Αφηρημένο

Tetrandrine, ένα αλκαλοειδές δις-βενζυλισοκινολίνης απομονωθεί από αποξηραμένη ρίζα του Hang-Fang-Chi (

Στεφανία

tetrandra

S. Moore), έχει ανέφεραν ότι διαθέτουν αντικαρκινικές επιδράσεις σε πολλούς όγκους. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε tetrandrine απόπτωση στην ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου BGC-823 κύτταρα

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι tetrandrine ανέστειλε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο και απόπτωση. Αύξησε την απόπτωση? προς τα πάνω ρύθμιση του Βαχ, Bak, και Bad? και προς τα κάτω ρύθμιση του Bcl-2 και Bcl-XL στην BGC-823 κύτταρα. Επιπλέον, tetrandrine αύξησε την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και -9, απελευθέρωση του κυτοχρώματος

c

, και προς τα πάνω ρύθμιση Apaf-1, προτείνοντας ότι tetrandrine επαγόμενη απόπτωση που σχετίζονται με το μιτοχονδριακό μονοπάτι. Εν τω μεταξύ, η προθεραπεία με την παν-κασπάσης αναστολέα z-VAD-fmk σε BGC-823 κύτταρα μειώνεται tetrandrine επαγόμενη απόπτωση με δέσμευση ενεργοποίηση κασπασών. Επιπλέον, tetrandrine ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου μέσω επαγωγής απόπτωσης, η οποία επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημική ανάλυση σε ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Στο σύνολό τους, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι tetrandrine ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων BGC-823 μέσω μιτοχονδρίων-εξαρτώμενη απόπτωση, που μπορεί να διαδραματίσει έναν πολλά υποσχόμενο ρόλο στο γαστρικό θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Τσιν R, Shen Η, Cao Υ, Fang Υ, Li H, Chen Q, et al. (2013) Tetrandrine Προκαλεί μιτοχόνδρια-απόπτωση στα ανθρώπινα γαστρικός καρκίνος BGC-823 κύτταρα. PLoS ONE 8 (10): e76486. doi: 10.1371 /journal.pone.0076486

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16, Δεκ, 2012? Αποδεκτές: 27 Αύγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 1, Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Qin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις ακόλουθες επιδοτήσεις: οι επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81070423 και 81101677), τις επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (BK 2010332). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στην Κίνα, γαστρικό καρκίνο, μία από τις πιο κοινές κακοήθεις όγκους, η οποία προκύπτει από τη συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών εκδηλώσεις, εξακολουθεί να έχει υψηλή συχνότητα εμφάνισης και θνησιμότητας [1-3]. Υπάρχουν διάφοροι παράγοντες που προκαλούν την εμφάνιση του καρκίνου του στομάχου, όπως

Helicobacter pylori

μόλυνση, τη διατροφή, τη χρήση καπνού, και ούτω καθεξής [4]. Ανάλογα με τις περιστάσεις, οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του στομάχου χρειάζεται χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, και /ή χημειοραδιοθεραπεία [5]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι γαστρικό καρκίνο είναι ένα σύμπλοκο γενετική ασθένεια που σχετίζεται με ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων [6].

Tetrandrine (C

38Η

42N

2O

6, ΜΒ 622.730 ) είναι ένα αλκαλοειδές δις-βενζυλισοκινολίνης απομονωθεί από αποξηραμένη ρίζα του Hang-Fang-Chi (

