Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατα υπήρξε αυξημένο ενδιαφέρον για τις φαρμακολογικά δραστικές φυσικά προϊόντα που σχετίζονται με θεραπείες των διαφόρων ειδών ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Fucoidan είναι ένας πολυσακχαρίτης που προέρχεται από καφέ φύκια και έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό ως συστατικό σε ορισμένα διαιτητικά προϊόντα συμπλήρωμα. Αν και fucoidan έχει γίνει γνωστό ότι έχει αντικαρκινική δράση, τα αντι-μεταστατική αποτελέσματα και λεπτομερής μηχανισμός της ενέργειες έχουν ελάχιστα κατανοητή. Ως εκ τούτου, οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να καταδείξει τις αντι-μεταστατική λειτουργίες fucoidan και ο μηχανισμός δράσης της, χρησιμοποιώντας Α549, ένα ιδιαίτερα μεταστατικό ανθρώπινο πνεύμονα καρκίνου κυτταρική γραμμή.

Μέθοδοι και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

fucoidan αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων Α549 σε συγκέντρωση 400 μg /ml. θεραπεία Fucoidan μη τοξική δόση (0-200 μg /ml) παρουσιάζει μία εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση ανασταλτική επίδραση στην εισβολή και τη μετανάστευση του καρκινικού κυττάρου μέσω μειώνοντας δραστικότητα του ΜΜΡ-2. Για να γνωρίζουμε το μηχανισμό αυτών των ανασταλτικών αποτελεσμάτων, κηλίδωση Western εκτελέστηκε. θεραπεία Fucoidan ρυθμίζει προς τα κάτω εξωκυτταρική κινάση σήματος που σχετίζονται με 1 και 2 (ERK1 /2) και φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) στόχος -Akt-της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (ΡΙ3Κ-Akt-mTOR) οδού. Επιπλέον, fucoidan μειώνει τα κυτοσολικά και πυρηνικά επίπεδα του πυρηνικού παράγοντα κάππα Β (p65).

Συμπεράσματα /Σημασία

Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι fucoidan εμφανίζει αντι-μεταστατική επίδραση στα καρκινικά κύτταρα Α549 πνεύμονα μέσω της κάτω ρύθμιση ERK1 /2 και της Akt-mTOR, καθώς και NF-kB μονοπατιών σηματοδότησης. Ως εκ τούτου, fucoidan μπορεί να θεωρηθεί ως δυνητική θεραπευτική αντιδραστήριο κατά της μετάστασης του διηθητικού ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων

Παράθεση:. Lee H, Kim JS, Kim E (2012) Fucoidan από φύκια

Fucus Vesiculosus

Αναστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή των Ανθρωπίνων καρκίνος του πνεύμονα μέσω του PI3K-Akt-mTOR Pathways. PLoS ONE 7 (11): e50624. doi: 10.1371 /journal.pone.0050624

Επιμέλεια: Renping Zhou, Πανεπιστήμιο Rutgers, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30, Αυγούστου, 2012? Αποδεκτές: 23η Οκτωβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 Νοεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Lee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η μετάσταση είναι η κύρια αιτία (μέχρι και 90%. ) των θανάτων από καρκίνο. Η ανάπτυξη της μετάστασης του καρκίνου αποτελείται από πολλαπλές διαδικασίες, στις οποίες τα καρκινικά κύτταρα αποσπώνται πρώτα από τον πρωτογενή όγκο, εισβάλλουν στους περιβάλλοντες ιστούς και intravasate στο αίμα και /ή το λεμφικό σύστημα και εξαγγειώνονται από το αγγειακό σύστημα και στη συνέχεια να εγκατασταθούν και να αποικίσουν σε όργανα στόχους. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) παίζουν βασικό ρόλο στην μετάσταση όγκου, όπου MMPs αποικοδομούν εξωκυτταρική μήτρα (ECM) πρωτεΐνες όπως κολλαγόνο, πρωτεογλυκάνη, την ελαστίνη, η λαμινίνη, και φιμπρονεκτίνη [1], [2]. Μεταξύ αυτών, ΜΜΡ-2 (ζελατινάση Α) και ΜΜΡ-9 (ζελατινάση Β) εκφράζονται άφθονα σε διάφορες κακοήθεις καρκίνους και αποδομούν το κολλαγόνο τύπου IV, το οποίο είναι ένα κύριο συστατικό της βασικής μεμβράνης. Γενικώς, ΜΜΡ-2 είναι υπερ-εκφράζεται ιδιοσυστατικά σε υψηλά μεταστατικούς καρκίνους, ενώ το ΜΜΡ-9 επάγεται από ορισμένους παράγοντες διέγερσης όπως φλεγμονωδών κυτοκινών, του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και φορβόλη-12-μυριστική-13-οξική [3]. Ως εκ τούτου, η ΜΜΡ-2 μπορεί να παίζει ένα περισσότερο σημαντικό ρόλο στην μετανάστευση καρκινικών κυττάρων και εισβολή.

