Αφηρημένο

Στόχοι

Η σηματοδότηση σκαντζόχοιρος οδός παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ΕΜΤ παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων, αλλά οι ακριβείς μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς. Επειδή S100A4 όπως διαπιστώθηκε βασικό δείκτη EMT moleculer να ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά Gli1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, εστιάσαμε στη σχέση μεταξύ των σημάτων Shh-Gli1 και τα γονίδια S100 οικογένεια.

Μέθοδοι

Από την βάση δεδομένων cDNA microarray, διερευνήσαμε ρυθμίσεως μηχανισμό Gli1 σε ορισμένα μέλη της οικογένειας S100A γονιδίων σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές πρώτον. Στη συνέχεια, η ρύθμιση της Gli1 να γονιδίου S100A4 μελετήθηκε με προσδιορισμούς μοριακής βιολογίας και η φιλο-μετάσταση Επίδραση της Gli1 εξαρτώμενη S100A4 διερευνήθηκε in vitro. Τέλος, οι εκφράσεις της Shh, Gli1, S100A4 και E-cadherin στον παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ανοσοϊστοχημείας.

Αποτελέσματα

Πέντε μέλη της οικογένειας γονιδίων S100, S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 και S100A14 βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά κατά Gli1 νοκ ντάουν. πρόβλεψη ενισχυτή Gli1 συνδυασμό με in vitro δεδομένα κατέδειξαν ότι Gli1 ρυθμίζει κατά κύριο λόγο μέλη της οικογένειας S100A μέσω στοιχείων δρώντα. Πράγματι, τα στοιχεία δείχνουν S100A4 και γονίδια βιμεντίνης ήταν απορυθμίζεται σημαντικά με Shh /Gli1-έκφραση αύξηση και Ε-καδερίνης μειώθηκε σημαντικά κατά την ίδια στιγμή. Η μετανάστευση των κυττάρων PC αυξήθηκε σημαντικά με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο έκφρασης Gli1 (Ρ & lt? 0,05) και siS100A4 ανέστρεψε σημαντικά την απόκριση των κυττάρων PC που επάγεται από την L-Shh μεταγωγή (Ρ & lt? 0,01).

Συμπέρασμα

τα στοιχεία μας δημιουργήσει μια νέα σχέση μεταξύ Shh-Gli1 σηματοδότησης και ρύθμιση S100A4, το οποίο σημαίνει ότι S100A4 θα μπορούσε να είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες για την EMT διαμεσολαβείται από Shh-Gli1 σηματοδότησης στον καρκίνο του παγκρέατος.

Παράθεση : Xu X, Su Β, Xie C, Wei S, Zhou Υ, Liu H, et al. (2014) Sonic Hedgehog-Gli1 μονοπάτι σηματοδότησης Ρυθμίζει τα επιθηλιακά μεσεγχυματικά Μετάβασης (EMT) μεσολαβώντας ένα νέο στόχο Gene, S100A4, σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (7): e96441. doi: 10.1371 /journal.pone.0096441

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Μάρτη 2013? Αποδεκτές: 8, Απριλίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 Ιουλίου του 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81072005, 81172312 και 81101839). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος αποτελεί μία από τις κύριες αιτίες της θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται με τις βιομηχανικές χώρες [1]. Η κακή πρόγνωση της νόσου οφείλεται κυρίως στην πρώιμη συστηματική μετάσταση του [1] – [3]. Ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι η μετάβαση επιθηλιακά μεσεγχυματικά (ΕΜΤ) μπορεί να είναι ένα βασικό μηχανισμό παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα αποσπώντας από την πρωτογενή θέση όγκου και εξάπλωση σε απομακρυσμένα όργανα. Ωστόσο, οι οδοί σηματοδότησης ΕΜΤ-κίνηση παραμένουν ασαφείς τώρα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Πρόσφατα, hedgehog (Hh) μονοπατιού σηματοδότησης έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα σημαντικό προαγωγός της ανάπτυξης του όγκου σε αρκετούς καρκίνους του γαστρεντερικού σωλήνα [4], [5]. Όσον αφορά τον καρκίνο του παγκρέατος, έχει αποδειχθεί ότι ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Hh είχε προκύψει από Ηχητικού ακανθόχοιρου (Shh) υπερέκφραση στην πλειονότητα των περιπτώσεων [6] – [8]. Ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχει δείξει ότι οι κύριοι μηχανισμοί Hh μονοπατιού σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα ήταν να προωθήσει διαδικασία επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) [9] – [11]. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η αναστολή αυτού του μονοπατιού ανέστειλε σημαντικά τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων in vivo και σε μοντέλα ξενομοσχεύματος [12], [13].

Δεδομένου ότι τα γονίδια-στόχους του Gli1 ήταν τα βασικά μηχανισμούς μονοπατιού σηματοδότησης Hh, προσπαθήσαμε να κατανοήσουμε προ-μεταστατική τους μηχανισμούς της από identifing τους στόχους της Gli1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Ως βασικό προ-μεταστατικό γονίδιο στόχος του Gli1 σε καρκίνο του παγκρέατος πρέπει να έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: Πρώτον, υπάρχουν αποτελεσματικές Gli1 δρώντα στοιχεία cis σε γονιδιακή αλληλουχία του? Δεύτερον, η μεταγραφή του ρυθμιζόταν θετικά από Gli1? Τρίτον, ρυθμίζεται αυξητικά στην πλειοψηφία των παγκρεατικών ιστών καρκίνου και επίπεδο έκφρασης του συσχετίστηκε θετικά με σηματοδότηση Hh? Τέταρτον, της πρέπει να αποτελέσει βασικό προ-μεταστατικό λειτουργικό παράγοντα. Σε προηγούμενη μελέτη, έχουμε πραγματοποιήσει μια συστηματική έρευνα σχετικά με τα προφίλ του γονιδίου-στόχου κατά Gli1 σε high-μεταστατικό καρκίνο του παγκρέατος κυτταρική γραμμή μέσω cDNA μικροσυστοιχιών και διαπίστωσε ότι 5 μέλη αυτής της οικογένειας γονιδίων απορυθμίζεται από Gli1. Ειδικά, η S100A4 ως βασικό δείκτη moleculer προώθηση διαδικασία ΕΜΤ στον καρκίνο του παγκρέατος βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω πάνω από 3 φορές σε αυτή τη μελέτη. Στη βάση αυτών των μελετών μας επικεντρώνεται στη σχέση μεταξύ των σημάτων Shh-Gli1 και οικογένεια γονιδίων S100.

Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε την Gli1 περιμένοντας περιοχές εντός των αλληλουχιών του DNA των S100 οικογένεια γονιδίων με εργαλεία βιοπληροφορικής και τις βάσεις δεδομένων. Επιπλέον, προσπαθήσαμε να εντοπίσει τις νέες συνδέσεις της Shh-Gli1 μονοπάτι σηματοδότησης με S100 οικογένεια γονιδίων και να αποδείξει προ-μεταστατικό λειτουργία του S100A4 γονιδίου που προκαλείται από τα σήματα Shh-Gli1 στον καρκίνο του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταροκαλλιέργειες

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PC, BxPC3, AsPC-1 και Panc-1, ήταν όλες οι εμπορικές κυτταρικές σειρές και μας δόθηκαν αυτές τις κυτταρικές σειρές από το Ινστιτούτο Κυτταρολογίας κινεζική Ακαδημία Science.These κυττάρων γραμμές χρησιμοποιούνται ευρέως στην έρευνα του καρκίνου του παγκρέατος [14] – [18]. Τρεις κυτταρικές γραμμές ήταν όλα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 στον αέρα.

φορέων Η κατασκευή και τα κύτταρα μόλυνση

λεντοϊών φορείς μεταφοράς για ανθρώπινη Gli1 shRNA ή Shh cDNA κατασκευάστηκαν με Genechem Co., Ltd, Shanghai, Κίνα. Το σύστημα αυτό περιλαμβάνει τον φορέα λεντοϊού pLVTHM, το πλασμίδιο περιβάλλουν pMD2G, και το πλασμίδιο πακεταρίσματος pRSV-REV και pMDlg-pRRE. Η φακοϊό-Shh (L-Shh) περιείχε μια αλληλουχία που κωδικοποιεί 3,3-kb για Shh και τον φακοϊό-Gli1i (L-Gli1i) περιείχε Gli1 μικρό RNA φουρκέτας (5′-CTCCACAGGCATACAGGAT-3 ‘) προς την αλληλουχία στόχευσης του shRNA ως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Η φακοϊό ελέγχου (L-C), οι οποίες δεν περιλαμβάνουν τις ακολουθίες Gli1 παρεμβολές ή ακολουθίες Σσσς cDNA χρησίμευσε ως έλεγχος. Τέλος λεντοϊού κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν μέσω προσδιορισμού αλληλουχίας DNA για να εξασφαλιστεί η ακρίβεια. Η ανασυνδυασμένη lentivirus παρήχθη με παροδική επιμόλυνση των κυττάρων 293Τ παρακάτω ένα πρότυπο πρωτόκολλο. Όταν BxPC3, AsPC-1 και Panc-1 κύτταρα ήταν περίπου 50% συρρέοντα σε RPMI-1640 που περιέχει 2% FCS, αυτά μολύνθηκαν με τα κατασκευάσματα φακοϊό σε ΜΟΙ 5. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 72 ώρες για περαιτέρω πειράματα. Για τον προσδιορισμό των λειτουργικών L-Shh και L-Gli1i κατασκευάζει, αναλύσαμε συνήθως έκφραση Shh και Gli1 από qRT-PCR και κηλίδωση Western.

S100A4 Παροδικές Νοκ ντάουν

Χρησιμοποιήσαμε μια ακολουθία RNAi (siS100A4 ) και μια αλληλουχία ελέγχου negtive (siS100A4 MIS), η οποία έχει δείξει αποτελεσματική knockdown του S100A4 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου ΗΤ29 σε προηγούμενη έκθεση [20]. S100A4 knockdown παρακολουθήθηκε με τον προσδιορισμό των επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης του μετά από 48 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA, αντίστοιχα. Και στη συνέχεια τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να Transwell προσδιορισμούς. Τα κύτταρα λιπομετάδοσης με τα siRNAs χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

RNA εκχυλίσεις και σε πραγματικό χρόνο προσδιορισμούς RT-PCR

δείγματα Ολικό RNA εκχυλίστηκαν με αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και 100 ng ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε όγκο 20 μΐ και 2 cDNA μΙ χρησιμοποιήθηκαν για PCR σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. (Takara Βιοτεχνολογίας, Dalian, Κίνα). Οι αλληλουχίες των εκκινητών παρατηρήθηκαν στον πίνακα 1. CT (κατώφλι κύκλου) οι τιμές καθορίστηκαν σε τιμές CT του GAPDH.

Η

εκχυλίσεις πρωτεΐνης και τη δυτική-κηλίδωση δοκιμασίες

Σύνολο δείγματα πρωτεΐνης εξήχθησαν με ρυθμιστικό RIPA σύμφωνα με την πρότυπη μέθοδο και τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν ως προς την περιεκτικότητα πρωτεΐνης με ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ (Bio-Rad Company). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν για τη Δυτική-κηλίδωση δοκιμασίες σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο για την Shh, Gli1, S100A4, E-cadherin, VIM (βιμεντίνη) και ανίχνευση GAPDH.

