Abstract

Ο αυξητικός παράγοντας εξαλλαγής (TGF) -β /Smad σηματοδότηση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο του παχέος εντέρου ανάπτυξη, εξέλιξη και μετάσταση. Στην παρούσα μελέτη αποδείξαμε ότι ο microRNA-130a /301α /454 οικογένεια είναι επάνω ρυθμισμένη σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου σε σύγκριση με αντιστοιχισμένο παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο, τα οποία μοιράζονται το ίδιο 3′-untranslational περιοχή (3′-UTR) δεσμευτική αλληλουχία σπόρου και είναι στηρίζεται να στοχεύσετε Smad4. Σε παχέος HCT116 καρκίνο και SW480 κύτταρα, η υπερέκφραση του miRNA-130 /301α /454 μιμείται ενισχύει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση, ενώ οι αναστολείς αυτών των miRNAs επηρεάζουν την επιβίωση των κυττάρων. Η βιολογική λειτουργία του miRNA-130α /301α /454 σχετικά με καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα είναι πιθανή μεσολάβηση από την καταστολή της Smad4, και το προς τα πάνω ρύθμιση του miRNAs συσχετίζεται με Smad4 ρύθμιση προς τα κάτω σε ανθρώπινους καρκίνους του παχέος εντέρου. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι miRNA-130 /301α /454 είναι νέα ογκογόνο miRNAs που συμβάλλουν στην ογκογένεση του παχέος εντέρου με τον TGF-β /Smad σηματοδότηση, η οποία μπορεί να έχει πιθανή εφαρμογή στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Liu L, Nie J, Chen L, Dong G, Du X, Γου Χ, et al. (2013) την ογκογόνο ρόλος των microRNA-130 /301α /454 στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της στόχευσης Smad4 έκφρασης. PLoS ONE 8 (2): e55532. doi: 10.1371 /journal.pone.0055532

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Σεπτέμβρη, 2012? Αποδεκτές: 27, Δεκεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Βασικές Ερευνητικά Προγράμματα (2012CB518103), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31100554, 31270820, 81230061, και 81121004), Νηπιαγωγείο Ίδρυμα PLA Γενικό Νοσοκομείο (12KMM48), και το Πεκίνο Nova Πρόγραμμα (Z12111000250000). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένας από τους πιο συχνούς καρκίνους και μια κοινή αιτία των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται [1]. Λόγω της κακής πρόγνωσης και μακρινή εισβολή και τη μετανάστευση, η συνολική επίπτωση του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι περίπου 5% και το ποσοστό επιβίωσης 5-ετών των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου είναι πολύ χαμηλό [2]. Έτσι, ο προσδιορισμός νέων στόχων για την ανάπτυξη των μη-συμβατικές θεραπείες είναι επείγον και θα επωφεληθούν από την πρόοδο στην ευρεία και βαθιά κατανόηση της μοριακής παθογένεσης του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια εκτενής κατηγορία των μικρών μη κωδικοποιητικού RNA (18-25 nt), με σημαντικές επιπτώσεις σε μια σειρά από βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης, της ανάπτυξης, του μεταβολισμού και της ογκογένεσης, μέσω της άμεσης σύνδεσης με untranslational περιοχής 3 ‘(3’-UTR) του στόχου mRNAs [3] – [5]. Τα microRNAs μπορεί να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση με δύο τρόπους, ανάλογα με το βαθμό της συμπληρωματικότητας με τους στόχους mRNA, για να καταστείλει μετάφραση ή επαγωγή αποικοδόμησης mRNA [6], [7]. Τα microRNAs μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια με βάση το εάν ή όχι οι miRNAs στοχεύουν ειδικά ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκου [8]. Και οι δύο ογκογόνους έχουν miRNAs και miRNAs κατασταλτικό όγκου έχουν καταδειχθεί και περιγραφεί στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου και την πρόοδο, όπως ρυθμίζεται προς τα πάνω miR-135, miR-21, miR-17-92, και miR-196a, και μειωτικά miR-34, miR-195, και miR-365 [9] – [13]. Το προφίλ έκφρασης του miRNAs είναι ιδιαίτερα ιστό και κυτταρικό τύπο ειδικών, αποδεικνύοντας έτσι την βιολογική λειτουργική σημασία ενός εκφρασμένου miRNA [14]. Ωστόσο, διασαφηνίζονται τα χαρακτηριστικά της έκφρασης και τους ρόλους των miRNAs στη βιολογία του καρκίνου, ιδιαίτερα του καρκίνου του παχέος εντέρου, παραμένει μια συνεχής διαδικασία.

