Αφηρημένο

Ιστορικό

Dipeptidyl-πεπτιδάσης IV (EC 3.4.14.5) (DPPIV) είναι ένα πεπτιδάσης σερίνη που εμπλέκονται στην κυτταρική διαφοροποίηση, προσκόλληση, ανοσορύθμιση και την απόπτωση, τις λειτουργίες που ελέγχουν νεοπλασματικό μετασχηματισμό. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει αλλαγμένη έκφραση και τη δραστηριότητα των ιστών και κυκλοφορία DPPIV σε αρκετούς καρκίνους και προτείνει πιθανή χρησιμότητα της για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του πρωκτού (CRC).

Μέθοδοι και κύρια ευρήματα

Η δραστικότητα και mRNA και πρωτεΐνη έκφραση της DPPIV προοπτικά αναλύθηκε σε αδενοκαρκινώματα, αδενώματα, μη εμπλεκόμενο παχέος βλεννογόνο και πλάσμα από 116 ασθενείς με CRC φθορομετρική, ποσοτική RT-PCR και ανοσοϊστοχημικές μεθόδους. Τα αποτελέσματα συσχετίστηκαν με τα σημαντικότερα κλασικά παθολογικά στοιχεία που σχετίζονται με την επιθετικότητα και τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι: 1) τα επίπεδα mRNA και της δραστηριότητας της DPPIV αυξήθηκε σε ορθοκολικό νεοπλάσματα (δοκιμή Kruskal-Wallis, ρ & lt? 0,01)? 2) Και τα δύο αδενωμάτων και CRCs εμφανίζεται θετική κυτταροπλασματική ανοσοχρώση με την ενίσχυση του αυλού μεμβράνη? 3) δραστηριότητα πλασματική DPPIV ήταν χαμηλότερη σε ασθενείς CRC σε σύγκριση με υγιή άτομα (Mann-U test, ρ & lt? 0,01)? 4) πλασματικών δραστηριότητα DPPIV σχετίστηκε με χειρότερη συνολική και ελεύθερη νόσου επιβίωση (log-rank p & lt? 0.01, Cox ανάλυση p & lt?. 0.01)

Συμπέρασμα /σημασία

1) Up-ρύθμιση του DPPIV σε όγκους παχέος εντέρου υποδηλώνει ένα ρόλο για το ένζυμο αυτό στη νεοπλαστικό μετασχηματισμό του ορθοκολικού ιστών. Αυτό το εύρημα ανοίγει τη δυνατότητα νέων θεραπευτικών στόχων σε αυτούς τους ασθενείς. 2) στο πλάσμα DPPIV είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την επιβίωση των ασθενών με CRC. Ο προσδιορισμός των επιπέδων ενεργότητας της DPPIV στο πλάσμα μπορεί να είναι μια ασφαλής, ελάχιστα επεμβατική και ανέξοδος τρόπος για να ορίσουμε την επιθετικότητα του CRC στην καθημερινή πρακτική

Παράθεση:. Larrinaga G, Perez Ι, Sanz Β, Μπεϊτία Μ, Errarte Ρ, Fernández A, et al. (2015) διπεπτιδυλικής πεπτιδάσης IV δραστηριότητα συσχετίζεται με καρκίνο του παχέος εντέρου πρόγνωση. PLoS ONE 10 (3): e0119436. doi: 10.1371 /journal.pone.0119436

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 7 Σεπτέμβρη 2014? Αποδεκτές: 14 του Γενάρη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 19, Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Larrinaga et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την κυβέρνηση της χώρας των Βάσκων (IT8-11 /13), το Πανεπιστήμιο της χώρας των Βάσκων UPV /EHU (UFI 11/44), και η Gangoiti Ίδρυμα Barrera. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

CRC είναι η τρίτη συχνότερη κακοήθεια στους άνδρες και τις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες, με περισσότερους από 136.500 εκτιμάται νέες περιπτώσεις και πάνω από 50.000 εκτιμάται θανάτους το 2014 [1]. Ευρώπη και άλλες αναπτυγμένες περιοχές δείχνουν παρόμοια ποσοστά εμφάνισης και θνησιμότητας [2]. Παραδοσιακά που σχετίζονται με τις διατροφικές συνήθειες [3], η συχνότητά του έχει αυξηθεί σταθερά τις τελευταίες δεκαετίες στις δυτικές χώρες, ως αποτέλεσμα του σύγχρονου στυλ της ζωής για να γίνει ένα πρόβλημα υγείας μείζονος ανησυχίας. Οι τεράστιοι πόροι που επενδύονται στην πρόληψη και την έγκαιρη διάγνωση της ασθένειας αυτής. εκστρατείες προσυμπτωματικού ελέγχου βάσει πληθυσμού προσπαθούν να ανακαλύψουν όσο νωρίς όγκους και προκαρκινικές βλάβες όσο το δυνατόν, με στόχο να μειωθεί η συχνότητα εμφάνισης της νόσου, να απλοποιηθεί η κλινική διαχείριση των ασθενών όταν η βλάβη αναπτύσσεται, και για τη βελτίωση της επιβίωσης.

από παθολογική άποψη, αδενωματωδών βλάβες στο παχύ έντερο είναι πλήρως αποδεκτές πρόδρομες ουσίες του CRC [4,5] και η αλληλουχία αδένωμα-καρκίνωμα εξακολουθεί να παρέχει μια σταθερή μοντέλο για την έρευνα σχετικά με την καρκινογένεση [6]. Ωστόσο, ένας μεγάλος αριθμός των κυτταρικών μεταβολικών διεργασιών ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστη εμπλέκονται στην προέλευση και την ανάπτυξη των νεοπλασματικών διεργασιών [7].