Transwell δοκιμασίες

τηλέφωνα εισβολή δοκιμασία-24 δείγματα κιτ (Chemicon, Bedford, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν για να μελετηθεί η εισβολή /μετανάστευση των κυττάρων PC γραμμών. Μετά την επώαση 24h, μετράει μετανάστευση των κυττάρων PC ελήφθησαν με φωτογράφηση της μεμβράνης μέσω του μικροσκοπίου. Μετρήσεις ελήφθησαν σε 5 υψηλότερη κύτταρα περιοχές σε μεγέθυνση υψηλής ισχύος (× 200). Η μέση τιμή των πεδίων μετρώνται θεωρήθηκε ως η μέτρηση μετανάστευση των κυττάρων PC.

Η φορμαλδεΰδη Cross-linking χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (XChIP) δοκιμασίες

Οι προσδιορισμοί XChIP διεξήχθησαν όπως οι προηγούμενες μελέτες [21]. Εν συντομία, η χρωματίνη κυττάρων AsPC-1 (3 × 10

7) συλλέχθηκε με 1 mL ρυθμιστικό ΙΡ το οποίο περιείχε κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Χρωματίνης διατμήθηκε με χρήση υπερήχων σε ένα κουτί πάγου (6 γύρους 10s παλμών, 350 W, δεύτερη διαστήματα 60) και Η διασύνδεση αντιστράφηκε με την προσθήκη 20 μΐ 5Μ NaCl όλη τη νύκτα στους 65 ° C. DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία φαινόλης /χλωροφορμίου. 20 μι του DNA υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1.5% και το υπόλοιπο χρησιμοποιήθηκε ως INPUT DNA. ChIP βαθμού κατσίκα πολυκλωνικό Gli1 αντίσωμα (0,1 μg /mL) (Santa Cruz Company) χρησιμοποιήθηκε για ανοσοκαθίζηση, η IgG ποντικού (0,1 μg /mL) (Santa Cruz Company) προστέθηκε σαν ένα τυχαίο έλεγχο, η RNA πολυμεράση II αντισώματος (0,1 μg /mL) ως θετικός έλεγχος και το αντίσωμα β-ακτίνης (0,1 μg /ml) ως αρνητικός έλεγχος. Το αστάρι της περιοχής του υποκινητή του GAPDH (Santa Cruz Company) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. (Πίνακας 2).

Η

φορέων αναφοράς λουσιφεράσης δοκιμασίες

Οι S100A4 λουσιφεράσης υποστηρικτής φορείς δημοσιογράφος κατασκευάστηκαν από Genechem Co., Ltd, Shanghai, Κίνα. Εν συντομία, ένα 1.5-kb θραύσμα cDNA (από -766 έως +734 του γονιδίου της ανθρώπινης S100A4) με θέσεις XhoI και HindIII συνετέθη και κλωνοποιήθηκε εντός των θέσεων Xho Ι και Hind III του βασικού φορέα λουσιφεράσης pGL3 να παράγουν pGL3-1.5 S100A4 περιέχουν τρεις Gli1 sites biding [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) και CTGGTGGGG (126~134)]. Στους φορείς μεταλλαξιγένεσης, Gli1 πιθανές θέσεις πρόσδεσης αλληλουχίες αντικαταστάθηκαν αντίστοιχα από αλληλουχία GATTCTTAA που δεν παρουσιάζει γνωστές θέσεις πρόσδεσης για τυχόν παραγόντων μεταγραφής [22]. Τα μονά Gli1 περιμένοντας το site φορείς μεταλλαξιγένεσης περιλαμβάνονται pGL3-1.5 S100A4 Μουτ 1 [GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) και CTGGTGGGG (126~134)], pGL3-1.5 S100A4 Μουτ 2 [ACCCACCAC ( -349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) και CTGGTGGGG (126~134)] και pGL3-1.5 S100A4 Μουτ 3 [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) και GATTCTTAA (126~134)]. Οι πολλαπλές θέσεις σύνδεσης Gli1 μεταλλαξιγένεση φορείς περιλαμβάνονται ρΘΙ_3 1,5 S100A4 Μουτ 1-2 [GATTCTTAA (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) και CTGGTGGGG (126~134)], pGL3 1,5 S100A4 Μουτ 1-3 [ ,,,0],GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) και GATTCTTAA (126~134)] και pGL3 1,5 S100A4 Μουτ 2-3 [ACCCACCAC (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235 ) και GATTCTTAA (126~134)]. Οι τελικές κατασκευές φορέα εξακριβώθηκαν μέσω της αλληλουχίας του DNA για να εξασφαλιστεί η ακρίβεια. κύτταρα AsPC-1 επιμολύνθηκαν με 5 μg είτε της pGL3-1500 S100A4 ή τα μεταλλαγμένα μορφώματα pGL3-1500 S100A4 και 2 μg του κατασκευάσματος λουσιφεράσης Renilla (pGL4.75, Promega) σαν εσωτερικός έλεγχος για ομαλοποίηση χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αντιδραστηρίου Lipofectin πρωτόκολλο. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα AsPC-1 χρησιμοποιήθηκαν για τις δοκιμασίες λουσιφεράσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο από το διπλό κιτ λουσιφεράσης (Promega) και οι volues είχαν READED χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές, κάθε φορά εις τριπλούν.