Στεφανία

tetrandra

S. Moore). Πρόσφατα, οι ποικίλες βιολογικές δραστηριότητες του tetrandrine έχουν μελετηθεί εντατικά λόγω της ευρείας χρήσης της σε αρθρίτιδα, αρρυθμία, φλεγμονή, πυριτίαση, διάφορους τύπους όγκων, και αντίστροφη αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα [7,8]. Έχει αναφερθεί ότι tetrandrine έχει σημαντικές επιπτώσεις στο όγκους, συμπεριλαμβανομένων επιβράδυνση της ανάπτυξης του όγκου και αύξηση του χρόνου επιβίωσης των ζώων και το ποσοστό επιβίωσης [9-12]. Tetrandrine προκαλεί αποκλεισμό του κυτταρικού κύκλου G1 και επάγει την απόπτωση σε διάφορους τύπους κυττάρων. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους tetrandrine εκκινεί την απόπτωση και αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα παραμένουν ασαφείς [13]. Έχει αναφερθεί ότι η codelivery του paclitaxel (Ptx) και tetrandrine με νανοσωματίδια μπορεί να ενισχύσει αποτελεσματικά την κυτταροτοξικότητα του Ptx με διαδοχική αναστολή της ROS-εξαρτώμενη Akt μονοπάτι και ενεργοποίηση των αποπτωτικών οδών βασίζονται σε θεραπεία οξείδωση κατά γαστρικού καρκίνου [14]. Ωστόσο, ως θεραπευτικό παράγοντα, Ptx έχει αναπόφευκτα σοβαρές παρενέργειες λόγω της μη ειδικής τοξικές επιδράσεις του και ειδικά διαλύτες, και τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να γίνει πιο ανθεκτικό σε Ptx επαγόμενη απόπτωση [15-17]. Μια προηγούμενη μελέτη έχει δείξει ότι έχει tetrandrine μια συνεργιστική δράση με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες στην απόπτωση των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου [18]. Επιπλέον, ένα παράγωγο (Η1) του tetrandrine ασκεί καλή δραστικότητα αντι-πολυφαρμακευτικής αντίστασης από την κίνηση της ενδογενούς οδού απόπτωσης και αναστολή της ενεργοποίησης Erk1 /2 και Akt1 /2 [19]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι tetrandrine θα μπορούσε να αντικαταστήσει Ptx ως την πρώτη χημειοθεραπεία γραμμή για καρκίνο του στομάχου.

Από tetrandrine έχει μεγάλες δυνατότητες σε αντικαρκινική θεραπεία, είναι σημαντικό να μελετήσουμε συστηματικά να κατανοήσουμε το μηχανισμό. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τους πιθανούς μηχανισμούς tetrandrine για τα ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα

in vitro

και

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά και αντιδραστήρια

Tetrandrine λήφθηκε από Jiangxi Yintao Φαρμακευτική Εταιρεία Ανάπτυξης (Jiangxi, Κίνα). Αντισώματα ελήφθησαν από τις ακόλουθες πηγές: αντισώματα έναντι Bcl-2, Βαχ, Bcl-XL, κασπάση-3, -8, -9, κυτόχρωμα

γ

, Apaf-1, και β-ακτίνη ήταν από τη Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)? αντι-Bad και Bak ήταν από Bioworld Τεχνολογίας (St. Louis Park, ΜΝ, USA). Το κιτ αντιδραστηρίου ΤπζοΙ αγοράστηκε από την Invitrogen (Grand Island, ΝΥ, USA). ΜΤΤ (3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA).

Κυτταρική καλλιέργεια

Η ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή BGC-823 αγοράστηκε από τη Σαγκάη Cell Biology, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, ΝΥ, USA), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT, USA), 1% πενικιλλίνη και 1% στρεπτομυκίνη σε ένα υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 στους 37 ° C.

κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 36 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς tetrandrine σε διάφορες συγκεντρώσεις για 24, 48, και 72 ώρες? και ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Στη συνέχεια, 20 μΙ διαλύματος βαφής ΜΤΤ (0,5 mg /ml, διαλυμένο σε PBS και διηθείται μέσω μεμβράνης 0,2-mm) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται στους 37 ° C για 4 ώρες. Στη συνέχεια, 150 μλ διμεθυλοσουλφοξειδίου προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για επιπλέον 10 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας 96 φρεατίων. Το

50 τιμή IC ορίστηκε ως η συγκέντρωση του φαρμάκου που αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 50% σε σύγκριση με τον έλεγχο.

κηλίδωση Western

Γαστρικό καρκινικά κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και στη συνέχεια 100 μΙ RIPA ρυθμιστικού λύσης (Beyotime, Κίνα) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για να λύουν κύτταρα για περίπου 20 λεπτά. Στη συνέχεια, το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 12.000

g

για 15 λεπτά, και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ολική πρωτεΐνη διαχωρίστηκε με SDS-PAGE σε 8%, 10%, και πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 12% και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά πάνω σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA). Μετά τον αποκλεισμό επί 2 ώρες ή όλη τη νύχτα με 5% άπαχο ξηρό γάλα (διαλυμένο σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα-Tween 20 ρυθμιστικό? TBST), οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (1: 500-1: 1000 αραίωση) επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου ή όλη τη νύκτα στους 4 ° C και κατόπιν πλύθηκαν τρεις φορές με TBST (5 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 136 mM NaCl, 0,1% Tween 20) πριν από την αντίδραση με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) δευτερογενή αντισώματα (1: 5000 -1: 10,000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση τρεις φορές για 10 λεπτά το καθένα με TBST, οι μεμβράνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντιδραστήριο ανίχνευσης ECL Western Blotting.

ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Το συνολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ αντιδραστήριο ( Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και διαλύθηκε σε νερό επεξεργασμένο με DEPC. Η συγκέντρωση του ολικού RNA μετρήθηκε με φασματοσκοπία υπεριώδους απορρόφησης. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas ΜΒΙ, Waltham, ΜΑ, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το νέο-συνθεμένο cDNA ενισχύθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Fermentas). Οι αλληλουχίες του κάθε εκκινητή χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή φαίνονται στον Πίνακα 1. Η αλύσου πολυμεράσης Οι συνθήκες αντίδρασης παρατίθενται ως εξής: 95 ° C για 3 λεπτά, 95 ° C για 5 λεπτά, 58 ° C για 30 λεπτά, και 72 ° C για 30 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους στους 94 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Όλες οι δοκιμές διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Gene

Sense εκκινητής (5 ‘προς 3’)

ανάστροφο έναυσμα (5 ‘προς 3’)

bcl-2GGATCCAGGATAACGGAGGCCCAGATAGGCACCCAGGGTbaxACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTACAAACATGGTCACGGTCTGCbclxlGGCAGGCGACGAGTTTGACCCATCCCGGAAGAGTTCATβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCATable 1. Ακολουθίες των εκκινητών για τα γονίδια που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη.

CSV Λήψη CSV

δέσμευσης αννεξίνης ιωδιούχο προπίδιο V-δοκιμασία

Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις tetrandrine για 24 ώρες, και PBS χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ ψυχρού ρυθμιστικού σύνδεσης. εναιωρήματα κυττάρων χρωματίστηκαν κατά Annexin-V και ιωδιούχο προπίδιο (BD Pharmingen

TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και στη συνέχεια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με ένα FACS (Coulter, Becton Dickinson).

Caspase-3 δραστικότητα δοκιμασίας

Εν συντομία, κύτταρα επωάστηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων σε μία συγκέντρωση 4 Χ 10

5 /καλά και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση των φαρμάκων. ένας ίσος όγκος PBS χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Caspase-3 ενεργότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κασπάσης-3 kit δραστικότητα δοκιμασίας (Beyotime, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε κατόπιν σε 405 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Ηθική δήλωση

Οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα και τη φροντίδα τους διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του ΝΙΗ (ΝΙΗ Pub. No.85-23, αναθεωρήθηκε το 1996) και εγκρίθηκαν από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση του Νοσοκομείου Ενταγμένο Λαϊκού Πανεπιστημίου Jiangsu.

τα πειράματα σε ζώα

Γυναικείο γυμνό ποντίκια (BALB /c nu /nu), ηλικίας 4-6 εβδομάδων, ελήφθησαν από το Πειραματικό Κέντρο ζώων της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) και διατηρείται υπό ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων σε ένα βιολογικό υπουργικό συμβούλιο στην Εγκατάσταση Εργαστήριο ζώων του Πανεπιστημίου Jiangsu. Τα ζώα διατηρήθηκαν σε ένα κύκλο φωτός-σκότους 12-h. Η θερμοκρασία δωματίου διατηρείται σε περίπου 20 ° C και υγρασία κρατήθηκε σε περίπου 50% σε ένα δωμάτιο με μια φιλτραρισμένη παροχή αέρα.

θεραπεία Tetrandrine του υποδόριου BGC-823 όγκων σε ποντίκια

Για να διαπιστωθεί ένα BALB /c ξενομοσχεύματος ποντικού μοντέλο του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου, BGC-823 κύτταρα σε συγκέντρωση 5.0 χ 106/150 μΙ εγχύθηκαν στο δεξί πλευρό κάθε BALB /c γυμνό ποντίκι. Περίπου 10 ημέρες αργότερα (μέγεθος του όγκου έφθασε 120-150 mm3), γυμνοί ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (Ν = 5) και με δεδομένες τις ακόλουθες επεξεργασίες: ελέγχου (αγωγή με φυσιολογικό ορό), την ομάδα χαμηλής δόσης (που έλαβαν θεραπεία με 40 mg /kg tetrandrine), και ομάδα υψηλής δόσης (που έλαβαν θεραπεία με 120 mg /kg tetrandrine). Ποντικοί BALB /c ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με tetrandrine (200 μΙ, 40 mg /kg ή 120 mg /kg) ή έναν ίσο όγκο φυσιολογικού ορού, μία φορά την ημέρα για 3 εβδομάδες, αντίστοιχα. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 3 ημέρες σε δύο κάθετες διαστάσεις με παχύμετρο, και ο όγκος του όγκου (TV) υπολογίστηκε από τον τύπο: TV = μήκος (mm) χ πλάτος

2 (mm

2) × 0,5 . Σχετική όγκος του όγκου (RTV) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: RTV = TV

T /TV

0, όπου τηλεόραση

0 είναι ο όγκος του όγκου την ημέρα 0 και τηλεόραση

t είναι ο όγκος όγκο σε μια δεδομένη ημέρα t. Εν τω μεταξύ, τα ζώα ζυγίστηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Στο τέλος του πειράματος, οι όγκοι αποκόπηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη για περαιτέρω ανάλυση.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Τα εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα αποκόπηκαν από BGC-823 γυμνούς ποντικούς βάφτηκαν χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα : Bcl-2 και Bax (Boster), Bcl-XL, ενεργοποιημένη κασπάση-3, και ενεργοποιημένη κασπάση-9 (Santa Cruz) για ανοσοϊστοχημεία. Εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss).

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσοι ± τυπική απόκλιση (SD). Οι στατιστικές διαφορές καθορίστηκαν με μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας SPSS 16.0 λογισμικού. Μια τιμή Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική.

Αποτελέσματα

κυτταροτοξική δράση του tetrandrine επί BGC-823 κύτταρα

Η χημική δομή της tetrandrine δείχνεται στο Σχήμα 1Α. Το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του tetrandrine διερευνήθηκε σε BGC-823 κύτταρα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24, 48, και 72 ώρες με διάφορες συγκεντρώσεις tetrandrine. Tetrandrine βρέθηκε να αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη του BGC-823 κύτταρα σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. BGC-823 κύτταρα αναστέλλεται σημαντικά από tetrandrine στα 10 μg /ml (

P

& lt? 0,05). Το

50 τιμή IC ήταν 6.104 ± 0.786, 4.471 ± 0.650 και 3.744 ± 0,573 μετά από 24, 48, και 72 ώρες της θεραπείας tetrandrine, αντίστοιχα. Έτσι, 6, 8, και 10 μg /ml καθορίστηκαν με τις αντιπροσωπευτικές συγκεντρώσεις στις ακόλουθες μελέτες.

(Α) Η χημική δομή του tetrandrine. πολλαπλασιασμό (Β) των κυττάρων προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ, και BGC-823 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις tetrandrine στις 24, 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα. Το ποσοστό αναστολής της ομάδας ελέγχου ορίστηκε σε 0. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001 έναντι της ομάδας ελέγχου, αντιστοίχως.

Η

επαγωγή απόπτωσης με tetrandrine

Tetrandrine μεσολάβηση ικανότητες αντικαρκινικά έχουν αναφερθεί ότι συνδέονται με την απόπτωση [9-12]. Συνεπώς, ερευνήσαμε την ικανότητα των tetrandrine απόπτωση που επάγεται από BGC-823 κύτταρα χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας. Όπως μετράται με κυτταρομετρία ροής, τα αποτελέσματα των tetrandrine στην απόπτωση των κυττάρων BGC-823 που φαίνεται στο Σχήμα 2Α και Β, με τις θεραπείες tetrandrine 24 h σε 0, 6, 8, και 10 μg /ml με αποτέλεσμα 4,35%, 11,4% , 17,72% και 32,34% των αποπτωτικών κυττάρων, αντίστοιχα, και tetrandrine (8 μg /ml) για 0, 12, 24, και 48 ώρες με αποτέλεσμα 3,4%, 6,64%, 19,15% και 25,85% των αποπτωτικών κυττάρων, αντιστοίχως (Σχήμα 2C και D). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν σαφώς ότι επάγεται tetrandrine απόπτωση σε BGC-823 κύτταρα σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Οι αριθμοί των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε μαζί με τη συγκέντρωση και το χρόνο tetrandrine θεραπεία.

