Αφηρημένο

προηγούμενες μελέτες μας δείχνουν ότι τα κύτταρα Th17 συσσωρεύονται μέσα στους ιστούς του όγκου και συσχετίζεται με επανεμφάνιση των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Ωστόσο, η πηγή των αυξημένων διηθούν όγκο κυττάρων Th17 παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Ερευνήσαμε την επικράτηση, φαινότυπο και διακίνηση περιουσίας των κυττάρων Th17 σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα κύτταρα Th17 υψηλά συναθροίζονται εντός των νεοπλασματικών κυττάρων σε ένα ενεργοποιημένο φαινότυπο με σημαντικά αυξημένη έκφραση του CCR6. Αντίστοιχα, το επίπεδο των CCL20 στους ιστούς του όγκου ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε μη-όγκου και φυσιολογικούς ιστούς ελέγχου, και ισχυρά θετικά συνδέονται με τα κύτταρα Th17. Περαιτέρω, in vitro δοκιμασία μετανάστευσης έδειξε CCL20 έπρεπε αποτελεσματική χημειοταξία να κυκλοφορούντα κύτταρα Th17. Εν κατακλείδι, τα κύτταρα Th17 προσλαμβάνονται σε ιστούς όγκων κατά προτίμηση μέσω CCR6-CCL20 μονοπάτι, το οποίο μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα νέο θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Yu Q, Lou Xm, Ο Υ (2015) Προνομιακή Πρόσληψη της Th17 κύτταρα για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας μέσω CCR6-CCL20 Pathway. PLoS ONE 10 (3): e0120855. doi: 10.1371 /journal.pone.0120855

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 15η Οκτωβρίου, 2014? Αποδεκτές: 27η Ιανουαρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2015

Copyright: © 2015 Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο δεύτερος συχνότερος καρκίνος στις γυναίκες παγκοσμίως [1]. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι τα κύτταρα CD4

+ Τ-βοηθητικά (Th) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση ανοσοαποκρίσεις κατά του καρκίνου [2, 3]. κύτταρα Th17 είναι μία νέα υποσύνολο της ιντερλευκίνης IL-17 που παράγουν CD4

+ Τ κύτταρα [4] που έχουν δειχθεί ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στη φλεγμονή και αυτοάνοση ασθένεια [5-7], ενώ επίσης συσσωρεύονται σε όγκους όπως ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [8], γαστρικού καρκίνου [9], του καρκίνου του πνεύμονα [10], και οισοφαγικό καρκίνωμα [11]. προηγούμενη μελέτη μας διαπίστωσε επίσης αύξηση του αριθμού των κυττάρων Th17 σε ιστούς όγκων του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και ανεξάρτητη ένωση τους με υποτροπή μετά τη λειτουργία [12]. Αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα Th17 μπορεί να συνεισφέρει στην ανοσοπαθογένειας πολλών τύπων καρκίνου.

Πριν Τ κύτταρα μπορούν να ασκήσουν τα αποτελέσματά τους επί καρκινικών κυττάρων, θα πρέπει να φθάσουν θέση στόχο. Η μετανάστευση των κυττάρων Τ στη θέση στόχο είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων, κατά την οποία τα σήματα από χημειοκίνες /υποδοχείς χημειοκινών παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο [13]. Διαφορετικές CD4

+ πληθυσμοί Τ κυττάρων σε ανθρώπους και ποντίκια εμφανίζουν διακριτά πρότυπα έκφρασης υποδοχέα χημειοκίνης. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου, Th1 κύτταρα εκφράζουν CCR5 και CXCR1, τα κύτταρα Th2 εκφράζουν CCR4 και CCR8, ενώ ρυθμιστικά Τ κύτταρα εκφράζουν κυρίως ΟΟΡ4 [14]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι τα κύτταρα Th17 εκφράζουν CCR2, CCR4, και CCR6 στο περιφερικό αίμα ενήλικα ανθρώπου [15, 16]. Ωστόσο, οι μεταναστευτικές καθοριστικοί παράγοντες για τη μετανάστευση Th17 κυττάρων σε ιστούς όγκων των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας παραμένουν άγνωστα. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι ο άξονας CCR6-CCL20 καθορίζει κυρίως τη μετανάστευση των κυκλοφορούντων κυττάρων Th17 σε ιστούς όγκων σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Ασθενείς και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review της Hangzhou Μαιευτικής και Γυναικολογίας Νοσοκομείο. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από ασθενείς σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Θέματα

