματα επειδή τα κύτταρα αυτά περιέχουν μεγάλες ποσότητες μεμβράνης /προσφύσεως συνδέεται διασταύρωση β-κατενίνης

Η

Όπως είναι η περίπτωση. για τις περισσότερες εκκρινόμενες πρωτεΐνες, οι πρόδρομοι Wnt διασπώνται στο αμινοτελικό άκρο για να απομακρυνθεί η αλληλουχία σήματος παράγοντας έτσι την ώριμο πολυπεπτίδιο. Ένα πεπτίδιο σήμα αλγόριθμο πρόβλεψης διάσπαση (

SignalP 4.1

– https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) προβλέπει ότι τόσο οι πρόδρομοι WNT5A αποδώσει πρωτεΐνες είτε 343 αμινοξέα (εκκίνηση με QVVIEA … ) ή 338 αμινοξέων (ξεκινήστε με ANSWWS …). Η τελευταία προβλεπόμενη θέση αποκοπής έχει την υψηλότερη βαθμολογία διάσπαση (Y-score των 0.625 για WNT5A-S [ξεκινούν από Μ21] και 0.246 για WNT5A-L). Ωστόσο, αμινο-τερματική αλληλούχιση του ποντικιού Wnt5a έδειξε ότι η διάσπαση αλληλουχίας-σηματοδότη συνέβη σε μια θέση 24 υπολείμματα καθοδικά από την προβλεπόμενη περιοχή [3]. Επιπλέον, δεδομένου ότι το 15 αμινοξέων διαφορά στην Ν-τερματική αλληλουχία του WNT5A-L και προδρόμων WNT5A-S μπορεί να επηρεάσει την θέση διάσπασης πεπτιδίου-σηματοδότη, μπορούμε πειραματικά προσδιορισμένη την ταυτότητα του αμινο άκρα των ώριμων πρωτεϊνών.

Για να προσδιοριστεί η θέση της διάσπασης του πεπτιδίου σήματος και του πρώτου αμινοξέος των ώριμων πρωτεϊνών, καθαρίσαμε και τις δύο ισομορφές WNT5A. Χρησιμοποιώντας ένα προηγουμένως αναπτυχθεί σύστημα έκφρασης CHO [30], μπορούμε ανεξάρτητα υπερεκφράζεται κάθε ισομορφή WNT5A και τους καθαρίζεται από το ρυθμισμένο μέσο (CM), σύμφωνα με τα δημοσιευμένα πρωτόκολλα [3,31]. Και οι δύο ισομορφές WNT5A εκκρίθηκαν εντός του CM σε ίσα επίπεδα (τα δεδομένα δεν φαίνονται), και καθαρίστηκαν προς ομοιογένεια κοντά (~ 95% καθαρό, όπως αξιολογήθηκε με χρώση Coomassie, Σχήμα 1 C). Αμινο-τερματικής αλληλουχίας έδειξε την καθαρισμένη WNT5A-L πρωτεΐνη για να ξεκινήσει ένα αμινοξύ κατάντι της προβλεπόμενης θέσης διάσπασης του πεπτιδίου σήματος, δημιουργώντας έτσι μια πρωτεΐνη 337 αμινοξέων αρχίζοντας με την αλληλουχία NSWWS … (Εικόνα 1Β? Σχήμα S1B και S1c). Το εκκρινόμενο WNT5A-S πρωτεΐνη έλειπε ένα επιπλέον αμινο-τερματικό αμινοξύ 18 για να δημιουργήσει μια πρωτεΐνη 319 αμινοξέων αρχίζοντας με την αλληλουχία IIGAQ … (Εικόνα 1Β? Σχήμα S1B και S1c). Ως εκ τούτου, οι δύο ισομορφές παράγουν πρωτεΐνες με διακριτές αλληλουχίες αμινοξέων τερματικού. Το αμινο-τελικό άκρο WNT5A-S ταιριάζει με αυτή του Wnt5a ποντικού, το οποίο είχε προηγουμένως εντοπιστεί από αμινο-τερματικό πεπτίδιο αλληλούχιση [3]. Είναι ενδιαφέρον, ο αλγόριθμος διάσπασης του πεπτιδίου σήματος δεν προέβλεψαν αυτή τη θέση ως πιθανή τοποθεσία της διάσπασης της αλληλουχίας σήματος είτε για WNT5A-L ή WNT5A-S (Y-βαθμολογία 0,16 για WNT5A-S και 0.113 για WNT5A-L).