καρκίνος του πνεύμονα είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους στον κόσμο και μια κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο, που αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το ένα εκατομμύρια θανάτους ετησίως σε όλο τον κόσμο [4]. Ειδικότερα, είναι ένα εξαιρετικά επιθετική και μεταστατικού όγκου πιθανώς λόγω εκκρίνουν υψηλότερα επίπεδα ΜΜΡ σύγκριση με άλλες μορφές καρκίνου. Ως εκ τούτου, η αναστολή της ΜΜΡ-2 σε καρκινικά κύτταρα φαίνεται να είναι μια ενδιαφέρουσα θεραπευτικός στόχος των άκρως μεταστατικών κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. έκφραση MMPs ρυθμίζεται από μεταγραφικούς παράγοντες (AP-1 και NF-kB), μέσω ανάντη οδών συμπεριλαμβανομένων των ενεργοποιημένων από μιτογόνο κινασών (MAPKs) και ΡΙ3Κ-Akt οδών [5]. MAPKs αποτελούνται από τρία κινάσες, συμπεριλαμβανομένων των εξωκυτταρικών κινάση σήματος που σχετίζονται με 1 και 2 (ERK1 /2), c-Jun Ν-τελική κινάση /ενεργοποιημένης στρες πρωτεϊνική κινάση (JNK /SAPK), και ρ38. MAPKs εμπλέκονται σε μια ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών όπως ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση και εισβολή [3]. Η ενεργοποίηση των ΡΙ3Κ μπορεί να διεγείρει κατάντη στόχο του, Akt, και στη συνέχεια ρυθμίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων, πρόσφυση, και εισβολή [6].

Υπήρξαν πολλές αναφορές ερευνά την χημειοπροληπτική καρκίνου ή θεραπευτικούς παράγοντες από φυσικά προϊόντα. Πολλά είδη θαλάσσιων φυκιών έχουν χρησιμοποιηθεί από καιρό στη διατροφή των τροφίμων, αλλά και να τεκμηριώνονται όπως χρησιμοποιείται στην παραδοσιακή ασιατική ιατρική για πάνω από 1000 χρόνια [7], [8]. Περιέχουν διάφορα λειτουργικά συστατικά, όπως porphyran, gepsin, αλγινικό οξύ, και ολιγοσακχαρίτης. Fucoidan, των οποίων το μοριακό βάρος μέσος όρος είναι περίπου 20 000, είναι μια θειωμένα πολυσακχαρίτης που εξάγεται από καστανά θαλάσσια φύκη και αποτελείται από L-φουκόζη και θειικού εστέρα ομάδες. Έχει προηγουμένως προταθεί ότι fucoidan έχει διάφορες βιολογικές δράσεις, όπως η αντιβακτηριακή [9], αντιοξειδωτικό [10], αντι-φλεγμονώδη [11], αντιπηκτικό [12], και κατά των όγκων δραστηριότητες [2]. Σε C57BL /6 ποντίκια μεταμοσχεύθηκαν με κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα Lewis, fucoidan από

Fucus evanescens

παράγονται μέτρια κατά του όγκου και αντι-μεταστατικά αποτελέσματα και ενίσχυσε την αντι-μεταστατική, αλλά όχι αντικαρκινική δράση του κυκλοφωσφαμιδίου [13]. Επιπλέον, fucoidan ανέστειλε ΜΜΡ-2/9 δραστηριότητες και διεισδυτικότητα των ΗΤ-1080 κυττάρων και το σχηματισμό των αγγειακών σωληναρίων μέσω καταστολή της έκφρασης και έκκριση ενός παράγοντα αγγειογένεσης [14]. Ωστόσο, μοριακός μηχανισμός δράσης του έχει σπάνια ακόμη κατανοητός.

(Α) κύτταρα Α549 Υποσυρρέουσες επωάστηκαν για 48 ώρες απουσία ή παρουσία fucoidan (0, 12.5, 25, 50, 100, και 200 μg /ml) σε μέσο RPMI χωρίς ορό. Τα ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν, και η δραστικότητα τους ΜΜΡ-2 εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ζυμογραφία ζελατίνης. (Β) δραστικότητα ΜΜΡ-2 με ανάλυση του ζυμογραφία ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση των εντάσεων ζώνη χρησιμοποιώντας Image J λογισμικού. (C) Συνολική κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western ανιχνεύθηκε με αντίσωμα αντι-ΜΜΡ-2. (D) Έκφραση της ΜΜΡ-2 με ανάλυση western blot ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση των εντάσεων ζώνη χρησιμοποιώντας Image J λογισμικού. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από έξι πειράματα. Σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου, * ρ & lt? 0,05 και ** p & lt?. 0.01

Η

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η επίδραση των fucoidan για τη μετανάστευση, την εισβολή και MMP-2 έκφραση της ανθρώπινης Α549 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και των υποκείμενων αντι-μεταστατική τους μηχανισμούς δράσης της.

Υλικά και Μέθοδοι

Προετοιμασία Fucoidan και αντιδραστήρια

Fucoidan εκχύλισμα από φύκια

Fucus Vesiculosus

ελήφθη από την Sigma (Sigma, St. Louis, Μο, USA). σκόνη Fucoidan διαλύθηκε σε PBS, στη συνέχεια αυτό αποστειρώθηκε με χρήση φίλτρου 0,45 μm πόρου (Sartorius Biotech GmbH, Gottingen, Γερμανία) και αποθηκεύεται ως «εκχύλισμα fucoidan (20 mg /ml) ‘στους 4 ° C μέχρι τη χρήση. αντιδραστήρια ΜΤΤ και ζελατίνη (G8150) αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ, USA). RPMI 1640 χωρίς ερυθρό της φαινόλης, θρυψίνη-EDTA, διάλυμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης-αμφοτερικίνη Β (10.000 U /ml, 10 mg /ml, και 25 μg /ml), ορό εμβρύου μόσχου (FBS), και φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) ήταν από την Gibco BRL, Life Technologies (ΗΠΑ). LY294002 (αναστολέας ΡΙ3Κ), U0126 (ERK1 /2 αναστολέα), και η ραπαμυκίνη (αναστολέας mTOR) ελήφθησαν από Tocris Cookson Ltd (Bristol, UK). Για ERK1 /2, ρ38, JNK, Akt, mTOR (Ser2448) και NF-kB, ολικό ή /και φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη-ειδικά αντισώματα αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). κιτ δοκιμασίας Invasion ήταν από την BD Biosciences (San Jose, CA, USA).