Ένα σύνολο των 35 ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή στο Νοσοκομείο τους πρώτους ανθρώπους της Hangzhou μεταξύ 2012 και 2013, εντάχθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Συμφωνήθηκε περιφερικό αίμα (ΡΒ), οι όγκοι, και οι αντίστοιχες μη καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από αυτούς τους ασθενείς. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν αντικαρκινική θεραπεία ή άλλες ιατρικές επεμβάσεις. Τα χαρακτηριστικά του ασθενούς (όπως σημειώνεται στον S1 πίνακα).

Απομόνωση του PBMC, TIL, και μηδέν

μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) απομονώθηκαν με Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich , St. Louis, ΜΟ) διαχωρισμό κλίσης πυκνότητας. ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα (TIL) και λεμφοκύτταρα μη καρκινικών-διηθητικά (μηδέν) απομονώθηκαν όπως περιγράφεται από Pang και ο συνάδελφός του [17]. Εν συντομία, ο ιστός κόβεται σε μικρά τεμάχια και επωάστηκαν σε ένα μίγμα ενζύμων που περιέχει 0.05% κολλαγενάση IV (Invitrogen, Carlsbad, CA) και 0,001% ϋΝάση Ι (Sigma-Aldrich) για 1 ώρα. Διαχωρισμένα ιστοί στη συνέχεια αλέθονται μέσα από ένα σουρωτήρι 70-μm, και μονοπύρηνα κύτταρα ελήφθησαν με διαχωρισμό βαθμίδας πυκνότητας χρησιμοποιώντας Ficoll-Hypaque.

Η κυτταρομετρία ροής

PBMC, TIL και μηδέν βάφτηκαν με fluorochrome- συζευγμένα μονοκλωνικά αντισώματα κατά του ανθρώπινου CD3, CD4, CD45RO, HLA-DR, CCR2, CCR4, CCR6, CD11a, CD49d, CD103, PD-1, Granzyme Β, και IL-17 (BD PharMingen, San Diego, CA). Τα κύτταρα διεγέρθηκαν για να εκκρίνουν κυτοκίνες για 4 ώρες με 100 ng /mL οξική μυριστική φορβόλη (ΡΜΑ), 1 μg /mL ιονομυκίνη (Sigma-Aldrich) και 2 μΜ μονενσίνη (Enzo, Plymouth, ΡΑ). Για ενδοκυτταρική χρώση, τα κύτταρα διαπερατά και στερεώνονται σύμφωνα με Cytofix /Cytoperm (BD PharMingen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά τη χρώση, τριών ή τεσσάρων χρωμάτων κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ταμειακών LSR II κυτταρομετρητή (Becton Dickinson, San Jose, CA) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR).

Ανοσοϊστοχημική χρώση

εγκλεισμένα σε παραφίνη, σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ιστού ήπατος κόπηκε σε 4-μm τμήματα. Το αντιγόνο ανάκτηση προσχηματίστηκε μέσω μαγειρέματος υπό πίεση για 10 λεπτά σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0). Αντισώματα ποντικού αντι-ανθρώπου FoxP3 (αραίωση 1: 200? Abcam, Cambridge, UK) και αντι-ανθρώπινο IL-17 κουνελιού (αραίωση 1: 150? Ε & amp? D System, Minneapolis, ΜΝ) χρησιμοποιήθηκαν για τα πρωτογενή αντισώματα . Διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιείται για υπόστρωμα μετά αντιχρωματισμός με αιματοξυλίνη για απλή χρώση.