για να επιβεβαιωθεί η διακριτή αμινο τερματικό σύνθεση των δύο ώριμων ισομορφών WNT5A, δημιουργήσαμε ένα αντίσωμα που κατευθύνεται προς το WNT5A-L-ειδικών 18 αμινοξέων (NSWWSLGMNNPVQMSEVY). Σε ανοσο-στυπώματα, το αντίσωμα WNT5A-L-ειδικό αναγνωρίζεται μόνο WNT5A-L και δεν WNT5A-S (Σχήμα 1 D). Αυτό αποδεικνύει ότι η εξόνιο 1 και το εξόνιο 1β-κινηθεί

WNT5A

μεταγραφές παράγουν διακριτές πρωτεΐνες WNT5A που διαφέρουν στην αμινο άκρα τους. Ο μηχανισμός με τον οποίο αυτές οι δύο πρόδρομοι διαφορικά σε επεξεργασία για να δώσει διακριτές ώριμες πρωτεΐνες προς το παρόν ασαφής, ωστόσο, εικάζουν ότι οι διαφορές στα αμινο άκρα επηρεάζουν την επιλογή του μηχανήματος επεξεργασίας προς διάσπαση των πρωτεϊνών σε διακεκριμένες θέσεις. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για την αντιμετώπιση αυτών των ζητημάτων.

πρωτεϊνών WNT είναι εξαιρετικά υδρόφοβο, μια ιδιότητα που προσδίδεται από την ομοιοπολική σύνδεση τουλάχιστον ένα λιπίδιο μόριο σε ένα συντηρημένο κατάλοιπο [31,32]. Η τροποποίηση αυτή είναι σημαντική για τη σωστή επεξεργασία και έκκριση [32,33]. Επιπλέον, όπως αποκαλύφθηκε από τη δομή συν-κρυστάλλου Wnt-Fzd, η χαρακτηριστική ομάδα λιπιδίου είναι κρίσιμες για τη δέσμευση του υποδοχέα [34]. Για την αντιμετώπιση αν οι δύο ισομορφές WNT5A διέφεραν σε υδρόφοβες ιδιότητες τους, και ως εκ τούτου σε λιπίδιο τροποποιήσεις τους, χρησιμοποιήσαμε την ιδιότητα διαχωρισμού φάσης του απορρυπαντικού Triton Χ-114. Δεν παρατηρήσαμε καμία διαφορά μεταξύ των δύο ισομορφές, καθώς και οι δύο κατανεμήθηκε εξίσου στην οργανική φάση (Σχήμα 1 Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι και τα δύο ισόμορφα παρομοίως τροποποιηθεί. Για να ελεγχθεί αν οι δύο ισομορφές διαφέρουν στην σταθερότητα τους, επωάσαμε κάθε πρωτεΐνης στους 37 ° C για μέχρι 60 ώρες. ανίχνευση ανοσο-κηλίδος έδειξε ότι αμφότερες οι πρωτεΐνες αποικοδομούνται σε ίσες τιμές (Σχήμα 1 F). Ως εκ τούτου, οι δύο ισομορφές WNT5A συμπεριφέρονται παρόμοια σε σχέση με την

in vitro

σταθερότητα και υδροφοβικότητα τους. Είναι, ωστόσο, πιθανό ότι κάθε ισομορφή έχει ξεχωριστές βιοχημικές ιδιότητες σε ένα

in vivo

ρύθμιση, μια δυνατότητα που δεν έχουν αντιμετωπιστεί.