Η microRNA-130ac /301ab /454/721 οικογένεια έχει το ίδιο σπόρο δεσμευτική 3′-UTR αλληλουχία. Πρόσφατα, miR-130a /301ab έχει αναφερθεί πως επαναρυθμίζεται στην διάφορους τύπους καρκίνου, όπως ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, χρόνια μυελοειδή λευχαιμία, καρκίνο του παγκρέατος, και του καρκίνου του μαστού [15] – [21]? Ωστόσο, miR-130 /301α ρυθμίζεται προς τα κάτω σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία [22], [23], που δείχνει την πολυπλοκότητα και την ποικιλομορφία των ρόλων του miR-130 /301α στην ογκογένεση. Παρ ‘όλα αυτά, το μοτίβο της έκφρασης και του ρόλου του miR-130 /301α /454 στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου παραμένει άγνωστος.

Στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε την έκφραση και τους ρόλους του miR-130 /301α /454 στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Δείξαμε ότι miR-130a /301α /454 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κλινικά-εκτομή ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου και κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, και αυτά τα miRNAs εμφανίζουν ογκογόνο ιδιότητες στο παχύ έντερο καρκινικά κύτταρα

in vitro

και

in vivo

. Οι μηχανισμοί που διέπουν τους ρόλους του miR-130 /301α /454 στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου ερευνήθηκαν επίσης. Έτσι, τα δεδομένα μας υπογραμμίζουν τη σημασία του miR-130 /301α /454 /οικογένεια στην παθογένεια του καρκίνου και να προτείνουν μια πιθανή εφαρμογή στη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα ιστού

χειρουργικά αφαιρεθεί ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου και σε συνδυασμό παρακείμενων φυσιολογικών ιστών βλεννογόνου συλλέχθηκαν από 35 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου στο Γενικό Νοσοκομείο του PLA (Πεκίνο, Κίνα), και χρησιμοποιήθηκαν για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφής-ποσοτική αντίστροφη (qRT- PCR) και ανάλυση ανοσοστύπωσης. Τα χειρουργικά-εκτομή ιστοί καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο μέχρι την ανάλυση. Όλα τα δείγματα που λαμβάνονται με την ενημερωμένη συγκατάθεση των ασθενών και τα πειράματα που εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Γενικού Νοσοκομείου PLA. Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση για να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη.

εκχύλιση RNA και qRT-PCR

Το συνολικό RNA, συμπεριλαμβανομένων των miRNA, απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Για την ανάλυση miRNA, χρησιμοποιήθηκε πολυ-Α σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR. Το απομονωμένο RNA ήταν πολυαδενυλιωμένα χρησιμοποιώντας πολυ-Α πολυμεράση (New England Biolabs) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, το πολυ-Α ουρά RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας IMPROM ανάστροφης μεταγραφάσης (Promega), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και miR-RT εκκινητή (Invitrogen). Ο εκκινητής miR-RT ήταν: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG (Τ) 18VN-3 ‘. Πραγματικού χρόνου PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κιτ SYBR Green PCR Mix (Qiagen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή [12], με τους ακόλουθους εκκινητές: miR-130a, 5’-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3 ‘? miR-301a, 5’-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3 ‘? miR-454, 5’-ACCCTATCAATATTGTCTCTGC-3 ‘? καθολικός εκκινητής, 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 ‘? U6-F, 5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 ‘, U6-R, 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης του miR-130 /301α /454 ομαλοποιήθηκε με τον εσωτερικό έλεγχο (U6) χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο όριο του κύκλου.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

το ανθρώπινο κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές HCT116, HCT15, ΗΤ29, LoVo, και SW480 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC), και διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη, σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C. Οι μιμείται miRNAs και αναστολείς miRNA συντέθηκαν από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). MiRNAs επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Ανάλυση κυτταρικής βιωσιμότητας

Ο

in vitro

βιωσιμότητα κυττάρου των HCT116 ή SW480 κύτταρα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την κυτταρική Μετρώντας Kit -8 (CCK-8, Dojindo, Japan) μέθοδο. Εν συντομία, πέρασε μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 10 μΐ αντιδραστηρίου CCK8 στον υποδεικνυόμενο χρόνο μετά την διαμόλυνση περιόδους. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

