Abstract

Εγκυμοσύνη σχετιζόμενη πλάσμα πρωτεΐνη-Α (ΠΑΠΠΑ) έχει αναφερθεί να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα του αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGF) μονοπάτι σήματος μέσω πρωτεολυτική αποικοδόμηση των πρωτεϊνών δέσμευσης IGF (IGFBPs) αυξάνοντας έτσι η τοπική συγκέντρωση του ελεύθερου IGFs διάθεση υποδοχείς. Σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε ότι ΠΑΠΠΑ εκκρίνεται από δύο από κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα επτά εξετάστηκαν. Κανένα από απαθανάτισε φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBE) δοκιμάστηκαν μυστικά ΠΑΠΠΑ. Δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης και έκκρισης ΠΑΠΠΑ σε αυτά τα κύτταρα. Μία κυτταρική γραμμή που υπερεκφράζουν ΠΑΠΠΑ συνοδεύεται με έκκριση δεν δείχνει αξιοσημείωτες αλλαγές στον πολλαπλασιασμό υπό συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας

in vitro

, αλλά εμφανίζει σημαντικά αύξηση της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος. Σε αντίθεση, μια κυτταρική σειρά που υπερεκφράζουν ΠΑΠΠΑ χωρίς μείωση έκκρισης εκθέματα της ανάπτυξης του όγκου και τα δύο

in vitro

και

in vivo

. Κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΠΑΠΠΑ και την έκκριση από RNAi νοκ ντάουν μειώνει την ανάπτυξη του όγκου μετά εμφυτεύεται

in vivo

. Η δραστικότητα προώθηση όγκου ΠΑΠΠΑ φαίνεται να διαμεσολαβείται κυρίως μέσω αύξησης του μονοπατιού σηματοδότησης IGF όπως υποδεικνύεται από αξιοσημείωτες αυξήσεις στην κατάντη Akt φωσφορυλίωση κινάσης σε δείγματα όγκων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκκριση ΠΑΠΠΑ μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Παν H, Hanada S, Zhao J, ο Μάο L, Ma MZ-Q (2012) Protein έκκριση απαιτείται για εγκυμοσύνη-Associated Plasma πρωτεΐνη-Α για την προώθηση του πνεύμονα ανάπτυξη του καρκίνου

In Vivo

. PLoS ONE 7 (11): e48799. doi: 10.1371 /journal.pone.0048799

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, Πανεπιστήμιο Magna Graecia, Ιταλία

Ελήφθη: 11 Ιουν 2012? Δεκτές: 1 Οκτ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 9 Νοεμ 2012

Copyright: © 2012 Pan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί R01 CA126818 και R01 CA136635. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ινσουλίνη-όπως αυξητικοί παράγοντες (IGFs) παίζουν. σημαντικούς ρόλους σε πολλές βιολογικές διαδικασίες όπως η κυτταρική ανάπτυξη, το μετασχηματισμό, τη διαφοροποίηση, την επιβίωση και τη μετανάστευση [1], [2]. Εκτός από κρίσιμους ρόλους τους στην αναπτυξιακή βιολογία ως εμφανές σε μεταλλάξεις της γενετικής null [3], [4], [5], IGFs εμπλέκονται σαφώς στη ρύθμιση του σχηματισμού και της εξέλιξης του όγκου [6], [7]. Είναι καλά γνωστό ότι τα επίπεδα στον ορό του IGF-1 συσχετίζονται με την επίπτωση του καρκίνου στον άνθρωπο [8], [9]. Mouse εμβρυϊκών ινοβλαστών με μηδενική μετάλλαξη του

Ifgf1r

είναι ανθεκτικά σε επαγωγή του μετασχηματισμού των κυττάρων [10]. Στο μοριακό επίπεδο, IGFs συνδέονται προς τις κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (IGF1R, IR-A) για να ενεργοποιήσετε πολλαπλές οδούς ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου phosphatidylinositide-3′-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) καταρρακτών σηματοδότησης [ ,,,0],11], [12]. Ωστόσο, η πρόσβαση των IGFs με τους υποδοχείς τους ελέγχεται αυστηρά από πρωτεΐνες IGF-σύνδεσης (IGFBPs) τα οποία δεσμεύονται σε IGFs με υψηλότερη συγγένεια από IGF1R [13]. Η υποβάθμιση των IGFBPs αυξάνει ελεύθερης δραστικής IGFs διάθεση των υποδοχέων στο εξωκυτταρικό μικροπεριβάλλον και έτσι ενισχύει δραστηριότητα IGFs [14]. Μια διαφορετική ομάδα πρωτεασών συμπεριλαμβανομένης της πλασμίνης, μεταλλοπρωτεασών μήτρας (ΜΜΡ-1, -2 και -3), καθεψίνη D και του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) έχουν αναφερθεί να συμμετάσχουν σε πρωτεόλυση IGFBPs με διαφορετικές ισχύς και η εξειδίκευση [15].

Εγκυμοσύνη σχετιζόμενη πλάσμα πρωτεΐνη-Α (ΠΑΠΠΑ) είναι μια άλλη πρωτεάση η οποία έχει αναφερθεί να διασπά IGFBP4 [16]. ΠΑΠΠΑ αρχικά βρέθηκε στον πλακούντα και αναπαραγωγικούς ιστούς, και έχει προταθεί ως βιοδείκτη για την εγκυμοσύνη με γενετική ανωμαλία [17]. Πρόσφατα η πρωτεολυτική δραστηριότητα του ΠΑΠΠΑ έχει ταυτοποιηθεί σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες, οστεοβλάστες καλλιεργήθηκαν [18], [19], αγγειακά κύτταρα των λείων μυών [20] και κοκκώδη κύτταρα ωοθηκών [21]. Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, η αυξημένη έκφραση του ΠΑΠΠΑ έχει βρεθεί

in vivo

στην ενεργό αθηρωματικές πλάκες στις στεφανιαίες αρτηρίες του ανθρώπου [22] και τη θεραπεία του ανθρώπινου δέρματος [23] του τραύματος. Έτσι, ΠΑΠΠΑ συμμετέχει στη ρύθμιση του IGFs μεσολάβηση παθοφυσιολογικές διεργασίες των ασθενειών αυτών. ΠΑΠΠΑ βρίσκεται επίσης για να διασπάσει και να αδρανοποιήσουν IGFBP2, IGFBP3 και ΙΟΡΒΡ5 [24].

