Αφηρημένο

Ιστορικό

PI3K /AKT οδό σηματοδότησης είναι έκτροπα ενεργό και θεατρικά έργα ένα κρίσιμο ρόλο για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων του ανθρώπου κακόηθες μεσοθηλίωμα υπεζωκότα (ΜΜΚ).

ΑΚΤ είναι ένα από τα σημαντικά κυτταρικών στόχων του perifosine, μία νέα βιο-διαθέσιμη alkylphospholipid που επέδειξε σημαντική αντι-πολλαπλασιαστική δράση in vitro και in vivo σε διάφορα συστήματα του ανθρώπου μοντέλο όγκου και αυτή τη στιγμή δοκιμάζεται σε κλινικές δοκιμές.

Μέθοδοι

Δοκιμάσαμε Perifosine δραστηριότητα σχετικά με τα ανθρώπινα μεσοθηλιακά κύτταρα και διάφορες κυτταρικές σειρές μεσοθηλιώματος, με σκοπό την παροχή αποδεικτικών στοιχείων από την αποτελεσματικότητά του ως μονοθεραπεία και της συνδυασμένης θεραπείας.

Αποτελέσματα

Έχουμε αποδείξει ότι εδώ perifosine, επί του παρόντος αξιολογούνται ως αντικαρκινικός παράγοντας στη φάση 1 και 2 κλινικών δοκιμών, προκάλεσε μια δοσο εξαρτώμενη μείωση της ενεργοποίησης ΑΚΤ, σε συγκεντρώσεις που προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων MME. Στη μελέτη αυτή, πρώτον περιγράφουν ότι κύτταρα ΜΜΚ εκφράζουν πέρα ​​από ΑΚΤ1 επίσης ΑΚΤ3 και ότι είτε η μυριστοϋλιωμένων, ουσιαστικά δραστική, μορφές των δύο πρωτεϊνών, κατήργησε perifosine μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης. Επιπλέον, περιγράφουμε εδώ ένα νέο μηχανισμό perifosine που παρεμβαίνει, ανάντη της ΑΚΤ, που επηρεάζουν τη φωσφορυλίωση του EGFR και ΚΟΑ. Τέλος, δείχνουμε μια σημαντική αύξηση στην τοξικότητα των κυττάρων όταν τα κύτταρα MME υποβλήθηκαν σε θεραπεία με perifosine σε συνδυασμό με σισπλατίνη.

Συμπεράσματα

Αυτή η μελέτη παρέχει ένα νέο μηχανισμό δράσης της perifosine, άμεσα αναστέλλοντας EGFR /MET-ΑΚΤ1 /3 αξόνων, παρέχει τη βάση για μια νέα μεταφραστική προσέγγιση για τη θεραπεία των MME

Παράθεση:. Pinton G, MANENTE AG, Αγγελή G, Mutti L, Μόρο L (2012) Perifosine ως πιθανή μυθιστόρημα Αντικαρκινική παράγοντα αναστέλλει EGFR MET-AKT Άξονα /στο Κακόηθες μεσοθηλίωμα του υπεζωκότα. PLoS ONE 7 (5): e36856. doi: 10.1371 /journal.pone.0036856

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Νοέμβρη, 2011? Αποδεκτές: 15 Απρ 2012? Δημοσιεύθηκε: May 10, 2012 |

Copyright: © 2012 Pinton et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εργασίας ήταν υποστηρίζεται από μεσοθηλίωμα Ίδρυμα Εφαρμοσμένης Έρευνας (MARF χορηγούν 2009), Fondazione Buzzi Unicem και GIMe (ιταλική μεσοθηλίωμα τόκων του Ομίλου). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κακόηθες μεσοθηλίωμα του υπεζωκότα (MME) είναι μια ταχέως θανατηφόρο καρκίνο που σχετίζεται με την έκθεση στον αμίαντο που αυξάνεται σε συχνότητα σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Δεδομένου ΜΜΚ είναι ανθεκτικό σε συμβατικές θεραπείες, η πρόγνωση αυτών των ασθενών είναι κακή, με μια διάμεση επιβίωση των 11-12 μηνών μετά τη διάγνωση [3], [4] Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για αποτελεσματική θεραπεία.

Η ενεργοποίηση των πολλαπλών κινασών τυροσίνης υποδοχέα (RTKs) είναι κρίσιμη για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και /ή επιβίωση των κυττάρων ΜΜΚ. Μεταξύ των RTKs, ΚΟΑ και EGFR ήταν πιστεύεται ότι είναι δύο από τα πιο σημαντικά που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό MME ή /και την επιβίωση μέσω της ΡΙ3-Κ /AKT σηματοδότησης ενεργοποίηση καταρράκτη. Ωστόσο, μια κλινική μελέτη φάσης ΙΙ της θεραπείας erlotinib δεν έδειξαν επίδραση στις MME, αν και το 96% των δειγμάτων έδειξαν θετικά pEGFR [5].