μορφομετατροπείς HCT116 υποβλήθηκαν σε παντελή στέρηση ορού για 12 ώρες σε μέσο RPMI-1640 που περιέχει 0.1% FBS. κύτταρα στερούνται ορού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θρυψίνη και επαναιωρήθηκαν σε RPMI-1640 που περιείχε 0.1% FBS, ακολούθως 1 χ 10

5 κυττάρων προστέθηκαν στον άνω θάλαμο (8 μm μέγεθος πόρου? Corning) της 24ης-φρεατίων σε μέσο ελεύθερο ορού (500 μλ). Μετά από επώαση για 24 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO

2, τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης βάφτηκαν με διάλυμα χρώσης ιώδες 0,1% για 30 λεπτά, και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο.

ογκογονικότητα δοκιμασία σε άτριχα ποντίκια

Όλα τα πειράματα με ζώα έγιναν σύμφωνα με το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση ζώων Εργαστηρίου, με την έγκριση του Επιστημονικού συμβουλίου έρευνας του Γενικού Νοσοκομείου του PLA. Η δοκιμασία ογκογονικότητα διεξήχθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [12]. Αρνητικός έλεγχος ή miR-130a /301α /454 μιμούνται επιμολυσμένα HCT116 ή SW480 κύτταρα (1 χ 10

7) αιωρήθηκαν σε 0,1 ml PBS, μετά ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές της πτέρυγας οπίσθιο τμήμα του ίδιου 4-εβδομάδα- παλιά γυναικεία BALB /c αθυμικά γυμνά ποντίκια. Οκτώ γυμνοί ποντικοί συμπεριελήφθησαν σε κάθε ομάδα και η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε καθημερινά χρησιμοποιώντας παχύμετρο. Ο όγκος του όγκου υπολογίσθηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: όγκος = μήκος Χ πλάτος

2 χ 0,5. Η έκφραση του miR-130a /301α /454 σε δείγματα όγκων στους χρόνους που υποδεικνύονται ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία qRT-PCR.

3’UTR αναφοράς λουσιφεράσης δοκιμασία

Το ανθρώπινο Smad4 3’UTR λουσιφεράση πλασμίδιο ρεπόρτερ και το πλασμίδιο που περιέχει την θέση στόχο miR-130a /301α /454 διαγράφεται ή μεταλλάσσεται Smad4 3’UTR κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [13]. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA. Λουσιφεράσης δοκιμασίες ρεπόρτερ διεξήχθησαν, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [13]. Εν συντομία, η λουσιφεράση δραστηριότητες μετρήθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση του Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν διαιρώντας

πυγολαμπίδας

δραστηριότητα λουσιφεράσης από

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης.

ανοσοαποτύπωσης

Τα λυμένα εκχυλίσματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε δωδεκυλοθειϊκού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής (SDS-PAGE), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και στη συνέχεια στυπώθηκαν, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [24]. Αντι-Smad4 αντίσωμα αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology. αντίσωμα GAPDH και τα δευτερογενή αντισώματα λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± s.d. Στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των πειραματικών ομάδων αναλύθηκαν από Φοιτητής

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ, και μια δίπλευρη τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Η συσχέτιση μεταξύ του miR-130 /301α /454 έκφρασης και το επίπεδο της πρωτεΐνης Smad4 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας την ανάλυση συντελεστή Pearson συσχέτιση με r και ρ αξίες, όπως υποδεικνύεται.

Αποτελέσματα

MiR-130 /301α /454 ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου και κυτταρικές σειρές

Για να διερευνήσουν το ρόλο των miR-130a /301α /454 στην ανάπτυξη ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου, ανιχνεύσαμε τα επίπεδα έκφρασης σε 35 ζεύγη ανθρώπινου καρκίνου κόλου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών βλεννογόνου. Σύμφωνα με την ανάλυση qRT-PCR, τα επίπεδα του miR-130a /301α /454 έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένα σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς παρακείμενα βλεννογόνου (Σχ. 1Α-C). Επιπλέον, miR-130a /301α /454 αυξήθηκε σε καρκινικές κυτταρικές σειρές κόλου (HCT116, HCT15, ΗΤ29, SW480, και LoVo? Σχ. 1D-F). Επιπλέον, υπήρξε μια θετική συσχέτιση μεταξύ κάθε δύο miRNAs μεταξύ miR-130 /301α /454 (Εικ. 1G-I), που δείχνει ένα κοινό προφίλ έκφρασης σε αυτή την οικογένεια miRNA στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-130 /301α /454 είναι up-ρυθμίζονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, τα οποία θα μπορούσαν να σχετίζονται με την ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου.