Real-time PCR

RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) και συντέθηκαν για cDNA με τη χρήση QuantiTech αντίστροφη κιτ Μεταγραφή (Qiagen). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε σε SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ Prism 7500 πραγματικού χρόνου PCR System (Applied Biosystems). Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: GAPDH: CTC TCT GCT ΚΔ ΚΔ Γ.Ο.Σ. CGA C (προς τα εμπρός), TGA ΟΟΟ ATG ΤΟΟ CTC GGC Τ (αναστροφή)? CCL17: CCA GGG ATG CCA TCG ΤΤΤ (προς τα εμπρός), GGT GGA GGT CCC ΑΟΟ TAG TC (πίσω)? CCL20: GAC ΑΤΑ GCC CAA GAA CAG ΑΑΑ (προς τα εμπρός), GAC AAG TCC AGT GAG GCA ΥΠΑ (πίσω)? και CCL22: GGA GGC ΑΑΑ GAG TAG GGT GTA AT (προς τα εμπρός), TCA GCC AGA ΑΑΟ GCA TAG ΑΤΑ GA (reverse). Τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν, και η σχετική έκφρασή τους υπολογίζεται με τον ακόλουθο τύπο χρησιμοποιώντας ΟΑΡϋΗ ως ενδογενή ελέγχους:. 2

-ΔΔCt

χημειοταξίας δοκιμασία

δοκιμασίες Μετανάστευση πραγματοποιήθηκαν σε PBMC χρησιμοποιώντας το σύστημα Transwell, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. PBMC (1 × 10

6) σε ένα όγκο 200 μΐ προστέθηκαν στα άνω φρεάτια (ένθετο μέγεθος πόρων, 5 μm? Millipore, Billerica, ΜΑ). Ανθρώπινα χημειοκίνες (CCL20, CCL21 και CCL22, 100 ng /ml από το καθένα? Όλα από R &? D System, Minneapolis, ΜΝ), ή υπερκείμενο κυττάρων HeLa, SiHa κύτταρα ή κύτταρα C-33Α (Cell Research Institute της κινεζικής Ακαδημίας Sciences, Σαγκάη, Κίνα) προστέθηκαν στον κατώτερο θάλαμο σε έναν όγκο 900 μΙ. Τα κύτταρα HeLa (HPV-18 μολυσμένων κυτταρικών σειρών του τραχήλου της μήτρας), SiHa κύτταρα (HPV-16 μολυσμένων κυτταρικών σειρών του τραχήλου της μήτρας) και κύτταρα C-33Α (HPV αρνητικά τραχήλου τα καρκινικά κύτταρα) καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FCS σε μια υγροποιημένο 5% CO2 στους 37 ° C. Το υπερκείμενο των καρκινικών κυττάρων που χρησιμοποιούνται για την δοκιμασία χημειοταξίας συλλέχθηκε μετά 3 έως 5 ημερών καλλιέργειας. Αντισώματα προς CCL20, CCL21 και CCL22 (R &? D System) προστέθηκαν λίγο πριν από τις χημειοτακτικές πειράματα σε ένα κορεσμένο συγκέντρωση 500 ng /ml. Μετά από 4 ώρες της χημειοταξίας στους 37 ° C, τα κύτταρα στα κατώτερα φρεάτια συλλέχθηκαν και διεγέρθηκαν με 100 ng /mL ΡΜΑ και 2 μΜ μονενσίνης για 4 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά και στερεώνονται σύμφωνα με Cytofix /Cytoperm (BD PharMingen) και βάφτηκαν με συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα κατά της IL-17. Ο απόλυτος αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε και υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το τέλειο σύστημα αρίθμησης (Cytognos, Σαλαμάνκα, Ισπανία). Για τον υπολογισμό του δείκτη μετανάστευση, τον αριθμό των μετανάστευσαν κυττάρων για χημειοκινών ήταν διαιρείται με τον αριθμό των μετανάστευσαν κυττάρων για το μέσο ελέγχου [19].

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα στατιστικά δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του SPSS , έκδοση 16.0. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA, Mann-Whitney U test, ή χ2 τεστ, όπου ενδείκνυται. συντελεστής Pearson υπολογίστηκε για την αξιολόγηση της σύνδεσης μεταξύ των επιπέδων των χημειοκινών και των κυττάρων Th17 στο περιβάλλον του όγκου. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσο ± S.E.M. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο

P

& lt? 0.05.