πεπτιδάσες διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην καρκινογένεση με διάφορους τρόπους, για παράδειγμα τη ρύθμιση βιοδραστικά πεπτίδια που είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη και την νεοπλασματική ανοσοαπόκριση, υποβαθμίζοντας την εξωκυτταρική μήτρα, που ενεργεί ως μόρια προσκόλλησης ή συμμετέχουν σε ενδοκυτταρική σηματοδότηση [8]. Εκτός αυτού, μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι η δραστηριότητα και η έκφραση αυτών των ενζύμων ποικίλουν σε διαφορετικούς όγκους, ανάλογα με τις διάφορες παθολογικές ιστολογικές παραμέτρους όπως Grade, Stage, και την επιβίωση των ασθενών [8-12]. Για το λόγο αυτό, πεπτιδάσες είναι χρήσιμα εργαλεία για την ανάπτυξη των κλινικών στρατηγικών για τη θεραπεία και την παρακολούθηση των ασθενών με καρκίνο.

Dipeptidyl-πεπτιδάσης IV (EC 3.4.14.5) (DPPIV), γνωστή επίσης και ως CD26 αντιγόνο διαφοροποίησης συμπλέγματος , είναι μια πεπτιδάσης σερίνη εκφράζεται σε μία ποικιλία κυττάρων συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών, ενδοθηλιακών και των λεμφοκυττάρων [13]. Όπως και άλλες γλυκοπρωτεΐνες είναι δεσμευμένη σε μεμβράνη, μπορεί επίσης να κυκλοφορήσει σε δραστική μορφή σε σωματικά υγρά όπως το πλάσμα, ορό και στα ούρα [14]. διασπά DPPIV Ν-τερματικά διπεπτίδια από επιλεγμένα βιοενεργά πεπτίδια συμπεριλαμβανομένων και ορισμένων κυτοκινών, χημειοκινών και νευροπεπτίδια, που οδηγεί σε αδρανοποίηση ή /και την υποβάθμιση τους. Ανεξάρτητα από την ενζυμική της δράση, DPPIV αλληλεπιδρά με συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) συμπεριλαμβανομένου του κολλαγόνου και ινονεκτίνης, ρυθμίζοντας έτσι κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-ECM αλληλεπιδράσεις, και με αρκετούς υποδοχείς και πρωτεάσες που οδηγεί στην έκκριση μεταλλοπρωτεασών μήτρας (MMPs). Μέσα από αυτές τις πολλαπλές λειτουργίες, DPPIV ρυθμίζει ποικίλες βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης των κυττάρων, πρόσφυση, ανοσορύθμιση και την απόπτωση, τις λειτουργίες που ελέγχουν νεοπλασματικό μετασχηματισμό [13].

Πολλές μελέτες έχουν περιγράψει ότι η έκφραση και η δραστικότητα DPPIV μεταβάλλεται σημαντικά σε αρκετούς ιστούς στερεού όγκου και ότι οι αλλαγές αυτές συνδέονται με το βαθμό του όγκου, το στάδιο και οι ασθενείς 5-ετή επιβίωση, τα οποία δείχνουν αυτού του ενζύμου ως πιθανό διαγνωστικό εργαλείο και θεραπευτικός στόχος [12,13,15]. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι τα επίπεδα της DPPIV στο αίμα είναι σημαντικά χαμηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο από ό, τι στα υγιή άτομα, ένα εύρημα που έχει γίνει μεγάλο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη συμπληρωματικών δεικτών όγκου [14,16-19].

Αναφορικά με CRC, δύο πρόσφατες μελέτες που περιγράφονται ότι τα υψηλότερα ανοσοϊστοχημική έκφραση της DPPIV σε ιστούς CRC συσχετίζεται με μεταστάσεις και χειρότερα συνολική επιβίωση των ασθενών CRC [20] και ότι τα κυκλοφορούντα επίπεδα DPPIV συσχετίζεται με απομακρυσμένη υποτροπή του CRC [21]. Έχουμε και άλλες ομάδες που περιγράφονται, επίσης, ότι η έκφραση και η δραστηριότητα προφίλ των άλλων πεπτιδασών σερίνης που σχετίζονται με την DPPIV να διαφέρει σε όλη την ακολουθία αδένωμα-αδενοκαρκίνωμα και που είναι ανεξάρτητα συσχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών με CRC [22-26]. Όλες αυτές οι συσσωρευμένες αποδείξεις δείχνουν τις αναλύσεις των πεπτιδασών σερίνης, όπως η DPPIV ως πολλά υποσχόμενη εργαλεία στο σχεδιασμό νέων διαγνωστικών /προγνωστικών βιοδεικτών και θεραπευτικών στόχων στο CRC [14,20-26].

Σε αυτό το πλαίσιο, η στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να σπουδάσουν σε ένα μελλοντικό τρόπο τα προφίλ του μεταβολισμού και της έκφρασης της DPPIV σε ασθενείς με CRC ανάλυση των ιστών από τα δείγματα ακολουθία αδένωμα-αδενοκαρκινώματος και πλάσματος, και να συσχετίσει τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με την κλασική ιστοπαθολογικές παραμέτρους για την πρόγνωση των όγκων και της επιβίωσης .

Υλικά & amp? Μέθοδοι

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι όλα τα πειράματα που πραγματοποιούνται σε αυτή τη μελέτη συμμορφώνονται με την ισχύουσα ισπανική και της Ευρωπαϊκής Ένωσης νομικούς κανονισμούς. Τα δείγματα και τα δεδομένα από ασθενείς που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη δόθηκαν από την Βιοτράπεζα Βάσκων Έρευνας-OEHUN (www.biobancovasco.org). Όλοι οι ασθενείς είχαν ενημερωθεί για την πιθανή χρήση για την έρευνα των χειρουργικά ιστούς τους, και έγινε αποδεκτή αυτό το ενδεχόμενο με την υπογραφή ενός ειδικού εγγράφου που εγκρίθηκε από τις ηθικές και επιστημονικές επιτροπές της Χώρας των Βάσκων Συστήματος Δημόσιας Υγείας (Osakidetza) (CEIC 11/51).