Η έκφραση του miR-130 /301α /454 εξετάστηκε από qRT -PCR σε 35 ζεύγη ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών βλεννογόνου (Α, Β, C), και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του κόλου όπως υποδεικνύεται (D, E, F). Η έκφραση του miR-130 /301α /454 ομαλοποιήθηκε σε U6 σε κάθε δείγμα. Τα δεδομένα δείχνονται χωριστά σε ανθρώπινα δείγματα (Α, Β, C), ή ως η μέση τιμή ± s.d. (N = 3) σε κυτταρικές σειρές (D, E, F). **

p & lt? 0,01

. (G, H, I) Η στατιστική ανάλυση για τη συσχέτιση μεταξύ κάθε δύο miRNAs μεταξύ miR-130 /301α /454 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Pearson ανάλυση συντελεστή συσχέτισης.

r

και

Οι σ

τιμές που εμφανίζονται όπως υποδεικνύεται.

Η

MiR-130 /301α /454 ενισχύει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τη μετανάστευση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου

Η υψηλή έκφραση του miR-130a /301α /454 στο παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές μας οδήγησαν στη διερεύνηση της βιολογικής λειτουργίας αυτών των miRNAs σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Η δοκιμασία CCK8 έδειξε ότι η αποκατάσταση του miR-130a /301α /454 ενισχύεται σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των HCT116 καρκίνου του παχέος εντέρου ή SW480 κύτταρα (Εικ. 2Α και Β), ενώ η υπερ-έκφραση είτε του αναστολέα έναντι miR-130a /301α /454 μειώνεται κύτταρο βιωσιμότητα σε αμφότερες καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (Σχ. 2C και D) Αυτά τα τρία miRNAs παρουσίασαν παρόμοια αποτελέσματα προαγωγής ανάπτυξης σε καρκίνους του παχέος εντέρου, και όχι αμοιβαία κανονισμοί μεταξύ miR-130a /301α /454 παρατηρήθηκαν (Σχ. 2Ε και F). Επιπλέον, miR-130a /301α /454 προωθείται μετανάστευση των κυττάρων σε κύτταρα HCT116, όπως αναλύθηκε με την δοκιμασία μετανάστευσης transwell κυττάρων (Σχ. 2G, αριστερό πάνελ). Σε αντίθεση, knockdown του miR-130a /301α /454 κατέστειλε την κυτταρική κινητικότητα σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου (Σχ. 2G, δεξί πάνελ). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι miR-130a /301α /454 προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και της μετανάστευσης, ενεργώντας έτσι ως ογκογόνο miRNAs στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

(Α, Β) HCT116 Καρκίνο του παχέος εντέρου και SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με RNA ελέγχου ή miR-130 /301α /454 μιμούνται όπως υποδεικνύεται. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας δοκιμασίες CCK8. *,

σ

& lt? 0,05. (C, D) Ο αναστολέας του miR-130a /301α /454 διαμολύνθηκε σε HCT116 και SW480 κύτταρα, και η κυτταρική βιωσιμότητα ανιχνεύθηκε στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας δοκιμασίες CCK8. *,

σ

& lt? 0,05. (Ε, F) Τα επίπεδα έκφρασης του κάθε δύο miRNAs μεταξύ miR-130a /301α /454 ανιχνεύθηκαν με προσδιορισμούς qRT-PCR, όταν το μιμητικό ή αναστολέας του άλλου miRNA επιμολύνθηκε σε κύτταρα HCT116. (G) κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με RNA ελέγχου, miR-130 /301α /454 μιμούνται, ή αναστολέας miR-130 /301α /454. Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν υπολογίστηκε και δείχνεται. Τα δεδομένα δείχνονται ως μέση ± s.d. (N = 3) ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *,