Αποτελέσματα

Κατανομή των κυττάρων Th17 σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Για να μελετήσουμε την κατανομή των κυττάρων Th17 στο site του όγκου, ΜΗΔΕΝ και TIL απομονώθηκαν από ζεύγη μη όγκου και καρκινικούς ιστούς σε 35 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και η οποία χαρακτηρίζεται μέσω κυτταρομετρία ροής (Εικ. 1Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, η συχνότητα των κυττάρων Th17 στον ιστό του όγκου, που αντιπροσωπεύει 11,49 ± 1,19% των CD4

+ Τ κύτταρα, ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες στη μη καρκινικό ιστό (3,68 ± 0,48%,

P

& lt ? 0.001), και το περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (4,96 ± 0,72%,

P

& lt? 0,01) και υγιείς δότες (1,67 ± 0,19%,

P

& lt? 0,001? Εικ . 1Β). Επιπλέον, η αναλογία των κυκλοφορούντων κυττάρων Th17 ήταν επίσης υψηλότερη σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας σε σύγκριση με υγιείς δότες (

P

& lt? 0.001). Ανοσοϊστοχημική χρώση παρατηρήθηκε επίσης σημαντική κύτταρα Th17 στον ιστό του όγκου του καρκίνου του τραχήλου, ακόμη υψηλότερο από ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Tregs) στο ίδιο περιβάλλον (Σχ. 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα συλλογικά υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα Th17 είναι εντόνως εμπλουτισμένα σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, ιδιαίτερα σε ιστό όγκου.

κύτταρα Th17 ήταν περιφραγμένη από CD3

+ Τ κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. (Α) Αντιπροσωπευτική IL-17 προφίλ έκφρασης σε CD4

+ Τ κύτταρα από τα τέσσερα που μελετήθηκαν ομάδες. Τα ποσοστά αντιπροσωπεύουν την συχνότητα των κυττάρων CD4 Th17 μεταξύ

+ Τ κύτταρα. (Β) Η στατιστική ανάλυση δείχνουν ότι η συχνότητα των κυττάρων Th17 ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, ιδίως μεταξύ των ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα (n = 35). **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001. (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες για κύτταρα Th17 (IL-17

+) και Tregs (FoxP3

+) διείσδυση σε τραχηλικό ιστό καρκίνου από τον ίδιο ασθενή. Ανοσοχρωματίστηκε κύτταρα (καφέ, που υποδεικνύεται από το μαύρο βέλος) και καρκινικά κύτταρα (μπλε). Μεγέθυνσης, × 100.

Η

Επιπλέον, η επικράτηση των κυττάρων Th17 ήταν υψηλότερη σε προχωρημένο στάδιο όγκους από ότι σε όγκους πρώιμο στάδιο (8,12 ± 1,31% σε ΦΥΓΩ Ι έναντι 14,18 ± 2,78% σε ΦΥΓΩ II έναντι 15,50 ± 1,73 σε FIGO III? Εικ. 2). Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στον επιπολασμό των κυττάρων Th17 για την ηλικία, την κατάσταση του HPV, το μέγεθος του όγκου, το βάθος της διείσδυσης, την κατάσταση των λεμφαδένων, λέμφο-αγγειακό χώρο εισβολής και της διαφοροποίησης του όγκου (Εικ. 2).

Η

Σύγκριση της συχνότητας των ογκο-διηθητικά κύτταρα Th17 σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας σε διαφορετικά ηλικία, την κατάσταση του HPV, το μέγεθος του όγκου, το στάδιο της νόσου, το βάθος διείσδυσης, το καθεστώς λεμφαδένων, λέμφο-αγγειακό χώρο εισβολής (Lvsi) και τη διαφοροποίηση του όγκου. Η στατιστική ανάλυση έδειξε την συχνότητα των κυττάρων Th17 σε ιστούς όγκων αυξήθηκε από ΦΥΓΩ Ι έως III ΦΥΓΩ, αλλά δεν συνδέονται με τις άλλες κλινικές παραμέτρους. *

P

& lt? 0.05.

φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του ογκο-διηθητικά κύτταρα Th17

Στη συνέχεια αναλύσαμε την έκφραση των δεικτών που σχετίζονται με την λειτουργία ενεργοποίησης /τελεστή (Οϋ45ΚΟ και HLA-DR) και ανοσοκαταστολή (γράνζυμο Β και PD -1). Διηθούν όγκο κυττάρων Th17 εξέφρασαν υψηλά CD45RO, HLA-DR, αλλά χαμηλή γράνζυμο Β και PD-1 (Σχ. 3Α). Granzyme Β-εξαρτώμενη κυτταρόλυσης [20] και Β7-Η1 /PD-1 μονοπάτι [21] συμβάλλουν στην ανοσολογική καταστολή στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι διηθούν όγκο κυττάρων Th17 εμφάνισαν μια ενεργοποιημένη φαινότυπο μνήμης (CD45RO

+ HLA-DR

+), αλλά δεν μπορεί να μεσολαβήσει λειτουργία τελεστή μέσω του γρανζύμου Β ή Β7-Η1 PD-1 μονοπάτι /(Granzyme Β

– /PD-1

-.)

(Α) Εκπρόσωπος προφίλ έκφρασης των Οϋ45ΚΟ, HLA-DR, Granzyme Β και PD-1 σε ογκο-διηθητικά κύτταρα Th17. Τα ποσοστά αντιπροσωπεύουν τις συχνότητες των διαφόρων δεικτών στα κύτταρα Th17. (Β) Εκπρόσωπος προφίλ έκφρασης του CCR4, CCR6 και CD49d σε κύτταρα Th17 από το περιφερικό αίμα (μακρά διακεκομμένη γραμμή), μη-όγκου (διακεκομμένη γραμμή) και ιστούς όγκων (συνεχής γραμμή). Τα ποσοστά αντιπροσωπεύουν τις συχνότητες των διαφόρων δεικτών σε ογκο-διηθητικά κύτταρα Th17. (Γ) Στατιστική ανάλυση επιφανειακή έκφραση του CCR4, CCR6, CD49d σε κύτταρα Th17 από περιφερικό αίμα, μη-όγκου και καρκινικών ιστών (n = 25). *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001.

Η

μετανάστευση λεμφοκυττάρων λαμβάνει χώρα μέσω μιας διαδικασίας πολλών σταδίων, όπου σηματοδότηση υποδοχέα χημειοκίνης /χημειοκίνης είναι ένα ουσιαστικό γεγονός, ακολουθούμενη από διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη προσκόλλησης στα τοιχώματα του αγγείου [13]. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε περαιτέρω τις επιφανειακές εκφράσεις των υποδοχέων χημειοκινών (CCR2, CCR4 και CCR6) και ιντεγκρίνες (CD49d, CD11a και CD103) σε κύτταρα Th17. Διηθούν όγκο κυττάρων Th17 εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του CCR4 (cPBMC: 38,83 ± 3,90%, μηδέν: 42,76 ± 2,84%, TIL: 57,61 ± 2,99%?

P

& lt? 0.001 και & lt? 0,01 για TIL vs. cPBMC και εναντίον ΜΗΔΕΝ, αντίστοιχα), CCR6 (cPBMC: 22,17 ± 2,04%, ΜΗΔΕΝ: 42,89 ± 3,23%, ΤΗΛ: 72,97 ± 2,45%?

P

& lt? 0,001 για ΤΙΤ εναντίον cPBMC και εναντίον NIL), και CD49d (cPBMC: 63.13 ± 3.74%, ΜΗΔΕΝ: 56.59 ± 3.10%, ΤΗΛ: 74,24 ± 2,69%?

P

& lt? 0.05 και & lt? 0,001 για ΤΙΤ εναντίον cPBMC και εναντίον ΜΗΔΕΝ , αντίστοιχα) (Εικ. 3Β και 3C), αλλά όχι CCR2, CD103, και CD11a (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι εξέφρασαν μόρια παλιννόστησης μπορεί να σχετίζεται με τη μετανάστευση Th17 κυττάρων και κατοχής εντός του όγκου [22].