Η έλλειψη της μετάλλαξης του EGFR σε MME μπορεί να είναι ένας από τους λόγους για την απάθεια [6]. ΜΕΤ είναι μια άλλη RTK που προκαλεί την ενεργοποίηση αρκετών οδών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάση (ΡΙ3-Κ) /ΑΚΤ και Ras /καταρράκτες κινάσης πρωτεΐνης που ενεργοποιείται από μιτογόνο [7]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το ΚΟΑ εκφράστηκε και ενεργοποιήθηκε στην πλειοψηφία των κυτταρικών σειρών ΜΜΚ και κλινικών δειγμάτων [8], [9]. Ωστόσο, η αναστολή ΜΕΤ προκάλεσε αναστολή της ανάπτυξης σε μόνο ένα μικρό υποσύνολο των κυτταρικών σειρών ΜΜΚ, ανεξάρτητα από συχνή ενεργοποίηση ΜΕΤ [10]. Σε μια πρόσφατα δημοσιευμένη μελέτη Kawaguchi et al. πρότειναν ότι η αναστολή των πολλαπλών RTKs μπορεί να χρησιμεύσει για να αναπτύξουν μια πιο αποτελεσματική θεραπεία στόχος για τους ασθενείς με κα [11].

Όπως και σε άλλους καρκίνους μεταξύ των RTKs ενεργοποιείται σήματα, η φωσφοϊνοσιτίδη 3-κινάση (PI3K) /μονοπατιού AKT , παίζει έναν κρίσιμο ρόλο για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα ανθρώπινου ΜΜΚ [12], [13]. Έχει αναφερθεί ότι η αναστολή της δραστηριότητας ΡΙ3Κ οδήγησε σε σημαντικές διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των διαφορετικών κυτταρικών γραμμών ΜΜΚ [14]. Αποτελέσματα ενεργοποίηση ΡΙ3Κ σε συσσώρευση φωσφατιδυλινοσιτόλης 3,4,5-τριςφωσφορικής και φωσφατιδυλινοσιτόλη 3,4-διφωσφορικής [15]. Τότε πλεκστρίνης ομολογία (PH) που περιέχει την περιοχή πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων ΡϋΚ1 και ΑΚΤ [16], [17] συνδέονται προς τις φωσφορυλιωμένες φωσφατιδυλινοσιτόλες 3′-ΟΗ μέσω αυτής της περιοχής. Αυτή η δεσμευτική αποτελέσματα στην στόχευση της ΑΚΤ στην πλασματική μεμβράνη και παρέχει μια ευνοϊκή διαμόρφωση για την ΑΚΤ Thr308 και φωσφορυλίωση Ser473 [18].

Η πρώτη γενιά των αναστολέων PI3K περιλαμβάνουν LY294002 και ουορτμανίνη, τόσο με στόχο την καταλυτική περιοχή της ρ110, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί ως εργαλεία έρευνας για τη διαλεύκανση της αξίας των ΡΙ3Κ ως θεραπευτικού στόχου [19]. Για τα un-ευνοϊκές φαρμακευτικές ιδιότητες, την τοξικότητα, και cross-over αναστολή των άλλων λιπιδίων και πρωτεϊνών κινασών, που δεν είχαν χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε κλινικές δοκιμές [20].

Perifosine [οκταδεκυλ (1,1-διμεθυλο -piperidinio-4-υλ) -φωσφορικό] είναι ένα συνθετικό νέα alkylphospholipid (ALP), μια νέα τάξη αντικαρκινικών παραγόντων που στοχεύει τις κυτταρικές μεμβράνες των ενεργών πολλαπλασιαστικών κυττάρων και αναστέλλει την πρόσληψη μεμβράνη μεσολαβεί ΑΚΤ χώρου ΡΗ και την ενεργοποίηση. Σημαντικά, perifosine δεν επηρεάζει άμεσα είτε δραστικότητα ΡΙ3Κ ή φωσφοϊνοσιτιδίου-εξαρτώμενη κινάση 1 (ΡϋΚ1) [21]. Perifosine έχει επιδείξει σημαντική αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα

in vitro

και

in vivo

σε διάφορα συστήματα του ανθρώπου μοντέλο όγκου και αυτή τη στιγμή δοκιμάζεται σε διάφορες κλινικές δοκιμές [22], [23].

Η παρούσα μελέτη ερευνά μια πιθανή αντικαρκινική δράση της perifosine χρησιμοποιώντας το

in vitro

μοντέλα κυττάρων MME, χρησιμοποιώντας perifosine είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με την καθιερωμένη χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Έχουμε αποδείξει ότι η αναστολή τόσο ΚΟΑ perifosine και την ενεργοποίηση του EGFR, ακόμη και στην παρουσία του HGF και EGF μειώνει τον πολλαπλασιασμό φωσφορυλίωση ΑΚΤ και μπλοκ των κυττάρων χωρίς να προκαλεί απόπτωση των κυτταρικών σειρών MME. Στη μελέτη αυτή, πρώτον περιγράφουν ότι κύτταρα ΜΜΚ εκφράζουν πέρα ​​από ΑΚΤ1 επίσης ΑΚΤ3 και ότι η επαγόμενη perifosine αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης αποκαταστάθηκαν με επιμόλυνση των δύο μυριστοϋλιωμένων-AKTs, ιδιοσυστατικά εντοπισμένη στην μεμβράνη του πλάσματος. Επιπλέον, η συν-θεραπεία με perifosine αυξάνει σημαντικά κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης στα κύτταρα MME.

Αποτελέσματα

Perifosine στοχεύει φωσφορυλίωση ΑΚΤ και επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MME παρακινήσει ένα G2 /M φάσεις συλλάβει

Perifosine έχει παρόμοια δομή με την αυτοφυή φωσφολιπίδια που έχει περιγραφεί να παρεμβαίνει κυρίως με μεμβράνες των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, όπως καρκινικά κύτταρα, Εδώ δείχνουμε ότι το 50% των Perifosine επαγόμενη αναστολή ανάπτυξης ΜΜΚ (IC50) σε 24 ώρες ήταν 23 μΜ, 14 μΜ και 7,5 μΜ για REN, MSTO211H και ΜΜΡ αντίστοιχα, ενώ ελάχιστη τοξικότητα που εμφανίζεται στο HMC κανονική μεσοθηλιακών κυττάρων (Σχήμα 1Α). Οι δόσεις αυτές ήταν σύμφωνες με επιτύχει συγκεντρώσεις στο πλάσμα

in vivo

(περιγράφεται να είναι περίπου 16 μΜ). Η οδός ΑΚΤ αποτελεί στόχο για την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του perifosine, έτσι ώστε να διερευνηθεί η επίδραση αυτού του φαρμάκου για την κατάσταση φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ. Η Εικόνα 1Β δείχνει ότι η έκθεση των κυττάρων ΜΜΚ να perifosine για 1 ώρα προκάλεσε εξαρτώμενη απώλεια δόση της φωσφορυλίωσης Ser473 της ΑΚΤ, χωρίς να επηρεάζει την συνολική ποσότητα της πρωτεΐνης. Αυτή η απώλεια της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν σε συγκέντρωση IC50 τους perifosine. Έχουμε εκλεγεί κύτταρα REN, εκπρόσωπος των πιο κοινών επιθηλιοειδής όγκων, για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό νωρίς γεγονότα σηματοδότησης που επηρεάζονται από perifosine. Σε κύτταρα REN αποδείξαμε ότι η αγωγή με διαφορετικές δόσεις του perifosine για 24 ώρες προκάλεσε μια διακοπή του κυτταρικού κύκλου με μια προοδευτική σημαντική συσσώρευση στο G2 /M φάσεις (Σχήμα 2Α). Τόσο υπο-G1 πάρει και διάσπαση πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης δεν ήταν εμφανείς κατά την επώαση με αυξανόμενες δόσεις perifosine για 24 ώρες, υποδεικνύοντας ότι δεν κασπάσης εξαρτώμενη θάνατος αποπτωτικών κυττάρων συνέβη (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, τα αποτελέσματα της perifosine αυξήθηκε με τη θεραπεία φορά που οδηγεί όλα τα κύτταρα που εκτίθενται σε 23 μΜ για να πεθάνει από 72 ώρες (Σχήμα 2C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε κύτταρα MSTO211-H (Σχήμα S1).

Α, επίδραση του perifosine στην βιωσιμότητα των HMC και τρεις διαφορετικές κυτταρικές γραμμές ΜΜΚ (REN, MSTO211-Η και ΜΜΡ) μετά από θεραπεία 24 ώρες σε οι αναφερόμενες συγκεντρώσεις.

σημεία

, μέσοι όροι ± SD τριών μεμονωμένων μετρήσεων. κύτταρα Β, REN, MSTO211-Η και ΜΜΡ υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες δόσεις perifosine για 1 ώρα. Τα κύτταρα λύθηκαν, και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, διερευνήθηκαν με φωσφο-ειδικό ΑΚΤ και την εκ νέου ανιχνεύθηκαν με panAKT αντισωμάτων όπως περιγράφεται σε «Υλικά και Μέθοδοι». Αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Α, κύτταρα REN υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικές δόσεις perifosine για 24 ώρες. Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι» και αναλύθηκαν για περιεκτικότητα κυτταρικού DNA με κυτταρομετρία ροής. Τα στοιχεία που καταγράφονται στον πίνακα αντιπροσωπεύουν μέσες ± SD (η = 3) του ποσοστού των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου, * p≤0.005, ** p≤0.001. Β, REN, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις perifosine για 24 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν, και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, ανιχνεύθηκε με ένα ειδικό αντι-PARP1 αντίσωμα και τουμπουλίνης για ίση φόρτωση. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. C, Επίδραση του perifosine στην βιωσιμότητα των κυττάρων REN ελέγχθηκε στις 24, 48 και 72 ώρες θεραπείας στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις.

σημεία

, μέσοι όροι ± SD τριών μεμονωμένων μετρήσεων

Η

Μια συστατική δραστική μορφή της ΑΚΤ πάνω-έρχεται perifosine αναστολή

AKT περιλαμβάνει τρεις στενά συνδεδεμένες ισομορφές:. AKT 1, 2 και ΑΚΤ ΑΚΤ 3, που κωδικοποιείται από τρία διαφορετικά γονίδια [24]. Καθώς η φωσφο-αντισώματος δεν κάνει διακρίσεις μεταξύ των τριών ισομορφών, σε αυτή τη μελέτη, ΑΚΤ 1, ΑΚΤ 2 και AKT 3 έκφραση διερευνήθηκε σε κύτταρα REN. Τα δεδομένα που αναφέρονται στο σχήμα 3Α και 3Β δείχνουν ότι τα κύτταρα εκφράζουν REN ΑΚΤ1 και ΑΚΤ3, ενώ ΑΚΤ2 mRNA δεν αποδεικνύεται (παρόμοια αποτελέσματα σε κύτταρα MSTO211-H φαίνονται στο Σχήμα S1).

Α, ΑΚΤ1, 2, 3 και ακτίνη ως έκφραση mRNA ελέγχου στα Α549 και κύτταρα REN αξιολογήθηκε με RT-PCR, όπως αναφέρεται στο «Υλικά και Μέθοδοι» ενότητα. Β, ΑΚΤ1 και η έκφραση της πρωτεΐνης 3 αξιολογήθηκε με ανάλυση Western blot σε κύτταρα REN με ειδικά αντισώματα ισομορφή, τουμπουλίνης κηλίδα επιβεβαιώνεται ίση φόρτωση. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. C, τα κύτταρα REN επιμολύνθηκαν με 1 μg /πλάκα του πλασμιδίου που κωδικοποιεί την συστατική ενεργοποιημένη μορφή του ΑΚΤ, Myr-ΑΚΤ1 ή 3. 24 ώρες τα κύτταρα REN μετά την επιμόλυνση υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 23 μΜ perifosine για 1 ώρα, στη συνέχεια λύθηκαν και ίσες ποσότητες πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE που ακολουθείται από ανοσο-στύπωση με ειδικά αντισώματα προς φωσφορυλιωμένο ΑΚΤ, ΗΑ για την επιβεβαίωση επιμόλυνση και τουμπουλίνης για ίση φόρτωση. Α, Η επίδραση της perifosine σε κύτταρα επιμολυσμένα με Myr- ΑΚΤ1 ή 3 εκτιμήθηκε επίσης επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. κύτταρα REN επιμολύνθηκαν με 1 μg /πλάκα του πλασμιδίου κωδικοποίησης Myr-ΑΚΤ1 ή 3 και 24 ώρες μετά την επιμόλυνση υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 23 μΜ perifosine για 24 ώρες. Στο τέλος της θεραπείας καταμέτρηση βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε.

σημεία

, μέσοι όροι ± SD τριών μεμονωμένων μετρήσεων. Perifosine μεταβάλλει αισθητά τη μετατόπιση της μεμβράνης ΑΚΤ, οπότε το επόμενο ερώτημα εάν αναγκαστεί έκφραση ενός εξωγενούς Myr-ΑΚΤ1 ή Myr-ΑΚΤ3 μπορούσε καταργήσει την επίδραση της perifosine επί ΑΚΤ ενεργοποίηση φωσφορυλιώσεις και ανάπτυξη των κυττάρων. Αντιφατικά στοιχεία είναι διαθέσιμα στη βιβλιογραφία σχετικά με την ικανότητα ενός ουσιαστικώς δραστικής ΑΚΤ να ξεπεράσει perifosine δράση. Ενώ σε κύτταρα καρκίνου προστάτη αναστολή της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ ουσιαστικά απαλλαγεί από εισαγωγή ενός Myr-ΑΚΤ1, η οποία παρακάμπτεται η απαίτηση για PH πρόσληψη μεμβράνη τομέα μεσολάβηση, σε κύτταρα μυελώματος έχει περιγραφεί ότι perifosine ξεπεραστούν συστατική εξαιρετικά δραστικό ΑΚΤ1 [25], [26]. Εμείς παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα REN είτε με ΗΑ-tagged Myr-ΑΚΤ1 ή Myr-ΑΚΤ3 και τους αγωγή για 24 ώρες με τη δόση IC50 του perifosine. ανάλυση Western blot-αναφέρονται στο Σχήμα 3C δείχνει ότι η επιμόλυνση αμφοτέρων Myr-ΑΚΤ1 και Myr-ΑΚΤ3 υπερνικά την αναστολή της φωσφορυλίωσης perifosine ΑΚΤ σε κύτταρα REN? μόνο μία ελαφρά μείωση της φωσφορυλίωσης, πιθανώς λόγω μπλοκ των ενδογενών πρωτεϊνών, παρατηρήθηκε. Ανάλυση της κυτταρικής ανάπτυξης που αναφέρονται στο Σχήμα 3D δείχνει ότι και οι δύο επιμολυσμένα εκατομμύρια χρόνια-AKTs διασωθεί προκαλείται από perifosine μπλοκ του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Η

Perifosine επηρεάζει EGFR και ΚΟΑ σηματοδότησης

Perifosine είναι παρόμοια με φωσφολιπίδια, η κύρια συστατικά των κυτταρικών μεμβρανών και μπορεί να τροποποιήσει μεμβράνη που σχετίζονται με μεταγωγή σήματος. Σταθερά σε κύτταρα καρκίνου προστάτη perifosine ήταν σε θέση να προσδιορίσει μια μείωση της δραστηριότητας ΑΚΤ, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και να επάγει απόπτωση μετά από διέγερση με 50 ng /ml EGF, αν και δεν υπάρχουν στοιχεία σχετικά με την ενεργοποίηση του EGFR έδειξαν μέχρι σήμερα [27]. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε εάν perifosine θα μπορούσε να παρέμβει με την μεσολάβηση συνδέτη ενεργοποίηση του EGFR και μετεωρολογικές από πειράματα ανοσοκατακρήμνισης και Δυτική κηλίδας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α και 4C στα κύτταρα REN πεινασμένα, κατεργάζεται 1 ώρα με perifosine (23 μΜ) και στη συνέχεια διεγέρθηκαν 10 λεπτά με 5 ng /ml EGF ή HGF δύο EGFR και ΜΕΤ δεν φωσφορυλιώθηκαν ακόμη και παρουσία των συνδετών τους. Επίσης EGFR και ΚΟΑ σηματοδότησης σημαντικά σε κίνδυνο? στην πραγματικότητα, επίσης, που προκαλείται ΑΚΤ φωσφορυλίωση αυξητικού παράγοντα έντονα αναστέλλεται. Όπως περιγράφεται σε άλλα μοντέλα κυττάρου [26], ανάλογες συγκεντρώσεις perifosine προκάλεσε πράγματι μια μικρή αύξηση στη βασική ERK1 /2 φωσφορυλίωση, ενώ εξουδετερώνεται εκείνη που προκαλείται από αυξητικούς παράγοντες. Η επίδραση της perifosine αξιολογήθηκε επίσης επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων διαμεσολαβείται παράγοντα ανάπτυξης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Β και 4D, 23 μΜ perifosine χορηγήθηκε 24 ώρες στη REN κύτταρα παρουσία του EGF ή HGF κατήργησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προκαλείται από αυξητικό παράγοντα. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρόμοια δεδομένα παρατηρήθηκαν στην MSTO-211H κυτταρική γραμμή (Σχήμα S1). Επιπλέον, perifosine ήταν πιο αποτελεσματικό από ενιαίο ή συνδυασμένο χρήση ειδικών αναστολέων EGFR και ΜΕΤ, είτε από την άποψη της κυτταρικής βιωσιμότητας από της ενεργοποίησης ΑΚΤ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Perifosine ενισχύει απόκριση των κυττάρων ΜΜΚ σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες

Για να προσδιοριστεί η φύση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ perifosine και χημειοθεραπευτικών παραγόντων που χρησιμοποιούνται σήμερα στη θεραπεία MME, εξετάσαμε τα στοιχεία από τις καμπύλες δόσης-απόκρισης με ανάλυση ισοβολογράμματος. Επιλέξαμε να αξιολογήσει αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα χρησιμοποιώντας το IC50 για ενιαία επιδράσεις των φαρμάκων που προσδιορίστηκαν πειραματικά, χρησιμοποιώντας τα δεδομένα από τα πειράματα δόσης-απόκρισης ως σημείο εκκίνησης. Perifosine (από 5 έως 20 μΜ) και σισπλατίνη (IC50: 100 μΜ) ή πεμετρεξίδη (IC50: 22 μΜ) ή γεμσιταβίνη (IC50: 2 ηΜ) χορηγήθηκαν ταυτόχρονα για 24 ώρες για να REN κύτταρα σε colture. Στο τέλος της επώασης τα κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης και απαριθμήθηκαν. Αντιπροσωπευτικά ισοβολογράμματα στο Σχήμα 5 δείχνουν ότι ο συνδυασμός του perifosine και cisplatin εμφανίζεται ισχυρή συνεργιστική κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα REN σε ένα ευρύ φάσμα δόσεων. Επιπλέον, perifosine έδειξε προσθετικότητα σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη, ενώ φαινόταν να ανταγωνίζεται τη δράση της πεμετρεξίδη. Sinergy με σισπλατίνη αναφέρεται επίσης στην MSTO-211H κυτταρική γραμμή (Σχήμα S1), ακόμη και αν παρατηρήθηκε διαφορετική ευαισθησία στα φάρμακα.

Συζήτηση

ΡΙ3-Κ σηματοδότηση /AKT έχει αποδειχθεί ότι έχουν ένα κρίσιμο βιολογικό αντίκτυπο στην Mme ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, αντι-απόπτωση και χημειο-αντίσταση.

ενεργοποίηση της ΑΚΤ, όπως αναφέρθηκε από Altomare et al., παρατηρήθηκε στο 65% των MME δείγματα ακόμη και αν γενετικές αλλοιώσεις φάνηκε να είναι σπάνια για την ενεργοποίηση /AKT PI3-K στα κύτταρα Mme [12]. Επιπλέον, ανάλυση της σειράς φωσφο-RTK έδειξαν ότι σε κύτταρα Mme η οικογένεια EGFR, EGFR, ErbB2 ή ErbB3, ήταν συχνά συν-ενεργοποιείται με το ΚΟΑ, η οποία πρότεινε ότι ΚΟΑ και EGFR ενεργοποίηση της οικογένειας μπορεί να αντισταθμίσει ο ένας τον άλλο για την επίμονη ενεργοποίηση κατάντη σηματοδότησης [28]. Στην πραγματικότητα, όπως αναφέρεται σε πολλές μελέτες, ακόμα και αν EGFR και ΚΟΑ ήταν άκρως εκφράζονται σε MME, μόνο οι αναστολείς RTK εφαρμόζεται σε δοκιμές φάσης ΙΙ, δεν ήταν επαρκής για να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό κα κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναστολή των πολλαπλών RTKs μπορεί να χρησιμεύσει για να αναπτύξει μια πιο αποτελεσματική θεραπεία για τους ασθενείς με κα στοχεύουν στο μέλλον [28].

από την εξέταση του PI3K /ΡϋΚ1 /AKT οδό σηματοδότησης, ως σημείο σύγκλισης των επιπτώσεων παράγοντα που σχετίζονται με την ανάπτυξη στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ως δυνητικό νέο στόχο για θεραπείας MME, οδήγησε τα πειράματα που αναφέρονται εδώ.

Perifosine [οκταδεκυλ (1,1-διμεθυλο-πι-περιδινιο-4-υλ) -φωσφορικό] είναι ένα συνθετικό μυθιστόρημα alkylphospholipid, μια νέα κατηγορία αντικαρκινικών παραγόντων που στοχεύει κυτταρικές μεμβράνες, αναστέλλει την ενεργοποίηση ΑΚΤ, και επάγει την απόπτωση σε διαφορετικά κύτταρα καρκινώματος.