Τα δείγματα ασθενούς

Σε αυτή την εργασία, 102 παίρνει κλίση εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς του καρκίνου από διαφορετικούς ασθενείς PC (από 63 άνδρες και 39 γυναίκες , μέση ηλικία 56,7 χρόνια, εύρος 44 – 75 ετών) αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία. Όλοι οι ασθενείς έχουν συμφωνήσει αυτή την έρευνα. Όλα τα δείγματα ελήφθησαν από το νοσοκομείο το δέκατο των ανθρώπων Πανεπιστήμιο Tongji, Κίνα και όλοι οι ασθενείς έχουν υπογράψει ένα έγγραφο συναίνεσης, στην οποία συμφώνησαν ότι η χειρουργική εκτομή της κακοήθειας θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην ιατρική έρευνα πριν από τη λειτουργία τους. Οι επιτροπές δεοντολογίας των πανεπιστημίων Tongji ενέκρινε τη διαδικασία συναίνεσης και των μελετών.

προσδιορισμούς ανοσοϊστοχημείας

Οι ιστούς παραφίνης υπολογιστή χρησιμοποιήθηκαν για την αναγνώριση των Shh, Gli1, S100A4 και E-cadherin. Shh πολυκλωνικό αντίσωμα αγοράστηκε από την R &? D Company και οι άλλοι (Gli1, S100A4 και E-cadherin) ήταν από Sant Cruz Εταιρείας. Οι δοκιμασίες ανοσοϊστοχημείας πραγματοποιήθηκαν όπως τις προηγούμενες μελέτες και τα επίπεδα έκφρασης της Shh, Gli1, S100A4 και Ε-καδερίνη γονίδια βαθμολογήθηκαν με βάση τις κατευθυντήριες γραμμές που περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Στατιστική Ανάλυση

Για όλες τις στατιστικές αναλύσεις, χρησιμοποιήθηκε ένα SPSS17.0 πακέτο λογισμικού (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA). Οι συνεχείς μεταβλητές εκφράσθηκαν ως μέσοι όροι ± SE και t-test μια μη αξιόπιστη Student χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική αξιολόγηση. Οι συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης της Shh, Gli1, S100A4 και πρωτεΐνες Ε-καδερίνη και η σχέση μεταξύ των κλινικών χαρακτηριστικών των ασθενών και των πέντε πρωτεΐνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ rank Spearman.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η διαφορική έκφραση της οικογένειας γονιδίων S100 κατά Gli1 στο AsPC-1 κύτταρα

Για να οριοθέτηση της γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από σήματα Shh-Gli1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, τα κύτταρα AsPC-1 χρησιμοποιήθηκαν για προσδιορισμούς cDNA μικροσυστοιχιών συγκρίνοντας φακοϊό ελέγχου vs κύτταρα φακοϊό-Gli1i. Όταν με επίκεντρο τα γονίδια EMT που σχετίζονται με τα δεδομένα cDNA, βρήκαμε τη θετική σχέση μεταξύ των σημάτων Shh και S100 οικογένεια γονιδίων [21]. Στην οθόνη μας (τα σήματα έκφρασης περιλαμβάνονται 23 μέλη του S100 οικογένειας γονιδίων εκτός από S100A17 και S100A18) 10 γονίδια, S100A10, S100A11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P και TCHH, εκφράστηκαν και 13 γονίδια, S100A1 , S100A12, S100A3, S100A5, S100A7, S100A15, S100A8, S100A9, S100B, S100G, S100Z, RPTN και FLG δεν εκφράστηκαν σε κύτταρα AsPC-1. ανάλυση σύγκριση από την ομάδα φακοϊό ελέγχου vs κύτταρα ομάδα φακοϊό Gli1i έδειξε ότι S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 και S100A14 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω κατά Gli1. (Σχήμα 1Α). Οι δέκα γονίδια, S100A10, S100A11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P και TCHH, επιλέχθηκαν για την επικύρωση από πραγματικού χρόνου RT-PCR. Όπως έδειξε στο Σχήμα 1Β, S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 και S100A14 βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα πάνω, χωρίς σημαντικές αλλαγές και στις άλλες πέντε γονίδια. Αυτά τα δεδομένα είναι σύμφωνο με αυτό που λαμβάνεται από το μικροσυστοιχιών cDNA

Α:. CDNA μικροσυστοιχιών δεδομένα σχετικά με την οικογένεια γονιδίων S100? Β: Τα επίπεδα διαφορική έκφραση της μερικής μέλη της οικογένειας γονιδίου S100 με qRT-PCR. Η έκφραση του GAPDH είναι ως μάρτυρας. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

Προβλεπόμενη Gli1 biding sites και υποθετικών γονιδίων στόχων Gli1 μέσα στην οικογένεια γονιδίων S100A

για να μελετήσει περαιτέρω το μηχανισμό της Shh-Gli1 μονοπατιού σηματοδότησης για τη ρύθμιση της γονιδιακής οικογένειας S100, θα κατεβάσει τις ακολουθίες DNA των S100A γονίδια από Τράπεζας Γενετικού Υλικού και αναλύονται ομόλογες ακολουθίες Gli1 biding ιστοσελίδα (GACCACCCA) με τη χρήση BLASTZ εργαλείο βιοπληροφορικής . Τα στοιχεία βιοπληροφορικής έδειξε ότι σχεδόν όλα τα μέλη της οικογένειας γονιδίων S100A περιέχουν πολλά εξαιρετικά διατηρημένες ομόλογες αλληλουχίες (η διαφορά δεν είναι τίποτα περισσότερο από μια βάση) και αυτές οι πιθανές θέσεις Gli1 biding παρουσίασαν τα χαρακτηριστικά της διάταξης ταμπλό. Ο Πίνακας 3 έδειξε ότι η υποτιθέμενη Gli1 περιμένοντας περιοχές εντός της εγγύς ρυθμιστική περιοχή που περιέχει διαγονιδιακές περιοχές, διαγονιδιακών περιοχών, untranscripted περιοχές και αμετάφραστες περιοχές (όχι περισσότερο από 5,0 kb μακριά από TSS). Τα δεδομένα πιθανώς confered ένα κάπως υψηλότερο συνολικό βαθμό στοιχεία που αποδεικνύουν ότι οι υποψήφιοι αυτοί είναι στην πραγματικότητα που εκφράζονται διαφορικά στη ρύθμιση του καρκίνου του παγκρέατος, πιθανώς ως κατάντη στόχοι της έκτροπα επανενεργοποιηθεί.

