Αφηρημένο

CPV1 (ονομάζεται επίσης COPV) είναι ένα θηλωμάτων υπεύθυνη για στοματική θηλωμάτωση σε νεαρούς σκύλους. Η εμπλοκή αυτής της ιογενούς τύπου του στόματος ογκογένεση έχει υποτεθεί σε στοματικά καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (κλώνοι ενός κυττάρου), αλλά δεν έχει ποτέ διερευνηθεί σε άλλες νεοπλασματικές και υπερπλαστικών αλλοιώσεων των σκύλων από το στόμα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η παρουσία CPV1 σε διάφορες νεοπλασματικές και υπερπλαστικών βλαβών προκειμένου να αξιολογηθεί ο ρόλος του στην σκύλων προφορική ογκογένεση? σύμφωνα με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν, ένας δεύτερος σκοπός της μελέτης ήταν να καθορίσει εάν ο σκύλος μπορεί να θεωρηθεί έγκυρη ζωικό μοντέλο για στοματική όγκους HPV που προκαλείται υψηλού κινδύνου. Ογδόντα οκτώ σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) σκύλου στοματικές αλλοιώσεις συμπεριλαμβανομένων 78 από το στόμα όγκους (θηλώματα, κλώνοι ενός κυττάρου, μελανώματα, ameloblastomas, από του στόματος αδενοκαρκινώματα) και 10 υπερπλαστικών αλλοιώσεων (υπερπλασία των ούλων) διερευνήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία για την παρουσία του ιού θηλώματος L1 πρωτεΐνες και με Real-Time PCR για CPV1 DNA. RT-PCR για RNA διεξήχθη σε επιλεγμένα δείγματα. Όλες οι ιογενείς θηλώματα ελέγχθηκαν ήταν θετικά για ανοσοϊστοχημεία και σε πραγματικό χρόνο PCR. Σε 3/33 (10%) ΕΕΑΚ ιικό DNA καταδείχθηκε αλλά όχι RNA του ιού θα μπορούσε να βρεθεί. Δεν θετικότητα παρατηρήθηκε τόσο με ανοσοϊστοχημεία και Real-Time PCR στις άλλες υπερπλαστικές και νεοπλαστικές αλλοιώσεις της στοματικής κοιλότητας των σκύλων. Ακόμη και αν η διαπίστωση του DNA CPV1 σε λίγες κλώνοι ενός κυττάρου σε πρόσωπο ενός αρνητικού ανοσοϊστοχημεία θα μπορούσαν να υποστηρίξουν την υπόθεση του ανεπιτυχή μόλυνση στην ανάπτυξη αυτών των βλαβών, η απουσία του ιικού RNA επισημαίνει ότι CPV1 πιο πιθανό αντιπροσωπεύει ένα αθώο παρευρισκομένων σε SCC ογκογένεση. Η μελέτη καταδεικνύει μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ CPV1 και του στόματος ιικών θηλωμάτων ενώ ιική συμβολή στη παθογένεση άλλων στοματικών αλλοιώσεων φαίνεται απίθανο. Επιπλέον, αυτό δείχνει ότι ένα μοντέλο σκύλου μόλυνσης CPV1 για τον HPV που προκαλείται από την ογκογένεση θα μπορούσε να είναι ακατάλληλο

Παράθεση:. Porcellato Ι, Brachelente C, Guelfi G, Reginato Α, Sforna M, Bongiovanni L, et al. (2014) Αναδρομική Έρευνα για Canine θηλωμάτων 1 (CPV1) στην Προφορική Ογκογένεση Αποκαλύπτει τα σκυλιά δεν είναι ένα κατάλληλο ζωικό μοντέλο για υψηλού κινδύνου HPV-Induced καρκίνο του στόματος. PLoS ONE 9 (11): e112833. doi: 10.1371 /journal.pone.0112833

Επιμέλεια: Xuefeng Liu, Πανεπιστήμιο Georgetown, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Ιούνη 2014? Αποδεκτές: 16 Οκτ 2014? Δημοσιεύθηκε: 17 Νοέμβρη 2014

Copyright: © 2014 Porcellato et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

