Αφηρημένο

Η λειχήνες ένωση usnic οξέος (UA) είναι μια λιπόφιλη ασθενές οξύ που λειτουργεί ως υπηρεσία μεταφοράς πρωτονίων και προκαλεί απώλεια του μιτοχονδριακού πιθανών εσωτερική μεμβράνη. Στην παρούσα μελέτη αποδεικνύουμε ότι η θεραπεία UA επάγεται ο σχηματισμός αυτοφαγοσώματα σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, αλλά είχε ελάχιστη επίδραση επί κανονικών ανθρώπινων ινοβλαστών. Ωστόσο, αυτοφαγικά ροή ήταν ελλιπής, η υποβάθμιση του περιεχομένου autophagosomal δεν συνέβη και η οξίνιση ήταν ελαττωματικό. UA-κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν μειωμένα επίπεδα ΑΤΡ και την ενεργοποίηση του ΑΜΡ κινάσης καθώς επίσης και σημάδια κυτταρικού στρες. UA είναι επομένως πιθανό να προκαλέσει το σχηματισμό autophagosome τόσο από τις συνθήκες εξάντληση ενέργειας και το άγχος. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το H

+ – μετακινούνται επίδραση της UA λειτουργεί όχι μόνο στα μιτοχόνδρια, όπως φαίνεται στο παρελθόν, αλλά και σε λυσοσώματα, και να έχουν επιπτώσεις για τη θεραπευτική χειραγώγηση της αυτοφαγία και pH-προσδιορίζεται διανομής φαρμάκων

. Παράθεση: Bessadottir Μ, Egilsson Μ, Einarsdottir Ε, Magnusdottir IH, Ogmundsdottir ΜΗ, Omarsdottir S, et al. (2012) Proton-μετακινούνται λειχήνα Ένωση Usnic οξύ Επηρεάζει μιτοχονδριακού και Λυσοσωμική Λειτουργία στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (12): e51296. doi: 10.1371 /journal.pone.0051296

Επιμέλεια: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, Γερμανία

Ελήφθη: 18 Ιουνίου 2012? Αποδεκτές: 31 του Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5, Δεκεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Bessadottir et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Eimskip Ταμείο διδακτορικού και το Πανεπιστήμιο της Ισλανδίας Ταμείου Έρευνας (www.hi.is). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

λειχήνες, η συμβίωση ανάμεσα σε μια μυκητιασική εταίρο και photobiotic μικροοργανισμό, βρίσκονται σε όλο τον κόσμο και να οδηγήσει σε ένα μεγάλο αριθμό μοναδικών δευτερογενών μεταβολιτών [1]. Το παράγωγο διβενζοφουρανίου, usnic οξύ (UA) είναι μια γνωστή δευτερογενής μεταβολίτης και έχει μελετηθεί σε κάποια έκταση [2]. Ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων έχει αναφερθεί για usnic οξέος, π.χ. αντι-μικροβιακές, αντι-ιικό, αντιπυρετική, αντιφλεγμονώδη και αναλγητικά αποτελέσματα [2]. δραστικότητα κατά του όγκου UA αναφέρθηκε για πρώτη φορά πριν από τρεις δεκαετίες στο καρκίνωμα του πνεύμονα σε ποντικούς και σε λευχαιμία Ρ388 [3], [4]. Εχει περαιτέρω δειχθεί ότι usnic οξύ έχει αντι-μιτωτική αποτελέσματα επί ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών [5] και προκαλεί απώλεια των βιώσιμων κυττάρων στη λευχαιμία, του πνεύμονα και κύτταρα καρκίνου του μαστού [6], [7]. Ωστόσο, η έκθεση σε UA δεν ενεργοποιεί p53 και δεν έχει προταθεί να εμπλέκονται σε βλάβη του DNA [8].

UA είναι μια λιπόφιλη ασθενές οξύ (p

K

ένα 4.4) που μπορεί να προκαλέσει διαρροή πρωτονίων με διάχυση μέσω των μιτοχονδριακών μεμβρανών [9]. Σε κύτταρα ήπατος ποντικού usnic οξύ διαταράσσει τη φυσιολογική μεταβολικές διαδικασίες των κυττάρων με αποσύζευξη της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης στα μιτοχόνδρια και με την ενεργοποίηση του οξειδωτικού στρες [10]. Τα μιτοχόνδρια παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των οδών κυτταρικού θανάτου και μιτοχονδριακή αλλαγές έχουν περιγραφεί σε καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης σταθερότητας, αναστέλλοντας έτσι την απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

και πρόληψη επαγωγή της απόπτωσης [11]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η θεραπεία UA προκαλεί απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου [12]. Είναι ενδιαφέρον, έχει δειχθεί ότι οι μεταβολές στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης μπορεί να οδηγήσει στην εμφάνιση της autophagy [13].