Η

Το νέο γονίδιο-στόχο και της αποτελεσματική Gli1 δεσμευτικός προσδιορισμός θέσεις σε AsPC-1

Οι εκκινητές PCR για δοκιμασίες XChIP σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις αλληλουχίες υποκινητή 1.5kb μήκους του S100A2, Α4 και Α6 γονίδια, τα οποία περιέχουν διάφορες προβλεπόμενες θέσεις Gli1 biding (64~72 , 326~334, 418~426 για S100A2? -349~-357, -227~-235, 126~134 για S100A4?. -246~-254, 786~794 για S100A6 η ομολογία του κάθε site είναι 89%. ). (Πίνακας 3). Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών έδειξαν ότι XChIP μεταγραφικός παράγοντας Gli1 δεσμεύεται στους προαγωγούς S100A2, 4 και 6 γονιδίων αντίστοιχα στα καλλιεργημένα κύτταρα AsPC-1 (Σχήμα 2)

M:. DNA Marker? PC: RNA πολυμεράση II αντισώματος για XChIP θετικό έλεγχο? IP: Gli1 XChIP? IGG: IgG ποντικού για XChIP τυχαίο έλεγχο? NC:. Β-ακτίνης αντισώματος για XChIP αρνητικό έλεγχο

Η

Αποτελέσματα δοκιμασιών λουσιφεράσης έδειξαν ότι οι δραστηριότητες του υποκινητή pGL3-1500 S100A4 αυξάνεται με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου Gli1 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (

P

& lt? 0,05). Η pGL3-1.5 S100A4 Mut 2 ή 3 δεν είχε σημαντική επίδραση στη δραστηριότητα της λουσιφεράσης (

P

& gt? 0.05), ωστόσο, pGL3-1.5 S100A4 Μουτ 1 μειωμένη δραστηριότητα λουσιφεράσης σημαντικά σε σύγκριση με pGL3-1.5 S100A4 (

P

& lt? 0.05), που υποδεικνύουν ότι η περιοχή 1 μπορεί να είναι ενισχυτές της Gli1. Η λουσιφεράσης δραστηριότητα των πλασμιδίων περιέχει την τοποθεσία 1 αυξήθηκε σημαντικά (

P

& lt? 0,01) και ότι πλασμιδίων περιέχουν το site 2 ή 3 δεν μεταβλήθηκε σημαντικά (

P

& gt? 0,05). (Σχήμα 3Α, Β, C). Η αλληλουχία του site 1, ACCCACCAC, είχε επίσης αποδειχθεί να αναγνωριστούν και να sis-ενεργοποιούνται από πρωτεΐνες Gli1 προηγουμένως [24], [25]

Α:. S100A4 δραστικότητα λουσιφεράσης αυξάνεται με την αύξηση του επιπέδου έκφρασης της Shh σε AsPC-1 κύτταρα. Οι φορείς λουσιφεράσης pGL3-1.5 S100A4 και Renilla επιμολύνθηκαν παροδικά σε L-Gli1i μολυνθεί, L-C μολυνθεί ή L-Shh μολυσμένα κύτταρα AsPC-1 αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν για αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής χρησιμοποιώντας λουσιφεράση της Renilla και το L-C μολυσμένα ομάδα αυθαίρετα δοθεί μια τιμή 1. Β: Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης των μεταλλάξεων θέσης δέσμευσης S100A4 υποκινητή Gli1. AsPC-1 κύτταρα επιμολυσμένα με L-Shh επιμολύνθηκαν παροδικά 5mg κάθε κατασκεύασμα ανταποκριτού συμπεριλαμβανομένων pGL3-1.5 S100A4, S100A4 pGL3-1.5 Mut1, Mut2 και Mut3 αντίστοιχα. Η pGL3-1.5 S100A4 αυθαίρετα δοθεί μια τιμή 1 και οι δραστηριότητες των άλλων επιμολύνσεων ήταν προσαρμοσμένη σε σχέση με αυτή τη δραστηριότητα. C: Ιστοσελίδα 1 ήταν υπεύθυνος για Gli1 μεταγραφή. δραστικότητα σε σχέση λουσιφεράσης από διαφορετικές ομάδες AsPC-1 κύτταρο, L-Gli1i μόλυνση, L-Shh λοίμωξη ή LC μόλυνση, επιμολύνθηκαν με διαφορετικές κατασκευές, pGL3 1,5 S100A4 Mut 1-2, 2-3 και Mut Mut 1-3 με Renilla διανύσματα λουσιφεράση . Τα αποτελέσματα ήταν κανονικοποιούνται για την αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης με χρήση της Renilla λουσιφεράσης και το LC μολυσμένο ομάδα αυθαίρετα δοθεί μια τιμή 1. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

κανονισμός σημάτων Shh-Gli1 στην έκφραση S100A4 και στην εισβολή /μετανάστευση των κυττάρων PC μέσω διαμεσολάβηση S100A4 in vitro