ασθενείς

Ένα σύνολο 116 ασθενών με CRC προοπτικά συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν μερική κολεκτομές. Η τοπογραφική κατανομή ήταν 41 δεξιάς ΚΕΣ 51 αριστερής και 24 από το ορθό. 7 ασθενείς έλαβαν προεγχειρητική θεραπεία, 49 ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ή χημειο-ακτινοθεραπεία μετά την εκτομή, και 60 ασθενείς δεν λαμβάνουν καμία θεραπεία.

Σε 20 ασθενείς, τόσο αδενωματώδεις πολύποδες και adenocarcinomatous διαγνώστηκαν. 13 αδενώματα ήταν σωληνοειδή, 6 ήταν tubulovillous αδενώματα, και 1 λαχνών αδένωμα. Επιπλέον, 16 εμφάνισαν ήπια έως μέτρια δυσπλασία και 4 έδειξαν υψηλού βαθμού δυσπλασία. Το μέσο μέγεθος ήταν 2,1 εκατοστών (με μια σειρά από 0.6-4cm). Αυτές οι 20 υποθέσεις που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση της ενεργότητας της DPPIV και mRNA έκφραση /πρωτεΐνης σε όλη την κανονική σειρά βλεννογόνο-αδένωμα-αδενοκαρκίνωμα.

Η αμερικανική μεικτής επιτροπής σχετικά με το σύστημα του Καρκίνου (AJCC, 7

η έκδοση) [27 ] έχει εφαρμοστεί για να εκχωρήσετε Stage και Grade. Παρακολούθηση έκλεισε στις 30 Ιουνίου, 2014. Εκείνη την εποχή, 43 ασθενείς (37%) είχαν πεθάνει από τη νόσο. Η μέση παρακολούθηση ήταν 53 μήνες (εύρος 4-88).

Το πλάσμα συλλέχθηκε επίσης προεγχειρητικά και αναλύονται σε 98 από αυτούς τους ασθενείς. Πλάσμα από 72 υγιείς εθελοντές χωρίς κλινικό ιστορικό των νεοπλασματικών ασθενειών χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα ελέγχου.

Κλινικά δεδομένα που περιλαμβάνονται στη μελέτη ανασύρθηκαν από τον ασθενή κλινικά αρχεία και συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

ιστών Δείγματα

Χειρουργική εκτομές υποβλήθηκαν

στο φρέσκο ​​

στο Εργαστήριο Παθολογίας σε διάστημα 30 λεπτών μετά την αφαίρεση. Το υλικό για τη μελέτη αυτή προέρχεται από την περίσσεια ιστού παθολογικών διάγνωση. Χειρισμός δειγμάτων εκτελέσθηκε ακολουθώντας συνηθισμένα πρωτόκολλα για τη διαχείριση των χειρουργικών εκτομές του παχέος εντέρου και του ορθού. [28] χαρακτηριστικά των όγκων αναγνωρίζεται με χονδρική εξέταση και επιλεγμένα θραύσματα όγκου και μη ιστούς όγκων καταψύχθηκαν σε ισοπεντάνιο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Διαδικασίες ρουτίνας στο Εργαστήριο Παθολογίας περιλαμβάνεται στερέωση με φορμαλίνη του χειρουργικού δείγματος και παραφίνη ενσωμάτωση των θραυσμάτων ιστού που επιλέγεται για ιστοπαθολογική εξέταση. Ιστολογικά σλάιντ βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη. Εκτός αυτού, περιφερικό φλεβικό δείγματα αίματος από 98 από αυτούς τους ασθενείς λήφθηκαν πριν από την χειρουργική επέμβαση και φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm κατά την διάρκεια 15 λεπτών. Το ληφθέν πλάσμα αποθηκεύεται επίσης στους -80 ° C. Enzyme δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σε πλάσμα που ελήφθη από 72 υγιείς εθελοντές (συνοδεύεται από φύλο και ηλικία).

Παρασκευή δείγματος

εκτεμνόμενα δείγματα όγκων ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό 10 mM Tris-HCl σε ρΗ 7.4, για 30 δευτερόλεπτα σε 800 rpm χρησιμοποιώντας ένα Heidolph PZR 50 Selecta ομογενοποιητή, και υπερφυγοκεντρήθηκε σε συσκευή Kontron Instruments centrikon Τ-2070 σε 100.000

g

για 35 λεπτά. Για να αποφευχθεί η μόλυνση με διαλυτά ένζυμα, τα προκύπτοντα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με εναιώρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα 10 mM Tris-HCl σε ρΗ 7,4. Οι σβώλοι κατόπιν ομογενοποιούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα 10 mM Tris-HCl σε ρΗ 7.4, και φυγοκεντρήθηκαν σε χαμηλή ταχύτητα (1500

ζ

) για 3 λεπτά για να καθαρίσει τα δείγματα. Τα υπερκείμενα που λαμβάνονται έτσι χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό δραστικότητας DPPIV και συγκεντρώσεις πρωτεΐνης. Όλα τα προαναφερθέντα στάδια διεξήχθησαν στους 4 ° C.

μετρήσεις δραστικότητας DPPIV

δραστικότητα DPP IV μετρήθηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας H-Gly-Pro-β-ναφθυλαμίδη ως υπόστρωμα, μετά από μια τροποποιημένη εκδοχή της μεθόδου Alponti et al. [29]. Ο προσδιορισμός βασίζεται επί του φθορισμού των προϊόντων που παράγονται από την υδρόλυση του υποστρώματος από το ένζυμο. Οι αντιδράσεις ξεκίνησαν με την προσθήκη 30-50 μι του δείγματος σε 1 mL από το κατάλληλο μίγμα επώασης (50 mM ρυθμιστικό Tris-HCl, ρΗ 7.4, και 0.2 mM αμινοακυλο-β-ναφθυλαμίδη). Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 37 ° C, 1 mL 0,1 Μ ρυθμιστικού διαλύματος οξικού νατρίου (ρΗ 4.2) προστέθηκε στο μίγμα για να τερματιστεί η αντίδραση. Η απελευθερωμένη προϊόντος προσδιορίστηκε με μέτρηση της έντασης φθορισμού με ένα Shimadzu RF-540 Spectrofluorophotometer (τα μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής ήταν 345 και 412 nm, αντίστοιχα). Κενά χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί ο φθορισμός υποβάθρου. Ο σχετικός φθορισμός μετατράπηκε σε picomoles του προϊόντος χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη κατασκευασμένη με αυξανόμενες συγκεντρώσεις β-ναφθυλαμίνης.