Επιπτώσεις της WNT5A-L και WNT5A-S ισομορφές στη σηματοδότηση μονοπάτια

Αρκετές σηματοδότηση Wnt μονοπάτια έχουν περιγραφεί και προταθεί. Η πιο συχνά μελετηθεί και καλύτερα καθιερωμένες μονοπάτι, που συχνά αναφέρεται ως η κανονική οδό WNT, περιλαμβάνει β-κατενίνη ως κεντρικό μεσολαβητής. Άλλα μη κανονικών μονοπατιών, η οποία ενεργεί ανεξάρτητα από β-κατενίνης, είναι ελάχιστα κατανοητές. Κατά το ελάχιστο, οι δύο αυτές οδοί σκέφτηκε να μοιραστεί τα ακόλουθα στοιχεία: συνδέτες WNT, υποδοχείς FZD και Dishevelled (DVL) μετατροπείς σήματος. Αν και WNT5A κατά κύριο λόγο συνδέονται με την μη κανονικά σηματοδότηση WNT, έχει επίσης βρεθεί ότι ενεργοποιούν κανονική σηματοδότηση β-κατενίνης σε ορισμένες συνθήκες [3]. Ερευνήσαμε αν οι ισομορφές WNT5A διαφορικά επηρεάσουν το /TCF σηματοδοτικό μονοπάτι της β-κατενίνης. Για το σκοπό αυτό, δημιουργήσαμε δύο κυτταρικές σειρές, ΗΕΚ 293 και MDA-MB-231, που φέρει ένα WNT /β-κατενίνης σύστημα ειδικού ανταποκριτή. Αυτό το σύστημα αναφοράς αποτελείται από ένα στοιχείο απόκρισης WNT αποτελείται από 7 πολυμερισμένες θέσεις πρόσδεσης TCF (που αναφέρεται ως κορυφή για TCF Optimal Promoter [35,36]), η οποία ρυθμίζει την έκφραση ενός γονιδίου αναφοράς, είτε κύτταρα λουσιφεράσης για ΗΕΚ 293 (HEK293- TOP-λουσιφεράσης, Σχήμα 2Α? Σχήμα S3A) ή GFP για MDA-MB-231 κύτταρα (MDA-MB-231-TOP-GFP, Σχήμα 2Β? Σχήμα S3b). Αυτά τα κύτταρα ανταποκριτού ισχυρώς ενεργοποιούνται από Wnt3A (Σχήμα 2Α και Β), ένα WNT πρωτεΐνη που χρησιμοποιείται συνήθως για την τόνωση της κανονικής οδού σηματοδότησης. Σε αντίθεση, ούτε WNT5A ισομορφή ενεργοποιείται ή σταθερά διαμορφωμένη την βασική δραστηριότητα αυτών των ρεπόρτερ (Σχήμα S3A και S3b), υποδεικνύοντας ότι αυτά τα κυτταρικά συστήματα δεν παρέχουν την κατάλληλη περιβάλλον για τη σύνδεση WNT5A σηματοδότησης με την κανονική οδό β-κατενίνης.

Ευαίσθητες και ισχυρή δοκιμασίες με βάση κύτταρα για τη μη κανονική σηματοδότηση WNT είναι λιγοστές. Ωστόσο, η μη κανονική σηματοδότηση WNT έχει αποδειχθεί ότι ανταγωνίζεται σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης, μια δραστηριότητα που μπορεί να προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας το σύστημα TOP-ρεπόρτερ [3]. Βρήκαμε ότι και οι δύο ισομορφές WNT5A αναστέλλουν την ενεργοποίηση ρεπόρτερ Wnt3A επαγόμενη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2 Α και Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, παρά τη διαφορά αμινο-άκρα τους, και οι δύο πρωτεΐνες WNT5A ανταγωνίζονται ισχυρά την σηματοδότηση /β-κατενίνης WNT. Παρόμοιες ανασταλτικές δράσεις του WNT5A-L και WNT5A-S ισομορφές για το WNT /β-κατενίνης με γνώμονα ρεπόρτερ παρατηρήθηκαν όταν κύτταρα μορφομετατράπηκαν με φορείς έκφρασης (Σχήμα 2C) και όχι υπό θεραπεία με καθαρισμένη WNT5A-L και πρωτεΐνες WNT5A-S. Ως εκ τούτου, σε αυτές τις δοκιμασίες, οι ισομορφές WNT5A εμφανίζουν παρόμοιες βιολογικές δραστηριότητες όταν παραδίδεται ως καθαρισμένες πρωτεΐνες ή επιμολυσμένα γονίδια.