οι ιοί των θηλωμάτων (φωτοβολταϊκά) είναι μια ομάδα ιών που ανήκει στο

Papillomaviridae

οικογένεια που είναι πολύ συγκεκριμένα είδη που μπορούν να επηρεάσουν τα θηλαστικά, πουλιά και ερπετά [1] . PVs έχουν κυκλική δίκλωνο γονιδίωμα DNA περίπου 8 kb σε μέγεθος που τυπικά περιέχει οκτώ ORFs (Open Reading Frames), που κωδικοποιεί νωρίς (Ε1, Ε2, Ε4, Ε5, Ε6 και Ε7) και αργά (L1 και L2) ιικών πρωτεϊνών [ ,,,0],2], [3]. Ε1 είναι ένα DNA ελικάση απαραίτητα για την αντιγραφή και η ενίσχυση του ιικού επίσωμα στον πυρήνα των μολυσμένων κυττάρων [4]. Ε2 πρωτεΐνες συμμετέχουν στην έναρξη της αντιγραφής DNA του ιού, αλλά είναι κομβικής σημασίας στην μεταγραφική ρύθμιση και στεγανοποίηση των ιικού γονιδιώματος, καθώς [5]. Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών είναι υπεύθυνες για τις κυτταρικές διεργασίες πολλαπλασιασμού και μετασχηματισμού, με Ε7 να αναγνωριστεί ως μία από τις πιο αποτελεσματικές deregulator κυτταρικού κύκλου [6]. Ε4, Ε5 μαζί με, εμπλέκεται στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού ιικού γονιδιώματος και αντιπροσωπεύει την πιο άφθονη μεταγραφής σε παραγωγικές αλλοιώσεις [7], [8]. Αργά πρωτεΐνες (L1, L2) κωδικοποιούν για τις δομικές πρωτεΐνες του ιικού καψιδίου, οι οποίες είναι θεμελιώδεις για την ολοκλήρωση του κύκλου ζωής ΦΒ [8]. HPVs (Human ιοί θηλώματος) ταξινομούνται σε δερματικές και βλεννογονικές τύπους με βάση τον τροπισμό τους για δέρματος ή του βλεννογόνου επιθηλίου, αντίστοιχα, και μπορεί είτε να επιμένουν ασυμπτωματικά ή να προκαλέσει καλοήθεις υπερπολλαπλασιαστικών ασθενειών ή κακοήθειες [2], [9]. Βλεννογόνου ιοί HPV μπορούν να ταξινομηθούν σε κατηγορίες υψηλού κινδύνου και χαμηλού κινδύνου σε σχέση με την ένωσή τους με την ανάπτυξη του καρκίνου [10]. Αυτή η ταξινόμηση βασίστηκε αρχικά μόνο σε επιδημιολογικά δεδομένα και αργότερα επιβεβαιώθηκε με επιπλέον αποδείξεις από δοκιμές in vitro [11]. Περισσότερα από 170 τύποι του HPV έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι στιγμής, ενώ στην κυνικός ιατρική μόνο 14 τύποι του CPV (Canine των ανθρωπίνων θηλωμάτων) είναι γνωστό αυτή τη στιγμή [12], [13]. Ο ρόλος του του CPV στην παθογένεση του καρκίνου δεν έχει διευκρινιστεί σαφώς και κανένας από τους τύπους του ιού των σκύλων έχει συσχετιστεί με μια συγκεκριμένη οντότητα καρκίνου. Αντιθέτως, στην ιατρική ο ογκογόνους ρόλος των τύπων HPV υψηλού κινδύνου όπως HPV 16 και HPV 18 είναι καλά γνωστή και θεωρούνται να συμβάλλουν σε πάνω από το 70% των καρκίνων του τραχήλου [14]. Πιο πρόσφατα, η μόλυνση από HPV έχει συσχετισθεί επίσης με καρκίνο κεφαλής και λαιμού, ιδίως με πλακώδες καρκίνωμα του στοματοφάρυγγα [15], [16]. Στους σκύλους, ο πρώτος τύπος PV τεκμηριωμένη είναι ο αιτιολογικός παράγοντας του σκύλου του στόματος θηλωμάτωση, που αρχικά ονομαζόταν COPV (Canine Προφορική θηλωμάτων) και πρόσφατα μετονομάστηκε CPV1 [2], [17]. Το DNA αυτού του ιού είναι 8607 ζεύγη βάσεων σε μήκος και ως εκ τούτου είναι ο μεγαλύτερος PV αλληλουχία [18]. Αν και η διάταξη των CPV1 γονιδίωμα είναι παρόμοιο με τα άλλα PVs, δεν διαθέτει την περιοχή Ε5 και χαρακτηρίζεται από ένα μακρύ δεύτερο μη-κωδικοποιητική περιοχή [19]. Canine στοματική θηλωμάτωση προκαλείται από CPV1 είναι πιο συχνή σε σκύλους από περίπου ένα έτος της ηλικίας τους και συνήθως προκαλεί κουνουπίδι-όπως εξωφυτικό κονδυλώματα? σε ορισμένες περιπτώσεις, οι όγκοι μπορούν επίσης να κρόσσια ή οζώδης. Οι βλάβες συνήθως εντοπίζεται στο βλεννογόνο του στόματος, τα χείλη και βλεννογονοδερματική κόμβους, αλλά δεν περιορίζονται σε αυτές τις τοποθεσίες [17]. Συνήθως υφίστανται αυθόρμητη παλινδρόμησης που συνδέεται με ένα κυρίαρχο διείσδυση των CD4 + και CD8 + λεμφοκυττάρων [20]. Αν και CPV1 τυπικά σχετίζεται με καλοήθη και αυθόρμητα υποχωρεί θηλώματα, αυτό ιογενή τύπος έχει περιστασιακά αναφερθεί σε μη παλινδρόμηση αλλοιώσεων, ιδιαίτερα στην στοματική και περιστοματική καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [21], [22]. Στη διάρκεια των τελευταίων χρόνων, η παρουσία του HPV DNA έχει ευρέως ερευνηθεί και αποδειχθεί σε διάφορα στόματος όγκους όπως καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [23], ameloblastoma [24], καρκίνωμα σιελογόνων αδένων [25], [26], καθώς και σε δερματικό μελάνωμα [27] και άλλων όγκων [28], [29], [30]. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει διαφορετικές κυνικός στόματος όγκους και υπερπλαστικών αλλοιώσεων για την παρουσία CPV1 DNA και RNA καθώς επίσης και ιικό εντοπισμός αντιγόνου σε αλλοιώσεις. Αξιολογώντας ιογενή επικράτηση στην προφορική νεοπλασματικές εκδηλώσεις σε σκύλους θα μπορούσε να παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με το δυνητικό ρόλο της συγκεκριμένης ιογενούς τύπου σκύλου προφορική ογκογένεση και για τη χρησιμότητα του σκύλου μοντέλο για στοματική HPV που προκαλείται από την ογκογένεση στον άνθρωπο. Η έρευνα διεξήχθη σε όγκους επιθηλιακής προέλευσης, όπως καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, ameloblastomas και από του στόματος αδενοκαρκινώματα. Μια ομάδα μελανωμάτων, τα οποία είναι τα πιο κοινά και επεμβατικές στοματικών καρκίνων σε σκύλους, εξετάστηκε επίσης σε αυτή τη μελέτη. Επιπλέον, δεδομένου ότι είναι γενικά αποδεκτό ότι το PVS εξαρτώνται από επιθηλιακή διαφοροποίηση για την ολοκλήρωση του κύκλου ζωής τους [8], η μελέτη αυτή περιέλαβε επίσης μια ομάδα από ούλων υπερπλαστικών αλλοιώσεων. Ιστολογία ρουτίνας, ανοσοϊστοχημεία και Real-Time PCR χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Η μελέτη μας επικεντρώθηκε στο ρόλο του CPV1 σε στοματική ογκογένεση μέσω της αναδρομικής ανοσοϊστοχημική και μοριακή ανάλυση ενός ευρέος φάσματος νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών στοματικών αλλοιώσεων.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθική

η αναδρομική αυτή μελέτη διεξήχθη σε FFPE δείγματα τα οποία είχαν σταλεί για να Τμημάτων μας για την ιστοπαθολογική διάγνωση και επομένως δεν χρειάζονται έγκριση από την επιτροπή δεοντολογίας.

επιλογή του δείγματος και ιστοπαθολογική εξέταση

Είκοσι δύο θηλώματα (Ps), 33 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (κλώνοι ενός κυττάρου), 11 μελανώματα (MS), 10 ameloblastomas (τροπολογίες), 2 στόματος αδενοκαρκινώματα (ACS) και 10 περιπτώσεις των ούλων υπερτροφία /υπερπλασία (GH), που συλλέγονται 2005-2012, επιλέχθηκαν από τα αρχεία του Τμήματος κτηνιατρικής (Πανεπιστήμιο της Περούτζια, Ιταλία), και του Τμήματος κτηνιατρικής (University of Teramo, Ιταλία). Η διάγνωση αναθεωρήθηκε από 2 παθολόγους σε διαφάνειες αιματοξυλίνη-Eosin. Θηλώματα στη συνέχεια ταξινομήθηκαν σε ιογενή θηλώματα (VPS) και πλακώδη θηλώματα (SPS). VP διαγνώστηκαν με βάση την παρουσία των τυπικών ιστολογικά χαρακτηριστικά ενδεικτικά της ιογενούς κυτοπαθικά αποτελέσματα, όπως επιθηλιακά πολλαπλασιασμό, κοιλοκυττάρωση, hypergranulosis, υπερκεράτωση και την παρουσία σωμάτων εγκλεισμού.