Για να βεβαιωθείτε ότι ο σχηματισμός του β-ναφθυλαμίνη (β-ΝΑ) οφείλεται στη δράση της DPPIV και δεν οφείλεται σε άλλα ένζυμα, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς αναστολής σε CRC ιστό και το πλάσμα με ειδικό αναστολέα του ενζύμου (διπροτίνης Α, 0.2 mM). Η απελευθέρωση του β-NA αναστάλθηκε κυρίως σε ορθοκολικό ιστούς (82%) και σε δείγματα πλάσματος (86%).

Protein συγκέντρωση μετρήθηκε εις τριπλούν με την μέθοδο Bradford [30], με τη χρήση BSA (1 mg /mL) ως το βαθμονομητή. Τα αποτελέσματα από τους ιστούς CRC και από δείγματα πλάσματος καταγράφηκαν ως μονάδες πεπτιδάσης ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης (UP /mg prot) και ανά λίτρο πλάσματος (UP /L), αντίστοιχα. Μία μονάδα δραστικότητας πεπτιδάσης (UP) είναι η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται ώστε να απελευθερώνεται μία pmol από β-ναφθυλαμίνη ανά λεπτό. Φθορισμογόνων δοκιμασίες ήταν γραμμική σε σχέση με το χρόνο υδρόλυσης και περιεκτικότητα πρωτεΐνης.

Ανοσοϊστοχημεία

φορμαλίνη σταθερών και εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό από 20 ΚΕΣ αδενωματώδεις πολύποδες και τα μη εμπλεκόμενο γύρω βλεννογόνο ανοσοχρωματίστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για την DPPIV /CD26 (Novus Biologicals ΝΒ 100 έως 59021, αντι-ανθρώπινο κουνελιού, που εργάζονται αραίωση 1: 250). Η διαδικασία ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε ακόλουθες μεθόδους ρουτίνας σε ένα αυτόματο ανοσοκηλιδωτή (Dako Autostainer Plus). Εν ολίγοις, η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση τα πλακίδια σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε απόλυτη μεθανόλη επί 10 λεπτά. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη σε κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα (10 mM, ρΗ = 6) για 15 λεπτά στους 100 ° C σε ένα φούρνο μικροκυμάτων. Το πρωτογενές αντίσωμα εφαρμόστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μια επακόλουθη αντίδραση διεξήχθη με δευτερογενή αντισώματα και βιοτίνη-ελεύθερο ένζυμο HRP επισημασμένο πολυμερές του συστήματος ανίχνευσης EnVision-Flex (Dako, Carpinteria, CA). Η μη ειδική IgG χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Μια θετική αντίδραση γίνεται ορατή με διάλυμα diaminobenzydine ακολούθησε αντίθετη χρώση με αιματοξυλίνη.

σε πραγματικό χρόνο ποσοτική RT-PCR ανάλυση

Η έκφραση του

DPP4

, το γονίδιο που κωδικοποιεί την DPPIV , αναλύθηκε σε ιστό από 20 ΚΕΣ αδενωματώδεις πολύποδες και τα αμέτοχη γύρω βλεννογόνο. Για να αποφευχθεί η υποβάθμιση, τμήματα ιστού βυθίστηκαν σε RNAlater αμέσως μετά την επέμβαση και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι να μεταποιηθούν. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από 20 mg του ιστού χρησιμοποιώντας TriReagent (Sigma, St. Louis, ΜΟ). Τα δείγματα του RNA στη συνέχεια επωάστηκαν με RNase-free DNase Ι και RNasin (Promega, Madison, WI) για να απομακρυνθεί το απομένον γονιδιωματικό DNA. Πρώτου κλώνου cDNA συνετέθη από 5 μg ολικού RNA από κάθε ανθρώπινο δείγμα χρησιμοποιώντας πρώτου κλώνου κιτ σύνθεσης cDNA (Roche, Mannheim, Germany). Τα προκύπτοντα δείγματα cDNA ενισχύθηκαν με PCR με ειδικά ζεύγη ολιγονουκλεοτιδικού εκκινητή σχεδιασμένο με το Primer λογισμικό ανάλυσης 3 και συντίθενται από την Sigma-Genosys (Cambridge, UK). Με βάση την προηγούμενη πειράματα σε ανθρώπινο καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [15], CRC [12] και άλλους ανθρώπινους ιστούς [31] που επιλέξαμε αφυδρογονάσης γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής (

GAPDH

), πολυμεράση (RNA) II (DNA- Σκηνοθεσία) πολυπεπτίδιο Α (

POLR2A

), φωσφοριβοσυλτρανσφεράση της υποξανθίνης-1 (

HPRT1

), β-ακτίνη (

ACTB

), ηλεκτρική αφυδρογονάση συγκρότημα, υπομονάδα Α (

SDHA

), ΤΑΤΑ πρωτεΐνης δέσμευσης κουτί (

TBP

) και πεπτιδυλπρολύλ ισομεράση Α (

PPIA

) ως ενδογενή γονίδια αναφοράς. Η αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν

DPP4

και οι επτά γονίδια καθαριότητας παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.