σηματοδότηση Wnt, κανονικά και μη κανονικά, οδηγεί στην υπερφωσφορυλίωση πρωτεϊνών ϋνΙ, μόρια που δρουν αμέσως κατάντη των υποδοχέων FZD σηματοδότησης. Αυτή η μετα-μεταφραστική τροποποίηση των πρωτεϊνών ϋνΙ μπορεί να ανιχνευθεί εύκολα με μία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας [37-39]. Βρήκαμε ότι η θεραπεία των δύο κυτταρικών γραμμών (κύτταρα ποντικού L και το μυοβλαστών ποντικού κυτταρική γραμμή C2C12) είτε με WNT5A ισομορφή, καθώς και Wnt3A, προκαλεί μια μετατόπιση της κινητικότητας των πρωτεϊνών ϋνΙ, όπως ανιχνεύεται με ανοσο-κηλίδωση για Dvl1 και Dvl2 (Εικόνα 2D). Ωστόσο, σε συμφωνία με τις διακριτές δραστηριότητες του Wnt3A και ισομορφών WNT5A για σηματοδότηση WNT /β-κατενίνης (Σχήματα 2Α, 2Β? Σχήμα S3A, S3b), μόνο Wnt3A, αλλά όχι ισομορφές WNT5A, επαγόμενη συσσώρευση της πρωτεΐνης β-κατενίνης, όπως αποδεικνύεται σε κύτταρα L. Αυτή η συσσώρευση της πρωτεΐνης β-κατενίνης δεν είναι εμφανής σε κύτταρα C2C12, τα οποία εκφράζουν ήδη υψηλά επίπεδα β-κατενίνης (Σχήμα 2D). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι οι δύο ισομορφές WNT5A εμφανίζουν όμοια βιολογικές δραστηριότητες στην καθιερωμένη βασισμένη σε κύτταρα WNT δοκιμασίες σηματοδότησης.

Η έκφραση των ισομορφών WNT5A σε κυτταρικές σειρές καρκίνου και φυσιολογικούς ιστούς

Προηγούμενες μελέτες της έκφρασης WNT5A δεν διακρίσεις μεταξύ των δύο ισομορφών που περιγράφονται εδώ. Συνεπώς, μετρήσαμε τα επίπεδα μεταγραφής τους σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και σε φυσιολογικούς ιστούς, εκτελώντας ποσοτικής RT-PCR (qRT-PCR) με ισομορφής-ειδικούς εκκινητές (βλέπε Πίνακα S1 και το σχήμα S1). Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση αυτών των ισομορφών είναι εξαιρετικά μεταβλητή μεταξύ των επιμέρους κυτταρικών γραμμών καρκίνου. Για παράδειγμα, ενώ MDA-MB-231 (που προέρχεται από ένα καρκίνωμα του μαστού) και SH-SY5Y (που προέρχεται από ένα νευροβλάστωμα) εκφράζουν κυρίως

WNT5A-L

, κύτταρα HeLa (προερχόμενη από ένα καρκίνωμα τραχήλου της μήτρας) εκφράζουν κυρίως

WNT5A-S

(Σχήμα 3Α). Άλλες κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων MCF-7 (που προέρχεται από ένα καρκίνωμα μαστού) ή IMR-32 (που προέρχεται από ένα νευροβλάστωμα) εκφράζουν εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα είτε WNT5A ισομορφή (Σχήμα S4A). Αν και λιγότερο ποσοτική, η ανάλυση γέλης των τελικού σημείου RT-PCR προϊόντων που λαμβάνονται από αντιπροσωπευτικές κυτταρικές γραμμές επιβεβαίωσαν τα δεδομένα qRT-PCR (Σχήμα S4A). Είμαστε δίπλα ανέλυσε τα επίπεδα μεταγραφής των ισομορφών WNT5A σε φυσιολογικούς ιστούς ενήλικα. Διαπιστώσαμε

WNT5A-L

έκφραση σχεδόν σε όλους τους ιστούς, εκτός από τον λιπώδη ιστό. Σε αντίθεση, ανιχνεύσαμε

WNT5A-S

έκφραση μόνο στον πλακούντα, και, σε μικρότερο βαθμό, στην τραχεία και το λεπτό έντερο (Σχήμα S4B).