Αρκετές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων δείχνουν ότι ΠΑΠΠΑ εμπλέκεται στο σχηματισμό όγκων. γονίδιο ΠΑΠΠΑ εντοπίζεται σε μία χρωμοσωμική περιοχή που σχετίζεται με την υψηλή συχνότητα της απώλειας της ετεροζυγωτίας σε όγκους των ωοθηκών. Οι περισσότερες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών και πρωτογενείς όγκους παρουσιάζουν μερική ή ολική απώλεια της έκφρασης του ΠΑΠΠΑ [25]. έκφραση ΠΑΠΠΑ δείχθηκε να είναι σταθερά υψηλή σε φυσιολογικά δείγματα των ωοθηκών και καταστάλθηκε από SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο [25], [26]. Αντιθέτως, τα ποντίκια που φέρουν μηδενική μετάλλαξη του γονιδίου της ΠΑΠΠΑ ζουν περισσότερο και παρουσιάζουν μικρότερη συχνότητα εμφάνισης σχηματισμού όγκου κατά την διάρκεια της ζωής τους [27]. Επιπλέον, το επίπεδο ΠΑΠΠΑ ορού έχει αναφερθεί να αυξηθεί σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σύγκριση με υγιή άτομα [28]. Κατά την άποψη των αμφιλεγόμενων ρόλους των ΠΑΠΠΑ αναφέρθηκε στην ανάπτυξη καρκίνου, αποφασίσαμε να υπερεκφράζουν ΠΑΠΠΑ σε καρκινικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα για να αξιολογήσει το ρόλο της στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Εδώ αναφέρουμε ότι η έκτοπη υπερέκφραση του ΠΑΠΠΑ σε Η1299 κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα προάγει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ενώ τα κάτω ρύθμιση της ενδογενούς ΠΑΠΠΑ σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μειώνεται την ανάπτυξη του όγκου. ρυθμός ανάπτυξης του όγκου συνδέεται με την έκκριση ΠΑΠΠΑ. Όγκοι από ΠΑΠΠΑ υπερ-εκφράζοντα κύτταρα Η1299 επέδειξαν αυξημένους αριθμούς μιτωτικών κυττάρων και μείωση στην απόπτωση. Σηματοδότησης ανάλυση οδός έδειξε αυξημένη σηματοδότηση Akt. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εκκρινόμενη ΠΑΠΠΑ στα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου μέσω της ενισχύσεως της IGF οδό σηματοδότησης

Υλικά και Μέθοδοι

Τα αντιδραστήρια ελήφθησαν από τους ακόλουθους προμηθευτές:. κυτταρικές σειρές Η1299, Α549, Η460 , H596, H1792, H1944 και Η522 είχαν αρχικά αγοραστεί από την ATCC. HBE1, HBE2 και HBE4 ελήφθησαν από τον John Minna (University of Texas Southwestern Medical Center, Ντάλας), κάθε που εκπροσωπούν HBEC1, HBEC2 και HBEC4 απαθανάτισε με Cdk4 και hTERT, αντίστοιχα [29]. Προέλευση των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται σε πειράματα παρατίθεται ως ακολούθως: Ανθρώπινη ΠΑΠΠΑ πλήρους μήκους cDNA κλώνο (ATCC, Item No: 10625309)? Ποντίκι μονοκλωνικό αντι-ΠΑΠΠΑ αντίσωμα (Novus, Littleton CO)? πρωτεΐνη IGF2, πρωτεΐνη IGFBP4 και κουνελιού πολυκλωνικό αντι-IGFBP4 αντίσωμα (Abcam, Cambridge, ΜΑ)? Φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ κουνέλι mAb, ρ44 /42 ΜΑΡΚ κουνέλι mAb, φωσφο-Ακί κουνέλι mAb, Akt (PAN) κουνέλι mAb, αντίσωμα β-τουμπουλίνης (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ)? Αντι-ποντικού IgG, IgG αντι-κουνελιού (Thermo Scientific, Rockford, IL)? Βιοτινυλιωμένη αντι-κουνελιού IgG, Βιοτινυλιωμένο αντι-ποντικού IgG, (Vector Lab, Burlingame, CA)? Ανασυνδυασμένο ανθρώπινο παράγοντα επιδερμικής ανάπτυξης (EGF), ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ανάπτυξη παράγοντα μετασχηματισμού-β1 (ΤΟΡ-β1) (Invitrogen, Camarillo, CA)? Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας Ι (IGF1) (R &? D System, Minneapolis, ΜΝ)? CellTiter-Blue (Promega, Madison, WI)? Αντι-φωσφο ιστόνης Η3 (Millipore, Temecula, CA)? RIPA ρυθμιστικό (Sigma, Saint Louis, ΜΙ)? κιτ ΠΑΠΠΑ ELISA (Lab Diagnostic Systems, Webster, ΤΧ)? αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ δισκία (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)

Κυτταρική καλλιέργεια

Η1299, Η460, Η596, H1792, H1944 και Η522 κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε ΚΡΜΙ1640 και κυττάρων Α549 καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε DMEM. Τόσο PRMI1640 και ϋΜΕΜ συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Atlanta, Lawrenceville, GA), L-γλουταμίνη (4 mM), πενικιλλίνη (100 U /ml), και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml), όλα από Invitrogen. HBE1, HBE2 και HBE4 διατηρήθηκαν σε πλήρες θρεπτικό μέσο ελεύθερο από κερατινοκύτταρα ορού (SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγρό επωαστήρα καλλιέργειας ιστών στους 37 ° C, 5% CO

2. εμπλουτισμένο μέσο χωρίς ορό κυττάρων (CM) παρασκευάστηκε από καλλιέργειες μονοστιβάδας σε 80-100% συρροή. Ορός που περιέχει μέσο αναρροφήθηκε και οι μονοστιβάδες πλύθηκαν τρεις φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό. Πλήρης κερατινοκυττάρων-SFM προστέθηκαν και επωάστηκαν για 24 ώρες. Κατά τη συγκομιδή, CM μεταφέρθηκε σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης και φυγοκεντρήθηκε στις 2500 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C πριν από την κατάψυξη σε μικρές ποσότητες στους -20 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθεί σε προσδιορισμούς. Για εκχύλισμα ολόκληρου κυττάρου (CE), το μέσο απομακρύνθηκε και πλύθηκε τρεις φορές σε PBS και υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό RIPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) που περιέχει πρωτεάση και ο αναστολέας φωσφατάσης δισκία κοκτέιλ (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ) και φυγοκεντρήθηκε στις 12.500 rpm για 5 λεπτά. Αυτό το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για δοκιμασίες.