Μια δοκιμασία σύνδεσης ΡΙ-αννεξίνης V-FITC χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της απόπτωσης του BGC-823 κύτταρα. (Α) κύτταρα κατεργασμένα με tetrandrine για 24 ώρες σε 0, 6, 8, και 10 μg /ml. (Γ) Κύτταρα κατεργασία με 8 μg /ml tetrandrine για 0, 12, 24, και 48 ώρες. (Β, D) στήλες αντιπροσωπεύουν τον μέσο ± SD αποπτωτικών κυττάρων που λαμβάνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001 έναντι της ομάδας ελέγχου.

Η

Tetrandrine μεσολάβηση έκφραση των μελών της οικογένειας Bcl-2

Για να διερευνηθεί η πιο ειδικό μηχανισμό για την επαγωγή της απόπτωσης σε BGC-823 κύτταρα με tetrandrine, ανιχνεύσαμε την έκφραση της απόπτωσης που συνδέονται με τις πρωτεΐνες με κηλίδωση Western και το επίπεδο mRNA τους με πραγματικού χρόνου (RT) -PCR. Εδώ, μελετήσαμε την έκφραση του Bax, Bad, Bak, Bcl-2, και Bcl-XL στην BGC-823 κύτταρα κατεργασμένα με tetrandrine. Μετά από 24 ώρες έκθεσης σε tetrandrine, Bax, Bad, και η έκφραση της πρωτεΐνης Bak ήταν δοσοεξαρτώμενο αυξήθηκε, ενώ Bcl-2 και Bcl-XL έκφραση πρωτεΐνης ήταν δοσοεξαρτώμενο μειώθηκαν (Σχήμα 3Α). Βρήκαμε επίσης ότι θα μπορούσε να tetrandrine αυξορρυθμίζουν την έκφραση Bax και ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση της Bcl-2 σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 3Β). Για να καθοριστεί εάν tetrandrine θα επηρέαζε το γονίδιο μεταγραφή του bcl-2, Bcl-xL, και bax, η έκφραση του mRNA τους εξετάστηκε με RT-PCR (Σχήμα 3C). Τα αποτελέσματα RT-PCR σαφώς συνέπεσαν με εκείνα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3Α.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση σε BGC-823 κύτταρα κατεργασμένα με 6, 8, και 10 μg /ml tetrandrine για 24 ώρες. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των bcl-2 και bax κατεργασία με 8 μg /ml tetrandrine για 12, 24, 48, και 72 ώρες. (Γ) Αποτελέσματα της tetrandrine στα επίπεδα έκφρασης του bcl-2, Bcl-xL, και Βαχ προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου (1), ελέγχου (2) 6 μg /ml (3) 8 μg /ml (4) 10 μg /ml. έκφραση β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα αναφέρονται ως το μέσο ± SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001 έναντι της ομάδας ελέγχου.

Η

Tetrandrine-επαγόμενη απόπτωση μέσω μιτοχονδριακό μονοπάτι στην BGC-823 κύτταρα

Για να διερευνήσουν κατά πόσον tetrandrine επαγόμενη απόπτωση συνδέεται με την ενεργοποίηση των μελών της κασπάσης, μετρήσαμε την έκφραση των κασπασών σε BGC-823 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις tetrandrine με κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν μία εξαρτώμενη από τη δόση ανύψωση του διασπασμένη κασπάση-3 και διασπασμένη κασπάση 9 σε tetrandrine- επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 4Α). Ωστόσο, μη ανιχνεύσιμα επίπεδα της διασπασμένης κασπάσης-3 και κασπάσης-διασπάστηκε 9 βρέθηκαν σε κύτταρα σε απουσία θεραπείας tetrandrine (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να προσδιοριστεί περαιτέρω ο ρόλος της ενεργοποίησης κασπάσης σε tetrandrine επαγόμενη απόπτωση, BGC-823 κύτταρα προκατεργάστηκαν με την παν-κασπάσης αναστολέα z-VAD-fmk (10 μΜ) για 4 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 8 μg /ml tetrandrine για 24 h. Σε σύγκριση με τον μάρτυρα, οι σχετικές δραστηριότητες της κασπάσης-3 αυξήθηκαν σε BGC-823 κύτταρα κατεργασμένα με tetrandrine μόνο (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, η απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