Autophagy είναι μια διαδικασία που μπορεί και οι δύο ενισχύσεις επιβίωση των καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της έλλειψης θρεπτικών συστατικών, αλλά μπορεί επίσης να προωθήσει τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων . Τα μοριακά μονοπάτια που καθορίζουν την διπλή ιδιότητα παραμένουν ασαφείς και είναι πιθανό ότι η λειτουργία του αυτοφαγία στον καρκίνο εξαρτάται από το στάδιο του όγκου, την κυτταρική πλαίσιο και ιστό προέλευσης [14], [15]. Περισσότερα από 30 διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιεί πρωτεΐνη, γνωστή ως γονίδια autophagy σχετίζονται (ATG), έχουν ταυτοποιηθεί και μελέτες σε μοντέλα ποντικών έχουν δείξει ότι μακροαυτοφαγία είναι απαραίτητη για την διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης σε πολλούς ιστούς [16], [17]. Autophagy μπορεί να προκληθεί από εξάντληση θρεπτικών ή μεταβολικό στρες και μπορεί να ποικίλει ανάλογα με τη ζήτηση για την αποικοδόμηση του υποστρώματος και ερέθισμα. Τα αισθητήρας ενέργεια σήματα ΑΜΡ κινάση στο στόχο των θηλαστικών του συμπλόκου ραπαμυκίνης 1 (mTORC1), ένα κύριος ρυθμιστής του αυτοφαγία, που ελέγχει άμεσα τη σύνθεση πρωτεϊνών και αναβολική διαδικασίες σε ένα θρεπτικό ευαίσθητο τρόπο. Η πείνα που προκαλείται αυτοφαγικά κυστίδια σχηματίζονται, τα οποία είναι πιθανό να περιέχουν ελεύθερο κυτοσόλιο [18], [19]. Επιπλέον, άλλες συνθήκες στρες, όπως κατεστραμμένα οργανίδια, ενδοκυτταρικά παθογόνα ή στρες στο ενδοπλασματικό δίκτυο μπορεί να επάγει αυτοφαγία μέσω διαφορετικών οδών από εκείνες που ενεργοποιούνται από ασιτία [19]. Η διαδικασία ωρίμανσης, το τελικό στάδιο της αυτοφαγία, περιλαμβάνει την παράδοση και την υποβάθμιση των αυτοφαγικά φορτίου. Η σύντηξη πραγματοποιείται με λυσοσώματα, και αυτοφαγικά κυστίδια συγχωνεύονται και τα περιεχόμενα είναι υποβαθμισμένη. Το όξινο περιβάλλον του λυσοσώματα είναι απαραίτητη για τα τελικά στάδια της αυτοφαγία, και από την διατάραξη της κενοτοπικής H

+ ΑΤΡάσης, η οποία εμπλέκεται στην οξίνιση λυσοσώματα, η ολοκλήρωση της αυτοφαγία μπορεί να ανασταλεί [15], [19].

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει περαιτέρω τις συνέπειες της απώλειας του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης που προκαλείται από UA. Ρωτήσαμε αν αυτό προκάλεσε απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

και προκάλεσε την απόπτωση. Απώλεια δυναμικό της μεμβράνης και της περιουσίας των UA με πρωτόνια λεωφορείο κατά μήκος των μεμβρανών αναμένεται να οδηγήσει σε μείωση της παραγωγής ΑΤΡ από τα μιτοχόνδρια [9]. Βρήκαμε ότι UA αγωγή καρκινικά κύτταρα είχαν μειωμένα επίπεδα ΑΤΡ και αυξημένη φωσφορυλίωση του ΑΜΡ κινάση. Είναι ενδιαφέρον, UA πυροδότησε αυτοφαγία, αλλά χωρίς υποβάθμιση του περιεχομένου autophagosomal, γεγονός που υποδηλώνει μια διασπαστική επίδραση στην autophagolysosomal οξίνιση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επαγωγή της autophagy επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση ενός συνδυασμού απόκριση σε έλλειψη θρεπτικών συστατικών, καθώς και κυτταρικό στρες.

(Α) Επίπεδα του ΑΤΡ, το οποίο μετράται σε ένα φωτόμετρο, μειώθηκαν σε κύτταρα T47D μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL? DMSO 0,2%) για 24 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φωταύγειας /κύτταρο κάθε ομάδα σε σύγκριση με τον έλεγχο του DMSO. Οι μπάρες σφάλματος δεικνύουν πρότυπο σφάλμα του μέσου, * ρ & lt? 0.05. (Β) Η φωσφορυλίωση των ΑΜΡ κινάση, επαληθεύεται με κηλίδωση Western, δεν ανιχνεύθηκε στα κύτταρα T47D μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL? DMSO 0,2%) για 24 και 48 ώρες

Η

Υλικά και Μέθοδοι.

φυτικό υλικό, Cell Culture και έκθεσης σε δοκιμή ουσίες

(+) – Usnic οξύ (97%) απομονώθηκε από

Cladonia arbuscula

(Wallr.) Rabenh. (Κλαδωνιϊδών) συλλέγονται σε ανοικτή χώρα στην Ισλανδία, δεν ιδιόκτητα. Απομόνωση και ταυτοποίηση διεξήχθη όπως περιγράφεται [12]. Η ουσία διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO? Merck, 2951) και αραιώθηκε για χρήση σε μέσο ιστοκαλλιέργειας. Όλες οι δοκιμασίες που περιλαμβάνονται ελέγχους όπου χρησιμοποιήθηκε η υψηλότερη ισοδύναμη συγκέντρωση DMSO. Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού T47D και MCF7 και ο παγκρεατικός καρκίνος κυτταρική γραμμή Capan-2 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATTC), μέσω LGC Promochem. T47D περιέχει ένα μόνο μεταλλαγμένο αντίγραφο του p53 [20], αλλά Capan-2 και MCF7 είναι ομόζυγα για το άγριου τύπου ρ53 [21]. MCF7 είναι θετικούς οιστρογονικούς υποδοχείς [22]. Πρωτογενείς ανθρώπινους ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν από κανονικές βιοψίες δέρματος και χρησιμοποιείται στο πέρασμά 6-13 (άδεια VSNb2006020001 /03-16 Εθνικής Επιτροπής Βιοηθικής? Ενημέρωσε συγκατάθεση). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 μέσο καλλιέργειας ιστού (GIBCO ™, 52400), που περιέχει 0.5% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (GIBCO ™, 15.140 με 148) και 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS? GIBCO ™, 10270) με T47D που λαμβάνουν επιπλέον 0,01 mg /mL ινσουλίνη (Sigma, I1882) και υποκαλλιεργήθηκαν ακόλουθη απόσπαση με θρυψίνη (0,25% θρυψίνη /EDTA, Difco ™, 215,240) όπως είναι κατάλληλο. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα κατάλληλο αριθμό να υπερβεί το 70-80% συρροή μετά από 24 ώρες καλλιέργειας. (+) – Usnic οξύ (5 ή 10 μg /mL), μετφορμίνη (10 mM? Sigma, D150959) και έλεγχος διαλύτη προστέθηκαν και τα κύτταρα επωάστηκαν υπό πρότυπες συνθήκες, για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Για την επαγωγή της αυτοφαγία με θρεπτικό στέρηση, τα κύτταρα επωάστηκαν με διάλυμα Hank (Sigma, H9394) για το τελευταίο 40 λεπτά του χρόνου επώασης.