Η ανάλυση έκφρασης των καρκινικών κυτταρικών γραμμών με πραγματικού χρόνου PCR

Η RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή ολικού RNA από κυτταρική καλλιέργεια . Ολικό RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DNase σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Qiagen). Σύνθεση του cDNA δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια TaqMan RT-PCR από την Applied Biosystems (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). γονιδιακή έκφραση ΠΑΠΠΑ προσδιορίσθηκε με δοκιμασία TaqMan γονιδιακής έκφρασης με έναν ανιχνευτή 7900HT PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems). Οι ειδικοί εκκινητές για την ενίσχυση των γονιδίων στόχων και ειδικού ανιχνευτή για την ανίχνευση ενίσχυση σχεδιάστηκαν από την Applied Biosystems (Cat #: Hs00361692_m1). Ανθρώπινα PPIA (κυκλοφιλίνη Α) χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για ομαλοποίηση της γονιδιακής έκφρασης (Cat #: 4333763F, Applied Biosystems).

Δημιουργία κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα σταθερώς υπερ-εκφράζουν ΠΑΠΠΑ ή προς τα κάτω ρύθμιση της ενδογενούς ΠΑΠΠΑ έκφραση

Ανθρώπινο ΠΑΠΠΑ πλήρους μήκους cDNA (αγοράστηκε από την ATCC, Item No: 10625309) απελευθερώθηκε από τον φορέα pBluescript με SfiI (γεμάτο) -XbaI πέψη και υποκλωνοποιήθηκε σε EcoRV και Xbal θέσεις του φορέα έκφρασης pCR3.1 (Invitrogen ) για να κατασκευαστεί φορέας έκφρασης ΠΑΠΠΑ. Ο φορέας έκφρασης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας. κύτταρα Η1299 επιμολυσμένα με είτε φορέα έκφρασης ΠΑΠΠΑ ή κενό φορέα επιλέχθηκαν υπό μέσο επιλογής περιέχουν 0,5 mg /ml G418 (Sigma). ανθεκτικοί σε G418 κλώνοι εξετάστηκαν για την έκφραση των ΠΑΠΠΑ και στη συνέχεια επεκτάθηκε για να δημιουργήσει υπερ-έκφραση γραμμή Η1299 ΠΑΠΠΑ (Η1299 /PAPPAov) και κενή γραμμή κυττάρων φορέα ελέγχου (Η1299 /pCR3.1). Για τα πειράματα ΠΑΠΠΑ νοκ ντάουν, λεντοϊού σωματίδια # 81 (Cat #: VGH5523-101126912, Κλώνος ID: V3LHS_355181), # 82 (Cat #: VGH5523-101130068, ID Κλώνος: V3LHS_355182), # 83 (Cat #: VGH5523-101132535, Κλώνος ID: V3LHS_355183) που περιέχουν shRNAmir να ΠΑΠΠΑ και μη φίμωσης shRNAmir (Cat #: RHS4348) αγοράστηκαν από την Thermo Scientific (Lafayette, CO) και χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν τα καρκινικά κύτταρα Α549. Οι ώριμες αλληλουχίες αίσθηση αυτών των κλώνων που απαριθμούνται ως εξής: V3LHS_355181: CGACAAGAAGTCTCCTTCA? V3LHS_355182: AGAGCCTACTTGGATGTTA? V3LHS_355183: GGGCAGTTCATGAAGCTCT? Μη αποσιώπηση: TCTCGCTTGGGCGAGAGTA. Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα επιλέχθηκαν σε μέσο επιλογής που περιέχει 2 μg /ml πουρομυκίνη (Invitrogen). Οι κλώνοι εξετάστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου για την ισχύ των ΠΑΠΠΑ mRNA νοκ ντάουν και επεκτάθηκε για να δημιουργήσει ΠΑΠΠΑ νοκ ντάουν κυτταρική σειρά (Α549 /PAPPAkd) και μη φίμωση κυτταρική γραμμή ελέγχου (Α549 /sc).

ΠΑΠΠΑ ELISA

Ρυθμισμένο μέσο (CM) και εκχύλισμα ολικού κυττάρου (CE) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. επίπεδα ΠΑΠΠΑ μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ELISA Υπερευαίσθητα ΠΑΠΠΑ λαμβάνεται από Diagnostic Systems Laboratories σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ελάχιστη ευαισθησία είναι 0.24 mIU /L, με ενδο- και δια-δοκιμασίας συντελεστές διακύμανσης των 4,7 και 4,2%, αντίστοιχα.

Μέτρηση πρωτεολυτική δραστικότητα IGFBP

Η πρωτεολυτική δραστηριότητα των ΠΑΠΠΑ αναλύθηκε με επώαση ρυθμισμένο μέσο άνευ ορού (CM) με πρωτεΐνη υπόστρωμα IGFBP4. Εν συντομία, οι αντιδράσεις αναπαράγουν στήθηκαν με ανάμιξη 25 μΐ CM με υπόστρωμα IGFBP4 40 ng παρουσία ή απουσία IGF2 (75 ηΜ τελική συγκέντρωση) που ακολουθείται από επώαση στους 37 ° C για 4 ώρες. Ακέραιου και σχισμένου πρωτεΐνη του IGFBP4 σε μίγματα αντίδρασης στη συνέχεια διαχωρίστηκαν από μη-αναγωγικό 10% SDS-PAGE και κατέστησαν ορατά με ανάλυση Western Blot χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντι-IGFBP4 αντίσωμα (Abcam).