Η

Η έκφραση του

DPP4

και τα γονίδια καθαριότητας ήταν ποσοτικοποιείται σε όλες cDNAs με PCR πραγματικού χρόνου με χρήση της συσκευής ανίχνευσης σε πραγματικό χρόνο iCycler iQ (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). Πειράματα διεξήχθηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12,15,32]. Οι αραιώσεις του προτύπου cDNA παρασκευάστηκαν από κάθε ιστό και ενισχύθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας SensiFAST SYBR Mix (Bioline Ltd., London, UK). Τρεις αρνητικοί μάρτυρες (χωρίς μήτρα, χωρίς αντίστροφη μεταγραφάση και χωρίς RNA στην αντίδραση ανάστροφης μεταγραφάσης) επίσης συμπεριελήφθησαν σε κάθε πλάκα για την ανίχνευση οποιασδήποτε πιθανής μόλυνσης. Μετά από μία θερμή εκκίνηση (10 λεπτά στους 94 ° C), οι παράμετροι που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση PCR ήταν: 10 s στους 94 ° C, 20 s στους 60 ° C και 30 s στους 72 ° C, για 50 κύκλους

σε πραγματικό χρόνο δεδομένα PCR εκφράστηκαν ως πολλαπλάσια μεταβολή της έκφρασης γονιδίου-στόχου σε σχέση με την έκφραση του mRNA γεωμετρικού μέσου (gm) των γονιδίων housekeeping σε κάθε δείγμα, όπως περιγράφεται από Vandesompele et al. [33]. Το φορές αλλαγή στην έκφραση γονιδίου υπολογίστηκε από τον τύπο: 2

-ΔΔ C

T, όπου C

T είναι ο κύκλος ορίου, που υπολογίζεται από το λογισμικό iCycler, ΔΟ

T = (C

Ttarget γονίδιο-C

γονίδια Tg.m.reference) και ΔΔC

T = (ΔΟ

TTEST δείγμα-ΔΟ

Tcontrol δείγμα).

Τα δείγματα από τον ίδιο ασθενή μετρήθηκαν πάντα με τον ίδιο αναλυτικό γύρο να αποκλείσει μεταξύ διοικούμενο παραλλαγές. δεδομένα PCR που λαμβάνονται σε ένα από τα φυσιολογικά δείγματα CRC αυθαιρέτως επελέγησαν ως έλεγχος, και αυτό το δείγμα συμπεριλήφθηκε σε όλα τα πειράματα PCR για να διορθώσει για πιθανές Διακυμάνσεις.

Στατιστική ανάλυση

Kolmogorov-Smirnov και τεστ Shapiro-Wilk εφαρμόστηκαν σε δεδομένα που λαμβάνονται από δείγματα ιστού και πλάσματος, αντίστοιχα για να ξέρω αν οι αριθμοί που ακολουθείται ή όχι μια κανονική κατανομή. Με βάση αυτή την πληροφορία (ρ & lt? 0,05), δραστικότητα DPPIV στον ιστό και το πλάσμα αναλύθηκε με μη παραμετρικές ανιχνευτές: δοκιμές δοκιμή Mann-Whitney και Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των διαφορών μεταξύ δύο ή τρεις ομάδες, αντίστοιχα

Τέλος, Kaplan-Meier καμπύλες και δοκιμασία log-rank πραγματοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας της DPPIV και την επιβίωση 5 ετών, συγκρίνοντας ομάδες που έχουν δημιουργηθεί από τα σημεία αποκοπής βασίζεται σε δέκτη-λειτουργικό χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη. Ένα μοντέλο παλινδρόμησης Cox χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστούν οι ανεξάρτητες επιδράσεις των κλινικών και παθολογικών μεταβλητών και δραστικότητα DPPIV στην επιβίωση. SPSS® 21,0 λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση.

Αποτελέσματα

δραστηριότητας DPPIV και έκφραση σε παχέος ιστούς από CRC ασθενείς

Όταν η δραστηριότητα της DPPIV αναλύθηκε σε όλο τον ορθοκολικό adenoma- ακολουθία αδενοκαρκίνωμα, υψηλότερη δραστηριότητα βρέθηκε στο CRCs και αδενώματα από ό, τι στο διπλανό αμέτοχος βλεννογόνο (τεστ Kruskal-Wallis, p = 0,015).

DPP4

έκφραση του mRNA έδειξε ένα παρόμοιο μοτίβο, με υψηλότερα επίπεδα και στις δύο νεοπλάσματα σε σχέση με το μη καρκινικό ιστό (τεστ Kruskal-Wallis, p = 0,001). Αυτά τα αποτελέσματα που περιγράφονται στον Πίνακα 3.

Η

Όταν τα δεδομένα ταξινομήθηκαν ανάλογα με την τοπογραφική κατανομή του ΚΕΣ, δεν βρέθηκε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά (δοκιμασία Kruskal-Wallis, p = 0,965). δραστικότητα DPPIV ιστού ήταν επίσης παρόμοια μεταξύ των ασθενών που έλαβαν προεγχειρητική θεραπεία, μετεγχειρητική θεραπεία και ασθενείς που δεν έλαβαν καμία θεραπεία μετά την εκτομή (δοκιμή Kruskal-Wallis, ρ = 0.842).

Το Σχ. 1 δείχνει την ανοσοϊστοχημική έκφραση της DPPIV σε αδενοκαρκίνωμα του κόλου, αδένωμα και φυσιολογικό γειτονικό βλεννογόνο. Φυσιολογικού βλεννογόνου δεν εκφράζουν DPPIV ανοσοχρώση. Ωστόσο, και οι δύο αδενώματα (σωληνοειδή, tubulovillous και λαχνών) και CRCs εμφανίζεται θετική κυτταροπλασματική ανοσοχρώση με ενίσχυση της μεμβράνης του αυλού. Η φλεγμονώδης συστατικό σε όλες τις περιπτώσεις ήταν επίσης θετικές.

DPPIV ανοσοχρώση βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των αδενωμάτων και των κυττάρων που εμφανίζουν CRC ενίσχυση του αυλού της μεμβράνης.