(Α) Α549 κύτταρα επιστρώθηκαν επί 12 φρεατίων και αναπτύχθηκαν σε 90% συρροή σε RPMI που περιέχει 10% FBS. Τα κύτταρα γδαρμένο με ένα ρύγχος πιπέτας και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με fucoidan (0, 50, 100, και 200 ​​μg /ml). απόσταση (Β) Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με μέτρηση του πλάτους της πληγής. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από έξι πειράματα. Σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου, * ρ & lt? 0,05 και ** p & lt?. 0.01

Η

(Α) Επίδραση της fucoidan σε καρκινικά κύτταρα εισβολής εξετάστηκαν με τη χρήση κυττάρων Δοκιμασία Εισβολή σετ (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Α549 σπάρθηκαν πάνω στον άνω θάλαμο του Matrigel επικαλυμμένα φίλτρο και επωάστηκαν απουσία ή παρουσία fucoidan (0, 50, 100, και 200 ​​μg /ml) για 48 ώρες. Τα εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης κατέστησαν ορατές με βαφή κρυσταλλικού ιώδους και-παρατηρήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο. (Β) Το ποσό της εισβολής κυττάρων μετρήθηκε ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού J Image. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD τριών πειραμάτων. Σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου, * ρ & lt? 0,05 και ** p & lt?. 0.01

Η

Cell Culture

Α549 κύτταρα από την ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη-αμφοτερικίνη διάλυμα 100 μg /ml Β στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα. Τα κύτταρα περάστηκαν τρεις φορές την εβδομάδα με κατεργασία με τρυψίνη-ΕϋΤΑ και εκείνων της μετά από πέντε περάσματα χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα.

(Α) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με fucoidan 200 μg /ml για τις περιόδους των 0, 1 , 3, 6, και 9 ώρες, αντίστοιχα. (Β) κύτταρα Α549 επωάστηκαν για 6 ώρες με fucoidan σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 50, 100 και 200 ​​μg /ml). Τα επίπεδα φωσφο-ΙΝΚ 1/2, φωσφο-ΕΚΚ 1/2, και φωσφο-ρ38 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ και Δ) Το επίπεδο φωσφορυλίωση των ERK1 /2 ποσοτικοποιήθηκε από την ανάλυση με το λογισμικό Image J. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου, * ρ & lt? 0.05 και ** ρ & lt?. 0.01

Η

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με fucoidan 200 μg /ml για τις περιόδους των 0, 1, 3, 6 , και 9 ώρες, αντίστοιχα. (Β) κύτταρα Α549 επωάστηκαν για 6 ώρες με fucoidan σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 50, 100 και 200 ​​μg /ml). Τα επίπεδα φωσφο-ΡΙ3Κ και φωσφο-Ακί αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του ΡΙ3Κ (Γ και Δ) και Akt (Ε και F) ποσοτικοποιήθηκαν με την ανάλυση με το λογισμικό Image J. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου, * ρ & lt? 0.05 και ** ρ & lt?. 0.01

Η

(Α) κύτταρα Α549 επωάστηκαν για 24 ώρες με fucoidan σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 50, 100 και 200 ​​μg /ml). Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του mTOR, p70S6K και 4EBP1 ποσοτικοποιήθηκαν με την ανάλυση με το λογισμικό Image J. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (B, C και D) Οι εντάσεις ζωνών (επίπεδα φωσφορυλίωσης) κάθε μορίων σηματοδότησης ποσοτικοποιήθηκαν με την ανάλυση με το λογισμικό Image J. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD τριών πειραμάτων. Σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου, * ρ & lt? 0.05 και ** ρ & lt?. 0.01

Η

(Α) Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με U0126 (10 ή 20 μΜ) (Α), LY294002 (10 ή 20 μΜ ) (Β), ή ραπαμυκίνη (1 ή 2 μΜ) (C) για 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με την απουσία ή παρουσία fucoidan (25 μg /ml) για 48 ώρες. Οι μεταβολές της ΜΜΡ-2 δραστηριότητες προσδιορίστηκαν ποσοτικά με μέτρηση των εντάσεων ζώνη χρησιμοποιώντας Image J λογισμικού. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου, * ρ & lt? 0.05 και ** ρ & lt? 0,01