για να μελετήσει περαιτέρω τη λειτουργία προ-μετάσταση Gli1 που προέρχονται S100A4 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, πέντε ομάδες κυττάρων PC, L-Gli1i, LC, L-Shh, L-Shh + siS100A4 MIS και L-Shh + siS100A4, χρησιμοποιήθηκαν για να αναλύεται ο κανονισμός της Shh-Gli1 σήματα σε S100A4, Ε-καδερίνης και γονιδίων VIM σε πραγματικό χρόνο RT-PCR και προσδιορισμούς δυτικό-κηλίδωση. Και στη συνέχεια τα ίδια πέντε κύτταρα ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί εισβολή /μετανάστευση των κυττάρων PC

in vitro από

επικοινωνούντα δοκιμασίες. Τα αποτελέσματα της qRT-PCR και κηλίδωση Western έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του S100A4 και VIM γονίδια αυξήθηκαν σημαντικά από την Shh /Gli1-έκφραση αυξάνεται. Σε αντίθεση, τα επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης ήταν σημαντικά μειωμένες ταυτόχρονα. (Σχήμα 4Α, C). Επιπλέον, η S100A4 νοκ-κάτω signifiantly αντιστραφεί μειωτικά E-cadherin και υπερεκφράζεται VIM που προκαλείται από την L-Shh μεταγωγή. (Σχήμα 4Β, D). Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών έδειξαν επικοινωνούντα η μετανάστευση των κυττάρων PC μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα L-Gli1i και αυξήθηκαν σε ομάδα L-Shh αντίστοιχα, σε σύγκριση με την ομάδα L-C (

P

& lt? 0,05). (Σχήμα 4Ε). Επιπλέον, siS100A4 ανέστρεψε σημαντικά την απόκριση των κυττάρων PC που επάγεται από την L-Shh μεταγωγής (

P

& lt? 0,01). (Σχήμα 4F). Έτσι, φαίνεται ότι S100A4 διαμεσολαβείται από abnomal ενεργοποιηθεί Shh-Gli1 μονοπατιού σηματοδότησης θα μπορούσε να είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες φιλο-μεταναστευτική σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Α:. Τα σχετικά επίπεδα μεταγραφής της Shh, Gli1, S100A4, Ε- cadherin και βιμεντίνης ρυθμίζονταν από την L-Gli1i /L-Shh μεταγωγή. Β: Τα σχετικά επίπεδα μεταγραφής του S100A4, Ε-καδερίνης και βιμεντίνη σε L-Shh επιμολυσμένα κύτταρα αντιστραφεί με μεταγωγή siS100A4. C: Τα επίπεδα έκφρασης του Gli1, S100A4, Ε-καδερίνη και βιμεντίνης πρωτεΐνες ρυθμίζονται από την L-Gli1i /L-Shh μεταγωγή. D: Τα επίπεδα έκφρασης του S100A4, Ε-καδερίνης και βιμεντίνης πρωτεΐνες αντιστραφεί με μεταγωγή siS100A4. Ε: Η εισβολή /μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος που ρυθμίζονται από L-Gli1i /L-Shh μεταγωγής αναλύθηκαν με επικοινωνούντα δοκιμασίες. ΣΤ: Η εισβολή /μετανάστευση της L-Shh επιμολυσμένα κύτταρα αντιστραφεί με μεταγωγή siS100A4. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της Shh, Gli1, S100A4 και πρωτεΐνες E-καντερίνης ιστούς PC

τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας έδειξε ότι οι θετικές χρώσεις της Shh. Gli1 και πρωτεΐνες S100A4 εντοπισμένες σχεδόν αποκλειστικά στα νεοπλασματικά κύτταρα δίπλα ασθενώς θετική χρώση της Shh στα κύτταρα νησιδίων και η χρόνια pancreatitic συγκρότημα αγωγού περιστασιακά να δει σε παγκρεατικά ιστούς εκτός από τον καρκίνο. Αντίθετα, η έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε ιστούς PC σε σύγκριση με το φυσιολογικό όγκο γειτονικούς ιστούς. Τα πρότυπα χρώσης των Shh και S100A4 ήταν διάχυτη κυτταροπλασματική τύπου, δηλαδή του Ε-καδερίνης ήταν διάχυτη τύπου cytomembrane και εκείνη του Gli1 εμφανίζουν περιπυρηνικών κυτταροπλασματική και πυρηνική χρώση. Επειδή το Gli1 ενεργοποιήθηκε μόνο μετά την είσοδο του πυρήνα, τα δείγματα με μόνο κυτταροπλασματική χρώση μετρήθηκαν ως αρνητική έκφραση. (Σχήμα 5). αναλογίες ανοσολογική αντίδραση ήταν 78,43% για το Shh (80 από 102), 51.96% για Gli1 (53 από 102), 81,37% για S100A4 (83 από 102) και 48.04% για το E-cadherin (49 από 102) σε δείγματα PC. Η ανάλυση των δοκιμών κατάταξης Spearman έδειξε ότι σημαντικές θετικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ των Shh, Gli1 και S100A4 στο επίπεδο της πρωτεΐνης στο PC (Shh vs Gli1: CC = 0.697,

P

& lt? 0,01? Σσσς vs S100A4: CC = 0.476,

P

& lt? 0,01? Gli1 vs S100A4: CC = 0.510,

P

& lt? 0,01). Αντίθετα, οι σημαντικές αρνητικές συσχετίσεις μεταξύ των τριών πρωτεϊνών και E-cadherin επιβεβαιώθηκαν (Shh vs E-cadherin: CC = -0,278,

P

& lt? 0,01? Gli1 vs E-cadherin: CC = -0,207,

P

& lt? 0,05? S100A4 vs E-cadherin: CC = -0,285,

P

& lt? 0,01)