σ

& lt?. 0.05

Η

MiR-130 /301α /454 προωθεί tumorigenecity

in vivo

Η

Εμείς επιβεβαίωσε περαιτέρω τον όγκο -προώθηση αποτελέσματα των miR-130 /301α /454

in vivo

. Αρνητικός RNA ελέγχου, miR-130a /301α /454 μιμούνται ή αναστολέα επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα κόλου, ενέθηκαν σε γυμνά ποντίκια οκτώ, όπως περιγράφεται. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, miR-130a /301α /454-μορφομετατραπέντα HCT116 και SW480 κύτταρα είχαν σχηματισμός ταχεία όγκου σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο μορφομετατροπείς, ενώ knockdown του miR-130a /301α /454 προκάλεσε καθυστερημένη σχηματισμό όγκων (Σχ. 3Α-F). Τα επίπεδα του miR-130a /301α /454 έκφρασης επικυρώθηκαν με δοκιμασίες qRT-PCR από τα δείγματα όγκων στους χρόνους που υποδεικνύονται (Σχ. 3G και Η). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-130 /301α /454 σημαντικά ενισχυμένη καρκινογέννεση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων σε ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού.

Επίδραση του miR-130 /301α /454 για ογκογένεσης με ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Έλεγχος RNA, miR-130a /301α /454 μιμούνται ή miR-130a /301α /454 αναστολέα-επιμολυσμένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116 (A, B, C) και SW480 κύτταρα (D, E, F) ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές της η πλευρά οπίσθιο των ίδιων γυμνών ποντικών, αντίστοιχα (η = 8 ανά ομάδα). Εμφανίζεται η καμπύλη ανάπτυξης όγκου όπως υποδεικνύεται. *,

σ

& lt? 0,05. (G, H) σε ιστούς όγκων συλλέχθηκαν από δύο ποντίκια σε κάθε ομάδα στους υποδεικνυόμενους χρόνους, και τα επίπεδα έκφρασης του miR-130a /301α /454 εξετάστηκαν με δοκιμασίες qRT-PCR.

Η

miR-130 /301α /454 καταστέλλει άμεσα την έκφραση της Smad4

Με βάση την πρόβλεψη στόχων των miRNAs (https://www.targetscan.org), πάνω από εκατό γονίδια είναι υποθετικό γονιδίων στόχων για miR-130a /301α /454. Δεδομένου ότι αυτά τα miRNAs είναι σε θέση να ενισχύσει την tumorigenecity του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων

in vitro

και

in vivo

, το γονίδιο-στόχο ρυθμίζεται από miR-130 /301α /454 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας των όγκων. Μεταξύ των θεωρούμενων γονιδίων στόχων, Smad4, ένα σημαντικό ογκοκατασταλτικών εμπλέκονται σε TGF-β /ΒΜΡ σηματοδότηση, δείχθηκε να περιέχει μία συντηρημένη θέση στόχο υποθετική miR-130a /301α /454 με βάση την πρόβλεψη TargetScan (Σχ. 4Α). Για να καθοριστεί εάν ή όχι Smad4 στοχεύει άμεσα από miR-130 /301α /454 έκφρασης, κατασκευάσαμε πλασμίδια αναφοράς της λουσιφεράσης που περιέχει Smad4 3′-UTR ή φέρουν τη διαγραφή /μετάλλαξη του πιθανή θέση-στόχο miR-130 /301α /454. Με συν-επιμόλυνση με miR-130 /301α /454 μιμούνται, δείξαμε ότι η δραστηριότητα της λουσιφεράσης του άγριου τύπου Smad4-3’UTR δημοσιογράφος κατεστάλη, ενώ η θέση στόχο διαγραφεί ή μεταλλαχθεί δημοσιογράφος δεν πρόκειται να θιγούν από το miR-130 /301α /454 συν-διαμόλυνση (Εικ. 4Β). Αξίζει να σημειωθεί, ανοσοκηλίδωσης ανάλυση έδειξε ότι miR-130a /301α /454 μείωσε σημαντικά το επίπεδο έκφρασης ενδογενούς πρωτεΐνης Smad4 σε σύγκριση με αρνητικό μάρτυρα RNA σε HCT116 και SW480 κυττάρων (Εικ. 4C). Smad4 λειτουργεί ως κεντρική αισθητήριο του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης (TGF) πρωτεΐνη -β και μορφογενετική του οστού (ΒΜΡ) σηματοδότησης, διότι R-Smad σχηματίζει ένα ετερομερές σύμπλοκο με Smad4 και μετατοπίζεται εντός του πυρήνα για τη ρύθμιση του γονιδίου μεταγραφής. Ως εκ τούτου, προσπάθησαν να προσδιορίσουν κατά πόσο ή όχι αυτά τα miRNAs επηρεάζουν TGFβ και BMP δραστηριότητες σηματοδότησης. αναστολέας miR-130 /301α /454 εισήχθη σε κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με τον TGF-β δημοσιογράφος CAGA12-lux ή της ΒΜΡ δημοσιογράφος BRE-lux. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4D, miR-130a /301α /454 αναστολέα σημαντικά ενισχυμένη ΤΟΡβ και ΒΜΡ αποκρίσεις όταν η ιδιοσυστατικά ενεργή μορφή της /ΒΜΡ-υποδοχέα ΤΟΡ-β I (TβRI-ca /BMPRI-CA) συν-εκφράζεται, συνοδευόμενη από Smad4 πάνω ρύθμιση , γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-130a /301α /454 μπορεί να καταστείλει TGF-β /ΒΜΡ σηματοδότηση μέσω αναστολής της έκφρασης Smad4.