Η

Α549 κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με fucoidan σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 50, 100 και 200 ​​μg /ml). . (Α) Το κυτοσολικό εκχύλισμα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με φωσφο-ΙκΒ και φωσφο- και σύνολο- ΝΡ-κΒ (ρ65). (B, C και D) Το επίπεδο της φωσφο-ΙκΒ και phosphor- και συνολικό NF-kB ποσοτικοποιήθηκαν με την ανάλυση με το λογισμικό Image J. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης σε κυτοσολικό κλάσμα και Lamin Β φόρτωση ελέγχου σε πυρηνικό κλάσμα. Οι εντάσεις ζώνη κάθε μορίων σηματοδότησης ποσοτικοποιήθηκαν με την ανάλυση με το λογισμικό Image J. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD τριών πειραμάτων. Σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου, * ρ & lt? 0.05 και ** ρ & lt? 0,01

Η

ΜΤΤ Δοκιμασία για την Κυτταρική Βιωσιμότητα

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ΜΤΤ (3- (4,5. διμεθυλο-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) δοκιμασία αναγωγής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 επωάστηκαν με πυκνότητα 4 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις fucoidan για 48 ώρες. Στη συνέχεια, ΜΤΤ χρωστικής (5 mg /ml) προστέθηκε στα κύτταρα και επωάστηκαν για επιπλέον 3 ώρες. Αφού το μέσο απομακρύνθηκε, DMSO προστέθηκε στα κύτταρα για τη διαλυτοποίηση των παραγόμενων φορμαζάνης αλάτων. Η ποσότητα του άλατος φορμαζάνης προσδιορίσθηκε με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD) στα 540 nm με χρήση GENios® μικροπλάκας φασματοφωτόμετρο (PowerWave

TMXS, BioTek Instruments, Inc., Winooski, USA). Σχετική κυτταρική βιωσιμότητα της θεραπείας υπολογίστηκε ως ποσοστό του ελέγχου υπό αγωγή με όχημα ([OD επεξεργασμένων κυττάρων – OD του τυφλού /OD του ελέγχου – OD του τυφλού] × 100).

Πληγή Δοκιμασία Μετανάστευσης

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας πλάκες 12 φρεατίων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων (1 χ 10

5 κύτταρα /ml) και αναπτύχθηκαν σε 80~90% συρροή για το πείραμα. Μετά από αναρρόφηση του μέσου, τα κύτταρα αποξέστηκαν με 200 μΙ άκρο αποστειρωμένη πιπέττα για να δημιουργήσει μια ευθεία μηδέν. Πλύθηκαν δύο φορές με PBS για την απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων και στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με πλήρες RPMI 1640. Τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με fucoidan (0, 50, 100, και 200 ​​μg /ml) και επωάστηκαν για 48 ώρες. μετανάστευση των κυττάρων εντός της περιοχής του τραύματος φωτογραφήθηκε στα στάδια 0 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα, για την ανάλυση της εικόνας της κάθε θεραπείας. Το επίπεδο της κυτταρικής μετανάστευσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή Hewlett-Packard και το λογισμικό Image ΝΙΗ (Εικόνα J), και στη συνέχεια εκφράστηκε ως ποσοστό του κάθε ελέγχου για τη μέση του τομέα το κλείσιμο του τραύματος.

κυτταρική διείσδυση Δοκιμασία

Η επεμβατική συμπεριφορά των κυττάρων Α549 εξετάστηκε χρησιμοποιώντας κιτ θάλαμο κυττάρων εισβολής (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) [17]. Α549 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ένα μέσο RPMI 1640 άνευ ορού (5 × 10

4 κύτταρα /200 μΐ) σε απουσία ή παρουσία fucoidan (0, 50, 100 και 200 ​​μg /ml). Τα κύτταρα σπάρθηκαν πάνω στον άνω θάλαμο του Matrigel επικαλυμμένων φίλτρου και FBS προστέθηκαν 500 μΐ στον κάτω θάλαμο ενός RPMI 1640 που περιέχει 10%. Μετά από 48 ώρες επωάσεως, τα μη εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια της μεμβράνης φίλτρου. Τα εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης του φίλτρου χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες για 1 ώρα και ξεπλένεται με νερό και ξηραίνεται. Η ποσότητα του εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου μεμβράνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ελαφρύ μικροσκόπιο και το λογισμικό Image ΝΙΗ (Εικόνα J).

ζυμογραφία ζελατίνης

δραστικότητα ΜΜΡ-2 προσδιορίστηκε με ζυμογραφία ζελατίνης [18]. Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 σπάρθηκαν (1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και αφέθηκαν να αναπτυχθούν μέχρι συνένωσης επί 24 ώρες και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις fucoidan (0, 50, 100, και 200 ​​μg /ml) σε RPMI 1640 χωρίς ορό για 48 ώρες. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και αναμίχθηκε με μη αναγωγικό ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος, τότε σε ηλεκτροφόρηση σε 10% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου που περιείχε 0,1% (νν /ν) ζελατίνη. Μετά την ηλεκτροφόρηση, πηκτή πλύθηκε για 30 λεπτά δύο φορές με 2,5% Triton Χ-100 και επωάστηκαν για επιπλέον 18 ώρες στους 37 ° C για την ενζυματική αντίδραση των MMPs σε ρυθμιστικό αντίδρασης ζυμογραφία (200 mM NaCl, 10 mM ΟαΟ

2 , 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4). Η πηκτή στη συνέχεια βάφτηκε με Coomassie blue R-250 (0.125% Coomassie blue R-250, 50% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ) και αποχρωματίζονται (μεθανόλη /οξικό οξύ /νερό, 40/10/50, ν /ν /ν ).

