You must be logged into post a comment.
Αφηρημένο
Beclin 1 αλληλεπιδρά με υπεριώδη ακτινοβολία αντίστασης που σχετίζεται με το γονίδιο (UVRAG) για να σχηματίσουν πυρήνα συγκροτήματα που προκαλούν αυτοφαγία. Ενώ τα κύτταρα με ελαττωματικό αυτοφαγία είναι επιρρεπείς σε γενωμική αστάθεια που συμβάλλει στην ογκογένεση, είναι άγνωστο εάν Beclin1 ή UVRAG μπορεί να ρυθμίσει τη βλάβη του DNA /απόκρισης επισκευής τη θεραπεία του καρκίνου σε καθιερωμένες καρκινικά κύτταρα. Βρήκαμε ότι siRNA νοκ ντάουν του
Beclin 1
ή
UVRAG
μπορεί να αυξήσει το DNA διπλής διαλείμματα που προκαλείται από ακτινοβολία σκέλος (DSBs), φαίνεται από Patm και γH2Ax, και την προώθηση του παχέος θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, νοκ ντάουν του
Beclin 1
,
UVRAG
ή
ATG5
αυξήθηκε το ποσοστό των ακτινοβολημένων κυττάρων με πυρηνική εστίες εκφράζει 53BP1, ένα δείκτη των μη ομόλογου τέλος ενώνει, αλλά δεν RAD51 ( ομόλογο ανασυνδυασμό), σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA.
Beclin 1
siRNA φάνηκε να εξασθενεί την έκφραση UVRAG. Κύτταρα με ένα
UVRAG
διαγραφή μεταλλαγμένο ελαττωματικό Beclin 1 δέσμευση έδειξε αυξημένη ϋδΒδ ακτινοβολία και κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με τα κύτταρα με έκτοπη άγριου τύπου
UVRAG
. Knockdown του
Beclin 1
ή
UVRAG,
αλλά όχι
ATG5,
οδήγησε σε σημαντική αύξηση του αριθμού κεντροσωμάτων (χρώση γ-τουμπουλίνης) σε ακτινοβολημένα κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA . Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι Beclin 1 και UVRAG παρέχουν προστασία έναντι DSBs DNA που προκαλείται από ακτινοβολία και μπορούν να διατηρήσουν κεντροσωμάτων σταθερότητα σε καθιερωμένες καρκινικά κύτταρα
Παράθεση:. Myung Πάρκο J, Tougeron D, Huang S, Okamoto Κ, Sinicrope FA (2014) Beclin 1 και UVRAG παρέχουν προστασία από την ακτινοβολία-Induced βλάβες στο DNA και να διατηρήσει κεντροσώματος Σταθερότητα σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (6): e100819. doi: 10.1371 /journal.pone.0100819
Επιμέλεια: Ilya Ulasov, σουηδική Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής
Ελήφθη: 5η Φεβρουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 29 Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιούνη του 2014
Copyright: © 2014 Myung Park et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται
Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (5 K05 CA142885 και CA113681, τόσο για την FAS). DT είναι ο αποδέκτης της χρηματοδοτικής στήριξης από την Multi-Οργανωτική Θεματικό Ινστιτούτο για τον Καρκίνο και το γαλλικό Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου
Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα
Εισαγωγή
μακροαυτοφαγία είναι ένα μονοπάτι καταβολισμού, λυσοσωμική αποδόμηση που διατηρεί την κυτταρική βιοσύνθεση κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού, υποξική ή κυτταροτοξικά στρες [1]. Ένα βασικό ρυθμιστή της αυτοφαγία είναι Beclin 1 του οποίου η πρωτεΐνη είναι μια βασική συνιστώσα της κατηγορίας συγκρότημα /Vps34 III PI3K που απαιτείται για autophagosome σχηματισμό και την ωρίμανση [2]. Beclin 1 αλληλεπιδρά με διάφορες πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων των ρυθμιστών αυτοφαγία, πρωτεΐνες πρόσδεσης στην μεμβράνη οργανιδίων, και Bcl-2 και Bcl-x
L. Ένας τομέας σπειραμάτων σε Beclin 1 χρησιμεύει ως πλατφόρμα αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης για να προσλάβει δύο κύριους ρυθμιστές αυτοφαγία, το γονίδιο αντοχής που σχετίζονται με Atg14 και την υπεριώδη ακτινοβολία (
UVRAG
) προϊόντων [3]. UVRAG, αρχικά εντοπίστηκαν χάρη στην ικανότητά του να συμπληρώνει την ευαισθησία υπεριώδη ακτινοβολία στα κύτταρα του όγκου, συνδέεται με το πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα Beclin 1-Bcl-2-ΡΙ (3) KC3 όπου και Beclin 1 αλληλεπιδρούν μέσω του τομέα πηνίο πηνίο (CCD) και αλληλένδετα επάγουν αυτοφαγία [4].
Beclin 1
και
UVRAG
λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικά γονίδια, και
Beclin 1
+/-
ποντίκια φαίνεται να είναι όγκου-επιρρεπείς [5]. Beclin 1 χάρτες σε μία περιοχή στο χρωμόσωμα 17q21, και
Beclin 1
[6] και
UVRAG
[7] διαγράφονται monoallelically σε ορισμένους καρκίνους. Αλληλόμορφη απώλεια
Beclin 1
και ελαττωματικά αυτοφαγία έδειξαν να ευαισθητοποιήσει κύτταρα σε μεταβολικό στρες [8], και για να ενεργοποιήσετε την απόκριση βλάβης του DNA σε συνδυασμό με ανευπλοειδία σε απαθανάτισε επιθηλιακά κύτταρα ποντικού και όγκων του μαστού [8].