(α) Ανθρώπινη Smad4 θα μπορούσε να είναι ένας μοριακός στόχος του miR-130a /301α /454. Οι ευθυγραμμίσεις ακολουθία του miR-130 /301α /454 και θέσεις στόχους της στην 3’UTR της Smad4, κατεβάσει από TargetScan (https://www.targetscan.org) εμφανίζεται. (Β) κύτταρα HCT116 συν-επιμολύνθηκαν με ανθρώπινο Smad4 3’UTR

πυγολαμπίδας

λουσιφεράση πλασμίδιο ρεπόρτερ, miR-130a /301α /454 θέσεις στόχους διαγράφεται ή μεταλλάσσεται κατασκεύασμα ανταποκριτή, μαζί με πλασμίδια RL, RNA ελέγχου, ή miR-130 /301α /454 μιμούνται, όπως υποδεικνύεται. Μετά από 48 ώρες,

πυγολαμπίδας

δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε και κανονικοποιήθηκαν από

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης. (Γ) HCT116 και SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με RNA ελέγχου ή miR-130a /301α /454 μιμούνται. Μετά από 48 ώρες, τα ανθρώπινα Smad4 και GAPDH εσωτερικού ελέγχου ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωση (άνω πάνελ), και τα επίπεδα του miR-130a /301α /454 έκφρασης μετρήθηκαν με δοκιμασία qRT-PCR (κάτω πίνακας). Η αναλογία πυκνομετρία για ανοσοκηλιδώσεως εδείχθη. (D) κύτταρα HCT116 ήταν συν-επιμολυσμένα με τον TGFβ δημοσιογράφο CAGA12-lux ή της ΒΜΡ δημοσιογράφος BRE-lux, μαζί με το πλασμίδιο RL, RNA ελέγχου, ή αναστολέα miR-130/301/454, και TβRI-CA ή BMPRI-ca , Οπως αναφερεται. Μετά από 48 ώρες,

πυγολαμπίδας

δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε και κανονικοποιήθηκαν από

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης. Η ενδογενής έκφραση του Smad4 και GAPDH ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. TβRI-ca, η συστατικώς δραστική μορφή της υποδοχέα ΤΟΡ-β Ι? BMPRI-ca, η συστατικώς δραστική μορφή του ΒΜΡ-υποδοχέα Ι έκφρασης (Ε) Smad4 σε άδειο φορέα pCDNA ή Smad4 εκφράζει πλασμίδιο σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. (F, G) ελέγχου ή Smad4 σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με RNA ελέγχου, miR-130 /301α /454 μιμούνται (F), ή αναστολέα miR-130 /301α /454 (G), όπως υποδεικνύεται. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε 96 ώρες μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας δοκιμασίες CCK8. *,

σ

& lt?. 0.05

Η

Επίσης, καθορίζεται κατά πόσον ή όχι τα αποτελέσματα που προάγουν την ανάπτυξη του miR-130 /301α /454 είναι κυρίως μέσα από τη στόχευση της έκφρασης Smad4. πλασμίδιο Smad4 εκφράζουν σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 παρασκευάστηκαν, η οποία μεταγράφεται Smad4 mRNA χωρίς την αλληλουχία 3’UTR. Σε αυτά τα κύτταρα, η έκφραση Smad4 επιβεβαιώθηκε να είναι αυξημένη σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4Ε.)? Ωστόσο, miR-130 /301α /454 δεν είναι πλέον στοχευμένη έκφραση Smad4, όπως τα κύτταρα αυτά μεταγράφονται Smad4 mRNA χωρίς την 3’UTR. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι επιπτώσεις της ανάπτυξης αύξηση του miR-130 /301α /454 ήταν σημαντικά κατέστειλε σε Smad4-επιμολυσμένα HCT116 κύτταρα (Σχ. 4F). Επιπλέον, ο αναστολέας miR-130a /301α /454 απέτυχε να καταστείλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 4G). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι οι ρόλοι που προάγουν την ανάπτυξη του miR-130 /301α /454 ήταν κυρίως μέσω της αναστολής της έκφρασης Smad4.