Παρασκευή κυτταρικά λύματα

Μετά θεραπείες φουκοϊδάνη, Α549 κύτταρα ξεπλένονται δύο φορές με παγωμένο PBS, και στη συνέχεια προστέθηκε με 100 μι ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,4, 1% ΝΡ-40, 0,25% δεοξυχολικό νάτριο, 150 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 1 mM NaF, 1 mM Na

3νο

4, 1 μg /ml απρωτινίνη, 1 μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη). Η αντίδραση λύσης διεξήχθη επί πάγου με λίκνισμα επί 3 λεπτά και τα κύτταρα αποξέστηκαν χρησιμοποιώντας λαστιχένιο ξέστρο σε σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης Eppendorf. Τα ξύνεται κύτταρα αφέθηκαν να λύουν για άλλα 30 λεπτά σε πάγο με περιοδική ανάδευση. Τα κυτταρικά θραύσματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση (22.000 χ

g

, στους 4 ° C για 30 λεπτά) και το προκύπτον υπερκείμενο συλλέχθηκε και προσδιορίστηκε για συγκέντρωση πρωτεΐνης του χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad, CA USA). Τα δείγματα μαγειρεύονται με ρυθμιστικό δείγματος SDS σε βραστό νερό για 5 λεπτά.

Western Blotting

Τα συστατικά πρωτεΐνη (50 μg) διαχωρίστηκαν σε 12% SDS-πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Bio-Rad, CA USA), και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με τη χρήση ειδικών πρωτογενών αντισωμάτων για μία νύχτα σε 4 ° C. Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κηλίδες στη συνέχεια κατέστησαν ορατές με τη χρήση της ενισχυμένης μεθόδου χημειοφωταύγειας (ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) σε μπλε φωτοευαίσθητο φιλμ (Fujifilm Corporation, Tokyo, Japan). Εάν είναι απαραίτητο, οι κηλιδώθηκαν μεμβράνες απογυμνώθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται χρησιμοποιώντας άλλες πρωτογενή αντισώματα. πυκνομετρική ανάλυση διεξήχθη με ένα σαρωτή Hewlett-Packard και το λογισμικό Image ΝΙΗ (Εικόνα J).

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (S.D.). Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σημασία της διαφοράς μεταξύ των δύο μέσων τιμών. *

P

& lt? 0,05 και **

P

& lt?. 0.01 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Fucoidan αναστέλλει τη δράση της ΜΜΡ -2 σε Α549 ανθρώπινα κύτταρα πνεύμονα Cancer

για να προσδιορισθεί μη-κυτταροτοξική συγκέντρωση fucoidan, κύτταρα Α549 επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις fucoidan (0-1000 μg /ml) για 24 ώρες ή 48 ώρες, και τότε η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Fucoidan δεν έδειξε καμία σημαντική τοξική επίδραση στα κύτταρα Α549 εντός του εύρους συγκέντρωσης από 0-200 μg /ml. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (400-1000 μg /ml), ωστόσο, fucoidan ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη εφάρμοσε την θεραπεία των fucoidan σε συγκέντρωση ίση ή μικρότερη από 200 μg /ml, στο οποίο δεν παρατηρήθηκε σημαντική κυτταροτοξική δράση των κυττάρων Α549.

Η αποικοδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) είναι ζωτικής σημασίας για την κυτταρική εισβολή, υποδεικνύοντας την αναπόφευκτη εμπλοκή πρωτεϊνασών μήτρας αποικοδόμησης για τη διαδικασία. Ως εκ τούτου, αξιολογήθηκε η επίδραση της fucoidan στη δραστηριότητα ΜΜΡ-2, ως βασικό μόριο της υποβάθμισης της ECM, με ζυμογραφία ζελατίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, fucoidan καταστέλλεται δραστικότητα ΜΜΡ-2 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Από την άλλη πλευρά, ο αντίκτυπος της fucoidan στην δραστικότητα ΜΜΡ-9 ήταν ασαφή, αφού υπάρχει μόνο ένα εξαιρετικά χαμηλό επίπεδο εγγενούς δραστικότητας ΜΜΡ-9 ανιχνεύσιμη σε κύτταρα Α549 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). δραστικότητα ΜΜΡ-2 μειώθηκε κατά 36%, 53% και 72% στα 50, 100, και 200 ​​μg /ml, αντίστοιχα, μετά την αγωγή με την fucoidan για 48 ώρες (Εικ. 1Β). Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με ζυμογραφία επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με ανάλυση κηλίδος Western. έκφραση ΜΜΡ-2 σταδιακά μειώθηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις fucoidan (Εικ. 1 C). Το επίπεδο της πρωτεΐνης ήταν μειωμένη κατά 38%, 48%, και 60% στα 50, 100, και 200 ​​μg /ml, αντίστοιχα. Η μείωση της δραστηριότητας ΜΜΡ-2 ήταν πιθανόν να οφείλεται στη μείωση της έκφρασης της ΜΜΡ-2 (Σχ. 1 Β και 1 D).