εγκατεστημένων όγκων, βασικοκυτταρικό αυτοφαγία ρυθμίζεται προς τα πάνω για να επιβιώσει μεταβολική, υποξικές ή κυτταροτοξική θεραπεία στρες που σχετίζονται, υποδεικνύοντας ότι autophagy μπορεί να χρησιμεύσει ως ένας μηχανισμός της θεραπευτικής ανθεκτικότητας [9]. αναστολή Autophagy έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία, για την ίδρυση autophagy ως νέο στόχο για θεραπεία [10], [11]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι τα κύτταρα με ελαττωματικό αυτοφαγία είναι επιρρεπείς σε γενωμική αστάθεια με αυξημένη βλάβη του DNA και ανευπλοειδίας [8], [12]. Ωστόσο, τα στοιχεία που υποστηρίζουν έναν ρόλο για αυτοφαγία στην προστασία του γονιδιώματος σε καθιερωμένες καρκίνων είναι περιορισμένη και ο ρόλος του Beclin 1, εάν υπάρχει, είναι άγνωστη. Έχει αναφερθεί ότι UVRAG παίζει ένα διπλό ρόλο σε χρωμοσωμική σταθερότητα που βρέθηκε να είναι ανεξάρτητη από αυτοφαγία [13]. θεραπείες του καρκίνου επάγουν DNA δίκλωνα σπασίματα (DSBs) που ενεργοποιούν τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA, συμπεριλαμβανομένων των μη-ομόλογων άκρο σύνδεσης (NHEJ) και ομόλογο ανασυνδυασμό (HR) για την αποκατάσταση γονιδιωματική ακεραιότητα [14]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι UVRAG μπορεί να προωθήσει την επιδιόρθωση του DNA DSB από άμεσα δεσμευτικό και ενεργοποίηση του DNA-PK στο ΝΗΕΙ [13]. Ιστόνης Η2ΑΧ, ένα υπόστρωμα του αταξία τελαγγειεκτασία μεταλλαγμένου (ΑΤΜ) και DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (ϋΝΑ-ΡΚ) (ένζυμο κλειδί στην NHEJ), φωσφορυλιώνεται σε σερίνη 139 και σχηματίζει εστίες στις περιοχές DSB που μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης του DSBs [ ,,,0],15]. Διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας απαιτεί κατάλληλο διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά την κυτταρική διαίρεση που εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη συναρμολόγηση της συσκευής μιτωτικής ατράκτου από κεντροσωμάτια. Extra κεντροσωμάτια σχεδόν αναπόφευκτα προκαλούν άξονα δυσπλασία και εσφαλμένη χρωμοσωμικές διαχωρισμού [16] ότι ως απάντηση στην καταστροφή του DNA, μπορεί να οδηγήσει σε ανευπλοειδίας και της γονιδιωματικής αστάθειας [17]. Ελαττώματα και στα γονίδια που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί εκτροπές σε αριθμό κεντροσωμάτων που είναι κοινή σε ανθρώπινους όγκους [18].
Αν και ο ρόλος του Beclin 1 και UVRAG έχουν μελετηθεί στη ρύθμιση της ογκογένεσης [4 ], [13], [19], λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο τους στη ρύθμιση του γενωμικού σταθερότητα και τη δυνητική σημασία της αλληλεπίδρασης τους σε αυτή τη διαδικασία σε καθιερωμένους όγκους. Για να αποκτήσουν εικόνα για τον μηχανισμό (ες) με την οποία καρκινικών κυττάρων αυτοφαγία μπορεί να προσδώσει ανθεκτικότητα θεραπεία, εξετάσαμε την ικανότητα των Beclin 1 ή /και συμπαράγοντας UVRAG του να ρυθμίσει την απόκριση βλάβες στο DNA και αριθμό κεντροσωμάτων σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). CRCs είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στο DNA βλάπτει θεραπείες όπως κυτταροτοξική χημειοθεραπεία και ακτινοβολία τα οποία συνήθως χορηγούνται ταυτόχρονα στην κλινική. Σε αυτό το πλαίσιο, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι Beclin 1 υπερέκφραση συσχετίστηκε με μειωμένη επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου που έλαβαν θεραπεία με 5-φθοριοουρακίλη ως επικουρική θεραπεία [20]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι Beclin 1 και UVRAG αλληλεπιδρούν για να ρυθμίζουν βλάβη /επιδιόρθωσης του DNA που χρησιμοποιεί μη ομόλογο τέλος ενώνει και διατηρεί κεντροσωμάτων σταθερότητα σε απάντηση στην ακτινοβολία. Ένα
UVRAG
διαγραφή μεταλλαγμένο ελαττωματικό Beclin 1 απέτυχε δέσμευση για την προστασία από τις DSBs καταδεικνύοντας τη σημασία της αλληλεπίδρασης τους στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας.
Υλικά και Μέθοδοι
Πολιτισμός τηλέφωνα , Drugs, αντιδραστήρια, και ακτινοβολία κυττάρων
Ανθρώπινο ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, κύτταρα καρκινώματος του τραχήλου της μήτρας ΗΤ-29 και DLD1, και HeLa καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδούς και 1% αντιβιοτικό /αντιμυκητιακό. Κύτταρα 293Τ αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ (Sigma Chemical Co.) και συμπληρωμένο όπως παραπάνω. Όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και περιγράφεται προηγουμένως [21], [22], με εξαίρεση των κυττάρων Hela που ελήφθησαν από τον Dr. S. Kaufmann στο Mayo Clinic [23]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-φθοριοουρακίλη, βαφιλομυκίνης Α1 (Sigma, B1793), και spautin-1 (Cellagen Technology, C3430-2s) όπως υποδεικνύεται. Τα φάρμακα διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), το οποίο χρησιμοποιήθηκε επίσης ως μάρτυρας θεραπείας. Τα κύτταρα επίσης υποστεί επεξεργασία με ιοντίζουσα ακτινοβολία με μια πηγή καισίου 137 σε irradiator MARK 1-25 (JL Shepherd και Συνεργάτες).
μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)
Τα κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) και αλληλουχίες στόχευσης για
Beclin 1
(GGGTCTAAGACGTCCAACA),
κυτοσολική πρωτεΐνη που σχετίζεται με ελαφριά αλυσίδα 3 B
(
LC3B
) (GAAGGCGCTTACAGCTCAA),
UVRAG
(TCACTTGTGTAGTACTGAA), και
πρωτεΐνη αυτοφαγία 5
(
ATG5
) (GGCATTATCCAATTGGTTT) σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. Για την εκτέλεση διπλό knockdown, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με δύο siRNA ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν διαφορετικές πρωτεΐνες, 24 ώρες στο μεταξύ για τα κύτταρα να ανακάμψει.
λεντοϊών Σύντομη φουρκέτας RNA
Short φουρκέτα RNA (shRNA) πρότυπο ολιγονουκλεοτίδια ( συντίθεται από το Core Βιολογίας διευκόλυνση Mayo Clinic Μοριακής) συνδέθηκαν στο λεντοϊού shRNA κλωνοποίηση και έκφραση διάνυσμα pSIH1-H1 (Σύστημα Bioscience, Mountain View, CA. Η ακολουθία ελέγχου shRNA ήταν CAACAAGATGAAGAGCACCAA (Sigma). Η ακολουθία στόχευσης για ειδική για ουμπικιτίνη πεπτιδάσης 10 (
USP10)
ήταν GCCTCTCTTTAGTGGCTCTTT Lentivirus παραγωγή χρησιμοποιώντας κύτταρα 293Τ και την μεταγωγή των κυττάρων στόχων διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [24] πουρομυκίνη (2 μg /mL? Sigma, Ρ8833).. προστέθηκε σε 48 ώρες μετά την μεταγωγή, και πουρομυκίνη-ανθεκτικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν.
έκτοπη έκφραση της ρετροϊικοί
UVRAG
η
cDNA του
UVRAG
(ΟηΟεηε) υποκλωνοποιήθηκε σε pBabe- διάνυσμα puro με ένα Ν-τερματικό 3-tag. Η παραγωγή μεταλλαγμένου
UVRAG
με διαγραφή του τομέως σπείρας-σπείρας (
ΔCCD
) [25] επιτεύχθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές επικαλυπτόμενα που κράτησε την περιοχή ενδιαφέροντος. Ψευδο-δακτυλογραφημένο ρετροϊός παράχθηκε χρησιμοποιώντας αυτά τα
UVRAG
κατασκευάζει ανά ένα περιγράφηκε προηγουμένως διαδικασία [24]. Αμινοξέα 144-269 διαγράφηκαν για να αποκτήσετε το
UVRAG ΔCCD
μεταλλαγμένα.
Κυττάρων Η βιωσιμότητα και η απόπτωση Αναλύσεις
Η 3-4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ ) -5- (3-carboxymethoxyphenly) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο (MTS) χρωματομετρική δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων. δοκιμασία απόπτωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αννεξίνη V /χρώση ΡΙ και κασπάσης-3 διάσπασης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22].
ανοσοαποτύπωσης
Τα δείγματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν και στη συνέχεια φορτώνονται πάνω σε ένα πήκτωμα SDS-PAGE με ηλεκτροφορητική μεταφορά επί μεμβράνης διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Bio-Rad), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Αντισώματα έναντι των ακόλουθων πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκαν: Beclin 1, διασπασμένη κασπάση-3, γH2Ax, H2AX, pCHK2, LC3, UVRAG, ATM (όλα από την Cell Signaling Technology, 1:1000), γ-τουμπουλίνης, Patm (EPITOMICS, 1:2000 ) και Ρ62 (MBL, 1:2000). Οι ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν και εξομαλύνθηκαν έναντι γ-τουμπουλίνης χρησιμοποιώντας ImageJ (Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας).
Δοκιμασία κλωνογονιδιακή επιβίωση
Διακόσια κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας έξι φρεατίων και στη συνέχεια ακτινοβολημένα (4 Gy) μόνο ή με την παρουσία 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) (2 μΜ). Μετά από επώαση για 7-14 ημέρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 10% μεθανόλη /10% οξικό οξύ και στη συνέχεια βάφτηκαν με 0.4% κρυσταλλικό ιώδες σε 10% μεθανόλη. Ο αριθμός των αποικιών με & gt? 50 κυττάρων προσδιορίστηκε και εκφράστηκε ως η σχετική μεταβολή στην ακατέργαστα κύτταρα αγωγή με φάρμακο
vs
Η
Ανοσοκαταβύθιση
Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα CHAPS. [5 mmol /L MgCl
2, 137 mmol /L KCI, 1 mmol /L EDTA, 1 mmol /L EGTA, 1% CHAPS, 10 mmol /L HEPES (ρΗ 7,5)] για 30 λεπτά σε πάγο και στη συνέχεια διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση στα 17.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν με αντίσωμα επί μία νύκτα στους 4 ° C. σύμπλεγμα αντιγόνου /αντισώματος συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας σφαιρίδια /G μαγνητική πρωτεΐνη Α (Thermo Scientific) για 2 ώρες στους 4 ° C. Χωρίς περιορισμούς πρωτεΐνες πλύθηκαν τρεις φορές με 1 mL ρυθμιστικό CHAPS χωρίς αναστολείς πρωτεάσης. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες επί σφαιριδίων εκλούσθηκαν με επώαση σε ρυθμιστικό δείγματος LDS για 10 λεπτά και στη συνέχεια φορτώνονται για ανοσοκηλίδωση.