Επαγωγή αυτοφαγικά κενοτόπια, με διπλό μεμβράνες χαρακτηριστικό αυτοφαγοσώματα, ανιχνεύθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία σε κύτταρα T47D μετά από θεραπεία με UA (2,5 και 5,0 μg /mL? DMSO 0,1%) για 24 ώρες. Μαύρα βέλη δείχνουν αυτοφαγικά κενοτόπια, λευκά βέλη δείχνουν το σχηματισμό διπλής μεμβράνης.

Η

(Α) Η αύξηση της LC3 puncta ανιχνεύθηκε, με ανοσοφθορισμό στα κύτταρα T47D και MCF7 μετά τη θεραπεία με UA (10 μg /mL) για 24 ώρες. Καμία επίδραση παρατηρήθηκε σε φυσιολογικούς ινοβλάστες. Το μπαρ κλίμακα εμφανίζεται αντιπροσωπεύει 20 μm και ισχύει για όλους τους πίνακες. (Β) LC3 puncta ανά κύτταρο μετρήθηκαν και ποσοτικά με ImageJ και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως LC3 puncta /κύτταρο της κάθε ομάδας σε σχέση με τον έλεγχο του DMSO. Οι μπάρες σφάλματος δεικνύουν πρότυπο σφάλμα του μέσου, * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0.001. (Γ) Αύξηση LC3 Ι και II LC3, επαληθεύεται με κηλίδωση Western, δεν ανιχνεύθηκε στα κύτταρα T47D μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL? DMSO 0,2%) επί 24 ώρες

Η

Εκτίμηση της. Επίπεδα ΑΤΡ

τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με τρυψινοποίηση, ένα μικρό κλάσμα απομακρύνθηκε για απαρίθμηση και συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 0,5 Μ υπερχλωρικό οξύ (Merck, 1,00519) για 10 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από φυγοκέντρηση 10 μι του υπερκειμένου αναμίχθηκαν με 1 mL απεσταγμένου ύδατος. Η βιοφωταύγεια αναλύθηκε χρησιμοποιώντας 75 μL αντιδραστηρίου λουσιφεράσης (Promega, FF2021), τα οποία υποβάλλονται σε λύση των κυττάρων και την προϋπόθεση ότι η λουσιφερίνη υπόστρωμα. Η φωταύγεια μετρήθηκε σε ένα φωτόμετρο (Turner TD 20/20) και εκφράζεται ως φωταύγεια /κύτταρο.

(Α) αριθ αποικοδόμηση της ρ62 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western, σε κύτταρα Τ47ϋ και MCF7 μετά τη θεραπεία με UA ( 5,0 και 10 μg /mL, 24 h? DMSO 0,1%). (Β) Lysotracker, ανιχνεύεται με μικροσκοπία φθορισμού, δείχνει διάχυτη χρώση στα κύτταρα T47D μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL? DMSO 0,2%) για 24 ώρες και 72 ώρες. (Γ) Lysotracker ένταση ανά κύτταρο ποσοτικοποιήθηκε με ImageJ και δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος φθορισμός αξίας κάθε ομάδα σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO. Οι μπάρες σφάλματος δεικνύουν πρότυπο σφάλμα του μέσου, ** ρ & lt? 0.001. Το μπαρ κλίμακα εμφανίζεται αντιπροσωπεύει 100 μm και ισχύει για όλους τους πίνακες. (D) ανιχνεύθηκαν Καμία επίδραση στην Lamp2 ανοσοχρώση, μετά από θεραπεία με UA

(

10 μg /mL? DMSO 0,2%) για 24 ώρες. Το μπαρ κλίμακα εμφανίζεται αντιπροσωπεύει 100 μm και ισχύει για όλους τους πίνακες. (Ε) Ένα πλασμίδιο που εκφράζει mRFP-GFP-LC3 διαμολύνθηκε σε κύτταρα T47D. Έλλειψη autophagolysosomal οξίνισης παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία με UA (10 μg /mL? DMSO 0,2%) επί 24 ώρες με ανίχνευση διακριτών GFP puncta. Το μπαρ κλίμακα εμφανίζεται αντιπροσωπεύει 20 μm και ισχύει για όλα τα πάνελ.