Α:. Ισχυρή κυτταροπλασματική χρώση για Shh στον καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα (× 400)? Β: ασθενώς θετική χρώση για Shh στο συγκρότημα του πόρου της χρόνιας παγκρεατίτιδας ιστών (× 400)? C: ασθενώς θετική χρώση για Shh σε κύτταρα νησιδίων του φυσιολογικού πλευρά καρκινικού ιστού (χ 200)? D: negtive χρώση για Shh σε φυσιολογικά επιθηλιακά /κυψελοειδή κύτταρα του καρκίνου του πλευρά ιστού (χ 200)? Ε: Τα καρκινικά κύτταρα δείχνουν ισχυρή πυρηνική χρώση για Gli1 και κανονική πλευρά του καρκίνου ιστοί negtive (× 400)? F: Ισχυρή θετική περιπυρηνικών κυτταροπλασματική και πυρηνική χρώση μέρος για Gli1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (× 400)? G: Ισχυρή θετική κυτταροπλασματική χρώση για S100A4 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (× 400)? H: Θετική κυτταροπλασματική χρώση για Ε-καδερίνης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Μαύρα βέλη δείχνουν θετική περιοχή χρώση και λευκά βέλη δείχνουν προς negtive χρώση περιοχή.

Η

Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των τεσσάρων πρωτεϊνών και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά των ασθενών PC

Τα στοιχεία στατιστικής ανάλυσης έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης της Shh (CC = 0.245,

P

& lt? 0,05 και CC = 0.254,

P

& lt? 0,05) και S100A4 (CC = 0.265,

P

& lt? 0,01 και CC = 0.220,

P

& lt? 0,05) πρωτεΐνες συσχετίζεται θετικά με το μέγεθος του όγκου και των λεμφαδένων μεταστάσεων και του Gli1 πρωτεΐνης συσχετίστηκε θετικά με μεταστάσεις στους λεμφαδένες (CC = -0,370, P & lt ? 0,01), ενώ εκείνη της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης ήταν negtive συσχετίζονται με μεταστάσεις λεμφαδένα (CC = -0,203,

P

& lt? 0,05). Ωστόσο, δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ των τεσσάρων πρωτεϊνών και την ηλικία, το φύλο, την τοποθεσία και τη διαφοροποίηση του όγκου.

Συζήτηση

Κατά την ενεργοποίηση των ιστών μορφογένεση του μονοπατιού σηματοδότησης Hh συνοδεύουν σχεδόν την εμφάνιση των EMT και αυτό διαδικασία απαιτείται για τη μετανάστευση της Hh κύτταρα που αποκρίνονται [26], [27]. Έχει αναφερθεί ότι οι μηχανισμοί της οδού σηματοδότησης Shh-Gli1 προώθηση κακοήθων όγκων που εμπλέκονται σε πολλές πτυχές του κακοήθους βιολογικών συμπεριφορών αλλά ο κύριος ρόλος του σε όγκους είναι η προώθηση της ΕΜΤ και να διατηρούν βλαστικά κύτταρα όγκου [28]. Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε μια συστηματική έρευνα για τον μηχανισμό της Gli1 σε ένα υψηλής μετάστασης παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική γραμμή, AsPC-1. Η κυτταρική γραμμή AsPC-1 περιέχει δύο γονιδιακή μετάλλαξη Ki-ras και το γονίδιο διαγραφή DPC4, οι οποίες ήταν τυπικά καρκίνο του παγκρέατος μοριακό παθολογική αλλαγή [29], [30]. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης της Gli1 χτυπήθηκε κάτω μέτρια χρησιμοποιώντας το σύστημα παρεμβολής RNA, το οποίο ήταν πιο συνεπής με την πραγματική μοριακή παθολογική αλλαγή του καρκίνου του παγκρέατος από τεχνητές γονιδίου νοκ-άουτ. Έτσι, το φάσμα του γονιδίου στόχου που λαμβάνονται στον έλεγχο μας ήταν πιο συνεπής με την πραγματική κατάσταση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος.