Η ανοσοϊστοχημεία

Τμήματα των 2 μm κόπηκαν από τα μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) τα δείγματα 88 και τοποθετημένα σε θετικά φορτισμένο διαφάνειες. Η ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κατά της υψηλής διατηρημένων καψιδίου πρωτεΐνη L1 του BPV1 (1:200 αραίωση? Anti-ιού βόειου θηλώματος /BPV1, BO580 DakoCytomation, Glostrup, Denmark), όπως αναφέρεται σε άλλες μελέτες [31]. Εν συντομία, τομές ιστών FFPE αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και πλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό. Δεν ανάκτησης αντιγόνου εκτελέστηκε. Η ενδογενής υπεροξειδάση αποκλείσθηκε με 3% Η

2O

2 για 8 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια στη συνέχεια πλύθηκαν σε TBS και επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε υγροποιημένο θάλαμο σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια επωάστηκαν με δευτερεύον βιοτινυλιωμένο καθολική δευτερογενές αντίσωμα, που ακολουθείται από διαδοχική επώαση με στρεπταβιδίνη σημασμένη με υπεροξειδάση (LSAB + /System-HRP, Dako, Glostrup, Δανία). Τρεις-αμινο-εννέα-αιθυλοκαρβαζόλη χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο (AEC + Substrate-Chromogen Έτοιμο προς χρήση, Dako, Glostrup, Denmark) και αιματοξυλίνη Carazzi ως αντιχρώση. Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με υδατικό μέσο στερέωσης. Οι αρνητικοί έλεγχοι κατεργάστηκαν με τον ίδιο τρόπο, παραλείποντας το πρωτογενές αντίσωμα και επώαση τομών ιστού με TBS. Οι θετικοί μάρτυρες ελήφθησαν από βοοειδή δερματική θηλώματα

Αστάρια σχεδιασμό

Οι ανιχνευτές έχουν σχεδιαστεί για την αναφερόμενη ακολουθία του CPV1. [GenBank: L22695.1] ιδίως σε τέσσερις ΑΠΑ στόχο: Ε4, Ε7, L1 και L2. Μεταξύ νωρίς ιική προϊόντα, επιλέχθηκε Ε4 ως γονίδιο στόχος λόγω της υψηλής έκφρασης του (τόσο υψηλή όσο το 30% της συνολικής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη, σε ορισμένες παραγωγικές κονδυλώματα) σε παραγωγικές αλλοιώσεις και Ε7 λόγω των αναγνωρισμένων ογκογόνο ρόλο της [6], [7 ]. L1 και L2, τα αργά πρωτεΐνες, συμπεριλήφθηκαν λόγω του κεντρικού ρόλου τους στην ολοκλήρωση του ιικού κύκλου ΦΒ [8]. Για την ανίχνευση του κάθε γονιδίου ιού, προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν (Πίνακας 1). Ανιχνευτές για Ε4, Ε7 και L1 ήταν κατάλληλες επίσης για την ανίχνευση ιικού RNA. Οι σχεδιασμένους εκκινητές ελέγχθηκαν με ανάλυση έκρηξη NCBI και ανάλυση στοίχισης ClustalW να εξασφαλίσει την ειδικότητα.

Η

νουκλεϊκών οξέων εκχύλιση

εξαγωγή DNA και RNA πραγματοποιήθηκε από 5 μm τομές παραφίνης με ένα εμπορικό kit ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Οδηγός Γονιδιωματικό DNA κιτ καθαρισμού, Promega, Milano, Italia και RecoverAll Σύνολο Nucleic Acid κιτ απομόνωσης, Ambion, Austin, Texas). Ολικό DNA και RNA ποσοτικοποιήθηκαν με ένα φθορόμετρο (qubit 2.0, Invitrogen, Carlsbad, California) χρησιμοποιώντας ένα υψηλής ευαισθησία εμπορικό κιτ (qubit dsDNA HS ή RNA HS Assay Kit, Invitrogen, Carlsbad, California) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

αντίστροφη Μεταγραφή

Περίπου 20 ng ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε 20 μί iSCRIPT cDNA (BioRad, Hercules, CA) με τη χρήση τυχαίων εξαμερών σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Δεν-RT ελέγχους συμπεριλήφθηκαν για να ελέγξει για γενωμική μόλυνση DNA.