Η κλινική συσχέτιση μεταξύ 130 miR-/301α /454 επίπεδα και την έκφραση Smad4

Για να κατανοήσουμε την κλινική σημασία του miR-130 /301α /454 και το στόχο της στον καρκίνο του παχέος εντέρου, προσδιορίσαμε τα επίπεδα του miR-130 /301α /454 και πρωτεΐνης έκφραση της Smad4 σε 14 ζεύγη ταιριάζουν δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου από qRT- PCR και ανοσοστύπωση, αντίστοιχα (Σχ. 5Α και Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, η ανάλυση Pearson συντελεστής συσχέτισης πρότεινε ότι η έκφραση Smad4 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το miR-130 /301α /454 έκφρασης σε ιστούς του καρκίνου του παχέος εντέρου (Εικ. 5C-Ε). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι η υπερ-έκφραση του miR-130a /301α /454 οδηγεί σε Smad4 κάτω ρύθμιση, αναστέλλοντας έτσι ΤΟΡ-β καταστολή ανάπτυξης κυττάρου σηματοδότηση διαμεσολαβούμενη, η οποία συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

(Α, Β) Έκφραση Smad4 και GAPDH σε δείγματα συμφωνημένα καρκίνο του παχέος εντέρου και μη νεοπλασματικών ιστών βλεννογόνου ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωση (Α). miR-130 /301α /454 έκφρασης εξετάστηκε από qRT-PCR (Β). Οι τέσσερις αντιπροσωπευτικές περιπτώσεις εμφανίζονται. (Γ) Το σχετικό επίπεδο της Smad4 ή miR-130 /301α /454 έκφρασης ομαλοποιήθηκε με την εσωτερική GAPDH ή έκφραση U6. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Pearson ανάλυση συντελεστή συσχέτισης. Οι κανονικοποιημένες miR-130 /301α /454 και πρωτεΐνη Smad4 επίπεδα έκφρασης εμφανίζονται ως τυποποιημένες τιμές.

r

και

Οι σ

τιμές που εμφανίζονται όπως υποδεικνύεται.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι το miR-130 /301α /454 είναι επάνω ρυθμισμένο σε καρκίνο του παχέος εντέρου, και αποδεικνύεται περαιτέρω τον πολλαπλασιασμό αποτέλεσμα προαγωγής του miR-130a /301α /454 σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. MicroRNA-130a /301α /454 ενδείκνυται ως ογκογόνο miRNA στην ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου και την εξέλιξη, η οποία είναι συνεπής με ρόλους σε άλλους καρκίνους, όπως ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, χρόνια μυελογενή λευχαιμία, καρκίνο του παγκρέατος, και του καρκίνου του μαστού [15 ] – [21]. Ωστόσο, miR-130a ρυθμίζεται προς τα κάτω σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία, και μπορεί να ρυθμίζουν την κυτταρική επιβίωση με αναστολή του προγράμματος autophagy [22]. Επιπλέον, το επίπεδο του miR-301α πλάσμα είναι κάτω-ρυθμίζονται σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία, σε σύγκριση με φυσιολογικούς ελέγχους, η οποία σχετίζεται με ΡΑΙ-1 καταστολή [23]. Τα γνωστά πρότυπα της έκφρασης, πιθανών στόχων, και βιολογικές λειτουργίες αυτής της οικογένειας miR-130a /301α /454 συνοψίζονται στον Πίνακα 1 [15] – [23], [25] – [29]. Τα διαφορετικά χαρακτηριστικά έκφρασης του miR-130 /301α μπορεί να αντανακλά τις διαφορετικές τους ρόλους της οικογένειας miR-130/301 διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Ως εκ τούτου, η απορρύθμιση του miR-130 /301α /454 υπάρχει σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου, και οι ρόλοι της οικογένειας αυτής miRNA στην καρκινογένεση και την εξέλιξη δεν μπορεί απλώς να συναφθεί ως καταστολέας των όγκων ή ογκογονίδιο. Εξερευνώντας τα προφίλ έκφρασης και τους ρόλους του miR-130 /301α /454 στον καρκίνο του παχέος εντέρου θα επεκτείνει σημαντικά την κατανόησή μας για αυτή τη σημαντική οικογένεια των miRNAs στην καρκινογένεση.