Fucoidan Καταστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων Α549

Η κυτταρική μετανάστευση είναι ένα μέτρο του μεταστατικού δυναμικού των καρκινικών κυττάρων. Επιδράσεις της fucoidan για τη μετανάστευση των κυττάρων ερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας μια πληγή δοκιμασία επούλωσης. Α549 κύτταρα κατεργασμένα με fucoidan έδειξαν μείωση της μετανάστευσης (Εικ. 2Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η κυτταρική μετανάστευση αναστέλλεται από έως και 25%, 46%, και 57% στις 48 ώρες με την παρουσία 50, 100, και 200 ​​μg /ml του fucoidan, αντίστοιχα. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι fucoidan μπορεί να καταστείλει τη μεταναστευτική ιδιότητα του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων.

Fucoidan Αναστέλλει την εισβολή των κυττάρων Α549

Για να διαλευκανθεί ανασταλτική επίδραση της fucoidan στην εισβολή των κυττάρων Α549, ήταν δοκιμάζονται χρησιμοποιώντας κιτ θάλαμος εισβολή (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), στην οποία τα κύτταρα εισβάλλουν σε όλη εξωκυττάριας μήτρας, όπως επικαλυμμένα με Matrigel φίλτρο στον θάλαμο. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3Α, ο αριθμός των κυττάρων με εισβολή (χρώσης με κρυσταλλικό-ιώδες) μείωσε αξιοσημείωτα σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας fucoidan μπορεί να εμποδίσει την εισβολή των κυττάρων Α549. Τα ανασταλτικά αποτελέσματα της fucoidan επί καρκινικών κυττάρων εισβολή ήταν 35%, 68% και 86% στις συγκεντρώσεις 50, 100, και 200 ​​μg /ml του fucoidan, αντίστοιχα (Σχ. 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι fucoidan μπορεί να αναστείλει άμεσα την επιθετική πιθανότητα καρκίνου του πνεύμονα.

Fucoidan Αναστέλλει την ΜΜΡ-2 Δραστηριότητα μπλοκάροντας ERK1 /2 και ΡΙ3Κ-Akt Pathways σε Α549 κύτταρα

Τα ευρήματά μας έδειξε ότι fucoidan αναστέλλει δραματικά τη μετανάστευση, εισβολή και δραστικότητα ΜΜΡ-2 σε κύτταρα Α549. Ωστόσο, οι μηχανισμοί σήματος υπεύθυνη για την ανασταλτική επίδραση της fucoidan επί μετάσταση παραμένουν να διευκρινισθούν. Αρκετές ενδείξεις υποδεικνύουν ότι MAPKs (JNK 1/2, ERK 1/2, και ρ38) παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, και δραστικότητα ΜΜΡ-2 [5]. Λαμβάνοντας υπόψη την ισχυρή αντι-μεταστατικό δυναμικό fucoidan, ελέγχθηκε κατά πόσο μπορεί να ρυθμίσει τις μεταγωγές σήματος MAPKs στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Τα αποτελέσματα του σχήματος 4 έδειξε ότι fucoidan μειωμένη φωσφορυλίωση των ERK1 /2 από τη συγκέντρωση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ δεν είχε σχεδόν καμία ή περιθωριακή, εάν υπάρχουν, επίδραση στη ρ38 και JNK1 /2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α και 4C, μια χρονο-εξαρτώμενη μελέτη έδειξε ότι fucoidan μειώνονται προοδευτικά φωσφορυλίωση των ERK1 /2 από 1 ώρα έως 9 ώρες μετά την αγωγή. Σχήμα 4Β και 4D έδειξε ότι fucoidan ανέστειλε σημαντικά φωσφο-ERK1 /2 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, με ένα μέγιστο ανασταλτικό αποτέλεσμα στην υψηλότερη συγκέντρωση (200 μg /ml). Εκτός από MAPKs, το κύτταρο σηματοδότηση της PI3K /Akt έχει επίσης προταθεί ως βασικός παράγοντας στην ρύθμιση της δραστικότητας ΜΜΡ-2 [19]. τρέχουσα μελέτη μας έδειξε ότι fucoidan ανέστειλε σημαντικά τις φωσφορυλιώσεις των ΡΙ3Κ και κατάντη στόχο της, Akt, σε μια συγκέντρωση και το χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 5). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, fucoidan ανέστειλε ισχυρά την μεταστατική δραστικότητα των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, πιθανώς από τις καταστολές της ERK1 /2 και ΡΙ3Κ-Akt οδούς.

Fucoidan Καταστέλλει mTOR Σηματοδοσίας

Έχει ανέφεραν ότι ΡΙ3Κ σχετίζεται με έναν αριθμό κυτταρικών διεργασιών που συμπεριλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, την κυτταρική κινητικότητα, εισβολή και την αγγειογένεση [20], [21]. Η σηματοδότηση του mTOR έχει αναδειχθεί ιδιαίτερα ως ένα κρίσιμο τελεστή του μονοπατιού μεταγωγής σήματος ΡΙ3Κ σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [22]. Με βάση το εύρημα μας ότι fucoidan καταστέλλει PI3K-Akt μονοπατιού σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, εξετάστηκε κατά πόσον fucoidan διαμορφώνει mTOR και μεταγενέστερα μόρια σηματοδότησης του. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α και 6Β, fucoidan ανέστειλε την φωσφορυλίωση της mTOR σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, 4Ε-BP1 και p70S6K, δύο άμεσους μεταγενέστερους στόχους του mTOR και δείκτες δραστηριότητας mTOR, ήταν επίσης σημαντικά κατασταλεί (Εικ. 6C και 6D).