Σύλλογοι των επιπέδων των χημειοκινών με ενδοογκική κύτταρα Th17

Επειδή τα κύτταρα Th17 εκφράζεται έντονα CCR6 και CCR4, εμείς υπέθεσαν ότι τα κύτταρα Th17 θα μπορούσε να μεταναστεύουν σε απάντηση CCL20, CCL22 και CCL17. Έχουμε καθορίζεται η έκφραση του CCL20, CCL22 και CCL17 με πραγματικού χρόνου PCR. Βρήκαμε σημαντικά υψηλότερη έκφραση του mRNA του CCL20 στους ιστούς όγκου σε σύγκριση με μη καρκινικούς ιστούς και φυσιολογικούς ιστούς ελέγχου (

P

& lt?. 0.01, Σχήμα 4Α). Περαιτέρω, παρατηρήθηκε έντονα θετική συσχέτιση μεταξύ της επικράτησης των κυττάρων Th17 και ενδονεοπλαστική έκφραση του CCL20 (R = 0.795,

P

& lt? 0,001? Εικ. 4C). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι CCL20 είναι ένα σημαντικό μήνυμα για να μεσολαβήσει στην διακίνηση των κυττάρων Th17 σε όγκους. Αντιθέτως, δεν είχαμε βρέθηκε αυξημένη έκφραση του CCL17 και CCL20, τα δύο ειδικά προσδέματα του CCR4, στον ιστό του όγκου (Σχ. 4Α). Περαιτέρω, η ανάλυση παλινδρόμησης διαπιστώθηκε μόνο ασθενή συσχέτιση των κυττάρων Th17 με CCL22 (R = 0.385,

P

& lt? 0,05? Εικ. 4D), αλλά όχι με CCL17 (

P

& gt? 0,05, Εικ. 4Β), με τον ίδιο μικροπεριβάλλον του όγκου. Τα αποτελέσματα συλλογικά δείχνουν ότι CCR4-CCL17 /άξονα CCL22 μπορεί να μην είναι κυρίως υπεύθυνη για τη μετανάστευση Th17 κυττάρων.

(Α) σε πραγματικό χρόνο PCR των χημειοκινών CCL17, CCL20 και CCL22 στη όγκου (Τ) και μη όγκου (ηΤ) περιοχές των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και σε φυσιολογικό έλεγχο (NC). Η αξία ομαλοποιήθηκε σε GAPDH, πολλαπλασιαζόμενο επί 10

5 και συνδεθείτε μεταμορφωθεί. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01. (B, C, D) Συσχετισμοί του χημειοκίνης CCL17 (Β), CCL20 (C) και CCL22 (Δ) με συχνότητα που διηθούν όγκο κυττάρων Th17. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ισχυρή συσχέτιση των CCL20 με κύτταρα Th17 στον όγκο.

Η

επιπτώσεις χημειοκινών στην Th17 πρόσληψη κυτταρικών

Σημαντικές χημειοτακτική απαντήσεις των κυκλοφορούντων κυττάρων Th17 με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη CCL20 παρατηρήθηκαν σε δόση εξαρτώμενης τρόπο (Εικ. 5Α). Περαιτέρω, ένα εξουδετερωτικό μονοκλωνικό αντίσωμα προς CCL20 είχε σημαντικά μπλοκάρει CCL20 επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων Th17 (

P

& lt?. 0,001, Σχήμα 5Α). Αν και CCL17 και CCL22 μπορεί επίσης να επάγει μετανάστευση κυττάρων Th17, το αποτέλεσμά τους ήταν σημαντικά ασθενέστερη από CCL20 έκαναν (δείκτης μετανάστευσης σε συγκέντρωση 100 ng /ml: CCL20, 45,5 ± 10,6 έναντι CCL17, 19,1 ± 6,5 και εναντίον CCL22, 26,1 ± 7.9, τόσο