πειράματα ξενομοσχεύματος όγκου

παλιό τεσσάρων εβδομάδων θηλυκών σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID /NOD) ποντίκια ή ηυ /ηυ αθυμικοί ποντικοί (Charles River) χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη, και όλοι οι ποντικοί διατηρήθηκαν υπό ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων. 5 × 10

6 του Η1299 /PAPPAov, H1792 /PAPPAov ή κύτταρα του ελέγχου κενού φορέα (Η1299 /pCR3.1 ή H1792 /pCR3.1) αιωρήθηκαν σε 0,1 ml 1 χ PBS που περιέχει 50% matrigel και ενίεται υποδορίως σε πέντε ποντικούς ανά ομάδα, χρησιμοποιώντας 26 βελόνες διαμετρήματος και αφήνεται να διαδοθεί προς σχηματισμό ψηλαφητών όγκων. Οι όγκοι παρακολουθήθηκαν και στη συνέχεια μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα σε τρεις διαστάσεις χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο. Ομοίως, ΠΑΠΠΑ κύτταρα νοκ ντάουν Α549 γραμμή Α549 /PAPPAkd και μη φίμωση A549sc ελέγχου επεκτάθηκαν σε καλλιέργεια. 1 × 10

6 κύτταρα αιωρούνται σε 0,1 ml 1 χ PBS εγχύθηκαν υποδορίως σε ηλικίας τεσσάρων εβδομάδων ηυ /ηυ αθυμικοί ποντικοί. Οι αναπτυσσόμενοι όγκοι παρακολουθήθηκαν και μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα όπως περιγράφηκε παραπάνω. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο (π /6) χ μήκος (

L

) × πλάτος (

W

) × ύψος (Η) των όγκων όπου

L

και

W

αντιπροσωπεύουν τις μεγαλύτερες και πιο σύντομη διαστάσεις του όγκου, αντίστοιχα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με τον ίδιο τρόπο, όταν το μεγαλύτερο όγκο φτάσει το τελικό σημείο της μελέτης που ορίζεται από ένα φορτίο όγκου 10% του σωματικού βάρους του ποντικού.

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ποντίκια αντιμετωπίζονται σύμφωνα με την Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου. Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν μετά από διαδικασίες που έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Θεσμικών των ζώων στο Πανεπιστήμιο του Μέριλαντ Οδοντιατρική Σχολή. Το όνομά επιτροπή επιτροπή δεοντολογίας ή ηθικής εγκριθεί ειδικά αυτή τη μελέτη.

Western Blot Ανάλυση

Πρωτεΐνη από όλη την εκχύλιση των κυττάρων προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BCA (Pierce). Ένα σύνολο 25 μα πρωτεΐνης κλασματοποιήθηκαν με NuPAGE 10% Bis-Tris γέλης (Invitrogen) και μεταφέρθηκε σε ένα διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVD) μεμβράνη από το σύστημα μεταφοράς γέλη iBlot (Invitrogen). Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε TBST (10 mMTris-HCI, ρΗ 7,4, 100 mM NaCl, 0,1% (ν /ν) Tween-20) που περιείχε 5% (w /v) μη λιπαρό γάλα σε σκόνη για μία ώρα και επωάζεται όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα (1:1000) είτε σε TBST /1% (β /ο) μη λιπαρό γάλα σε σκόνη ή σε TBST /1% (w /v) BSA (αλβουμίνη βόειου ορού). Οι μεμβράνες πλύθηκαν έξι φορές με TBST, επωάστηκαν με υπεροξειδάση κρένου 1:5000 συζευγμένο αντι-ποντικού ή αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού σε TBST /1% (β /ο) μη λιπαρό γάλα σε σκόνη για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από άλλες έξι πλύσεις σε TBST, τα σύμπλοκα αντισώματος ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham Biosciences). Τα μοριακά βάρη εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα προχρωματισμένους πλήρους οργή ουράνιο τόξο δείκτες μοριακού βάρους (GE Healthcare).

ανοσοϊστοχημική χρώση

εγκλεισμένα σε παραφίνη, τομές 5 μm πάχους ιστού από ιστούς όγκων χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημική χρώση . Εν συντομία, τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε μια σειρά λουτρών ξυλόλιο και στη συνέχεια επανυδατώθηκαν χρησιμοποιώντας μία διαβαθμισμένη σειρά αλκοόλη. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 9) για 15 λεπτά κάτω από ακτινοβολία μικροκυμάτων έτσι ώστε ανάκτηση αντιγόνου. Μετά από αποκλεισμό με κανονικό ρυθμιστικό μπλοκαρίσματος (κιτ Vectastain) για 30 λεπτά, οι τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα (φωσφο-ιστόνης Η3 mAb: 1:000? Phospho-Ακί mAb: 1:100? Phospho-ρ44 /42 ΜΑΡΚ mAb: 1:100). Οι τομές στη συνέχεια σε επεξεργασία με τη χρήση τυποποιημένων ανοσοχημικές τεχνικές αβιδίνης-βιοτίνης (ABC) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Vector Laboratories). Diamnobenzidine χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο και αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε για αντιχρωματισμός.