ανοσοφθορισμού και συνεστιακό μικροσκόπιο
Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πιάτα γυάλινο πυθμένα επικαλυμμένα με πολυ- L-λυσίνη (MatTeck Corp.) και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε γ-ακτινοβολία (2-8 Gy). Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν για 10 λεπτά με 4% παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS, και μπλοκαρίστηκαν σε 3% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA). Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια 53BP1 (Cell Signaling Technology, 4937, 1:100), ή RAD51 (Calbiochem, PC130, 1:100), ακολουθούμενη από αντίστοιχα φθορίζοντα δευτερεύοντα αντισώματα (Alexa Fluor 488 ή 568, Molecular Probes, Invitrogen). Τα δείγματα ξεπλύθηκαν, βυθισμένο σε 0,05 μg /mL 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) για 5 λεπτά, και τοποθετείται με καλυπτρίδες χρησιμοποιώντας Prolong Gold (Invitrogen). Ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Axiovert 100 Μ μικροσκόπιο εφοδιασμένο με σχέδιο-Αχρωματικός 63 X /1.4 αντικειμενικό φακό και το λογισμικό Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss). Το ποσοστό των κυττάρων που περιέχουν περισσότερο από 10 πυρηνικών εστίες φθοριζόντων ανά συνολικός αριθμός των κυττάρων υπολογίστηκε με εξέταση τουλάχιστον 100 κυττάρων σε πέντε πεδία σε 63X για κάθε πειραματική συνθήκη.
Για χρώση των κεντροσωμάτων, κυτταροπλασματικής τουμπουλίνη εξαντλήθηκε με ένα ρυθμιστικό σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων (3 Moll /L EGTA, 50 mmol /L Αγωγοί, 1 mmol /L θειικό μαγνήσιο
4, 25 mmol /L KCl). Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν για 10 λεπτά σε -20 ° C μεθανόλη [26], διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 σε PBS και επωάστηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (5% ορός κατσίκας, 1% γλυκερόλη, 0,1% BSA, 0,1% των ψαριών ζελατίνη δέρματος). Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα έναντι γ-τουμπουλίνης (Sigma, GTU-88, 1:5000) ακολουθούμενη από αντίστοιχα φθορίζοντα δευτερεύοντα αντισώματα. Το ποσοστό των κυττάρων με πάνω από 2 κεντροσωμάτια προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού με την οποία τουλάχιστον 100 κύτταρα σε πέντε πεδία σε 63X μετρήθηκαν για κάθε πειραματική συνθήκη.
Στατιστική Ανάλυση
Στατιστικές συγκρίσεις για πειράματα σε καλλιεργημένα κύτταρα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test του Student. Στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων με επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο
P & lt?.
0.05
Αποτελέσματα
κυτταροπροστατευτική δράση του
Beclin 1
σε κύτταρα που εκτίθενται σε 5-FU ή /και ακτινοβολία
καθοριστεί αν η καταστολή της Beclin 1 μπορεί να ενισχύσει chemoradiation επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Colon κυτταρικές γραμμές καρκίνου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με γ-ακτινοβολία (4 Gy) μόνη ή σε συνδυασμό με 5-FU (2 μΜ). Σε επεξεργασμένα κύτταρα,
Beclin 1
νοκ ντάουν
vs
ελέγχου siRNA είχε αποδειχθεί ότι μειώνει σημαντικά την βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 1Α, Β,
αριστερό πάνελ
).
Beclin 1
νοκ ντάουν μειώθηκε επίσης μακροπρόθεσμη κλωνογονικού επιβίωση των κυττάρων μετά την ακτινοβολία ± 5-FU σε σύγκριση με τα κύτταρα με έλεγχο siRNA (Εικ. 1Α, Β,
δεξιά πάνελ
). Σε αυτά τα πειράματα, η προσθήκη ενός κλινικώς επιτεύξιμη δόση της 5-FU είχε ελάχιστη επίδραση στο βαθμό της ακτινοβολίας που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο.
Α, Β,
ΗΤ-29 (Α) ή DLD1 κύτταρα (Β) επιμολύνθηκαν με το
Beclin 1
vs ελέγχου siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ακτινοβολία (RT? 4 Gy) μόνη ή σε συνδυασμό με 5-FU (2 μΜ). Τα αποτελέσματα της MTS (24 ώρες) και δοκιμασίες κλωνογονική επιβίωση δείχνεται. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση για τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με δοκιμή t διπλής όψης του Student και ορίζεται ως *
P
& lt? 0,05.
C
, κύτταρα με
Beclin 1
ή ελέγχου siRNA είχαν ακτινοβοληθεί (4 Gy) και στη συνέχεια διερευνήθηκαν για έκφραση LC3I-II, γH2Ax, και διασπάται κασπάσης-3 με ανοσοαποτύπωση σε 24 ώρες . Οι ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικοποιείται και σχετική ένταση σημάνθηκε κάτω από την αντίστοιχη κηλίδα. Μόνο LC3II προσδιορίστηκε ποσοτικά για LC3 πρωτεΐνη.
D,
χρονική πορεία της επίδρασης της ακτινοβολίας στην έκφραση Patm σε κύτταρα με
Beclin 1
siRNA vs ελέγχου siRNA.
E
, Επίδραση του
Beclin 1
siRNA για αυτοφαγικά ροή σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RT (4 Gy) και /ή 5-FU (4 μΜ).