P

& lt? 0.001? Εικ. 5Α). Να καθορίσει περαιτέρω εάν χημειοκινών όγκου εκκρίνεται είχε επίδραση στην πρόσληψη των κυττάρων Th17, χημειοταξίας δοκιμασία χρησιμοποιώντας υπερκείμενα καλλιεργειών από καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές εκτελέστηκε. Τα κύτταρα HeLa είναι HPV-18 μολυσμένα κύτταρα του τραχήλου, SiHa κύτταρα είναι HPV-16 μολυσμένα κύτταρα του τραχήλου, και τα κύτταρα C-33Α είναι HPV του τραχήλου της μήτρας αρνητικά καρκινικά κύτταρα. Όλα τα τρία κύτταρα του τραχήλου μπορούσε υψηλά εκκρίνουν CCL20 με υψηλότερο επίπεδο CCL20 από κύτταρα HeLa (Σχ. 5Β και 5C), και επαγόμενη από σημαντική μετανάστευση των κυττάρων Th17 (Εικ. 5D). Αυτό μπορεί να αποκλειστεί αποτελεσματικά με αντίσωμα έναντι μόνο του ή σε συνδυασμό με CCL17 και CCL22 CCL20 (

P

& lt? 0.001), αλλά σημαντικά λιγότερο αποτελεσματικά από αντίσωμα έναντι CCL17 ή CCL22 (Σχήμα 5Β).. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι συλλογικά CCL20 μπορεί να επάγει αποτελεσματική μετανάστευση κυττάρων Th17 σε ιστούς όγκων.

δοκιμασίες μετανάστευσης διεξήχθησαν σε ένα σύστημα Transwell. κύτταρα (Α) Th17 μεταναστεύουν σε απόκριση σε ανασυνδυασμένη ανθρώπινη CCL17, CCL20 και CCL22 σε δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (n = 5). Ειδικά αντισώματα για να χημειοκινών αναστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων Th17 ***

P

& lt.? 0.001. (Β και C) Έκφραση CCL20 από HeLa, Siha και κύτταρα C-33Α ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας πραγματικό χρόνο PRC (Β) και ELISA (C). Όλα τα τρία κύτταρα του τραχήλου μπορούσε πολύ εκκρίνουν CCL20 με υψηλότερο επίπεδο CCL20 από τα κύτταρα HeLa. κύτταρα (D) Th17 μεταναστεύουν επίσης προς υπερκείμενα καλλιέργειας των HeLa, Siha και κύτταρα C-33Α, η οποία μπορεί να μπλοκαριστεί αποτελεσματικά με αντίσωμα έναντι CCL20 μόνο του ή σε συνδυασμό με CCL17 και CCL22, αλλά σημαντικά λιγότερο αποτελεσματικά από αντίσωμα έναντι CCL17 ή CCL22 ( n = 3). *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001.

Η

Συζήτηση

Όπως αναφέρεται σε άλλους συμπαγείς όγκους [8, 10, 11, 19, 23-25], η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η ουσιαστική κύτταρα Th17, παρουσιάζοντας ενεργοποιημένο φαινότυπο μνήμης, είναι συγκεντρωμένα στο εσωτερικό του τραχήλου της μήτρας καρκινικό ιστό. Ωστόσο, ο ρόλος των κυττάρων Th17 στην ασυλία του καρκίνου παραμένει συγκεχυμένη. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι αν και ασθενείς με καρκίνο παρουσιάζουν μια γενικευμένη ανοσοκατασταλτική κατάσταση, η φλεγμονώδης αντίδραση στο σημείο του όγκου μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Η διαιώνιση της χρόνιας φλεγμονής επιτυγχάνεται σε μεγάλο βαθμό μέσω των θετικών βρόχοι ανάδρασης, τα οποία περιλαμβάνουν φλεγμονώδη κύτταρα που παράγουν κυτοκίνες που επάγουν την σύνθεση των χημειοκινών σε κακοήθη και στρωματικά κύτταρα που οδηγούν σε παρατεταμένη στρατολόγηση των φλεγμονωδών κυττάρων στο μικροπεριβάλλον του όγκου [26]. κύτταρα Th17 αποτελούν ένα από τα πιο κρίσιμα ανοσοκυττάρων υποσύνολα από την άποψη αυτή και έτσι έχουν καρκινογόνο δράση. Σε ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, ορθοκολικό καρκίνο ή καρκίνωμα του οισοφάγου, τα υψηλά επίπεδα του εντός του όγκου των κυττάρων Th17 βρέθηκε να σχετίζεται θετικά με φτωχή πρόγνωση [8, 24, 27]. Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα Th17 μερικές φορές μπορούν να παρέχουν σημαντική βοήθεια για την ενίσχυση κυτοτοξική ανοσία και έτσι ασκούν όγκο κατασταλτικά αποτελέσματα [28, 29]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η υψηλή εντός του όγκου κύτταρα Th17 προβλέψει μείωση των τοπικών υποτροπών σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [12], σύμφωνα με τις προηγούμενες εκθέσεις στον καρκίνο των ωοθηκών [25] και το μελάνωμα [30].