DNA και cDNA Real-Time PCR

Σύμφωνα με τις προτάσεις του κατασκευαστή, 4 μl DNA (30-50 ng) ή 4 μl του cDNA (1-10 ng) ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας 12,5 μL του Hot-διάσωσης Real-Time κύριο μείγμα (Diatheva, Fano, Ιταλία), 0.125 μL του Hot-διάσωσης DNA πολυμεράσης (Diatheva Fano, Ιταλία), 5 pmoles του ανιχνευτή , 10 pmoles εκκινητών (Integrated DNA Technologies, Coralville, ΙΑ), και ϋΝΑση /RNAse νερό ελεύθερο σε 25 μL. Όλες οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε ένα Bio-Rad iCycler Real-Time PCR με αρχικό επώαση στους 95 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους στους 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 1 λεπτό, στη διάρκεια της οποίας τα δεδομένα φθορισμού συλλέχθηκαν. Κάθε δείγμα εις τριπλούν και τα αποτελέσματα τέθηκαν στον μέσο όρο. Η Ct ήταν υπολογίζονται αυτόματα από κάθε καμπύλη. Δείγμα πιστότητα ενίσχυση επαληθεύτηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν και αλληλουχήθηκαν με QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen, Valencia, CA). Οι 18S χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος για την κανονικοποίηση διακυμάνσεις δείγματος στην ποσότητα του αρχικού RNA δείγματα όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [32]. Για κάθε εκτέλεση PCR, δεν υπάρχουν έλεγχοι πρότυπο και οι έλεγχοι NORT συμπεριλήφθηκαν προκειμένου να διαπιστωθεί η απουσία των μολυσματικών gDNA.

Αποτελέσματα

Ιστολογία και ανοσοϊστοχημεία

Με ιστολογική εξέταση ρουτίνας χρωματισμένο τμήματα, θηλώματα ταξινομήθηκαν σε ΠΝ (15/22) και SPs (7/22) την αξιολόγηση της παρουσίας χαρακτηριστικό κυτταροπαθολογικό χαρακτηριστικά της λοίμωξης PV (επιδερμικό πολλαπλασιασμό, κοιλοκυττάρωση, hypergranulosis, υπερκεράτωση και ένταξης φορείς) (Σχήμα 1). Μία περίπτωση με ήπια hypergranulosis και εστιακό υπερκεράτωση ήταν δύσκολο να ταξινομηθούν λόγω της έλλειψης των σωμάτων εγκλεισμού και της Κοιλοκύτταρα. Ωστόσο, μετά από σειριακή τομής, περιστασιακή Κοιλοκύτταρα παρατηρήθηκαν και η υπόθεση ταξινομήθηκε ως VP. Τα ιστολογικά χαρακτηριστικά του ΚΕΕ και ΠΝ φαίνεται στον Πίνακα S1. Θετική intranuclear ανοσοχρώση επιβεβαίωσε όλα τα ΠΝ διαγνωσθεί στο παρελθόν για HE τομές (Σχήμα 2). Θετικά κύτταρα εντοπίζονται ειδικά στα διαπλεκόμενα επιδερμίδα και συχνά σε περιοχές όπου η επιθήλιο χαρακτηρίζεται από σοβαρή hypergranulosis. Μόνο σε μία περίπτωση, η ανοσοσήμανση ήταν κυρίως δει σε επιφανειακά κύτταρα απολεπίζονται. Όλα τα άλλα όγκων και υπερπλαστικών αλλοιώσεων ήταν αρνητικά για PV ανοσοχρώση. Παρ ‘όλα αυτά, ένα λεπτά κοκκώδη κυτταροπλασματική χρώση ανιχνεύθηκε σε πέντε περιπτώσεις κλώνοι ενός κυττάρου

Η ) έχουν ταξινομηθεί ως αρνητικό και αβέβαιο θετικότητα αντιμετώπισε θεωρήθηκε ως τεχνούργημα. Ν /Α = δεν πραγματοποιήθηκε λόγω ελάχιστα υλικό που είναι διαθέσιμο για εξαγωγή RNA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0112833.s002

(DOCX)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ Αιμιλία del Rossi και Luca Stefanelli για τις προσπάθειές τους και την τεχνική υποστήριξη για την παρούσα μελέτη.