Η
Για να προσδιορίσετε αν Beclin 1 μπορεί να ρυθμίσει την απόκριση βλάβες στο DNA, εξετάσαμε την επίδραση της ακτινοβολίας κατά την έκφραση των δεικτών ΟΕΔ φωσφορυλιώνεται ιστόνης H2AX (γH2Ax) [27] και φωσφορυλιωμένη αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαχθεί (Patm). ATM είναι ένα κρίσιμο αισθητήρας της βλάβης του DNA που εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA και G2-M to-έλεγχος οδοφράγματος [28], και του οποίου η ενεργοποίηση απαιτεί αυτοφωσφορυλίωση του [29]. Καταστολή της
Beclin 1 από
siRNA αυξημένη έκφραση γH2Ax δύο φορές, που προκαλείται από Patm και αυξημένη διάσπαση της κασπάσης-3 (2-φορές) σε κύτταρα που εκτίθενται σε ακτινοβολία σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA (Σχ. 1C, D). Διαφοροποίηση των γH2AX σε 24 ώρες πιθανόν να αντιπροσωπεύει μη επισκευαστεί, υπολείμματα DNA μετά την βλάβη ακτινοβολίας. Στη συνέχεια προσδιορίζεται εάν
Beclin 1
siRNA μπορεί να αναστείλει την ακτινοβολία που προκαλείται από αυτοφαγικά ροή. Χρησιμοποιώντας βαφιλομυκίνης Α1 που αναστέλλει κενοτοπικής Η + ΑΤΡάσης, παρατηρήσαμε την συσσώρευση κυτοσολική (LC3I) και συνδεδεμένη με μεμβράνη (LC3II) μορφές της LC3 (Εικ. 1 Ε) του οποίου η αναλογία συσχετίζεται με την έκταση της autophagosome σχηματισμού [1], [30]. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 5-FU + ακτινοβολία και βαφιλομυκίνης Α1,
Beclin 1
knockdown είχε αποδειχθεί ότι ελαττώνει τη συσσώρευση των LC3I-ΙΙ σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου και για την αύξηση της έκφρασης του ρ62 υπόστρωμα autophagy /sequestosome1 [24] συνεπής με την αναστολή της αυτοφαγικά ροής (Εικ. 1 Ε).
στη συνέχεια, προσδιορίζεται η ικανότητα των Beclin 1 και UVRAG να ρυθμίζουν την απόκριση βλάβης του DNA σε ακτινοβολημένα κύτταρα. Έκφραση των 53BP1 είναι ένας αισθητήρας για βλάβες του DNA και διευκόλυνσης της ΝΗΕΙ [31], ενώ RAD51 είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστή της επιδιόρθωσης του DNA μέσω HR [32]. Η ακτινοβόληση σχετίζεται με την αύξηση του ποσοστού των κυττάρων με & gt? 10 53BP1 πυρηνική εστίες μετά από 4 ώρες, που ήταν σημαντικά (ρ & lt? 0,05) αυξημένη σε
Beclin 1
,
UVRAG
ή
ATG5
νοκ ντάουν
vs κύτταρα
ελέγχου (Εικ. 2Α).
ATG5
νοκ ντάουν κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένας έλεγχος για την απενεργοποίηση αυτοφαγία. Η ακτινοβόληση αύξησε επίσης τον αριθμό των RAD51 εστίες οι οποίες δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των
Beclin 1
,
UVRAG
ή
ATG5
νοκ ντάουν
vs κύτταρα
ελέγχου (Εικ . 2Β).
Α, Β,
ανοσοφθορισμού χρώση για 53BP1 (Α) ή RAD51 (Β) πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα ΗΤ-29 με νοκ ντάουν του
Beclin 1
,
UVRAG
ή
ATG5
και εκτίθενται σε ακτινοβολία (2 Gy) στους χρόνους που υποδεικνύονται. Το ποσοστό των κυττάρων με & gt? 10 πυρηνικών εστιών που εκφράζουν είτε 53BP1 ή RAD51 υπολογίστηκε και απεικονίστηκε όπως φαίνεται. 53BP1 και RAD51 είναι δείκτες των μη ομόλογα τέλος ενώνει και ομόλογο ανασυνδυασμό, αντίστοιχα. DAPI χρησιμοποιήθηκε αιματοξυλίνης τον πυρήνα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση για τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με δοκιμή t διπλής όψης του Student και ορίζεται ως *
P
& lt?. 0.05
Η
USP10 και USP13 έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί την αποουβιτικινίωσης της Beclin 1, σταθεροποιώντας έτσι το Vps34 συγκρότημα [33]. Η αναστολή αυτών των deubiquitinases μπορεί, ως εκ τούτου, αποτελούν μια στρατηγική για να καταστείλει αυτοφαγία. Βρήκαμε ότι η καταστολή του
USP10 από
shRNA προκάλεσε μία αύξηση κατά 2 φορές στο δείκτη DSB γH2Ax και διάσπαση της κασπάσης-3, και επίσης μειωμένη κλωνογονική επιβίωση σε ακτινοβολημένα κύτταρα (Σχ. 3Α). Αναστολή της USP10 και USP13 επίσης επιτυγχάνεται με τη χρήση spautin-1, ένας ισχυρός αναστολέας μικρό μόριο του αυτοφαγία που προωθεί την υποβάθμιση των συμπλεγμάτων κινάσης Vps34 ΡΙ3 [33]. Spautin-1 αναστέλλεται αυτοφαγία όπως υποδεικνύεται από μειωμένη μετατροπή και τη συσσώρευση του ρ62 /sequestosome 1 (Σχ. 3Β) LC3I-II. Επιπλέον, spautin-1 ενισχυμένη DSBs, συγκρατημένα επαγόμενη απόπτωση (Σχ. 3Β, C), και μειωμένο κλωνογονική επιβίωση σε κύτταρα που εκτίθενται σε ακτινοβολία μόνη ή σε συνδυασμό με 5-FU (Σχ. 3D).
Α,
κύτταρα με
USP10 vs ελέγχου
ακτινοβολήθηκαν shRNA και αναλύθηκαν για έκφραση USP10, LC3I-ΙΙ, γH2Ax και διασπασμένη κασπάση 3 στις 24 ώρες με ανοσοκηλίδωση (
αριστερά
) ή για κλωνογόνο επιβίωση (
δεξιά
).