Μέχρι σήμερα, τουλάχιστον 25 μέλη έχουν αναφερθεί ότι ανήκουν στην οικογένεια S100 στον άνθρωπο. Είκοσι ένα από αυτά κωδικοποιούνται από τα γονίδια συγκεντρωμένα σε θέση χρωμοσώματος 1q21, γνωστή ως το σύμπλοκο επιδερμική διαφοροποίηση (EDC) με συμμετοχή στην κυτταρική διαφοροποίηση επιθηλιακών προερχόμενο [31]. Έχει αναφερθεί ορισμένα μέλη αυτής της οικογένειας έχουν υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου και οι λειτουργίες τους ενδέχεται να εμπλέκονται μετάσταση και EMT [32] – [34]. Η ΔΑΠ περιέχει δύο ομάδες διαδοχικά διανέμονται γονιδίων S100A. Μια ομάδα περιέχει S100A1, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2-S100A7, S100A15, S100A8, S100A12 και S100A9 και το άλλο περιέχει FLG, HRNR (S100A18), RPTN, TCHH, TCHH1 (S100A17), S100A11 και S100A10. Τα άλλα γονίδια που ανήκουν στις υπο-οικογένειες των S100B, S100P, S100Z και S100G είναι, αντίστοιχα, που βρίσκεται στο χρωμόσωμα τόπους 21q22, 4ρ16, 5q14 και Xp22. Έχει αναφερθεί ότι τα γονίδια S100A είχαν κοινή προέλευση στη μοριακή εξέλιξη, ενώ S100B, της S100P, S100Z και S100G είχε διαφορετική προέλευση, οπότε γονίδια S100A μπορεί να έχει μια καθολική διατηρημένες ρυθμιστικές ακολουθίες [35]. Δεδομένου εξαιρετικά διατηρημένη δεσμευτική Gli1 ομόλογες ακολουθίες τους, εικάζεται ότι παίζουν παρόμοιο ρόλο που σχετίζονται με Gil1, αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι έχουν διαφορετικές λειτουργίες που δεν σχετίζονται με Gil1. Τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι η έκφραση των S100A οικογένεια γονιδίων σε κύτταρα PC έχει τρεις τρόπους: Πρώτον, την έκφραση και ανάλογα με Gli1? δεύτερο, εκφράζοντας αλλά όχι ανάλογα με Gli1? Τρίτον, δεν εκφράζουν. Συνδυάζοντας πρόβλεψη ενισχυτή Gli1 με δεδομένα μικροσυστοιχιών, έχουμε σκεφτεί ότι Gli1 γονίδια ρυθμιζόμενη S100A μέσα από τα στοιχεία δρώντα θα μπορούσε να είναι μια θεμελιώδης λειτουργία της ρύθμισης. Προηγούμενη μελέτη είχε αναφέρει ότι S100A7 και S100A9 μεταγραφής επάγεται από την αγωγή GlI1 σε επιδερμικά κύτταρα [25]. Κατά τη διάρκεια της εξελικτικής διαδικασίας μερικά S100A έκφραση των γονιδίων μπορεί να απενεργοποιηθεί λόγω απόκτηση άγνωστη αλληλουχία καταστολέα και, στη συνέχεια, κάποια από αυτά τα γονίδια μπορεί να ενεργοποιηθεί και πάλι, αλλά δεν ήταν πλέον ρυθμίζονται από Gli1 ως αποτέλεσμα της απόκτησης πρόσθετων στοιχείων δρώντα. Αυτή η υπόθεση μπορεί εν μέρει να ερμηνεύσει γιατί η έκφραση της οικογένειας S100A χαρακτηρίζεται από επιλεκτικότητα ιστού αν και εξακολουθεί να είναι η έλλειψη επαρκών αποδεικτικών στοιχείων. Λεπτομερείς μελέτες συγκριτική γονιδιωματική μεταξύ διακριτών ειδών, καθώς και διαφορετικά γονίδια S100A θα μπορούσε να βοηθήσει στην περαιτέρω καταλάβουμε τους ακριβείς μηχανισμούς. Σε μικροανάλυσης μας και τις επακόλουθες πραγματικού χρόνου PCR μελέτες, αρκετά γονίδια S100A, συμπεριλαμβανομένων S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 και S100A14, ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε απάντηση Gil1. Αρκετά από αυτά τα γονίδια S100A όπως S100A2, Α4 και Α6 έχουν δειχθεί να εμπλέκονται σε καρκίνο του παγκρέατος. Σε αυτή τη μελέτη τα δεδομένα των αναλύσεων έδειξαν ότι XChIP μεταγραφικός παράγοντας Gli1 συνδεδεμένο με τις ρυθμιστικές αλληλουχίες των γονιδίων S100A2, Α4 και Α6, αντιστοίχως σε κύτταρα AsPC-1, που πρότεινε ότι αυτά τα γονίδια μπορεί να είναι cis-ρυθμίζεται από Gli1.

Μελέτες έχουν δείξει ότι οι λειτουργίες των μελών της οικογένειας του γονιδίου S100 ήταν πολύπλοκες και ποικίλες και Μέχρι στιγμής, μόνο S100A4 βρέθηκε να συνδέεται στενά με τη διαδικασία EMT. Επιπλέον, σε προηγούμενες μελέτες έχουμε προτείνει την υπόθεση ότι S100A4 γονίδιο θα μπορούσε να είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες για την EMT μοριακό δίκτυο ρυθμίζεται από την Shh-Gli1 μονοπατιού σηματοδότησης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [19]. Ως εκ τούτου, S100A4 γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως παράδειγμα για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ των σημάτων Shh-Gli1 και την οικογένειά του γονιδίου S100. Ως θέμα πραγματικότητα, πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης S100A4 σε ιστό καρκίνου, παγκρεατικό υγρό και ορό ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος ήταν σημαντικά αυξημένα [36] – [38]. Μερικές μελέτες έχουν εννοηθεί ότι S100A4 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μια πιθανή βιοδείκτη του καρκίνου του παγκρέατος [39]. Ωστόσο, ο λόγος γονιδίου S100A4 ήταν υπερεκφράζεται επιλεκτικά στο PC ήταν αβέβαιο. Ίσως γονίδιο S100A4 μπορούσε να ρυθμίζεται από ορισμένα ενεργοποιούνται επιλεκτικά σηματοδοτικό μονοπάτι ταυτόχρονα σε καρκίνο του παγκρέατος. Στην παρούσα μελέτη, για πρώτη φορά, βρέθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του S100A4 πρωτεΐνης συσχετίζεται θετικά με την δραστικότητα των σημάτων Shh-Gli1 σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς και την πρωτεΐνη Gli1 απορυθμίζεται S100A4 mRNA μέσω τρόπο cis-ενεργοποίηση σε κύτταρα PC που εγκατεστημένη μια ακριβή μοριακό μονοπάτι από την Shh-Gli1 σήματα σε S100A4 στα κύτταρα PC.

Παρά το γεγονός ότι η ενεργοποίηση του Hh σηματοδοτεί σχεδόν συνόδευσε την εμφάνιση των EMT, μέχρι σήμερα, δεν υπήρξε καμία απόδειξη ότι Gli1 ρυθμίζονται απευθείας σαλιγκάρι /Slug μεταγραφή. Έχει αναφερθεί ότι S100A4 και Ε-καδερίνης ήταν αντιστρόφως ρυθμίζονται σε διάφορα συστήματα κυττάρου και S100A4 προώθησε την έκφραση των ουσιωδών παραγόντων μεταγραφής, Twist και σαλιγκάρι, κατά τη διαδικασία EMT, καθώς και δείκτες μεσεγχυματικά, συμπεριλαμβανομένων VIM και MMPs [40]