Η

δραστικότητα DPPIV υγείας σύμφωνα με 5ετή επιβίωση και να παθολογικών χαρακτηριστικών

για να προσδιορίσετε τις καλύτερες τιμές αποκοπής για τη συνολική επιβίωση (OS) (Εικ. 2Α) και την ελεύθερη νόσου επιβίωση αναλύσεις (DFS) (Εικ. 2Β), καμπύλες ROC πραγματοποιήθηκαν. Για τη δραστηριότητα της DPPIV ιστού, 2600 UP σημείο /mg πρωτεΐνης cut-off έδειξε τις πιο βέλτιστη ευαισθησία και ειδικότητα αναλογίες (Se = 47% και Sp = 55% για το OS, και Se = 48% και Sp = 55% για DFS) (Εικ . 2Α και 2Β)

η βέλτιστη ευαισθησία και ειδικότητα αναλογίες παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας την ακόλουθη τιμή αποκοπής:.. 2600 UP /mg prot δραστηριότητας DPPIV ιστού για OS (Α) και DFS (Β)

Kaplan-Meier καμπύλες και δοκιμασία log-rank έδειξε ότι πέντε ετών OS και DFS των ασθενών με CRC δεν συσχετιζόταν με τη δραστηριότητα της DPPIV ιστού (test log-rank, p = 0.8 για το OS? και p = 0,67 για DFS) (Εικ. 3Α και 3Β, αντιστοίχως).

Η συνολική επιβίωση (Α) και καμπύλες ελεύθερη νόσου επιβίωση (Β) των ασθενών CRC σύμφωνα με το πρότυπο δραστηριότητας DPPIV όγκου τους. Ο αριθμός των ασθενών που διατρέχουν κίνδυνο σε κάθε ομάδα σε επιμέρους χρονικά σημεία περιλαμβάνεται επίσης.

Η

Επίσης, η διαστρωμάτωση της ενεργότητας της DPPIV από διάφορες παθολογικές μεταβλητές δεν ρίξει κανένα στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα (Πίνακας 4).

δραστηριότητα DPPIV σε δείγματα πλάσματος από CRC ασθενείς

στο πλάσμα από CRC δραστηριότητα DPPIV ασθενείς ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στα υγιή άτομα (175 ± 7.2 UP /L έναντι 218 ± 10.1 UP /L, Mann-Whitney test ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 4).. Ωστόσο, η διαστρωμάτωση των δεδομένων σύμφωνα με παθολογικές μεταβλητές δεν αποφέρει κανένα σημαντικό αποτέλεσμα (Πίνακας 5).

Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± SE των μονάδων πεπτιδάσης ανά λίτρο πλάσματος (UP /L). (*) Τεστ Τ του Student, ρ & lt?. 0.01

Η

Σε δείγματα πλάσματος καμπύλες ROC έγιναν τόσο για τη δραστηριότητα DPPIV και τα επίπεδα καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA). Για πλασματική δραστηριότητα DPPIV, 165 UP /L τιμή αποκοπής έδειξε τις πιο βέλτιστη ευαισθησία και ειδικότητα αναλογίες (SE = 64% και Sp = 63% για το OS, και Se = 65% και Sp = 58% για το DFS) (Εικ. 5Α και 5Β). Μία τιμή αποκοπής του 5 ng /mL για CEA, η οποία είναι γνωστό ότι έχουν προγνωστική αντίκτυπο CRC [34], έδειξε χαμηλότερη ευαισθησία (44% για το OS, και 39% για το DFS), αλλά μεγαλύτερη ειδικότητα (68% για το OS και 64% για DFS) από DPPIV (Σχήμα 5Α και 5Β)

Βέλτιστη ευαισθησία και ειδικότητα αναλογίες παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας την ακόλουθη τιμή αποκοπής:.. 165 UP /L για το πλασματικό δραστικότητα DPPIV τόσο για το OS ( Α) και DFS (Β). Μια τιμή αποκοπής 5 ng /mL για CEA, έδειξαν χαμηλότερη ευαισθησία αλλά μεγαλύτερη ειδικότητα από την DPPIV.

Η

Kaplan-Meier καμπύλες και δοκιμασία log-rank έδειξε ότι τόσο OS (Εικ. 6) και DFS (Εικ. 7) συσχετίζονταν αντίστροφα με πλασματικών δραστικότητα DPPIV. Έτσι, όταν πλασματικών δραστηριότητα DPPIV ήταν υψηλότερη από 165 UP /L το λειτουργικό σύστημα και DFS ήταν σημαντικά χειρότερο (log-rank p = 0,009 και = 0,018, αντίστοιχα) (Εικ. 6Α και 7Α).

(Α) καμπύλη Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank. (Β) Ανάλυση Πολυμεταβλητών της κλινικοπαθολογική μεταβλητών και πλασματική δραστηριότητα DPPIV στην πρόβλεψη OS. Ο αριθμός των ασθενών που διατρέχουν κίνδυνο σε κάθε ομάδα σε επιμέρους χρονικά σημεία περιλαμβάνεται επίσης.

Η

(Α) Καμπύλη Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank. (Β) Ανάλυση Πολυμεταβλητών της κλινικοπαθολογική μεταβλητών και πλασματική δραστηριότητα DPPIV στην πρόβλεψη DFS. Ο αριθμός των ασθενών που διατρέχουν κίνδυνο σε κάθε ομάδα σε μεμονωμένα χρονικά σημεία περιλαμβάνεται επίσης.

Η

Από την άλλη πλευρά, πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι πλασματική δραστικότητα DPPIV (p = 0,001), ιστολογικές Βαθμός (p = 0.02 ) και των τοπικών εισβολή (p = 0.01) ήταν ανεξάρτητοι παράγοντες που επηρεάζουν OS ασθενή (Σχ. 6Β), και ότι η δραστηριότητα πλασματική DPPIV (p = 0,005), αγγειακή εισβολή (p = 0.02) και ομαδοποιούνται στάδιο (p = 0.02) ήταν ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντες της DFS (Εικ. 7Β).