B,
κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ακτινοβολία μόνη ή σε συνδυασμό με spautin-1 (10 μΜ) και η έκφραση των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών αναλύθηκαν στις 24 ώρες με ανοσοκηλίδωση.
C, D,
κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με spautin-1 (10 μΜ) μόνη ή σε συνδυασμό με RT (4 Gy) (C) ή RT ± 5-FU (2 μΜ) (D). Σε αυτά τα κύτταρα, αννεξίνη V
+ ΡΙ
– επισήμανση στις 24 ώρες (C) και κλωνογόνο επιβίωση (D) αναλύθηκαν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση σε σύγκριση με μάρτυρες για πειράματα εις τριπλούν. **
P
& lt?. 0.01
Η
UVRAG
αλληλεπιδρά με το
Beclin 1
για τη ρύθμιση της απόκρισης Βλάβη DNA
Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι μειωμένη έκφραση του
UVRAG
δει σε μερικούς καρκίνους μπορεί να καταστήσει τα καρκινικά κύτταρα ευάλωτα σε χρωμοσωμική βλάβη [34]. Βρήκαμε ότι
Beclin 1
siRNA μπορεί να μειώσει ισχυρά την έκφραση UVRAG παρουσία ή απουσία ακτινοβολίας (Σχ. 4Α). Knockdown του
UVRAG από
siRNA αυξημένη ακτινοβολία επαγόμενη DSBs (γH2Ax) (Εικ. 4Β), τα επίπεδα του Patm (Εικ. 4C), και διάσπαση της κασπάσης-3 σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA (Σχ. 4Β). Για να καθοριστεί εάν
Beclin 1
έχει αθροιστική δράση με το
UVRAG
για τη ρύθμιση της ακτινοβολίας που προκαλείται από βλάβες του DNA και την απόπτωση, συγκρίναμε κύτταρα με νοκ ντάουν του
UVRAG vs
άτομα με διπλό νοκ ντάουν του
Beclin 1
και
UVRAG
. Ενώ βρέθηκαν παρόμοια επίπεδα γH2Ax και pCHK2, ακτινοβολημένα κύτταρα με διπλό νοκ ντάουν έδειξαν αυξημένη κασπάσης-3 διάσπασης που υποδηλώνει ότι η ρύθμιση της απόπτωσης από Beclin 1 παρουσιάζεται ανεξάρτητα από
UVRAG
(Εικ. 4D). Στη συνέχεια μελετήθηκε η αλληλεπίδραση μεταξύ Beclin 1 και UVRAG στον έλεγχο και ακτινοβολούνται κυτταρικές σειρές. Ανοσοκαταβυθισμένες UVRAG δείχθηκε να συνδέσει με Beclin 1 παρουσία ή απουσία ακτινοβολίας (Εικ. 5Α).
Α, Β,
ΗΤ-29 και DLD1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με
Beclin 1
(Α) ή
UVRAG
(Β)
vs
ελέγχου siRNA. Τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν και η έκφραση των δεικνυομένων πρωτεϊνών αναλύθηκε στις 24 ώρες μετά την ακτινοβολία με ανοσοκηλίδωση.
C,
χρονική πορεία της επίδρασης της ακτινοβολίας στην έκφραση Patm σε κύτταρα με
UVRAG vs έλεγχο
siRNA.
D,
επίδραση της ακτινοβολίας στις βλάβες του DNA και την απόπτωση δείκτες σε κύτταρα με διπλή εξουδετέρωση του
Beclin 1
και
UVRAG
vs
UVRAG
siRNA μόνο ( 24 h). Πυκνομετρία διεξήχθη και ομαλοποιημένη έναντι τουμπουλίνης.
Η
Α,
Ανοσοκαταβύθιση UVRAG ακολουθούμενη από ανίχνευση για Beclin 1 πραγματοποιήθηκε σε προϊόντα λύσης ΗΤ-29 κυττάρων (4 ώρες) μετά την ακτινοβολία (4 Gy)
vs
μη επεξεργασμένα κύτταρα. Κανονική IgG χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την εξειδίκευση του αντισώματος. Τόσο βραχυπρόθεσμα (SE) και πλέον (LE) ανοίγματα παρουσιάζονται για UVRAG.
Β,
ΗΤ-29 κύτταρα που υπερεκφράζουν
UVRAG
άγριου τύπου (wt) ή μια μετάλλαξη διαγραφής στο πεδίο της σπείρας-σπείρας (ΔCCD), τόσο επισημαίνονται με τρεις-διαδοχικού tag [ ,,,0],3tag: s-tag, πρωτεΐνη δέσμευσης 2XFLAG και στρεπταβιδίνης (SBP)], υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση για FLAG. Κατακρημνισμένο πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα εναντίον Beclin 1, UVRAG ή σημαία. Κανονική IgG χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.
C,
κυτταρολύματα από ακτινοβολημένα (4 Gy) κύτταρα ανιχνεύθηκαν για LC3I-ΙΙ και γH2Ax στις 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με ανοσοκηλίδωση. Σταθερό
UVRAG
βάρος ή
ΔCCD
μεταλλαγμένα κύτταρα που χρησιμοποιούνται εδώ και στο Σχ. 5Β.