Α, Β, Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα REN προ-κατεργασία με 23 μΜ perifosine για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν 10 λεπτά, με EGF (5 ng /ml) ή HGF (5 ng /ml). Στο τέλος του πειράματος, λύματα κυττάρων παρασκευάστηκαν ή ανοσοκαταβυθίστηκαν και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση με αντισώματα υποδεικνύονται. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών πειραμάτων. Β, D, Η επίδραση της perifosine αξιολογήθηκε επίσης επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων διαμεσολαβείται παράγοντα ανάπτυξης. κύτταρα REN υποβλήθηκαν σε αγωγή με 23 μΜ perifosine 24 ώρες απουσία ή παρουσία 5 ng /ml EGF ή HGF. Στο τέλος της θεραπείας καταμέτρηση βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε.

σημεία

, μέσοι όροι ± SD τριών μεμονωμένων μετρήσεων.

Η

Α, Β, C, Ισοβολόγραμμα οικόπεδα των αλληλεπιδράσεων μεταξύ perifosine και σισπλατίνη ή γεμσιταβίνη ή πεμετρεξίδη ενώσεων σε κύτταρα REN. Κύτταρα (5 × 10

4) απλώθηκαν σε πλήρες μέσο και αφέθηκαν να προσκολληθούν στην επιφάνεια όλη τη νύκτα. Το μέσο επιμετάλλωση απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις perifosine και τις δόσεις που IC50 των άλλων φαρμάκων. Για να προσδιοριστεί η φύση της αλληλεπίδρασης μεταξύ perifosine και cis-πλατίνα ή γεμσιταβίνη ή πεμετρεξίδη, μετρήσαμε επιζώντα κύτταρα μετά από 24 ώρες επώασης φαρμάκου. Η διαγώνια γραμμή αντιπροσωπεύει την isoeffect γραμμή της προσθετικότητας. Κάθε σημείο είναι η μέση προσδιορίζεται από τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Τα πειράματα που παρουσιάζονται στο παρόν έγγραφο αποδεικνύει ότι perifosine, προκάλεσε αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης MME (IC

50 κατά 7,5 μΜ έως 23 μΜ σε 24 ώρες) και διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε φάση G2-M, που σχετίζεται με ταχέως μειωμένη ενεργοποίηση ΑΚΤ, όπως αξιολογείται με Ser473 φωσφορυλίωση ποσοτικοποίηση. Όπως προτίμηση ενεργεί για τη δομή της μεμβράνης των ενεργών πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, perifosine οδήγησε μόνο ελαφρώς τοξικά σε φυσιολογικά mesothelial κύτταρα

Η οικογένεια ΑΚΤ έχει τρία ιδιαίτερα ομόλογο ισομορφές:. ΑΚΤ 1, ΑΚΤ 2 και AKT 3, κωδικοποιούνται από τρία διαφορετικά γονίδια. Και οι τρεις πρωτεΐνες ΑΚΤ περιέχει μια Ν-τελική περιοχή πλεκστρίνης ομολογίας (ΡΗ), έναν καταλυτικό τομέα κινάσης και C-τερματικού ρυθμιστικού πεδίου.

Καθώς η φωσφο-ειδικά και τα αντισώματα αντι-ΑΚΤ που χρησιμοποιούνται δεν κάνουν διακρίσεις μεταξύ των τριών ισομορφών, είμαστε πιο βαθιά διερευνήθηκε έκφραση τους στα κύτταρα μας. Εμείς πρώτον περιγράφουν ότι κύτταρα MME εκφράζουν ΑΚΤ1 και ΑΚΤ3 και ότι perifosine παρεμβαίνει με τους δύο. Λαμβάνοντας υπόψη το δυναμικό ογκογένεσης των ισομορφών ΑΚΤ, η περαιτέρω μελέτη σχετικά με τη λειτουργία τους σε MME χρειάζονται. Αναστολή της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ουσιαστικά απαλλαγεί από την εισαγωγή ενός συστατικού δραστικής μυριστοϋλιωμένης ΑΚΤ1 ή 3, η οποία παρακάμπτεται η απαίτηση για PH πρόσληψη μεμβράνη domain-μεσολάβηση, υποστηρίζοντας την υπόθεση ότι perifosine δεν επηρεάζει άμεσα δραστικότητα ΡΙ3-Κ ή phosphoinositide- εξαρτώμενη κινάση 1 (ΡϋΚ1). Έχει αναφερθεί ότι perifosine ενισχύει την αντικαρκινική δράση του cetuximab σε ΡΤΕΝ ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα και ότι η θεραπεία συνδυασμού ενίσχυσε την αναστολή της φωσφορυλίωσης του ΑΚΤ, ρ44 /42MAPK και p38MAPK, αλλά αντισταθμιστεί η φωσφορυλίωση της SAPK /JNK που ενεργοποιούνται από perifosine μόνη θεραπεία [29]. Επιπλέον, έχει περιγραφεί ότι perifosine έδειξε συνεργιστικά αποτελέσματα με erlotinib αποκατάσταση της αποτελεσματικότητας έναντι αναστολείς EGFR σε προστάτη [28].

Είναι σημαντικό, όταν αναλύσαμε πιο βαθιά την ανταπόκριση των κυττάρων MME προς EGF και HGF παρατηρήσαμε ότι perifosine, πιθανώς δρουν στη δομή της κυτταρικής μεμβράνης ή επηρεάζουν τις αλληλεπιδράσεις υποδοχέα ή πρόσληψη συν-ενεργοποιητών, κατήργησε ανάντη σε μόρια σηματοδότησης που προκαλείται από συνδέτη φωσφορυλίωσης τόσο EGFR και ΚΟΑ.