Αποτελέσματα

Η έκκριση των λειτουργικών δραστικών ΠΑΠΠΑ από καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα

Ελέγξαμε πρώτα την υπόθεση αν η αυξημένη πλάσμα συγκέντρωση ΠΑΠΠΑ παρατηρηθεί σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα [28] οφείλεται στην έκκριση του ΠΑΠΠΑ απευθείας από καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. Εξετάσαμε περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη και την έκκριση του ΠΑΠΠΑ σε αρκετές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται συνήθως μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) σε σύγκριση με αθανατοποιημένη φυσιολογικό ανθρώπινο κυτταρικές σειρές βρογχικά επιθηλιακά (ΗΒΕ). περιεκτικότητα ΠΑΠΠΑ σε κυτταρικές σειρές καρκίνου είναι συγκρίσιμη (σε περιπτώσεις Α549 και Calu-1) ή λιγότερο (σε περίπτωση Η460, Η596, Η1299, H1792 και H19444) από κυτταρικές σειρές HBE γενικά. Ωστόσο, ΠΑΠΠΑ έκκριση από Α549 και Η460 είναι σημαντικά περισσότερο από ό, τι τα κύτταρα ΗΒΕ όπως αποδεικνύεται από τη σημαντική υψηλά επίπεδα ΠΑΠΠΑ σε ρυθμισμένο μέσο από αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα δείχνουν έκκριση πρωτεΐνης ΠΑΠΠΑ μπορεί να είναι διαφορετικές μεταξύ των κυττάρων ΗΒΕ και Α549, αν και τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης ΠΑΠΠΑ είναι παρόμοια (σχ. 1Α). Έτσι, η εκκρινόμενη μορφή της ΠΑΠΠΑ από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να συμβάλλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη ορισμένων τύπων καρκίνου του πνεύμονα.

(Α) συγκέντρωση πρωτεΐνης ΠΑΠΠΑ σε διάφορες καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές (CE) και ρυθμισμένο μέσο (CM) . Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος δύο ανεξάρτητων προσδιορισμών εις διπλούν. (Β) IGF εξαρτώμενη δραστικότητα πρωτεάσης σε ρυθμισμένο μέσο από Α549 κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Μέτρηση της πρωτεολυτικής δραστικότητας IGFBP διεξάγεται όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα βέλη δείχνουν άθικτα IGFBP4 και 18 kD και 14 πρωτεολυτικά θραύσματα kD.

Η

Για την περαιτέρω διεύθυνση, εάν εκκρίνεται ΠΑΠΠΑ είναι λειτουργικά ενεργό, η δραστηριότητα της πρωτεάσης του ΠΑΠΠΑ εξετάστηκε χρησιμοποιώντας IGFBP4 ως υπόστρωμα σε προσαρμοσμένο μέσο από HBE1 και Α549 . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, ρυθμισμένο μέσο από Α549 θα μπορούσε να υποβαθμίσει ουσιαστικά IGFBP4 παρουσία IGF2, υποδεικνύοντας ότι ΠΑΠΠΑ εκκρίνεται από Α549 είναι λειτουργικά ενεργό. ΠΑΠΠΑ σε HBE1 είναι ούτε μυστικοπαθής ούτε λειτουργική, διότι δεν παρατηρήθηκε αποικοδόμηση IGFBP4 στο ρυθμισμένο μέσο από HBE1 (Εικ. 1Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να μυστικό ΠΑΠΠΑ αντί περιεχόμενο κυτταρικό ΠΑΠΠΑ σχετίζεται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Λειτουργική ανάλυση των πρωτεολυτική δραστηριότητα ΠΑΠΠΑ στην εξαρτώμενη IGF2 υποβάθμιση IGFBP4 είναι συγκεκριμένη, ευαίσθητη και αξιόπιστη. Χρησιμοποιήσαμε αυτή τη δοκιμασία στη συνέχεια ως μέσα για την ανίχνευση της παρουσίας του μέσου ελεύθερου ορού ΠΑΠΠΑ όπως αναφέρθηκε από άλλους [26], [27], [30].

Μείωση της έκκρισης ΠΑΠΠΑ μειώνει την ανάπτυξη του όγκου in vivo σε ένα ξενομόσχευμα μοντέλο, αλλά όχι in vitro σε κυτταρική καλλιέργεια

για να εκτιμηθεί ότι η εκκρινόμενη μορφή είναι σημαντική για ΠΑΠΠΑ για την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων που παρήγαγαν τη σταθερή κυτταρική γραμμή του Α549 σε μεταγωγή με λεντοϊού σωματίδια που περιέχουν shRNAmir να ΠΑΠΠΑ (Α549 /PAPPAkd) στο στόχο για να νοκ ντάουν την έκφραση και την έκκριση της ΠΑΠΠΑ. Πάνω από το 50% κάτω ρύθμιση των ΠΑΠΠΑ mRNA έχει επιτευχθεί στον κλώνο # 82 shRNAmir να ΠΑΠΠΑ όπως επιβεβαιώνεται με πραγματικού χρόνου PCR ποσοτικοποίησης (Εικ. 2Α). Είναι σημαντικό ότι, σχεδόν όλοι έκκριση ΠΑΠΠΑ από Α549 /PAPPAkd κύτταρα καταργήθηκε εμφανές από την έλλειψη δραστικότητας πρωτεάσης σε ρυθμισμένο μέσο (Εικ. 2Β). ΠΑΠΠΑ είναι γνωστό ότι υποβαθμίζουν IGFBPs και να αυξήσει τη βιοδιαθεσιμότητα των IGFs

in vivo

. Είναι πολύ ενδιαφέρον να γνωρίζουμε αν η μείωση της έκκρισης ΠΑΠΠΑ θα επηρεάσει την ανάπτυξη των κυττάρων

in vitro

σε κυτταρική καλλιέργεια. Η επίδραση της ΠΑΠΠΑ νοκ ντάουν στην ανάπτυξη των κυττάρων Α549 αξιολογήθηκε πρώτη

in vitro

σε σύγκριση με χωρίς φίμωση κύτταρα ελέγχου shRNAmir. Δεν παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη αλλαγή στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ανάπτυξη των Α549 /PAPPAkd

in vitro

σε κατάσταση κυτταρικής καλλιέργειας (Σχ. 2C). Η αποτυχία να ανιχνεύσει την επίδραση της ΠΑΠΠΑ knockdown επί της κυτταρικής ανάπτυξης δείχνει ότι κυτταρικής καλλιέργειας

in vitro

μπορεί να μην είναι το σωστό πρότυπο σύστημα επειδή δεν έχουν την κατάλληλη περιβάλλον για ΠΑΠΠΑ να ενεργεί ως πρωτεάση να αυξήσουν τη βιοδιαθεσιμότητα των IGFs και τα κύτταρα εκτίθενται συνεχώς σε πολλές ελεύθερες αυξητικούς παράγοντες συμπεριλαμβανομένων IGFs σε μέσο καλλιέργειας. Αποφασίσαμε να εξετάσει το ρόλο των ΠΑΠΠΑ στην αύξηση του όγκου

in vivo

σε μοντέλα ξένου μοσχεύματος. Όπως ήταν αναμενόμενο, οι όγκοι που δημιουργούνται από Α549 κυτταρική γραμμή με ΠΑΠΠΑ knockdown (Α549 /PAPPAkd) εμφάνισαν σημαντική μείωση στην ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου Α549 γραμμή (Σχ. 3Α και Β). Το μέσο όγκος υγρού βάρους Α549 /PAPPAkd στο τέλος του πειράματος ήταν 214 mg, η οποία είναι σημαντικά χαμηλότερη από 360 mg για την ομάδα μάρτυρα (Σχ. 4C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ΠΑΠΠΑ εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην προαγωγή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα και την εξέλιξη

in vivo

.

Α549 κύτταρα σε μεταγωγή με λεντοϊού σωματίδια που περιέχουν shRNAmir (# 81 # 82 και # 83) να ΠΑΠΠΑ και μη φίμωση shRNAmir (SC) και επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. επίπεδα (Α) ΠΑΠΠΑ mRNA από αυτές τις κυτταρικές σειρές προσδιορίζεται με PCR πραγματικού χρόνου ποσοτικοποίηση και απεικονίζεται ως σχετικό επίπεδο σε μη φίμωση ελέγχου. (Β) IGF εξαρτώμενη δραστικότητα πρωτεάσης σε ρυθμισμένο μέσο από ΠΑΠΠΑ knockdown Α549 κυτταρικές σειρές. (Γ) καμπύλη ανάπτυξης των κυττάρων ΠΑΠΠΑ νοκ ντάουν Α549 γραμμή # 82 και μη φίμωση της γραμμής ελέγχου.

Η

(Α) Εικόνα του μεγέθους του όγκου κατά τη στιγμή της εκτομής. (Β) καμπύλη ανάπτυξης του ξενομοσχεύματος όγκου. ΠΑΠΠΑ κύτταρα knockdown Α549 γραμμή Α549 /PAPPAkd και μη φίμωσης A549sc ελέγχου ενέθηκαν υποδορίως σε παλιά 4 εβδομάδες

ηυ /ηυ

αθυμικούς ποντικούς όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όγκος του όγκου (mm

3) ± SD (η = 5). (Γ) Υγρό βάρος του όγκου κατά τον χρόνο της εκτομής. *:

σ

& lt? 0,05 (φοιτητής

t

test)

Η

(Α) τα επίπεδα πρωτεΐνης του ΠΑΠΠΑ σε Η1299 κύτταρα που υπερεκφράζουν ΠΑΠΠΑ.. επίπεδα ΠΑΠΠΑ σε εκχυλίσματα πρωτεΐνης από κυτταρικές γραμμές Η1299 σταθερώς επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης ΠΑΠΠΑ (Η1299 /PAPPAov) και κενού φορέα ελέγχου (Η1299 /pCR3.1) προσδιορίστηκαν με κιτ ELISA όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα που δείχνονται είναι μέσες ± SE τριπλών προσδιορισμών. (Β) IGF εξαρτώμενη δραστικότητα πρωτεάσης σε ρυθμισμένο μέσο από Η1299 /pCR3.1 και Η1299 /PAPPAov. (Γ) καμπύλη ανάπτυξη κυτταρικών σειρών Η1299 /PAPPAov Η1299 /pCR3.1 και. Βιώσιμα κύτταρα σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετρήθηκαν με CellTiter-Μπλε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SE τριπλών προσδιορισμών της μονάδας σχετικού φθορισμού (RFU) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Δ) τα επίπεδα πρωτεΐνης του ΠΑΠΠΑ στην H1792 κύτταρα υπερεκφράζουν ΠΑΠΠΑ. επίπεδα ΠΑΠΠΑ σε εκχυλίσματα πρωτεΐνης από κυτταρικές γραμμές H1792 σταθερώς επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης ΠΑΠΠΑ (H1792 /PAPPAov) και κενού φορέα ελέγχου (H1792 /pCR3.1) προσδιορίστηκαν με κιτ ELISA όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα που δείχνονται είναι μέσες ± SE τριπλών προσδιορισμών. (Ε) IGF εξαρτώμενη δραστικότητα πρωτεάσης σε ρυθμισμένο μέσο από H1792 /pCR3.1 και H1792 /PAPPAov. (F) Καμπύλη ανάπτυξης του H1792 /pCR3.1 και H1792 /PAPPAov κυτταρικές σειρές.

Η

Η έκκριση της ΠΑΠΠΑ υπερ-εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα προάγει την ανάπτυξη του όγκου σε μοντέλο ξενομοσχεύματος, αλλά όχι in vitro στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

για την περαιτέρω αξιολόγηση του ρόλου της έκφρασης ΠΑΠΠΑ στην ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα, Η1299 και H1792 καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές που παρουσίασαν χαμηλό επίπεδο ενδογενούς έκφρασης ΠΑΠΠΑ, επιλέχθηκαν για υπερ-έκφραση του ΠΑΠΠΑ. Αμφότερα τα κύτταρα Η1299 και H1792 με φορέα έκφρασης σταθερά επιμολυσμένα ΠΑΠΠΑ (Η1299 /PAPPAov και H1792 /PAPPAov) επιτυγχάνεται περίπου δύο φορές αύξηση στο επίπεδο της πρωτεΐνης ΠΑΠΠΑ σε σύγκριση με γονικά κύτταρα ελέγχου φορέα τους (Η1299 /pCR3.1 και H1792 /pCR3.1) (Εικ. 4Α και D). Είναι σημαντικό ότι, ρυθμισμένο μέσο από κύτταρα Η1299 /PAPPAov ήταν σε θέση να διασπά το υπόστρωμα IGFBP4 σε IGF2 εξαρτώμενο τρόπο ενώ δεν δραστικότητα πρωτεάσης ανιχνεύθηκε σε γονικά κύτταρα ελέγχου φορέα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ΠΑΠΠΑ ήταν σε θέση να εκκρίνεται από τα κύτταρα Η1299 /PAPPAov και ήταν λειτουργικά ενεργά ( Σχ. 4Β). Σύμφωνα με τον ίδιο όρο δοκιμασία, ρυθμισμένο μέσο από κύτταρα H1792 /PAPPAov προκάλεσε μικρή υποβάθμιση του υποστρώματος IGFBP4, γεγονός που υποδηλώνει έλλειψη ΠΑΠΠΑ έκκριση από κύτταρα H1792 /PAPPAov (Εικ. 4Ε).