D
, κύτταρα με βάρος
UVRAG
ή το
UVRAG ΔCCD
μεταλλαγμένο vs κενό φορέα ελέγχου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα ή ακτινοβολία, και η μακροχρόνια κλωνογόνο επιβίωση προσδιορίστηκε. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα για κάθε κυτταρικό φαινότυπο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση για τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με δοκιμή t διπλής όψης του Student και ορίζεται ως * P & lt?. 0.05
Η
Σε ΗΤ-29 κύτταρα όπου UVRAG ανοσοκαταβυθίστηκε, η επαγωγή της από την ακτινοβολία παρατηρήθηκε σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα και UVRAG επίσης δείχθηκε να συνδέεται προς Beclin 1 (Σχ. 5Α). Να μελετήσει τις επιπτώσεις της αλληλεπίδρασης Beclin 1 και UVRAG στη ρύθμιση της ακτινοευαισθησία, δημιουργήσαμε ΗΤ 29-κύτταρα που εκφράζουν σταθερά φυσικού τύπου (wt)
UVRAG
ή
ΔCCD
μεταλλάξεις που μεσολαβεί αλληλεπίδρασή του με Beclin 1 [25]. Η
UVRAG ΔCCD
μεταλλαγμένα κύτταρα έδειξε σχεδόν πλήρη απώλεια της δέσμευσης με Beclin 1, σε αντίθεση με τα κύτταρα UVRAG βάρος (Εικ. 5Β). Έκτοπη κ.β.
UVRAG
δείχθηκε να ενισχύσει μετατροπή LCI-II σε ακτινοβολημένα κύτταρα (Σχ. 5C). Στη συνέχεια προσπάθησε να καθορίσει αν η
UVRAG ΔCCD
μπορεί να προκαλέσει απώλεια /εξασθένιση της επαγωγής αυτοφαγία από την ακτινοβολία.
UVRAG ΔCCD
κύτταρα έδειξαν μια μέτρια μείωση στην προκαλούμενη από ακτινοβολία μετατροπή LC3I-ΙΙ σε σύγκριση με wt κύτταρα (Σχ. 5C) που μπορεί να σχετίζονται με τη συνύπαρξη των ενδογενών UVRAG. Τα κύτταρα με την UVRAG
ΔCCD
ήταν περισσότερο επιρρεπή σε επαγόμενη από ακτινοβολία DSBs, που υποδεικνύεται από την αυξημένη γH2Ax (Εικ. 5C) σε σύγκριση με wt
UVRAG
και κενά κύτταρα ελέγχου φορέα. Περαιτέρω, τα κύτταρα με το
UVRAG ΔCCD
ήταν περισσότερο επιρρεπή σε κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από ακτινοβολία φαίνεται σε μακροχρόνια δοκιμασία κλωνογόνο επιβίωση σε σύγκριση με κύτταρα UVRAG wt (Σχ. 5D).
Beclin 1
και
UVRAG
Ρυθμίζουν κεντροσώματος Σταθερότητας
Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα με ελαττωματικό αυτοφαγία είναι επιρρεπείς σε γενωμική αστάθεια, αποδεικτικών στοιχείων που υποστηρίζουν ένα ρόλο για την αυτοφαγία στην προστασία του γονιδιώματος είναι περιορισμένη και ο ρόλος της Beclin 1 ή UVRAG, αν υπάρχει, είναι ελάχιστα κατανοητή. Εξετάσαμε την ικανότητα των ρυθμιστικών αρχών αυτοφαγία να μεσολαβήσει προστασία του γονιδιώματος με ανάλυση των κεντροσωμάτων ενίσχυσης. Πολλαπλασιασμό κεντροσωμάτων έχει ανιχνευθεί σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με βλάβες στο DNA που προκαλείται από ιονίζουσα ακτινοβολία ή κυτταροστατικά φάρμακα [35], και μπορεί να οδηγήσει σε μιτωτική αποτυχία και επακόλουθη κυτταρικό θάνατο [36]. αναστολή Autophagy με καταστολή του
ATG5
ή
LC3 από
siRNA είχαν αποδειχθεί ότι ενισχύει προκαλούμενη από ακτινοβολία γH2Ax και διάσπαση της κασπάσης-3 (Σχ. 6Α), υποδεικνύοντας την ικανότητα της αυτοφαγία να ρυθμίζουν αυτές τις διαδικασίες . Στη συνέχεια προσδιορίζεται κατά πόσον Beclin 1 ή /και UVRAG μπορεί να ρυθμίσει κεντρόσωμα σταθερότητα. Σε μη επεξεργασμένα ΗΤ-29 ή Hela κύτταρα, βρήκαμε μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε αριθμό κεντροσωμάτων εξής knockdown του
Beclin 1
ή
UVRAG
και σε μικρότερο βαθμό για ATG5, σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA απεικονίζεται με γ-τουμπουλίνης ανοσοφθορισμό (εικ. 6Β). Σε ακτινοβολημένα κύτταρα, μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε αριθμό κεντροσωμάτων περιορίστηκε σε κύτταρα με knockdown του
Beclin 1
ή
UVRAG,
αλλά όχι
ATG5
(Εικ. 6Β). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι Beclin 1 και UVRAG μπορεί να ρυθμίζει κεντροσωμάτων σταθερότητα ανεξάρτητα από αυτοφαγία.
Α,
Επίδραση της εξουδετέρωσης των
LC3
(
αριστερά
) ή
ATG5
(
δεξιά
) στους δείκτες των DSBs (γH2Ax), απόπτωση (κασπάσης-3), και αυτοφαγία (LC3I-II μετατροπής) σε ΗΤ-29 και /ή κύτταρα DLD1 εκτίθενται σε ακτινοβολία
vs ελέγχου 24
ώρες μετά την ακτινοβόληση.