Fucoidan Αναστέλλει MMP-2 Δραστηριότητα μπλοκάροντας ERK1 /2 και PI3K-Akt-mTOR Pathways στο Α549 κύτταρα

για να επιβεβαιώσετε κατά πόσον η αναστολή της δράσης της ΜΜΡ-2 από fucoidan βασίζονται κυρίως στην καταστολή της μονοπάτια ERK1 /2 και PI3K-Akt-mTOR, κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν στο παρουσία ή απουσία U0126 (αναστολέας ΕΚΚ), LY294002 (αναστολέας ΡΙ3Κ) ή ραπαμυκίνη (ένας αναστολέας mTOR) για 2 ώρες, στη συνέχεια εξετάζονται για τις επιδράσεις της θεραπείας fucoidan (Εικ. 7). Σε σύγκριση με τις αντίστοιχες χειριστήρια του οχήματος, ατομική θεραπείες με U0126 (Σχ. 7Α, λωρίδα 3 και 4), LY294002 (Σχ. 7Β, λωρίδα 3 και 4) ή ραπαμυκίνη (Σχ. 7C, λωρίδα 3 και 4) έδωσε μια σημαντική μείωση του δραστικότητα ΜΜΡ-2. Τα αποτελέσματα είναι συνεπή με εκείνα των πειραμάτων fucoidan της παρούσας μελέτης στο εν λόγω ΜΜΡ-2 αναστολή μπορεί να προκαλείται από τους διαμορφώσεις του ERK1 /2, ΡΙ3Κ-Ακί και /ή πορείες mTOR. Περιγράφοντας λεπτομερώς, ο ταυτόχρονης θεραπείας του U0126 (10 μΜ και 20 μΜ) και fucoidan μειωθούν περαιτέρω την δραστικότητα ΜΜΡ-2 με 66% και 75% σε σύγκριση με το U0126 μόνη (46% και 65%) (Σχ. 7Α). Με τον ίδιο τρόπο, οι συνδυασμένες θεραπείες της LY294002 και fucoidan κατέστειλε επιπροσθέτως την δραστικότητα ΜΜΡ-2 κατά 65% και 86% σε σύγκριση με το LY294002 μόνο (27% και 43%) (Σχ. 7Β). Ωστόσο, σε αντίθεση με άλλους, ραπαμυκίνη και fucoidan ταυτόχρονης θεραπείας δεν δίνουν μια επιπλέον μείωση της δραστικότητας ΜΜΡ-2 σε σύγκριση με ραπαμυκίνη μόνη (Σχ. 7C). Δεν είναι ακόμη σαφές κατανοητό γιατί δεν υπήρχε ούτε πρόσθετη ούτε συνεργιστικά αποτελέσματα της ραπαμυκίνης με fucoidan. Συνοπτικά, η αναστολή της ΜΜΡ2 από fucoidan θεραπεία πιθανώς εμφανίζουν τα διαμορφώσεις του ERK1 /2 ή /και ΡΙ3Κ-Akt-mTOR οδούς. Αυτά τα αποτελέσματα που προτείνει το θεραπευτικό δυναμικό του fucoidan ως αντι-μεταστατική παράγοντας σε ανθρώπους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

Fucoidan Μειώνει την Πυρηνική μετατόπιση του ΝΡ-κΒ

NF-κΒ μονοπάτι έχει αποδειχθεί να στηριχθεί κατόπιν ενεργοποιούνται διαδοχικά κινασών [23]. Κατά την ενεργοποίηση, ο ΝΡ-κΒ μετατίθεται από κυτόπλασμα σε πυρήνα και ρυθμίζει την έκφραση μίας ευρείας ποικιλίας γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων των MMPs [5]. Από το NF-κΒ μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην γονιδιακή έκφραση της ΜΜΡ-2, τα αποτελέσματα της fucoidan εκτιμήθηκε με ΙκΒα και μεταγωγής σήματος NF-κΒ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8Α και 8Β, fucoidan ανέστειλε την φωσφορυλίωση ΙκΒα σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, ενώ η συνολική ΙκΒα ήταν αντιστρόφως αυξήθηκε κατά fucoidan. Είναι συνεπές με αυτό, φωσφο-ρ65, ένας δείκτης της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ μέσω της αποικοδόμησης ΙκΒα, μειώθηκε με την κατεργασία του fucoidan (Εικ. 8Α και 8C), η οποία συνοδεύεται από την αύξηση του συνολικού p65 στο κυτταροπλασματικό κλάσμα και του μειωθεί στο πυρηνικό κλάσμα (Εικ. 8Α και 8D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι fucoidan ανέστειλε σημαντικά την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα Α549.

Συζήτηση

Είναι γνωστό ότι οι ΜΜΡ παρέχουν πρόσβαση για τα καρκινικά κύτταρα στο αγγειακό και λεμφαγγείων, οι οποίες υποστηρίζουν την ανάπτυξη του όγκου και αποτελούν μια οδό διαφυγής για την περαιτέρω διάδοση [24]. Επιπλέον, MMPs προώθηση κακοήθη μετασχηματισμό σε πρώιμα στάδια του καρκίνου και καταστέλλουν την απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου και την ενίσχυση της αγγειογένεσης, καθώς και να καταστρέψουν χημειοκίνες ισορροπία με το σύστημα άμυνας κατά του όγκου υποδοχής [25]. Κατά συνέπεια, ο αποκλεισμός των MMPs δραστηριότητας και έκφραση μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών σε ασθενείς με καρκίνο μεταστατικό. Αν και πολλοί επιστήμονες έχουν κάνει μεγάλες προσπάθειες για να αναπτύξει το δυναμικό αντικαρκινικών παραγόντων των αναστολέων MMPs, οι περισσότερες κλινικές δοκιμές δεν έχουν ολοκληρωθεί επιτυχώς ακόμη [26].