Συζήτηση

κακοήθη μετασχηματισμό από το φυσιολογικό να καρκινικού ιστού σχετίζεται με τροποποιήσεις γλυκοπρωτεΐνη επιφανείας κυττάρου. Αυτές οι φαινοτυπικές αλλαγές μπορεί να παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση και μπορούν να είναι χρήσιμοι δείκτες όγκου σε διακριτικό κακοήθεις από καλοήθεις ιστούς [8]. Όσον αφορά την CRC, η αλληλουχία αδένωμα-καρκίνωμα στο παχύ έντερο περιγράφει ότι η σταδιακή εξέλιξη από φυσιολογικό να δυσπλαστικό επιθήλιο, και ως εκ τούτου να καρκίνωμα, είναι το αποτέλεσμα των διαδοχικών συσσώρευση των γενετικών μεταλλάξεων που οδηγούν σε αλλαγμένη επίπεδα αρκετών γλυκοπρωτεΐνες, όπως και μερικά πεπτιδάσες [6,8].

το πρώτο σχετικό αποτέλεσμα στη μελέτη μας ήταν ότι DPPIV έδειξαν υψηλότερη δραστηριότητα και τα επίπεδα mRNA σε προνεοπλασματικών αδενωματώδεις βλάβες και CRC σε σύγκριση με το αμέτοχος περιβάλλοντα βλεννογόνο, αν και δεν σχετίζεται με την παθολογική μεταβλητές και με 5-ετή επιβίωση των ασθενών CRC. Προηγουμένως, είχε αναφερθεί ότι η δραστηριότητα και η έκφραση των δύο άλλων πεπτιδασών σερίνης, πρωτεΐνη ενεργοποίησης ινοβλαστών άλφα (FAP) και προλυλ ενδοπεπτιδάση (PEP), ήταν υψηλότερη στα αδενώματα και σε πρώιμα στάδια της CRC αντίστοιχα [22,24]. Επιπλέον, η έκφραση FAP συσχετίζεται με χειρότερη επιβίωση [22,23] και η δραστηριότητα PEP το έκανε με μια καλύτερη συνολική και την ελεύθερη νόσου επιβίωση [25]. Αν και αυτές οι αποκλίνουσες επιδράσεις στις CRC πρόγνωση προτείνουν διαφορετικούς ρόλους που ενεργεί για αυτές τις πεπτιδάσες σερίνη σε αυτή τη νόσο, θα πρέπει να ληφθούν οι έκφρασης και δραστηριότητας αυξήσεις αυτών των πεπτιδασών στο νεοπλασματικών και προ-νεοπλασματικών ιστών υπόψη κατά το σχεδιασμό νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για καρκίνο του παχέος εντέρου.

Λόγω μεταβλητή έκφραση της σχετικά με συμπαγείς όγκους και σε διάφορες βιολογικές λειτουργίες του, ο ακριβής ρόλος που παίζει DPPIV στον καρκίνο μένει να διευκρινιστεί. Έχει περιγραφεί ότι DPPIV μπορεί είτε να προωθήσουν ή να εμποδίσουν την ανάπτυξη του όγκου ανάλογα με τον συγκεκριμένο τύπο όγκου ή στην φάση της ανάπτυξης ο όγκος είναι [13]. Αυτό το φαινόμενο της εξειδίκευσης του όγκου θέτει πρακτικές δυσκολίες κατά την εφαρμογή πεπτιδάσης αναστολέων σε θεραπείες καρκίνου, και αυτό το σημείο γίνεται ενεργά διερευνάται σήμερα [35,36]. Μια νέα τάση σε αυτό το θέμα συνίσταται στη χρήση κυτταροτοξικών προφαρμάκων επέτρεψε να ενεργοποιείται από συγκεκριμένες πεπτιδάσες μόνον όταν αυτοί οι πεπτιδάσες είναι περισσότερο δραστικές ή υψηλής έκφρασης, με σκοπό να βλάψει το νεοπλασματικό κύτταρο χωρίς να τροποποιούν τη λειτουργικότητα του ενζύμου [35,36]. Μερικά ερευνητές εργάζονται σε προφάρμακα με FAP ως στόχος [35]. Από ομόλογο DPPIV του είναι επίσης πολύ ενεργή στην αδενωμάτων και CRC, προτείνουμε ότι αυτό πεπτιδάσης σερίνη θα μπορούσε να είναι ο στόχος παρόμοιων προφαρμάκων.

γλυκοπρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας μπορεί να απελευθερωθεί στο εξωκυττάριο χώρο, εμφανίζονται σε διαφορετικά σωματικά υγρά και έχουν γίνει χρήσιμο στον ορό ή στο πλάσμα βιοδεικτών για τη βοήθεια στον έλεγχο, τη διάγνωση, σταδιοποίηση, την πρόγνωση και την παρακολούθηση της θεραπείας του καρκίνου. Το πιο σχετικό παράδειγμα στην κλινική ακόλουθη ασθενών CRC είναι το καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο (CEA) [34]. Ωστόσο, η ανάλυση του DPPIV στο πλάσμα ή τον ορό αυτών των ασθενών έχει αποδειχθεί ότι είναι μια αξιόπιστη μέθοδος στην πρώιμη ανίχνευση του CRC, είναι συμπληρωματικό προς το κλασικό κόπρανα εξετάσεις αίματος και άλλων βιοδεικτών του ορού που είναι κάτω από κλινική έρευνα στις μέρες μας [14, 17-20].

Πολλοί συγγραφείς [14,17,19] περιέγραψαν μειώσεις στα κυκλοφορούντα επίπεδα της DPPIV της CRC ασθενείς σε σύγκριση με υγιή άτομα. Επιπλέον, οι αυξήσεις του ενζύμου αυτού έχει παρατηρηθεί στον ορό των μεταστατικών

vs

. μη μεταστατικό ασθενείς [14,17,19,20]. Αυτά τα δεδομένα ελήφθησαν με ανοσοανίχνευση, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή χρησιμότητα της για την έγκαιρη διάγνωση και την κλινική παρακολούθηση. Διαπιστώσαμε επίσης ότι η δραστηριότητα των DPPIV μετράται με φθορισμομετρική μεθόδους ήταν σημαντικά μειωμένη στο πλάσμα των ασθενών CRC. Αντιθέτως, διαπιστώσαμε ότι αυτή η δραστηριότητα δεν συσχετίστηκε με μεταστατική κατάσταση ή με οποιαδήποτε άλλη παθολογική μεταβλητή.