Β
, αριθμό κεντροσωμάτων προσδιορίστηκε με ανοσοφθορισμό σε
Beclin 1
,
UVRAG,
ή
ATG5
νοκ ντάουν κυττάρων (ΗΤ-29 ή HeLa) που έλαβαν θεραπεία με ακτινοβολία (4, 8 Gy)
vs
ελέγχου. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν για γ-τουμπουλίνης (κόκκινο χρώμα) και αντιπροσωπευτικές εικόνες εμφανίζονται (
αριστερά
). Το ποσοστό των κυττάρων με περισσότερους από δύο κεντροσωμάτια (multi-κεντροσωμάτια) μετρήθηκε και χαράσσεται (
δεξιά
). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση για τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με δοκιμή t διπλής όψης του Student και ορίζεται ως *
P
& lt?. 0.05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου
Η
Συζήτηση
Ενώ ο ρόλος του Beclin 1 και UVRAG σε βλάβη του DNA έχει μελετηθεί στη ρύθμιση της ογκογένεσης [4], [13], [19], λίγα είναι γνωστά για τις μοριακές λεπτομέρειες του ρόλου τους σε όγκο απόκριση κυττάρου σε θεραπεία καρκίνου. Κατανόηση κυτταρικοί μηχανισμοί αντίστασης στην βλάβη του DNA και την επισκευή απαντήσεις είναι κρίσιμης σημασίας για τη βελτίωση της θεραπευτικά αποτελέσματα σε ασθενείς με καρκίνο. Κατάλληλη εκτέλεση της επιδιόρθωσης του DNA DSB είναι κρίσιμη για την επιβίωση των κυττάρων όγκου μετά από βλάβη του DNA και για τη συντήρηση των γονιδιωματικών σταθερότητας. Βρήκαμε ότι Beclin 1 και συμπαράγοντας UVRAG της μπορεί να ρυθμίσει τη βλάβη του DNA /απόκρισης επισκευής και κεντροσωμάτων σταθερότητα σε ανθρώπινα κύτταρα CRC. Συγκεκριμένα, η καταστολή της
Beclin 1
ή
UVRAG
συνδέθηκε με τη συσσώρευση των DSBs και με αυξημένη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε απόκριση προς ακτινοβολία ± 5-FU, υποδεικνύοντας την ικανότητα τους να ρυθμίζουν αυτές τις διαδικασίες. Ένας μηχανισμός με τον οποίο
UVRAG
και
Beclin 1
ρυθμίζουν την απόκριση βλάβη του DNA προτείνεται από τη διαπίστωση ότι η καταστολή της είτε γονιδίου σημαντική αύξηση του αριθμού των ακτινοβολημένων κυττάρων με πυρηνική εστίες εκφράζοντας 53BP1 που συμβάλλει στην ΝΗΕΙ με την αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη σε θέσεις DSB να ρυθμίσει 5 ‘άκρο εκτομή [31]. Αυτή η παρατήρηση είναι συμβατό με δεδομένα σε
53BP1
ελλιπή ως ποντίκια που εμφανίζουν υπερευαισθησία σε ακτινοβολία και παρουσιάζουν χρωμοσωμικές ανωμαλίες ενδεικτικές των ελαττωμάτων επιδιόρθωσης του DNA [37]. Σε αντίθεση με 53BP1, βρήκαμε ότι ο αριθμός των RAD51 πυρηνικών εστίες ήταν ανεπηρέαστη από
Beclin 1
ή
UVRAG
καταστολή, αν και περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για να προσδιοριστεί η προνομιακή συμμετοχή της ΝΗΕΙ
vs
ΥΕ σε αυτή τη ρύθμιση. Από Beclin 1 σταθερότητα ελέγχεται από ουβικιτινίωση, αναστέλλοντας deubiquitinases που ρυθμίζουν προς τα κάτω Beclin 1 έχει δειχθεί να απενεργοποιήσει το κυτταροπροστατευτικό αποτέλεσμα της Beclin 1. Παρόμοια με
Beclin 1
knockdown, βρήκαμε ότι η καταστολή της ουμπικουϊτίνης-ειδική πεπτιδάση, USP10, ή ένα μικρό μόριο αναστολέα των deubiquitinases USP10 και USP13, δηλαδή, spautin-1 [33], μπορεί να αυξήσει την ακτινοβολία που προκαλείται DSBs και προάγουν θάνατο κυττάρου όγκου. Πρόσφατα δεδομένα καταδεικνύουν μια στενή σχέση μεταξύ Beclin 1 και p53 μέσω των deubiquitinases USP10 και USP13 [33]. Από USP10 μεσολαβεί το αποουβιτικινίωσης του p53, τη ρύθμιση της δραστηριότητας deubiquitinase της USP10 και USP13 από Beclin 1 μπορεί να παρέχει έναν μηχανισμό με τον οποίο μπορεί να ελέγχει τα επίπεδα της πρωτεΐνης p53. Ωστόσο, η σημασία αυτών των ευρημάτων σε κύτταρα με μεταλλαγμένα
p53
, όπως χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη, είναι άγνωστη. Ενώ χρησιμοποιούνται προσεγγίσεις νοκ ντάουν και έναν αναστολέα αυτοφαγία (spautin), αναγνωρίζουμε ότι ορισμένες ρυθμιστικές αυτοφαγία μπορεί άμεσα ή έμμεσα ρυθμίζουν τις κυτταρικές διεργασίες που είναι ανεξάρτητες από αυτοφαγία [13], [38].
Βρήκαμε ότι η καταστολή της
Beclin 1
συνδέθηκε με ρύθμιση προς τα κάτω της UVRAG, σύμφωνα με στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η σταθερότητα των συστατικών του PI (3) συγκρότημα KC3 που ρυθμίζει αυτοφαγία είναι αλληλοεξαρτώμενες σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο [3], [4 ]. Για τον προσδιορισμό της λειτουργικής επικάλυψης μεταξύ αυτών των γονιδίων, δημιουργήσαμε κυττάρων με διπλή knockdown του
UVRAG
και
Beclin 1
οποία έδειξε να αυξάνει την απόπτωση, αλλά όχι DSBs, σε σύγκριση με
UVRAG
νοκ ντάουν μόνο. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι Beclin 1 μπορεί να ρυθμίσει την απόπτωση ανεξάρτητα από UVRAG.
You must be logged into post a comment.