Σε αναζήτηση αποτελεσματικών μεταστατικού καταστολείς, μια ευρεία ποικιλία των φυσικών προϊόντων και τους φαρμακολογική συστατικά μπορεί να είναι μια καλή πηγή για την εξεύρεση πολλά υποσχόμενων υποψηφίων, έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με συνθετικές χημικές ουσίες για τις παρενέργειες και την ποικιλομορφία φαρμακοφόρο. Κάποιοι από αυτούς από διάφορες φυσικές πηγές έχουν ήδη χαρακτηριστεί ως πιθανά θεραπευτικά με αντι-μεταστατική δραστηριότητα [27]. Μεταξύ αυτών, fucoidan έχει αποκαλυφθεί ότι διαθέτει αντι-πολλαπλασιαστική και κυτταροτοξικά αποτελέσματα για τον καρκίνο MCF-7 κυττάρων του μαστού, αλλά όχι τα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (HMECs) [28]. Πρόσφατα, fucoidan έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει μετάσταση μέσω ΜΜΡ-2 /-9 καταστολή καθώς και υποτάξει την έκφραση και έκκριση ενός αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) [14]. Το αντι-μεταστατική δράση του fucoidan επίσης αποδειχθεί στο ζωικό μοντέλο της πειραματικής μεταμοσχευμένου καρκινώματος Lewis πνεύμονα (LLC) [13]. Ωστόσο, η ανασταλτική μηχανισμός για τη μετάσταση καρκίνου δεν έχει σαφώς διευκρινιστεί λεπτομερώς ακόμα. Για πρώτη φορά, σε αυτή τη μελέτη, είναι τουλάχιστον εν μέρει προσδιορίζεται η αντι-μεταστατική μοριακός μηχανισμός fucoidan.

Το καθεστώς της βιωσιμότητας των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων του fucoidan . Fucoidan ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων στα 400 μg /ml, αλλά όχι σε θερμοκρασία μεταξύ 0 έως 200 μg /ml, κατά την οποία ανέστειλαν αποτελεσματικά τη μετανάστευση και την εισβολή χωρίς σημαντική κυτταροτοξική δράση. Ως εκ τούτου, οι αντι-επεμβατική και αντι-μεταναστευτικές επιπτώσεις των fucoidan παρατηρείται από την παρούσα μελέτη δεν εξαρτώνται από τη δράση αντι-πολλαπλασιασμό του. Η ενίσχυση της δραστικότητας ΜΜΡ-2 έχει χαρακτηριστεί καλά σε πολύ μεταστατικός καρκίνος πνεύμονα ανθρώπου κύτταρα [29]. Ωστόσο, ΜΜΡ-9 είναι ακόμα ασαφές, αφού υπάρχει μόνο ένα εξαιρετικά χαμηλό επίπεδο ΜΜΡ-9 ανιχνεύονται σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα Α549 ανθρώπινα. Με βάση την παρούσα μελέτη μας, τα αντι-μεταστατική επιδράσεις της fucoidan φαίνεται να διαμεσολαβείται από την ανασταλτική της δράση επί ΜΜΡ-2. (Σχ. 1, 2 και 3). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επίδραση fucoidan είναι περισσότερο σαν την καταστολή της ΜΜΡ-2 έκκριση ή /και έκφραση όχι την άμεση αναστολή της δραστηριότητάς της.

ERK1 μονοπάτι /2 εμπλέκεται στην επεμβατική ή μεταναστευτική συμπεριφορά ενός αριθμού κακοηθειών, όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου, του μελανώματος, του καρκίνου του μαστού και του καρκίνου του προστάτη και αυτό είναι καθιερωμένη σε προηγούμενες μελέτες [30] – [32]. Επιπλέον, ERK1 /2 ρυθμίζει εστιακή προσκόλληση και την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού μέσω των φωσφορυλιώσεις των ειδικών κυτταροσκελετικών και εστιακή πρωτεΐνες προσκόλλησης, συμπεριλαμβανομένου παξιλλίνης, ΡΑΚ, μυοσίνης ελαφριάς αλυσίδας κινάσης [33]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, ο αντι-μεταστατική δράση του fucoidan οφείλεται στο αδρανοποίηση της ERK1 /2 μονοπατιού σε Α549 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Εκτός από την ERK1 /2, η ΡΙ3Κ-Ακί οδού σήματος έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει την εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου μη μικρού κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC), καθώς και την ανάπτυξη και την πρόοδο των διαφόρων άλλων όγκων. Δηλαδή, ΡΙ3Κ υπερέκφραση συσχετίζεται ιδιαίτερα με την ανάπτυξη, την εισβολή και τη μετάσταση των NSCLC [34]. Αρκετές άλλες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι η στόχευση των ΡΙ3Κ-Akt μονοπάτι σηματοδότησης με αντινόημα, siRNA ή μικρομοριακών αναστολέων αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα κάτω της εισβολής όγκου και ογκογένεση σε κακοήθη καρκινικά κύτταρα [6], [35].