Α. έκφραση ισομορφή WNT5A σε τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές. επίπεδα μεταγραφής του

WNT5A

ισομορφές προσδιορίστηκαν σε MDA-MB-231 (καρκίνωμα του μαστού), HeLa (καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας), και SH-SY5Y (νευροβλάστωμα) με qRT-PCR και κανονικοποιήθηκαν από

EF1-α

mRNA (κανονικοποίηση από

GAPDH

mRNA και

18S rRNA

παράγονται παρόμοια αποτελέσματα). Οι μέσες αναλογίες (

WNT5A

ισομορφές /

EF1-α

) ± SEM από ανεξάρτητες μετρήσεις εμφανίζονται. B. Επιπτώσεις της έκτοπη έκφραση της WNT5A-L και WNT5A-S ισομορφών στον πολλαπλασιασμό. Οι ενδεικνυόμενη κυτταρικές γραμμές μετήχθησαν με φορείς έκφρασης που κωδικοποιούν WNT5A-L (μπλε γραμμή), WNT5A-S (κόκκινη γραμμή) ή καθόλου αριθμούς κυττάρων WNT (μαύρη γραμμή) και προσδιορίστηκαν στους 3 και 6 ημέρες. WNT5A-S αυξήσεις, ενώ WNT5A-L μειώνει τα ποσοστά πολλαπλασιασμού. Τα δεδομένα (μέση τιμή ± SEM από προσδιορισμούς εις τριπλούν) από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα που φαίνεται. Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες φορές. Γ Ισόμορφης συγκεκριμένες siRNA που μειώνουν την έκφραση της κάθε ισομορφής WNT5A. Η αποτελεσματικότητα του WNT5A-L και WNT5A-S ισομορφή knockdown (KD) αξιολογήθηκε σε MDA-MB-231, HeLa και SH-SY5Y επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA και

WNT5A

ισομορφής ειδικά siRNA (KD).

WNT5A

ισομορφών επίπεδα μεταγραφής μετρήθηκαν με ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) και ομαλοποιήθηκε με

EF1-α

mRNA (ομαλοποίηση με

GAPDH

mRNA και

18S rRNA

παράγονται παρόμοια αποτελέσματα). D. Επιπτώσεις του siRNA με τη μεσολάβηση knockdown (KD) του WNT5A-L και WNT5A-S ισομορφές επί του πολλαπλασιασμού. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNAs ειδικά για WNT5A-L (μπλε γραμμή) ή WNT5A-S (κόκκινη γραμμή) και οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν στους 3 και 6 ημέρες. Μια ομελέτα siRNA χρησίμευσε ως έλεγχος (μαύρη γραμμή). Συν-μεταγωγή των κυττάρων με έναν φορέα έκφρασης WNT5A-S διασώζει την επίδραση του WNT5A-S-ειδικό siRNA (διακεκομμένη κόκκινη γραμμή). Τα δεδομένα (μέση τιμή ± SEM από προσδιορισμούς εις τριπλούν) από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα που φαίνεται. Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες φορές. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.005? ****

P

& lt? 0.001. ρύθμιση Ε Διαφορικές του

AXIN2

και

CDK8

έκφραση με ισομορφής ειδικά νοκ ντάουν της WNT5A. επίπεδα Απομαγνητοφώνηση του

AXIN2

και

CDK8

προσδιορίστηκαν με ποσοτική ανάλυση RT-PCR (κανονικοποιούνται

EF1-α

mRNA) σε έλεγχο της MDA-MB-231 (καρκίνωμα του μαστού ), HeLa (καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας) και SH-SY5Y (νευροβλάστωμα) κύτταρα, και σε απάντηση siRNA μεσολάβηση knock-down (KD) των WNT5A-L ή WNT5A-S. Σημαίνει αναλογίες ± SEM από τα ανεξάρτητες μετρήσεις εμφανίζονται.

Η

WNT5A-S προωθεί και WNT5A-L καταστέλλει την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου

Για να μελετήσει τις λειτουργίες των ισομορφών WNT5A, θα χειραγωγείται έκφρασή τους σε διάφορες κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων MDA-MB-231, HeLa και SH-SY5Y, και αναλύθηκαν η φαινοτυπική συνέπειες (Σχήμα 3Β-ϋ? Σχήμα S5). Δεδομένου ότι οι δραστηριότητες σηματοδότησης των καθαρισμένων πρωτεϊνών WNT είναι βραχύβια [30] και βιολογικές δοκιμασίες γενικά απαιτούν μακρές περιόδους διέγερσης, χρησιμοποιήσαμε επιμόλυνση