αυξήθηκε με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με tetrandrine. Ένα αντιπροσωπευτικό κυτταρομετρία ροής αποτέλεσμα έδειξε ότι τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με z-VAD-fmk μειώνεται έντονα tetrandrine επαγόμενη απόπτωση και ότι μόνο ένας μικρός αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων ανιχνεύθηκε (Σχήμα 4C). Στη συνέχεια, εξετάσαμε το επίπεδο έκφρασης της κυτταροπλασματικής κυτοχρώματος

γ

, η οποία απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, ενήργησε για αποπτωτικό πρωτεάση ενεργοποίησης παράγοντα-1 (Apaf-1) με την αύξηση της συνδέσεως του Apaf- 1 έως ΑΤΡ /dATP, και επαγόμενη από κασπάση-9-εξαρτώμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-3 [20-22]. Διαπιστώθηκε ότι tetrandrine αύξησε σημαντικά την έκφραση του κυτοχρώματος κυτταροπλασματικής

γ

και Apaf-1 σε BGC-823 κύτταρα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4D). Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ένας μιτοχόνδρια μεσολάβηση κασπάσης οδού καταρράκτη είχε εμπλακεί σε tetrandrine επαγόμενη απόπτωση.

(Α) ανάλυση Western blot της έκφρασης του procaspase-3, διασπασμένη κασπάση 3, και διασπασμένα caspase- 9 στην BGC-823 κύτταρα κατεργασμένα με tetrandrine σε 6, 8, και 10 μg /ml για 24 ώρες. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς παν-κασπάσης αναστολέα z-VAD-fmk (10 μΜ) για 4 ώρες ακολουθούμενη από επεξεργασία με tetrandrine στα 8 μg /ml για 24 ώρες, και μετρήθηκε η σχετική δραστικότητα της κασπάσης-3 χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης-3. (C) BGC-823 κύτταρα προκατεργάστηκαν με ή χωρίς z-VAD-fmk (10 μΜ) για 4 ώρες ακολουθούμενη από επεξεργασία με tetrandrine στα 8 μg /ml για 24 ώρες. Μία δοκιμασία σύνδεσης ΡΙ-αννεξίνης V-FITC χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της απόπτωσης του BGC-823 κύτταρα. (D) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης του κυτοχρώματος κυτταροπλασματικής

γ

και Apaf-1 σε BGC-823 κύτταρα κατεργασμένα με tetrandrine σε 6, 8, και 10 μg /ml για 24 ώρες. έκφραση β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα αναφέρονται ως το μέσο ± SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001 έναντι της ομάδας ελέγχου.

Η

αντικαρκινική επίδραση του tetrandrine στην BGC-823 ξενομοσχεύματα γυμνού ποντικιού

Από tetrandrine βρέθηκε να αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη της BGC-823 κύτταρα

in vitro

, αξιολογήσαμε περαιτέρω το αποτέλεσμα κατά του όγκου του tetrandrine

in vivo

με καθιερωμένα μοντέλα ξενομοσχεύματος. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, tetrandrine θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου μετά από μια θεραπεία 24 ημερών. Στο τέλος 24 ημερών, οι μέσες όγκοι του όγκου ήταν 493,06 mm

3 και 1243,00 mm

3 στην ομάδα υψηλής δόσης και την ομάδα χαμηλής δόσης, αντίστοιχα, που αντιστοιχούν σε 80,52% και 50,9% ποσοστό αναστολής σε σύγκριση με τον έλεγχο ομάδα. Επιπλέον, το βάρος του όγκου μειώθηκε ως αποτέλεσμα της θεραπείας με tetrandrine και στις δύο συγκεντρώσεις (Σχήμα 5Β & amp? Πίνακας 2). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι μια υψηλή δόση tetrandrine είχε ισχυρότερη αντικαρκινική επίδραση από μια χαμηλή δόση στο μοντέλο ξενομοσχεύματος BGC-823.