Η

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία

Μετά από χρόνο επώασης 24 ώρες σε κανονικές συνθήκες τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και σταθερό σε 1 mL γλουταραλδεΰδη (Ted Pella Inc, 18426) διάλυμα για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους 0-5 ° C για 24 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του γλουταραλδεΰδη, δύο σταγόνες ενός ζελατινοποιημένου διαλύματος 2% (Ted Pella Inc, 19225) αποσταγμένου νερού προστέθηκαν στο κυτταρικό ίζημα, αναμιγνύεται προσεκτικά και αποθηκεύονται στους 0-5 ° C για 24 ώρες. Τα δείγματα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS και τετροξείδιο οσμίου (Ted Pella Inc, 18463) προστίθενται σε κάθε δείγμα για μία ώρα και πλύθηκαν και πάλι με PBS. Τα δείγματα κόπηκαν σε κομμάτια 2-5 mm κάτω από ένα Macroscope χρησιμοποιούν ξυραφάκια. Τα τεμάχια αφυδατώθηκαν χρησιμοποιώντας αιθανόλη (Merck, 64271D) σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις, υπό περιστροφή. Εποξυ-ρητίνη (Ted Pella Inc, 18300) προστέθηκε, πρώτα στο 1:01 (όγκο: όγκο) με 99% αιθανόλη (Merck, 64271) για μία ώρα, στη συνέχεια δύο φορές ρητίνη μόνο για μία ώρα κάθε φορά. Τα καλούπια στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ένα φούρνο στους 70 ° C για 24 ώρες. Η ρητίνη στη συνέχεια σε φέτες με ένα ποτήρι μαχαίρι (πάχος περίπου 0,5 μm) και χρωματίστηκαν με μπλε τολουϊδίνης για την επιλογή των δειγμάτων για την κοπή με ένα μαχαίρι διαμάντι (70-100 nm πάχος). Τα δείγματα τοποθετήθηκαν επί ενός πλαισίου χαλκού πριν χρώση με 0,06 g διάλυμα μολύβδου-κιτρικού /mL (Ted Pella Inc, 19314) και έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ένα Philips EM300 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Εικόνες που προβάλλονται αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας τυπικές διαδικασίες για τη φωτογράφηση. Η αναπτυχθείσα μεμβράνη σαρώθηκε σε έναν υπολογιστή με ένα Nikon Coolscan V ED

(Α) Μία μείωση της ρ-p70S6K ανιχνεύθηκε, με χρώση ανοσοϋπεροξειδάσης, μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL?. DMSO 0,2% ) για 24 ώρες. Το μπαρ κλίμακα εμφανίζεται αντιπροσωπεύει 100 μm και ισχύει και για τις δύο επιτροπές. (Β) Η αύξηση ρ-eIF2α ανιχνεύθηκε, μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL? DMSO 0,2%). Για 6 ώρες

Η

Η ανοσοκυτταροχημεία

Για χρώση ανοσοφθορισμού, κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη (Sigma, P6148) και χρωματίστηκαν με αντι-κυτοχρώματος

γ, IgG2a μονοκλωνικό αντίσωμα

ποντικού (Abcam, ab110325), διασπασμένη κασπάση 3, πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (κυτταρική σηματοδότηση, 9661) ή LAMP2, μονοκλωνικό αντίσωμα IgG 1 ποντικού (H4b4, που λαμβάνεται από το Πανεπιστήμιο της Ιατρικής Σχολής, Βαλτιμόρη), ακολουθούμενη από την Alexa Fluor κόκκινο αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού 546 αιγών (Invitrogen, A11010), Alexa Fluor πράσινο αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού 488 κατσίκα (Invitrogen, A11070) ή Alexa Fluor κόκκινο αντι-ποντικού IgG

2 α αντίσωμα (Molecular Probes, A11018) για την πυρηνική χρώση TO-PRO-3 ιωδίδιο (Invitrogen, T3605) χρησιμοποιήθηκε 546 κατσίκα. Για την ανίχνευση LC3 τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη (Sigma, 34860) για 10 λεπτά στους -20 ° C και χρωματίστηκαν με αντι-LC3B (D11), κουνέλι μονοκλωνικό αντίσωμα IgG (Sigma, L7543) που ακολουθείται από Alexa Fluor πράσινο anti 488 κατσίκα Κουνέλι IgG αντίσωμα (Invitrogen, A11070). Τα χρωματισμένα κύτταρα έγιναν ορατά και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (Zeiss, LSM 5 Pascal). Για την ανοσοϋπεροξειδάσης χρώση κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη (Sigma, 34860) για 5 λεπτά στους -20 ° C και χρωματίστηκαν με αντι-φωσφο-p70S6 κινάσης (Thr389? 108D2), IgG κουνελιού, μονοκλωνικό αντίσωμα (Cell Signaling, 9234), αντι -LC3B (D11), IgG μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Sigma, L7543) και αντι-Ρ62 (SQSTM1), πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Enzo, PW9860) που ακολουθείται από επώαση με αντι-κουνελιού ανοσοσφαιρίνες ποντικού μονοκλωνικό IgG1κ (Dako, M0737), πολυκλωνικά κουνελιού ανοσοσφαιρίνες αντι-ποντικού IgG (Dako, Z0259), ΡΑΡ, υπεροξειδάση χράνου και μονοκλωνικά ποντικού αντι-χρένο ανοσοσύμπλοκα, IgG1 (Dako, P850) και δισκία DAB, χρωμογόνο (Dako, S3000). Τα χρωματισμένα κύτταρα έγιναν ορατά και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα κάτω από το φως μικροσκόπιο (Leica DMI 3000B).

Western Blot Ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με ρυθμιστικό ΚΙΡΑ. Η περιεκτικότητα πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε φασματομετρικά χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Bradford (Sigma, B6916). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε NuPAGE 10% Bis-Tris Gels Mini και μεταφέρθηκαν σε 0.2 μΜ διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) με ηλεκτροστύπωση. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντι-φωσφο-AMPKα (Thr172) κουνελιού IgG μονοκλωνικά αντισώματα (Cell Signaling, 4188), αντι-Ρ62 (SQSTM1), πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Enzo, PW9860), αντι-LC3B (D11), IgG μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Sigma, L7543), αντι-φωσφο-eIF2α (ser51) κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα (Cell Signaling, 9721) ή πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-G3PDH κουνελιού αντι-ανθρώπου (R &? D Systems, 2275-PC-1). Δευτερογενής αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν IgG κατσίκας αντι-κουνελιού /HRPlinked (κυτταρική σηματοδότηση, 7074S) και δευτερογενή αντίσωμα συζευγμένο με IRDye-680 ή 800 (Metabion, 68021). Πρωτεΐνες έγιναν ορατές με το κιτ ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (GE Healthcare, RPN2132) και το σήμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα υψηλής απόδοσης ταινία χημειοφωταύγειας (GE Healthcare, 91415) ή να ανιχνευθούν από το σύστημα υπέρυθρης απεικόνισης Οδύσσεια.

Οπτικοποίηση των λυσοσωμάτων από LysoTracker Probes

Το μέσο ιστοκαλλιέργειας αντικαταστάθηκε με προθερμασμένο (37 ° C) 75 ηΜ Lysotracker Red DND-99 (Invitrogen, L7528) και τα κύτταρα επωάζονται στους 37 ° C για 1 ώρα. διάλυμα φόρτωσης στη συνέχεια πλύθηκε του και αντικαταστάθηκε από φρέσκο ​​μέσο και τα χρωματισμένα κύτταρα έγιναν ορατά και φωτογραφήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Leica DMI 3000B). Lysotracker είναι μια φθορίζουσα acidotropic ανιχνευτής για την επισήμανση και τον εντοπισμό όξινα οργανίδια των κυττάρων. Η πρωτονιωμένη μορφή αυτού του ανιχνευτή συσσωρεύεται σε όξινα διαμερίσματα, όπου σχηματίζει συσσωματώματα που φθορίζουν φωτεινό κόκκινο.

Η επιμόλυνση με tfLC3 Κατασκευάστε

Το πλασμίδιο mRFP-GFP παράλληλα φθορίζον-tagged LC3 (tfLC3) κατασκευή παρασχέθηκε ευγενώς από τον καθηγητή Kevin Ryan, Beatson Ινστιτούτο, Πανεπιστήμιο της Γλασκώβης, με άδεια από τον καθηγητή Tamotsu Yoshimori, Πανεπιστήμιο Οσάκα [23], [24]. Ασβεστίου /μαγγάνιο βάση (CCMB) μετασχηματισμός του DH10B στελεχών του E.coli χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως [25]. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας TransPass D2 (BioLabs, M2554S) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα εκτέθηκαν σε δοκιμή ουσίες ή στερούνται των θρεπτικών ουσιών, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη (Sigma, P6148), και έγινε ορατό και φωτογραφήθηκε κάτω από ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (Zeiss, LSM 5 Pascal).

Στατιστικές Αναλύσεις

στατιστικές συγκρίσεις των μέσων τιμών πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση δύο όψεων ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας και τον αριθμό των τρέχει ως παράγοντες, που ακολουθείται από μια θέση. hoc σύγκριση χρησιμοποιώντας Tukey HSD. Οι τιμές ρ που περιγράφονται στο κείμενο σε κατάλληλα σημεία. Σε όλα τα σχήματα, * και ** δεικνύουν ρ & lt? 0,05 και p & lt? 0.001 αντίστοιχα. Οι εικόνες και τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά αυτού που παρατηρήθηκε σε τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Η ενδογενής οδός της απόπτωσης πυροδοτείται από το άνοιγμα των πόρων μέσα στο εξωτερικό μιτοχονδριακή μεμβράνη που οδηγεί σε απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

στο κυτοσόλιο και ενεργοποίηση του καταρράκτη κασπάσης [26]. Για να δοθεί συνέχεια στις προηγούμενες εργασίες μας σχετικά με τις επιπτώσεις της UA στη μιτοχονδριακή μεμβράνη δυναμικό [12] ερευνήσαμε κυτοχρώματος

γ

διαρροή και διάσπαση της κασπάσης-3 με ανοσοχρώση στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού T47D και την παγκρεατική κυτταρική σειρά Capan-2. Αριθ κυτόχρωμα

γ

απελευθέρωσης ή διασπασμένη κασπάση 3 προϊόντα ήταν ανιχνεύσιμα μετά από θεραπεία με usnic οξύ (10 μg /mL) μετά από 24, 48 και 72 ώρες (δεδομένα φαίνονται για 72 ώρες?. Σχ. S1A και S1B Εικ ). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τα προηγούμενα δεδομένα μας, που UA προκαλεί καθυστερημένη νέκρωση αλλά καμία απόπτωση [12], και δείχνουν ότι, αν και η μιτοχονδριακή βαθμίδα ρΗ διαταράσσεται, οι ίδιοι οι μιτοχόνδρια είναι άθικτα.