WNT

γονιδίων μάλλον παρά εφαρμογή των καθαρισμένων πρωτεϊνών. Η έκτοπη έκφραση του WNT5A-L μειωθεί σημαντικά οι αριθμοί των κυττάρων σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Β). Καμία ένδειξη αυξημένο κυτταρικό θάνατο παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι WNT5A-L δρα για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Σε αντίθεση, έκτοπη έκφραση της WNT5A-S προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων SH-SY5Y (Σχήμα 3Β) MDA-MB-231, HeLa και

Χρήση ισομορφής ειδικά siRNAs (βλέπε Σχήμα S1? Πίνακας S2)., Εμείς διαταραχθεί έκφραση κάθε WNT5A ισομορφής (Σχήμα 3C). Τα siRNAs ήταν σε θέση να knockdown ειδικά τους στόχους τους μέχρι και 80% όπως προσδιορίζεται με qRT-PCR (Σχήμα 3C). Είναι σημαντικό ότι, κάθε ισομορφή WNT5A εκλεκτικά αναστέλλεται από το αντίστοιχο siRNA χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα των άλλων ισομορφής. Συνεπής με τον πολλαπλασιασμό αποτελέσματα προαγωγής της WNT5A-S έκτοπη έκφραση, knockdown του WNT5A-S μειωμένους αριθμούς κυττάρων (Σχήμα 3D). Ακόμη και σε κύτταρα που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα WNT5A-S, όπως MDA-MB-231 (Σχήμα 3Α), knockdown της ισομορφής WNT5A-S παρήγαγε μια ισχυρή ανασταλτική επίδραση (Σχήμα 3D). Η αναστολή των κυττάρων που προκύπτουν από WNT5A-S siRNA διασώθηκε σε όλες τις δοκιμασμένες κυτταρικές γραμμές με συν-μεταγωγή με ένα φορέα WNT5A-S στερείται της αλληλουχίας στόχου siRNA (Σχήμα 3D, KD WNT5A-S + διάσωσης). Τα στοιχεία αυτά τη διάσωση αποδεικνύουν ότι τα αποτελέσματα αυτού του siRNA οφείλονται σε WNT5A-S knock-down παρά μη ειδικό off-στόχου αποτελέσματα. Επιπλέον, WNT5A-S knockdown αυξημένο κυτταρικό θάνατο στις τρεις κυτταρικές γραμμές (σχήμα S5A) και προκαλούμενη δραστηριότητα κασπάσης σε MDA-MB-231 και HeLa (Εικόνα S5B). Ωστόσο, η ≥3 φορές μείωση στους αριθμούς κυττάρου (Σχήμα 3D) υπερέβη την παρατηρήθηκε μέτρια αύξηση σε κυτταρικό θάνατο (Εικόνα S5A), υποδηλώνοντας ότι WNT5A-S knockdown κυρίως διαταραχή πολλαπλασιασμού. Σε αντίθεση, knockdown του WNT5A-L δεν είχε επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 3D), κυτταρικού θανάτου ή δραστηριότητα κασπάσης στα 3 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D? Σχήμα S5A, Β). Συνολικά, αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι η ενδογενώς και εκτοπικά εκφραζόμενη ισομορφές WNT5A εξασκούν διαφορετικά αποτελέσματα σε κυτταρικές σειρές του μαστού, του τραχήλου της μήτρας και όγκου νευροβλαστώματος, με WNT5A-S προώθηση και WNT5A-L αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Δεδομένου ότι δεν παρατηρήσαμε διακριτές δραστηριότητες σηματοδότηση για WNT5A-L και WNT5A-S σε WNT /β-κατενίνης και DVL δοκιμασίες φωσφορυλίωσης (Σχήμα 2), μπορούμε εικάζουν ότι η προώθηση και ανασταλτικές δραστικότητες των WNT5A αυτοί ανάπτυξης είναι ανεξάρτητη από την κανονική οδό σηματοδότηση Wnt .