BGC-823 κύτταρα υποδορίως εμβολιάσθηκαν εντός BALB /c γυμνά ποντίκια για τη δημιουργία του μοντέλο ξενομοσχεύματος. (Α) Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, και ο όγκος του όγκου μετρήθηκε κάθε 3 ημέρες. Την ημέρα έναρξης της θεραπείας απεξάρτησης ορίστηκε ως ημέρα 0. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD του σχετικού όγκου του όγκου για κάθε ομάδα. βάρος (Β) του όγκου μετρήθηκε στο τέλος του πειράματος. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD του βάρους του όγκου για κάθε ομάδα. ***

P

& lt? 0.001 έναντι της ομάδας ελέγχου.

Η Ομάδα (n = 5)

όγκος του όγκου (mm

3)

ποσοστό αναστολής (%)

βάρος του όγκου (ζ)

Ανασταλτικό ποσοστό (%)

control2531.78 ± 153.251.194 ± 0.10Tet (40 mg /kg) 1243,00 ± 55.19

*** 50.900.641 ± 0,06

*** 46.31Tet (120 mg /kg ) 493,06 ± 145,63

*** 80.520.298 ± 0,09

*** 75.04Table 2. Αναστολή της tetrandrine (Tet) στην αύξηση του όγκου των άτριχων ποντικών.

***

P

& lt? 0.001

έναντι

την ομάδα ελέγχου. CSV Λήψη CSV

Tetrandrine απόπτωση σε BGC-823 ξενομοσχεύματα

ανάλυση Η ανοσοϊστοχημεία των καρκινικών ιστών αποκόπηκαν από BGC-823 ξενομοσχεύτηκε άτριχων ποντικών επιβεβαίωσε ότι η απόπτωση είχε συμβεί σε όγκους tetrandrine επεξεργασμένο και ότι το μιτοχονδριακό μονοπάτι παίζεται ένα σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της απόπτωσης. Υπήρχαν πέντε γυμνούς ποντικούς σε κάθε ομάδα. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του Bcl-2 και Bcl-XL μειώθηκε, ενώ τα επίπεδα πρωτεΐνης του Βαχ, ενεργοποιημένη κασπάση-3, και ενεργοποιημένη κασπάση-9 ήταν σημαντικά ενισχυμένη με tetrandrine (Σχήμα 6). Όλα αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν με έμφαση ότι tetrandrine μπορεί να επάγουν απόπτωση, συνεπής με την

in vitro

μελέτη

Η ανοσοϊστοχημική χρώση για απόπτωση που σχετίζονται με πρωτεΐνες:. Bcl-2, Bcl-XL, Bax, ενεργοποιημένη κασπάση -3, και ενεργοποιημένα Capase-9. Η μεγέθυνση είναι 200 ​​×. Αντιπροσωπευτικά μικροφωτογραφίες από τις τρεις ομάδες που φαίνεται. DAB βάφονται ανοσοδραστικών κυττάρων (σκούρο καφέ).

Η

Συζήτηση

γαστρικός καρκίνος, η τέταρτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται νεόπλασμα πίσω από καρκίνο του πνεύμονα, του μαστού, του παχέος εντέρου, και του ορθού, προκαλεί σχεδόν ένα εκατομμύρια ετήσιους θανάτους και ήταν η δεύτερη αιτία θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [23-26]. Χειρουργική, χημειοραδιοθεραπεία, και μοριακή στοχευμένη θεραπεία ήταν οι κύριες στρατηγικές θεραπείας για τη θεραπεία του γαστρικού καρκίνου [27]. Αν και η χειρουργική εκτομή ήταν η πιο αποτελεσματική θεραπευτική αγωγή, τα αποτελέσματα είναι ασυνεπής και περιορίζονται από επανεμφάνιση του όγκου και χημειοαντίσταση. Συμβατικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως Ptx, 5-φθοροουρακίλη, και τα καρκινικά κύτταρα σισπλατίνη θανάτωσης με επαγωγή απόπτωσης και autophagy? αλλά τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να γίνουν ανθεκτικά στα φάρμακα προκαλείται από απόπτωση [17,28,29].