Έχει αναφερθεί ότι προκαλεί usnic οξύ αποσύζευξη των μιτοχονδρίων [27], αναστέλλει την μιτοχονδριακή αναπνοή και προκαλεί μια πτώση στα επίπεδα του ΑΤΡ στο μυϊκό ηπατοκύτταρα [10]. δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από την ανάλυση μικροσυστοιχιών έχει ενισχύσει τον ισχυρισμό ότι λεωφορεία usnic οξύ πρωτόνια κατά την κλίση που δημιουργείται από τη μιτοχονδριακή μεταφορά ηλεκτρονίων, καθώς οδηγεί σε επαγωγή των γονιδίων που σχετίζονται με συγκροτήματα Ι-IV της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων [9]. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το θέμα, τα επίπεδα ATP αξιολογήθηκαν και φωσφορυλίωση της AMP κινάση αναλύονται στα κύτταρα T47D. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία UA οδηγεί σε μειωμένη κυτταρικά επίπεδα της ΑΤΡ μετά από θεραπεία 24 ωρών (5,0 μg /mL ρ = 0.0523, 10 μg /mL ρ = 0.010). Όπως αναμένεται, οι μειωμένα επίπεδα ΑΤΡ συσχετίστηκαν με αυξημένη φωσφορυλίωση του ΑΜΡ κινάση μετά τόσο 24 και 48 ώρες θεραπείας (10 μg /mL) (Εικ. 1Α και Β).

Αυτή η μείωση στην κυτταρική επίπεδα ενέργειας και ενεργοποίηση του μηχανισμού ανίχνευσης θα πρέπει να αναμένεται να επάγει αυτοφαγία. Ανάλυση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας των κυττάρων T47D σε επεξεργασία με UA (2,5 και 5,0 μg /mL) για 24 ώρες έδειξε πιο έντονη παρουσία του αυτοφαγικά κενοτόπια, με διπλό μεμβράνες χαρακτηριστικό αυτοφαγοσώματα, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχ. 2). Τα αποτελέσματα αυτά ακολουθήθηκαν από την ανάλυση για LC3 puncta με ανοσοφθορισμό, και μια εκτίμηση της αφθονίας των αυτοφαγοσώματα, σε διαφορετικά χρονικά σημεία και θεραπείες από τρεις τύπους κυττάρων (Εικ. 3Α, Σχ. 3Β και Σχ. S2A-C). Δεν παρατηρήθηκαν επιδράσεις παρατηρήθηκαν μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL) για 2 ώρες σε οποιαδήποτε από τις τρεις κυτταρικές σειρές, αλλά παρατηρήθηκε αύξηση μετά την αγωγή με το αντι-διαβητικό φάρμακο μετφορμίνη στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού T47D, που δεν ήταν πλέον παρούσα μετά από παρατεταμένη θεραπεία. Η μετφορμίνη έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι διεγείρει ΑΜΡ κινάση ήδη μετά από μία ώρα [28]. Μετά από 24 ώρες κατεργασίας με UA (10 μg /mL) σε σημαντική αύξηση LC3 puncta ήταν εμφανής σε σύγκριση με τους ελέγχους στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού δύο. Ανοσο-χρώση των κυττάρων T47D έδειξε επίσης αυξημένη παρουσία LC3 puncta μετά τη θεραπεία UA (Εικ. S2D). Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με την παρατήρηση σε αύξηση της LC3 Ι και ΙΙ LC3 από κηλίδωση Western (Σχ. 3C). Οι συνέπειες για τους φυσιολογικούς ινοβλάστες δέρματος δεν είχαν σήμανση. Για σύγκριση, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής κατά 40 λεπτά επώασης σε ισορροπημένο θρεπτικό διάλυμα ελεύθερο Hank. Αν και οπτική επιθεώρηση πρότεινε παρουσία του σχηματισμού autophagosome στο πεινασμένο κύτταρα (Εικ. 3Α), LC3 puncta ήταν δύσκολο να μετρήσει και αυτό σκληρή μεταχείριση δεν ήταν καλά ανεκτή από τα κύτταρα.

Αφού παρατηρείται αύξηση της LC3 puncta μετά τη θεραπεία με UA, ερευνήσαμε αν ο σχηματισμός της αυτοφαγικά κενοτόπια ακολούθησε αυτοφαγικά ροή. Τα επίπεδα του ρ62 autophagosomal φορτίου αξιολογήθηκαν μετά από έκθεση σε UA. Η συγκέντρωση του ρ62 έχει δειχθεί ότι μειώνει εάν αυτοφαγικά ροή αυξάνεται καθώς αποικοδομείται κατά τη διαδικασία [29]. Σχηματισμός αυτοφαγοσώματα ως αποτέλεσμα της θεραπείας με UA μετά από 24 ώρες (5,0 και 10 μg /mL) σε T47D και MCF7 κύτταρα (Σχ. 4Α και το Σχ. S3) δεν ακολουθήθηκε από την υποβάθμιση της εσωτερικεύεται πρωτεΐνης. Η απουσία αποικοδόμησης ρ62 σε 24 ώρες προτείνει μια διαταραχή της λυσοσωμικής οξίνισης και autophagolysosome ωρίμανση η οποία θα μπορούσε να προκληθεί από το πρωτόνιο παλινδρομούσης ιδιότητες usnic οξέος σε όλη τη λυσοσωμιακή μεμβράνη, όπως φαίνεται στα αποπόλωση των μιτοχονδρίων [9], [10].

για να αξιολογήσει περαιτέρω τις συνέπειες της UA σε λυσοσώματα χρησιμοποιήσαμε το lysotracker δείκτη λυσοσωμικών στα κύτταρα T47D που χαρακτηρίζει και παρακολουθεί όξινα οργανίδια των κυττάρων. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν πολύ έντονες διάχυτη αύξηση της χρώσης lysotracker σε κύτταρα T47D, μετά τη θεραπεία UA για 24 και 72 ώρες (Σχ. Σχ. 4Β και 4C). Αυτό το μοτίβο χρώσης έχει ερμηνευθεί ως λυσοσωμική διαστολή που προκαλείται από θεραπεία με χλωροκίνη, η οποία συσσωρεύεται στο εσωτερικό λυσοσώματα. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με χλωροκίνη, ανοσοχρώση για την πρωτεΐνη λυσοσωμιακή μεμβράνη Lamp1 αντιγράψει το πρότυπο που ελήφθη με lysotracker, επιβεβαιώνοντας έτσι λυσοσωμική διαστολή [30]. Σε αντίθεση, στα πειράματά μας, χρώση ανοσοφθορισμού για την λυσοσωματική πρωτεΐνη Lamp2 δεν έδειξαν μορφολογικές μεταβολές και δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων κυττάρων (Σχ. 4D). Αυτό δείχνει ότι η lysotracker είχε χρώση έξω από το λυσόσωμα και θα μπορούσε να εξηγηθεί από το γεγονός ότι η διατήρηση της χρωστικής εντός των λυσοσωμάτων εξαρτάται από όξινο ρΗ [31]. Η διάχυτη χρώση lysotracker μετά τη θεραπεία UA μπορεί έτσι να οφείλεται σε πρωτόνια αδιάκοπης έξω από το λυσόσωμα, με παρόμοιο τρόπο όπως συμβαίνει σε ολόκληρη την μιτοχονδριακή μεμβράνη.

Για να διερευνήσουν autophagosome ωρίμανση μετά τη θεραπεία UA, χρησιμοποιήσαμε ένα πλασμίδιο κατασκεύασμα , tfLC3 (mRFP-GFP-LC3 tandem-tagged φθορίζουσα πρωτεΐνη), με την οποία έχουμε επιμολυσμένα τα κύτταρα T47D. Αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για να ακολουθήσει τη αυτοφαγικά διαδικασία ωρίμανσης. Η GFP-LC3 χάνει φθορισμού λόγω της λυσοσωματικής οξύτητα ενώ ο φθορισμός mRFP είναι σταθερή [23], [24]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το πεινασμένο κύτταρα GFP φθορισμός εξασθενεί υπονοώντας όξινες συνθήκες και την υποβάθμιση από υδρολάσες λυσοσωμικής, ενώ mRFP φθορισμού παρέμειναν σταθερές. Μετά τη θεραπεία με UA για 24 ώρες, GFP, καθώς επίσης και ο φθορισμός mRFP παρατηρήθηκε υποδεικνύοντας διάσπαση του autophagolysosomal οξίνισης και εξασθενημένη αποικοδομητική συνθήκες μετά τη θεραπεία με UA (Εικ. 4Ε). Η αποτυχία αυτών των κυττάρων για να ολοκληρωθεί αυτοφαγία θα μπορούσαν να συμβάλουν στη συσσώρευση αυτοφαγικά κενοτόπια και διατήρηση των μη υποβαθμισμένου ρ62.

Ένα από τα προσαρμοστικά χαρακτηριστικά των περισσότερων καρκίνων είναι απορυθμισμένη pH. Σε φυσιολογικά κύτταρα ενδοκυτταρικό ρΗ είναι χαμηλότερο από το εξωκυτταρικό ρΗ. Σε καρκινικά κύτταρα η κλίση αντιστρέφεται δημιουργία ευνοϊκού περιβάλλοντος για τη μεταστατική εξέλιξη. Υψηλότερες ενδοκυτταρικό ρΗ διατηρείται λόγω της αυξημένης H

+ εκροής λόγω των αλλαγών στην έκφραση και /ή δραστικότητα των αντλιών της μεμβράνης πλάσματος και μεταφορείς [32]. Η βαθμίδωση του ρΗ σε καρκινικά κύτταρα είναι ευεργετική για την κυτταρική συσσώρευση ασθενών οξέων, όπως usnic οξύ, προκαλώντας ασθενή οξέα να είναι ουδέτερες κυρίως σε χαμηλό ρΗ και διευκόλυνση της μεταφοράς τους δια μέσου της μεμβράνης. Η θεραπεία με UA δείχνει σημαντική επαγωγή των γονιδίων που είναι συνδεδεμένα με τα σύμπλοκα Ι έως IV της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων, η οποία θα μπορούσε να είναι ένας μηχανισμός αντιστάθμισης για τη διατήρηση της κλίσης πρωτονίων κατά μήκος της μιτοχονδριακής εσωτερικής μεμβράνης [9], [32].

Μελέτες αρκετών κληρονόμησε σύνδρομα που προδιαθέτουν σε διάφορους τύπους όγκων και καρκινωμάτων έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση του mTOR μονοπάτι ως ρυθμιστή της αυτοφαγία. Μεταξύ κατάντη στόχοι της mTORC1 είναι p70S6K και 4EBP1, οι οποίες έχουν ουσιώδη ρόλο στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό [33], [34]. Στο Σχ. 1Β δείχνουμε ότι UA ενεργοποιεί AMP-κινάση, η οποία σηματοδοτεί την πολύπλοκη mTORC1. Για να εξερευνήσετε κατάντη στόχοι της mTORC1 αναλύσαμε τα αποτελέσματα σε UA-επεξεργασμένα κύτταρα σε φωσφορυλιωμένη p70S6K με χρώση ανοσοϋπεροξειδάσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια αξιοσημείωτη μείωση στην χρώση μετά από θεραπεία για 24 ώρες (Σχ. 5Α). Τα κύτταρα ανταποκρίνονται σε έλλειψη θρεπτικών συστατικών μέσω επαγωγής autophagy αλλά αυτή η διαδικασία μπορεί επίσης να προκληθεί από κυτταρικό στρες [19]. Για να διερευνηθεί εάν UA μπορούσε να ενεργοποιεί autophagy από άλλο μηχανισμό ελέγξαμε για ένδειξη κυτταρικού στρες στα κύτταρα T47D μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL) για 6 ώρες. Αυξημένη φωσφορυλίωση του eIF2α, η οποία είναι μία από τις αναγνωρισμένες σημάδια ER στρες, ανιχνεύθηκε (Εικ. 5Β).

Τα αποτελέσματα του usnic οξέος επί autophagy μπορούν να συγκριθούν με αυτές που περιγράφονται για την καταπολέμηση της ελονοσίας χλωροκίνη φάρμακο η οποία είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές σε συνδυασμό με αντικαρκινικές αγωγές [19]. Χλωροκίνη είναι μία ασθενής βάση (p

K

ένα 8.5) και συσσωρεύεται στο εσωτερικό λυσοσώματα που καθίστανται διαστέλλεται και δυσλειτουργικό, το κλείδωμα αυτοφαγικά ροής [19]. Σε αντίθεση, usnic οξύ είναι ένα ασθενές οξύ που σαΐτες πρωτόνια κατά μήκος των μεμβρανών, αυξάνοντας έτσι λυσοσωμική ρΗ, όπως φαίνεται από την κατακράτηση του σήματος GFP, αλλά το σχήμα λυσοσωμική δεν επηρεάστηκε (χρώση LAMP2). ER στρες επάγεται από την αναστολή πρωτεασώματος και ER-συνδέονται αυτοφαγία εκ τούτου, είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τη θεραπεία του καρκίνου με αναστολείς πρωτεασώματος. Έχει αποδειχθεί ότι ο συνδυασμός χλωροκίνη με την bortezomib αναστολέα πρωτεασώματος αυξάνει κυττάρου όγκου θάνατος

in vitro

και

in vivo

[35]. Κυτταρική πρόσληψη και ενδοκυτταρική κατανομή των φαρμάκων επηρεάζεται από το pH [32], [36]. Χλωροκίνη μπορεί π.χ. αποτρέψει ενδοκυτταρική παγίδευση σε λυσοσώματα [36], αλλά δεν έχει καμία επίδραση στην μιτοχονδριακή συσσώρευση της δαουνορουβικίνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ένωση δεν επηρεάζει μιτοχονδριακής ρΗ [37]. Όπως usnic οξύ επηρεάζει ρΗ στην λυσοσώματα και μιτοχόνδρια το προβλέπεται να επηρεάσει ενδοκυτταρική διανομή του φαρμάκου.

Εν κατακλείδι, η προηγούμενη μελέτη μας έχει δείξει ότι UA προκαλεί απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε δείξει ότι αυτό δεν οδηγεί σε απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

και την ενεργοποίηση της απόπτωσης. Η H

+ μετακινούνται επίδραση της UA λειτουργεί σε δύο οργανίδια, μιτοχόνδρια και λυσοσώματα και την επίδρασή της στο σχηματισμό autophagosome είναι πιθανό να προκλήθηκε τόσο από τις συνθήκες εξάντληση διατροφή και το στρες. Αυτοφαγικά ροή είναι ωστόσο ελλιπής και δεν συμβεί υποβάθμιση του περιεχομένου autophagosomal. Τα ευρήματά μας έχουν επιπτώσεις για τη θεραπευτική χειραγώγηση της αυτοφαγία και pH-προσδιορίζονται διανομής φαρμάκων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

UA δεν προκαλεί απόπτωση. (Α) διαρροή Κυτόχρωμα c δεν ήταν ανιχνεύσιμη, με ανοσοφθορισμού σε T47D και κύτταρα Capan-2 μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL? DMSO 0,2%) επί 24, 48 και 72 ώρες. (Β) Δεν υπάρχουν προϊόντα αποκοπής της κασπάσης-3 ήταν ανιχνεύσιμα μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL? DMSO 0,2%) μετά από 24, 48 και 72 ώρες. Το μπαρ κλίμακα εμφανίζεται αντιπροσωπεύει 20 μm και ισχύει για όλους τους πίνακες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0051296.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

UA προκαλεί σχηματισμό autophagosome κενοτόπια. LC3 puncta ανά κύτταρο μετρήθηκαν και ποσοτικά με ImageJ και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως επίπεδο εμπιστοσύνης της οικογένειας-σοφός 95%. (Α) κυττάρων T47D σε επεξεργασία με UA για 2 και 24 ώρες. κύτταρα (Β) MCF7 σε επεξεργασία με UA για 2 και 24 ώρες. (Γ) φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών σε επεξεργασία με UA για 2 και 24 ώρες. (D) Η αύξηση χρώση ανοσοπεροξειδάσης LC3 ανιχνεύθηκε, σε κύτταρα Τ47ϋ μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL? DMSO 0,2%) για 24 ώρες. Το μπαρ κλίμακα εμφανίζεται αντιπροσωπεύει 100 μm και ισχύει και για τις δύο επιτροπές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0051296.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

UA δεν οδηγεί σε υποβάθμιση της ρ62. Δεν παρατηρήθηκε μείωση στη χρώση ανοσοπεροξειδάσης ρ62 ανιχνεύθηκε, σε Τ47ϋ κύτταρα μετά από θεραπεία με UA (10 μg /mL? DMSO 0,2%) για 24 ώρες. Το μπαρ κλίμακα εμφανίζεται αντιπροσωπεύει 100 μm και ισχύει και για τις δύο επιτροπές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0051296.s003

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες για την μέλη της Βιοϊατρικής Κέντρο του Πανεπιστημίου της Ισλανδίας, Johann Arnfinnsson για βοήθεια σχετικά με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο και η Τζένη Björk Þorsteinsdóttir για τεχνική βοήθεια. Ευχαριστούμε Άννα Helga Jonsdottir για βοήθεια σχετικά με τα στατιστικά στοιχεία.