Τέλος, εξετάσαμε τις επιδράσεις της συνδυασμένης θεραπείας με perifosine και σισπλατίνη ή πεμετρεξίδη ή γεμσιταβίνη χρησιμοποιώντας την ανάλυση ισοβολογράμματος. Όπως αποδεικνύεται από τα αποτελέσματα perifosine μας σαφώς synergized με τη θεραπεία με σισπλατίνη και άσκησαν ένα προσθετικό αποτέλεσμα με γεμσιταβίνη.

Εν ολίγοις, έχουμε επισημάνει AKT, μια πολυλειτουργική κινάσης, του οποίου η ενεργοποίηση σχετίζεται με την αντίσταση σε κυτταρικό θάνατο και ογκογένεση, όπως ένας σημαντικός στόχος της perifosine. Έχουμε αποδείξει ότι εδώ perifosine αναστέλλει είτε ΑΚΤ1 από φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση ΑΚΤ3 σε κύτταρα που αναπτύσσονται εκθετικά σε μέσο που περιέχει ορό και μετά αυξητικού παράγοντα διέγερσης. Η τελευταία αυτή μηχανισμοί παρέχουν μία νέα λογική για να εξετάσει perifosine επίσης ως αναστολέα πολυ-στόχου, ενώ παρεμβολή με την ορθή εντοπισμό μεμβράνη των πρωτεϊνών στόχων για φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση τους (αντί της άμεσης αναστολής της δραστικότητας φωσφοτρανσφεράσης των κινασών γνωστό ότι ρυθμίζει ΑΚΤ) , φαίνεται να είναι ένα επιπλέον νέο μηχανισμό δράσης του φαρμάκου που αποκαλύπτουμε εδώ. Αν και η αποτελεσματικότητα της συνδυασμένης θεραπείας μεταξύ σισπλατίνη και perifosine πρέπει να επικυρωθεί από την περαιτέρω

in vivo

μελέτες, τα αποτελέσματα μας υπογραμμίζουν perifosine ως θεραπεία πολυ-στόχο για Mme. Πιο ενδιαφέρον, perifosine είχε ήδη δείξει να δώσει μερική ανταπόκριση και σταθερή νόσο σε ασθενείς σε θεραπεία δεύτερης γραμμής (αδημοσίευτα στοιχεία ευγενικά από Keryx βιοφαρμακευτική).

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταροκαλλιέργειες θεραπείες και επιμόλυνση

Η επιθηλιοειδής MME που προέρχονται κυτταρική σειρά REN που χρησιμοποιήθηκε ως το κύριο πειραματικό μοντέλο στην έρευνα αυτή παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. SM Albelda (University of Pennsylvania, Philadelphia, ΡΑ), ΜΜΡ σταθεροποιήθηκαν από πλευριτική συλλογή των ασθενών κακόηθες μεσοθηλίωμα [30] και πρωτογενείς καλλιέργειες HMC-τριτ ελήφθησαν από ασθενείς με συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια και αθανατοποιημένα με έκφραση ενός ανθρώπινου υπομονάδας τελομεράσης [31]. Το διφασικό προέρχονται κυτταρική σειρά MSTO-211H ελήφθη από το Istituto Scientifico Tumori (IST) κυττάρων-τράπεζα, Γένοβα, Ιταλία. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πρότυπες συνθήκες.

κύτταρα αναπτύσσονται προς 80% συρροή σε δίσκους καλλιέργειας ιστού διαμολύνθηκαν παροδικά με pcDNA3 Myr-HA-ΑΚΤ1 ή ρΒΑΒΕ puroL Myr-HA-ΑΚΤ3 πλασμίδιο που κωδικοποιεί για myristilated ιδιοσυστατικά ενεργή μορφή της AKTs από Addgene από το αντιδραστήριο LipofectAMINE όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Τα μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για φωσφο τυροσίνη, φωσφο-ERK1 (pThr202 και pTyr204) και ERK2 (pThr185 και pTyr187) ΜΑΡ κινάσες, και φωσφο-Akt (pSer473) ΑΚΤ1 και ΑΚΤ3, ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Τα αντισώματα ειδικά για α-τουμπουλίνης, PARP1, ERK1 /2, panAKT, ΚΟΑ, EGFR και HA ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). συζευγμένα αντισώματα αντι ποντικού IgG και υπεροξειδάσης αντι-κουνελιού, αυξητικούς παράγοντες και τα χημικά αντιδραστήρια ήταν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). ECL ήταν από την Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden). μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης ήταν από την Bio-Rad (Hercules, CA). μέσα καλλιέργειας, ορούς, αντιβιοτικά και Lipofectamine ήταν από Invitrogen (Carlsbad, CA). Perifosine διατίθεται στο εμπόριο και ευγενώς από Keryx βιοφαρμακευτική (New York, NY).