Η επίδραση της ΠΑΠΠΑ υπερ-έκφραση στο κυτταρική ανάπτυξη στη συνέχεια αξιολογήθηκε τόσο Η1299 /PAPPAov και κυττάρων H1792 /PAPPAov. Αριθ αξιοσημείωτη αλλαγή της κυτταρικής ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε κύτταρα Η1299 /PAPPAov όταν συγκρίνεται με γονική κυτταρική φορέα ελέγχου τους, και πάλι πιθανώς λόγω της έλλειψης κατάλληλης μικροπεριβάλλον σε συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων όπως περιγράφεται παραπάνω (Σχ. 4C). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα H1792 /PAPPAov έδειξαν σημαντική μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα της (σχ. 4 F), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι αυξήσεις των μη μυστικοπαθείς, ενδοκυτταρική ΠΑΠΠΑ μπορεί να ασκήσει διακριτούς ρόλους στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Παρόμοια με ΠΑΠΠΑ knockdown σε κύτταρα Α549, η επίδραση του ΠΑΠΠΑ υπερέκφραση αξιολογήθηκε σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος. κύτταρα Η1299 /PAPPAov ότι η υπερβολική ρητή και μυστική ΠΑΠΠΑ, και H1792 /PAPPAov κύτταρα που υπερεκφράζουν ΠΑΠΠΑ χωρίς έκκριση ΠΑΠΠΑ εγχύθηκαν υποδορίως σε ανοσολογική ανεπάρκεια NOD /SCID ή

nu /nu

αθυμικοί θηλυκά ποντίκια, αντίστοιχα . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, οι όγκοι που δημιουργούνται από ΠΑΠΠΑ υπερέκφραση κυτταρική γραμμή Η1299 /PAPPAov αυξήθηκε πολύ ταχύτερα από ό, τι γραμμή ελέγχου φορέα του (Σχ. 5Α και Β). Είκοσι επτά ημέρες μετά τον εμβολιασμό, το μέσο υγρό βάρος των όγκων Η1299 /PAPPAov ήταν 630 mg ενώ αυτή του ελέγχου Η1299 ήταν 84 mg (Εικ. 5C). Το επίπεδο στον ορό της ΠΑΠΠΑ από ποντικών που φέρουν όγκο στο τέλος του πειράματος μετρήθηκε τόσο στην ομάδα Η1299 /PAPPAov και της αντίστοιχης ομάδας ελέγχου. επίπεδο στον ορό ΠΑΠΠΑ ήταν σημαντικά αυξημένα σε Η1299 /ομάδα PAPPAov (Εικ. 5D). Σε αντίθεση με τα κύτταρα Η1299 /PAPPAov, ξενομοσχεύματος όγκοι από κύτταρα H1792 /PAPPAov μεγάλωσε πολύ πιο αργή από ό, τι η γραμμή ελέγχου φορέα (Σχ. 5Ε και F). Εξήντα ημέρες μετά τον εμβολιασμό, το μέσο υγρό βάρος H1792 /PAPPAov όγκου ήταν 112 mg, σημαντικά λιγότερο από τα 644 mg του βάρους του όγκου που προέρχεται από τα κύτταρα ελέγχου H1792 /pCR3.1 (Σχ. 5g). Τα αποτελέσματα των ΠΑΠΠΑ υπερέκφραση και κάτω ρύθμιση στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι εκκρινόμενη μορφή ΠΑΠΠΑ είναι κρίσιμη για τη δραστικότητα προαγωγής όγκων του

in vivo

.

(Α) Εικόνα του μεγέθους του όγκου από Η1299 κύτταρα κατά το χρόνο της εκτομής. (Β) καμπύλη ανάπτυξης του ξενομοσχεύματος όγκου. Η1299 /pCR3.1 και Η1299 /PAPPAov κύτταρα ενέθηκαν υποδορίως σε 4 εβδομάδων NOD /SCID θηλυκά. (Γ) Υγρό βάρος του όγκου κατά τον χρόνο της εκτομής. (D) ΠΑΠΠΑ επίπεδο των ποντικών που φέρουν όγκο προσδιορίστηκε με ELISA κατά το τέλος των πειραμάτων ορού. (Ε) Εικόνα του μεγέθους του όγκου από H1792 κύτταρα κατά το χρόνο της εκτομής. (F) Καμπύλη ανάπτυξης του ξενομοσχεύματος όγκου. H1792 /pCR3.1 και H1792 /PAPPAov κύτταρα εγχέονται παλιά υποδορίως σε 4 εβδομάδες

nu /nu

αθυμικούς ποντικούς. βάρος όγκου (G) Wet κατά το χρόνο της εκτομής. Τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν και υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όγκος του όγκου (mm

3) ± SD (η = 5). *:

σ

& lt? 0,05? **:.