Οι πηγές της Th17 κύτταρα του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς μπορεί να περιλαμβάνουν τη διακίνηση των κυκλοφορούντων κυττάρων Th17 σε όγκους και σε τοπικό επίπεδο που προκαλείται από κύτταρα Th17. Η μετανάστευση των κυττάρων Τ ρυθμίζεται αυστηρά από την αλληλεπίδραση του υποδοχέα της χημοκίνης /χημοκίνης [31]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η πρόσληψη των κυττάρων Th17 διέπεται από πολλαπλές οδούς, συμπεριλαμβανομένων CCR2-CCL2, CCR4-CCL17 /CCL22 και CCL20 CCR6-[15, 16, 19, 32]. Στο πλαίσιο αυτό, βρήκαμε ότι η διακίνηση των κυκλοφορούντων κυττάρων Th17 στον ιστό των όγκων του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ήταν κατά προτίμηση μέσω της οδού CCR6-CCL20. Το συμπέρασμα αυτό βασίζεται σε δύο διαπιστώσεις. Πρώτον, CCL20 είχε αξιοσημείωτα αυξημένα έκφραση σε ιστό όγκου και συσχετίζεται ισχυρά με τον επιπολασμό των κυττάρων Th17 στο ίδιο μικροπεριβάλλον. Δεύτερον, η κυκλοφορούσα Th17 από ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας υψηλής έκφρασης CCR6, και επιλεκτικά μεταναστεύουν σε απόκριση σε CCL20 in vitro. Στο παρελθόν, CCR6 ήταν κυρίως ενοχοποιηθεί να είναι υπεύθυνη για την φλεγμονώδη στρατολόγηση των κυττάρων Th17. Fox παράδειγμα, CCR6 είναι απαραίτητη για τη βέλτιστη πρόσληψη κυττάρων Th17 σε θέσεις Th17 μεσολάβηση φλεγμονής σε πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (ΕΑΕ) [7]. Ωστόσο, συσσωρεύοντας πρόσφατα ευρήματα δείχνουν ότι η CCR6 σε κύτταρα Th17 παίζει επίσης έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου [8, 24]. Είναι κοινά αποδεκτό ότι η επίδραση των κυττάρων του ανοσοποιητικού στην ανάπτυξη του όγκου προσδιορίζεται όχι μόνο από τους προ- ή αντι-δυναμικού, αλλά επίσης σκόπιμο εντοπισμός [33]. Όλα αυτά τα αποτελέσματα, μαζί με τα δεδομένα μας, δείχνουν Th17 κύτταρο-εκφράζεται CCR6 είναι λειτουργικό και να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Εκτός αυτού, αν CCR4 μπορεί επίσης να σχετίζονται με Th17 κυττάρων-μετανάστευση, η επίδραση είναι πολύ ασθενέστερη από ό, τι CCR6 σύμφωνα με λιγότερη έκφραση του CCR4, χαμηλότερα εντός του όγκου επίπεδα CCL17 και CCL22, και ασθενέστερη απαντήσεις chemotacitc να CCL17 και CCL22.

Εν κατακλείδι, δείξαμε εδώ ότι η οδός CCR6-CCL20 είναι προνομιακή χημειοελκτικό για τη διακίνηση των κυκλοφορούντων κυττάρων Th17 στον ιστό των όγκων του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Τα αποτελέσματα επεκτείνει την κατανόησή μας για τον μηχανισμό του τραχήλου της μήτρας καρκινογένεσης, και να παρέχει μια πιθανή στρατηγική για την αντιμετώπιση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. Ασθενείς Χαρακτηριστικά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120855.s001

(DOC)