Έχει αναφερθεί ότι tetrandrine έχει ισχυρή δράση κατά των όγκων και

in vitro

και

στο vivo

σε πολλά καρκινικά κύτταρα, όπως τα κύτταρα Α549 καρκινώματος ανθρώπινου πνεύμονα, καρκίνο ουροδόχου κύστης, κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, κύτταρα ηπατώματος, και ούτω καθεξής [9-12]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι tetrandrine θα μπορούσαν να παίξουν ένα πολλά υποσχόμενο ρόλο συνεργιστική αλληλεπίδραση με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ενδεχομένως με συνεργιστική αποτελέσματά τους στην επαγωγή της απόπτωσης και προς τα κάτω ρύθμιση χημειοθεραπευτικό παράγοντα γονίδια που σχετίζονται σε ΜΚΝ-28 κύτταρα και BGC-823 κύτταρα [18]. Ωστόσο, ο μηχανισμός του tetrandrine σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα BGC-823 δεν έχει ταυτοποιηθεί. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι tetrandrine παρουσίασαν ισχυρή αντικαρκινική δράση προς την ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου

in vitro

και

in vivo

, αποσαφήνιση των υποκείμενων μηχανισμών δράσης.

Κατ ‘αρχάς, μας τα αποτελέσματα έδειξαν ότι tetrandrine αποτελεσματικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων BGC-823 προσδιορίστηκε με ΜΤΤ σε μία δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Εν τω μεταξύ, το IC

’50 του tetrandrine ήταν περίπου 6.1, 4.5, και 3.7 μg /ml σε BGC823 κυττάρων για 24, 48, και 72 ώρες, αντίστοιχα. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, χημειοθεραπευτικά φάρμακα σκοτώνουν στερεών όγκων κυρίως με διέγερση απόπτωσης [30-32]. Βρήκαμε ότι η απόπτωση που επάγεται από tetrandrine σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, μέσω ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής με αυξημένη πρώιμη αποπτωτικά κύτταρα και αργά αποπτωτικών κυττάρων στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα BGC-823.

Σε κύτταρα θηλαστικών, η απόπτωση μπορεί να προκληθεί από η εξωγενής οδός ενεργοποιείται από τον υποδοχέα του θανάτου και της ενδογενούς οδού ρυθμίζεται από Bcl-2 μελών της οικογένειας και καταρράκτες κασπάσης στο μιτοχόνδριο [33,34]. Στη μελέτη μας, tetrandrine αύξησε την έκφραση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax, Bad, και Bak και μειωμένα τα επίπεδα πρωτεΐνης Bcl-2 και Bcl-XL. Ως εκ τούτου, μια αυξημένη αναλογία της έκφρασης αντι- και προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, όπως η αναλογία Bax /Bcl-2, θα οδηγούσε στην απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Δυσλειτουργιών μιτοχόνδρια απελευθερώνει κυτόχρωμα

γ

, η οποία συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα και σχηματίζει ένα σύμπλοκο με Apaf-1. Στην ενδογενή οδό, ως τελεστή, κασπάσης-3 διασπάται με ενεργοποίηση της κασπάσης-9 [35-37]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι κασπάσης-9 και κασπάσης-3 ενεργοποιήθηκαν με tetrandrine. Ο αναστολέας παν-κασπάσης z-VAD-fmk μειωμένη απόπτωση σε BGC-823 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η μιτοχονδριακή οδός παίζει ένα κεντρικό ρόλο στην tetrandrine επαγόμενη απόπτωση.

Έχει αναφερθεί ότι tetrandrine θα μπορούσε να αντιστρέψει την αντίσταση σε πολλά φάρμακα χημειοθεραπείας, όπως Ptx και δοξορουβικίνη στην KBv200 και Κ562 γυμνά μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού [38,39]. Tetrandrine διαθέτει επίσης μια ισχυρή ικανότητα να αναστέλλει την αγγειογένεση σε γλοιώματα σε αρουραίους [40]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι tetrandrine εμφάνισαν ισχυρή δραστικότητα κατά του όγκου με αναστολή της ανάπτυξης του όγκου και επαγωγή απόπτωσης σε καθιερωμένης BGC-823 γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού.

Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι tetrandrine επάγεται σημαντικά απόπτωση σε ανθρώπινα καρκίνο του στομάχου BGC-823 κύτταρα και τα μοντέλα της ξενομοσχεύματος γυμνού ποντικού. Tetrandrine επαγόμενη απόπτωση σχετίζεται με την ενεργοποίηση της ενδογενούς οδού απόπτωσης. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, tetrandrine θα μπορούσε να έχει μεγάλες δυνατότητες στη θεραπεία του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου στο μέλλον.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τα μέλη του Τμήματος Κλινικής Ιατρικής του Πανεπιστημίου Jiangsu για τους τεχνικής βοήθειας.