λύσεως κυττάρων, ανοσοκαθίζηση και ανοσοστύπωμα

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν και SDS-PAGE διαχωρίζονται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32] . Μετά SDS-PAGE, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη, αντέδρασε με τα υποδεικνυόμενα ειδικά αντισώματα και κατόπιν ανιχνεύεται με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση κρένου και την chemioluminescent αντιδραστήριο ECL. Η πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το GS 250 Molecular Imager (Bio-Rad).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων όπως προσδιορίζεται με άμεση καταμέτρηση

κύτταρα ΜΜΚ αναπτύχθηκαν και κατεργάστηκαν σε πλήρες μέσο όπως ανωτέρω αναφέρεται, στη συνέχεια, ήταν επεξεργασία με θρυψίνη και χρωματίστηκαν με Trypan blue. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε σε ένα θάλαμο Burker.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

κυτταρικού κύκλου /αναλύσεις απόπτωση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας χρώση ιωδιούχου προπιδίου με ανάλυση μετέπειτα FACS. 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ιστών με ή χωρίς αγωγή για 24 ώρες. Μετά την επώαση, τα προσκολλημένα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη (0,5% θρυψίνη /0.1% EDTA σε PBS). Πωλείται και τα αιωρούμενα κύτταρα συλλέχθηκαν σε πλήρες μέσο DMEM και φυγοκεντρήθηκε στα 500 g για 10 λεπτά. Τα ιζήματα πλύθηκαν με PBS και μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη 75% όλη τη νύκτα αιθανόλη στους 4 ° C, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 μg /ml RNAse Α, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ιωδιούχο 25 μg /ml προπίδιο. Στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα flowcytometer FACS (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) και το λογισμικό ΜΟϋΡΙΤ (Verity Software House, Inc., Topsham, Maine).

απομόνωση RNA και RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από REN, MSTO-211H και κυτταρικές γραμμές Α549 μετά την αντιδραστηρίου ΤπζοΙ (Life Technologies, Inc.) πρωτόκολλο. Η ποιότητα και η ποσότητα του RNA προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης του συνολικού RNA στα 260 και 280 nm. Για να αποκτήσετε cDNA χρησιμοποιήθηκε RevertAid cDNA Synthesis Kit από Fermentas. Εκκινητές για έκφραση ισομορφή Akt περιγράφηκαν από Okano et al. [33] και συντέθηκαν με MWG. Οι εκκινητές ήταν: 5′-GCTGGACGATAGCTTGGA-3 ‘(Akt1 έννοια)? 5’-GATGACAGATAGCTGGTG-3 ‘(Akt1 αντινοηματικό)? 5’-GGCCCCTGATCAGACTCTA-3 ‘(Akt2 έννοια)? 5’-TCCTCAGTCGTGGAGGAGT-3 ‘(Akt2 αντινόημα)? 5’-GCAAGTGGACGAGAATAAGTCTC-3 ‘(Akt3 έννοια)? και 5’-ACAATGGTGGGCTCATGACTTCC-3 ‘(Akt3 αντιπληροφοριακό). β-ακτίνης εναρκτήρες ήταν 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 ‘(νοηματικό) και 5′-CTCCTTAAGTCACGCACGATTTC-3’ (antisense). Αντιδράσεις RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας 2xPCR Master Mix από Fermentas σύμφωνα με τυποποιημένες διαδικασίες. Τα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% και οπτικοποιήθηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. Οι Akt εκκινητές σχεδιάστηκαν για να παράγουν 383- (Akt1), 276- (Akt2), και 329- (Akt3) τα προϊόντα bp, αντίστοιχα.

Στατιστική και Ισοβολόγραμμα ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση τιμή ± SEM. Οι διαφορές μεταξύ των τιμών που λαμβάνονται σε έναν πληθυσμό κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με διαφορετικές πειραματικές συνθήκες προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το μη ζευγαρωμένο

t-τεστ

. Ένα

P-τιμή του & lt

? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Η θεωρητική βάση της μεθόδου ισοβολογράμματος έχει περιγραφεί σε προηγούμενες μελέτες [34], [35].

Με βάση τις καμπύλες δόσης-απόκρισης της σισπλατίνης, πεμετρεξίδη και γεμσιταβίνη, τρία ισοβολογράμματα κατασκευάστηκαν με τη γραφική αναπαράσταση των τιμών IC50 των απλών φαρμάκων στο

y

και της perifosine στο

x

άξονες, αντίστοιχα, και υπολογίστηκε ο συνδυασμός θεωρητικής δόση πρόσθετης ύλης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1 .

Ανάλυση perifosine επιδράσεις στα κύτταρα MSTO-211H. Α, επίδραση του perifosine στην βιωσιμότητα των κυττάρων MSTO-211H στις 24, 48 και 72 ώρες θεραπείας στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις.

σημεία

, μέσοι όροι ± SD τριών μεμονωμένων μετρήσεων. Β, Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα MSTO-211H προ-επεξεργασία με 20 μΜ perifosine για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν 10 λεπτά, με EGF (5 ng /ml) ή HGF (5 ng /ml). Στο τέλος του πειράματος, λύματα κυττάρων παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση με αντισώματα υποδεικνύονται. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών πειραμάτων. C, ΑΚΤ1, 2 και 3 και ακτίνη, ως έλεγχος, της έκφρασης mRNA σε κύτταρα MSTO-211H αξιολογήθηκε με RT-PCR, όπως αναφέρεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι». D, Ισοβολόγραμμα οικόπεδο των αλληλεπιδράσεων μεταξύ perifosine και σισπλατίνη σε κύτταρα MSTO-211H

doi:. 10.1371 /journal.pone.0036856.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

ευχαριστούμε Dott. Peter Sportelli από Keryx βιοφαρμακευτική για την παροχή κλινικά δεδομένα σχετικά με τους ασθενείς που έλαβαν perifosine.