σ

& lt? 0,01 (φοιτητής

t

test)

Η

Ενίσχυση της μεταγωγής σήματος ΑΚΤ στην αύξηση της ανάπτυξης του όγκου με ΠΑΠΠΑ

η αυξημένη ανάπτυξη όγκου σε ΠΑΠΠΑ εκκρίνουν κυτταρικές γραμμές θα μπορούσαν να προκύψουν από την αυξημένη σηματοδότηση του IGF που προκαλούνται από αποικοδόμηση του IGFBP4 και έτσι αυξάνει της βιοδιαθεσιμότητας της IGFs. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, ο πολλαπλασιασμός του όγκου και απόπτωση εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ιστόνη Η3 ως μιτωτική δείκτη και δοκιμασία TUNEL για απόπτωση. Σημαντικά περισσότεροι μιτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε ιστούς όγκου από Η1299 /κύτταρα PAPPAov από εκείνα από Η1299 ελέγχους /pCR3.1. Όσο για την απόπτωση, λιγότερες TUNEL θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε όγκους από Η1299 /κύτταρα PAPPAov από εκείνους από τους ελέγχους Η1299 /pCR3.1 (Εικ. 6). Για τον προσδιορισμό των πιθανών μονοπατιών μεταγωγής σήματος κατά κύριο λόγο υπεύθυνη για την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου, την κατάσταση του φωσφόρου-Akt και φώσφορο-Ρ43 /εξετάστηκαν 44 ΜΑΡΚ κινάσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, σημαντική μεγαλύτερη ποσότητα των θετικών κυττάρων φωσφο-Ακί παρατηρήθηκαν σε τομές όγκων από κύτταρα Η1299 /PAPPAov από τους όγκους από κύτταρα Η1299 /ελέγχου pCR3.1. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη εξάγεται απευθείας από ιστούς όγκων αυτών των δύο ομάδων. Η ποσότητα του φωσφόρου-Ακί αυξήθηκε σημαντικά σε εκχυλίσματα πρωτεΐνης από Η1299 δείγματα /PAPPAov όγκου από εκείνα από κύτταρα Η1299 /ελέγχου pCR3.1. Δεν αξιοσημείωτη διαφορά παρατηρήθηκε της φωσφο-ρ42 /44 ΜΑΡΚ κατάσταση μεταξύ Η1299 /ΠΑΠΠΑ και οι ομόλογοί τους

Α, C και Ε:. Ξενομοσχεύματος όγκοι από κύτταρα Η1299 /pCR3.1? Β, D και F:. Ξενομοσχεύματος όγκοι από Η1299 /PAPPAov

Η

Αριστερό πλαίσιο: ανοσοχρώση για την φωσφόρου-Akt (Α και Β) και φωσφόρου-Ρ42 /44 ΜΑΡΚ (Γ και Δ) στον ιστό του όγκου από Η1299 κύτταρα /pCR3.1 (Α και C) και από Η1299 /PAPPAov κύτταρα (Β και D). Δεξιά πίνακα: ποσοτικοποίηση κηλίδος western των πρωτεϊνών που σχετίζονται με το σήμα IGF μεταγωγής μονοπάτι: P-Akt και Ρ-Ρ42 /44 ΜΑΡΚ για πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από ιστούς όγκων. P-:. Φώσφορο, πρωτεΐνες

Η

Συζήτηση

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση της ΠΑΠΠΑ σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ποικίλλει σε μεγάλο βαθμό. Η ενδοκυτταρική επίπεδο ΠΑΠΠΑ πρωτεΐνη φαίνεται υψηλότερη σε αθανατοποιημένη φυσιολογικό ανθρώπινο βρογχικών επιθηλιακών εν γένει από τα περισσότερα από τα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα που εξετάστηκαν, η οποία εμφανίζεται συνεπής με την έκθεση ότι η ΠΑΠΠΑ χρωμοσωμικό τόπο συνδέεται με την υψηλή συχνότητα της απώλειας της ετεροζυγωτίας σε όγκους των ωοθηκών [25 ]. Υπερ-έκφραση του ΠΑΠΠΑ σε δύο διαφορετικά κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, Η1299 και H1792 σε παρόμοιο επίπεδο πρωτεΐνης, ωστόσο, είχε ως αποτέλεσμα διαφορετικά αποτελέσματα. Υπερ-έκφραση του ΠΑΠΠΑ σε Η1299 δεν έχει αξιοσημείωτη επίδραση επί της κυτταρικής ανάπτυξης

in vitro

αλλά αυξάνει σημαντικά στην ανάπτυξη του όγκου

in vivo

ως μοντέλο ξενομοσχεύματος. Αντιθέτως, η υπερέκφραση του ΠΑΠΠΑ σε H1792 προκάλεσε αξιοσημείωτη μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης, τόσο

in vitro

και

in vivo

ως ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος. Με τον έλεγχο και τις δύο κυτταρικές σειρές υπερέκφραση βρήκαμε ότι Η1299 μυστικά λειτουργική ΠΑΠΠΑ στο ρυθμισμένο μέσο, ​​ενώ H1792 δεν το έκανε. Ακόμα κι αν Η1299 και H1792 μπορεί να έχουν διαφορετικό γενετικό makeup που μπορεί να καταστήσει τους εξαρτώνται από διαφορετικές οδούς μεταγωγής σηματοδότησης για την ανάπτυξη, φαίνεται ότι η δραστηριότητα της ΠΑΠΠΑ στην προώθηση της ανάπτυξης του όγκου συνδέεται με την ικανότητα των κυττάρων να μυστική λειτουργική ΠΑΠΠΑ. Συνεπής με το ρόλο της έκκρισης ΠΑΠΠΑ στην ανάπτυξη του όγκου, ΠΑΠΠΑ knockdown σε Α549 είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση στην ανάπτυξη του όγκου όταν τα κύτταρα εμφυτεύονται σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια. Ο μοριακός μηχανισμός (ες) στις οποίες βασίζεται η ανασταλτική επίδραση της ενδοκυτταρικής ΠΑΠΠΑ σε αύξηση του H1792 κυττάρων παραμένει να προσδιοριστεί.

λειτουργίες ΠΑΠΠΑ ως πρωτεάση IGFBP για τον έλεγχο της τοπικής συγκέντρωσης της ελεύθερης δραστικής IGFs διαθέσιμο στους υποδοχείς τους με IGFBP αποικοδόμηση και να ενισχύσει έμμεσα το μονοπάτι σηματοδότησης IGF. Μας

in vitro

και

in vivo

αποτελέσματα εμφανίζονται σε συνεπείς με αυτό το μοντέλο.