Οι υψηλές διαφορές στον αριθμό των ασθενών μεταξύ των ομάδων με και χωρίς μεταστάσεις θα μπορούσε να είναι για την προέλευση αυτής της μερικής διαφορά. Άλλες αιτίες θα πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη επειδή έχει περιγραφεί ότι πολλά βιολογικά φαινόμενα μπορούν να επηρεάσουν την δραστικότητα του κυκλοφορούντος DPPIV /CD26 χωρίς να επηρεάζεται το επίπεδο πρωτεΐνης. Υπό την έννοια αυτή η παρουσία κυκλοφορούντων μορίων που μεταβάλλουν την δραστικότητα αυτού του ενζύμου έχει αναφερθεί [37,38]. Nazarian et al. [38] έδειξαν σε μια πολύ πρόσφατη μελέτη ότι οι ασθενείς μεταστατικό καρκίνο του προστάτη παρουσιάζεται μειωμένη κυκλοφορούν δραστικότητα DPPIV ενώ τα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν παρόμοια σε σχέση με τους ασθενείς με εντοπισμένη πρωτογενούς όγκου. Το εύρημα αυτό έδειξε ένα κυκλοφορούν μικρό πεπτίδιο ως πιθανή αιτία αυτής της αναστολής [38] και ανοίγει νέες προοπτικές για περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί η πιθανή χρησιμότητα της συνδυασμένης ανάλυσης των επιπέδων δραστηριότητας και πρωτεΐνη DPPIV στον ορό /πλάσμα των ασθενών με καρκίνο.

από πλασματικά επίπεδα και τις δραστηριότητες του PEP και FAP έχουν επίσης συσχετιστεί με την επιβίωση των ασθενών με CRC [19,25], ο κύριος στόχος της μελέτης μας ήταν να αναλύσουμε προοπτικά τη συσχέτιση μεταξύ πλασματική δραστηριότητα των ομόλογων DPPIV της και 5-ετή επιβίωση των ασθενών. Τα δεδομένα έδειξαν ότι οι ασθενείς με υψηλότερα πλασματικές δραστηριότητες DPPIV είχε φτωχότερες συνολική και την ελεύθερη νόσου επιβίωση. Αυτά τα στοιχεία έδειξαν καλύτερη ευαισθησία αλλά χειρότερα ειδικότητα από ό, τι εκείνα που λαμβάνονται με CEA. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι DPPIV είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας που επηρεάζει CRC επιβίωση των ασθενών. Ως εκ τούτου, υπάρχουν πειστικές αποδείξεις ότι ο προσδιορισμός των κυκλοφορούντων DPPIV μπορεί να είναι χρήσιμη για την έγκαιρη διάγνωση [14,17-19,21], καθώς και στην πρόγνωση της CRC.

Η προέλευση των κυκλοφορούντων DPPIV σε ασθενείς με ο καρκίνος είναι ένα αμφιλεγόμενο ζήτημα. Τρέχουσες υποθέσεις τοποθετήσει την προέλευσή του στο ήπαρ και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος [14] και σε μικροπεριβάλλον του όγκου [8,14,19,38]. Πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική ανάλυση σε ολόκληρη την αλληλουχία αδένωμα-καρκίνωμα να γνωρίζει την τοποθεσία των DPPIV στα παχέος ιστούς. Μη νεοπλασματικά κύτταρα του παχέος βλεννογόνου δεν χρωμάτισε με DPPIV. Αντίθετα, αδένωμα και τα κύτταρα CRC έδειξαν θετική κυτταροπλασματική ανοσοχρώση με ενίσχυση της μεμβράνης του αυλού. Αυτό ανοσοϊστοχημικές μοτίβο συμφωνεί με την υψηλότερη δραστικότητα και τα επίπεδα mRNA έχουμε βρει επίσης σε νεοπλάσματα. Επιπλέον, βρήκαμε ανοσοχρώση με DPPIV στα φλεγμονώδη κύτταρα του υμένα σε φυσιολογικές και νεοπλασματικές βλεννογόνου. Το εύρημα αυτό θα μπορούσε να σημαίνει ότι η DPPIV απελευθερώνεται από τόσο του ανοσοποιητικού και νεοπλασματικών κυττάρων σε CRCs.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι DPPIV είναι up-ρυθμίζεται σε αδενωματώδεις και CRC ιστούς σε σύγκριση με το αμέτοχος βλεννογόνο. Πλασματική δραστηριότητα DPPIV είναι χαμηλότερη από ό, τι σε υγιή άτομα και ανεξάρτητα σχετίζεται με χειρότερη επιβίωση 5 ετών σε ασθενείς με CRC. Ο προσδιορισμός δραστικότητας DPPIV στο πλάσμα είναι μια ασφαλής, ελάχιστα επεμβατική και φθηνή μέθοδο, και μπορεί να είναι συμπληρωματικό προς τον προσδιορισμό των επιπέδων πρωτεΐνης CD26 ασθενείς CRC. Νέες μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό ασθενών, συλλέγοντας το προεγχειρητική και μετεγχειρητική δείγματα πλάσματος σε διάφορα χρονικά σημεία [21], θα πρέπει να γίνει για να επιβεβαιώσετε την προγνωστική αξία αυτών των αποτελεσμάτων σε διαγνωστικές χρόνο και κατά τη διάρκεια των ασθενών παρακολούθησης.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Arantza Pérez (UPV /EHU) για την τεχνική συμβολή της με τη μελέτη αυτή και με τον καθηγητή Juan Μπιλμπάο (UPV /EHU) για στατιστικούς την υποστήριξή του.