Σε μια προσπάθεια να εντοπίσει έναν μηχανισμό με τον οποίο ισομορφές WNT5A ασκούν διαφορετικές επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό, θα προβληθεί την έκφραση αρκετών γνωστών WNT ρυθμίζονται τα γονίδια. Βρήκαμε ότι η έκφραση των δύο γονιδίων,

AXIN2

και

CDK8

, δύο από τα οποία έχουν εμπλακεί σε διάφορες πτυχές της σηματοδότηση Wnt [7,40,41], είχαν διαφορικά ρυθμίζονται από την ισομορφή συγκεκριμένες νοκ ντάουν της WNT5A. Εξόντωση WNT5A-L, αλλά όχι WNT5A-S, οδήγησε σε μείωση σε ποσοστό

AXIN2

έκφραση σε 3 δοκιμάστηκαν κυτταρικές γραμμές (MDA-MB-231, HeLa και SH-SY5Y, Σχήμα 3Ε). Σε αντίθεση, knockdown του WNT5A-S, αλλά όχι WNT5A-L, οδήγησε σε μια αύξηση σε ποσοστό

CDK8

έκφραση σε 2 από 3 κυτταρικές σειρές (MDA-MB-231 και HeLa) και μια μείωση στο SH- SY5Y (Σχήμα 3Ε). Αυτά τα δεδομένα προσφέρει μια πιθανή μοριακή σύνδεση μεταξύ των παρατηρούμενων διαφορικά αποτελέσματα των ισομορφών WNT5A στον πολλαπλασιασμό και γονιδιακή ρύθμιση και δείχνει ότι κάθε ισομορφή WNT5A προσκρούει επί της έκφρασης γονιδίου σε ένα ευδιάκριτο τρόπο. Περαιτέρω εξαντλητική μελέτες, όπως η ανάλυση μεταγραφικό, θα χρειαστεί να προσδιοριστούν και να καθοριστούν πορείες που διαμεσολαβούν αυτές τις διαφορικές επιδράσεις.

κάτω ρύθμιση των WNT5A-L και υπερέκφραση της ισομορφής WNT5A-S σε καρκίνους

Για να καθοριστεί αν η αντίστοιχη προ- και αντι-πολλαπλασιαστική λειτουργίες της WNT5A-S και WNT5A-L ισομορφές σχετίζονται με ογκογένεση, αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης τους με qRT-PCR σε δείγματα πρωτογενούς όγκου από το στήθος και τον τράχηλο καρκινώματα και νευροβλαστωμάτων. Σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς του μαστού,

WNT5A-L

ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω ≥3 φορές σε 46% (14 από 30) των καρκινωμάτων του μαστού (

P

= 0,04) (Σχήμα 4Α) .

WNT5A-S

ήταν μη ανιχνεύσιμη σε κανονικό ιστό μαστού και υπερεκφράζεται σε ένα μικρό υποσύνολο των καρκίνων του μαστού (4 από 30, 13%, Ν. S.) (Σχήμα 4Α). Σε φυσιολογικό επιθήλιο τραχήλου της μήτρας, και οι δύο

WNT5A-L

και

WNT5A-S

εκφράστηκαν,

WNT5A-L

είναι το κυρίαρχο ισόμορφο (Σχήμα 4Β). Σε σύγκριση με την κανονική του τραχήλου της μήτρας,

WNT5A-L

ήταν κάτω-ρυθμίζονται ≥3 φορές σε 53% (8 από 15) του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα (

P

= 0,047). Σε αντίθεση,

WNT5A-S

αυξορρυθμίστηκε ≥4 φορές σε 40% (6 από 15) αυτών των όγκων (

P

= 0,045) (Σχήμα 4Β). Νευροβλάστωμα, παιδιατρική καρκίνους του συμπαθητικού νευρικού συστήματος, μπορούν να ταξινομηθούν σε χαμηλού και υψηλού κινδύνου όγκους με 90% και 30% της επιβίωσης, αντίστοιχα. Το ήμισυ του υψηλού νευροβλάστωμα κινδύνου είναι θανατηφόρα εντός 2 ετών από τη διάγνωση [42]. Υψηλή νευροβλάστωμα κινδύνου έδειξε χαμηλή

WNT5A-L

έκφραση πιο συχνά από χαμηλή όγκους κινδύνου (55% -22 από 40- έναντι 21% -8 των 37-,

P

= 0.004), έτσι υποδηλώνοντας ότι WNT5A-L κάτω ρύθμιση συσχετίζεται με νευροβλάστωμα υψηλού κινδύνου. 0,01?