Η

Το μονοπάτι σηματοδότησης TGF-β διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο σε πολλές βιολογικές διεργασίες. Smad4, ο κεντρικός μετατροπέας της ΤΟΡ-β και ΒΜΡ οδού σηματοδότησης, δρα ως ένα σημαντικό ογκοκατασταλτικό. Smad4 μεταλλάξεις ή διαγραφές έχουν ευρέως παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, όπως του παχέος εντέρου, του παγκρέατος, του μαστού και του καρκίνου [30] – [32]? Ωστόσο, η λεπτομερής μηχανισμός του Smad4 αδρανοποίησης είναι περιορισμένη. Έχουμε αποδείξει ότι το miR-130 /301α /454 καταστέλλει την έκφραση Smad4 μέσω απευθείας σύνδεσης σε 3’ΙΙΤΡ, ενώ μπορούμε επίσης να σημειωθεί ότι υπάρχουν και άλλες θέσεις συμφωνίας miRNA στην Smad4 3′-UTR (π.χ., τοποθεσίες για miR-34a, ΜΙΚ 146α, και miR-199α, οι οποίες έχουν χαρακτηριστεί ως αρνητικοί ρυθμιστές της Smad4 σε καρκίνο του στομάχου και γλοιοβλάστωμα) [33] – [35]. Ως εκ τούτου, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι αυτές οι miRNAs συμμετέχουν επίσης στην προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Smad4 στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Επίσης, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι άλλοι πιθανοί στόχοι του miR-130 /301α /454 μπορούν να ρυθμίζουν τις πρόσθετες πορείες του καρκίνου και να προωθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου, όπως ένα ενιαίο miRNA είναι γνωστό ότι στοχεύουν πολλαπλά mRNA. Οι υποθέσεις αυτές υποδεικνύουν την ανάγκη για περαιτέρω μελέτες για να αποκαλύψει ολόκληρο το «targetome» της οικογένειας miR-130/301/454 στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου και την πρόοδο.

Τα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs) μπορεί να παραχθεί από την αναγκαστική έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των Oct4, Sox2, Klf4, και c-Myc [36]. Ειδικές miRNAs δειχθεί ότι εμπλέκεται στην παραγωγή iPSC, όπως miR-290 και miR-302 [37] – [39]. Πρόσφατα, Pfaff et al. [25] έδειξε ότι η οικογένεια miRNA (miR-130/301/721) λειτουργεί ως σημαντικός ρυθμιστής της επαγωγής iPSC στοχεύοντας τον παράγοντα μεταγραφής ομοιοκυτίου, Meox2. Η παραγωγή iPSCs περιλαμβάνει μια διαδικασία των μεσεγχυματικών-to-επιθηλιακά μετάβαση (ΚΟΑ), ως εκ τούτου οι παράγοντες που επάγουν ΚΟΑ ή αποκλεισμό της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) αναστέλλοντας ΤΟΡ-β σηματοδότηση διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στην κυτταρική επαναπρογραμματισμό [40] . Έχουμε ανακαλύψει μία νέα στόχο miR-130/301/454, της οικογένειας (Smad4), που έχει πλήκτρο λειτουργίας σηματοδότησης ΤΟΡ-β, παρέχοντας τη δυνατότητα ότι η οικογένεια miR-130/301/454, μπορεί να ελέγχει τον επαναπρογραμματισμό με καταστολή ΤΘΡ-β /δραστηριότητα Smad4. Έτσι, οι μελέτες μας έχουν ρίξει νέο φως στο μοριακό μηχανισμό και στιχομυθία της ρύθμισης των βλαστικών κυττάρων και την καρκινογένεση.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι η οικογένεια miR-130 /301α /454 είναι ένας κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας σε διαφορετικά είδη της ανάπτυξης και της εξέλιξης του καρκίνου. Έτσι, το miR-130 /301α /454 οικογένεια μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη μοριακός στόχος για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου.