Αφηρημένο

καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Χρωμοσωμικής αστάθειας (CIN) είναι μια σημαντική κινητήρια δύναμη της μικροδορυφόρων σταθερό (MSS) σποραδικές CRC. Οι CIN όγκοι χαρακτηρίζονται από ένα μεγάλο αριθμό σωματικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών αριθμού αντιγράφων (SCNA) που επηρεάζουν συχνά ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια. Ο κύριος στόχος αυτής της εργασίας ήταν να εντοπίσει τα νέα υποψήφια γονίδια του οδηγού CRC που πλήττονται από επαναλαμβανόμενες και εστιακή SCNA. συγκριτική γονιδιώματος υβριδισμού (CGH) συστοιχίες γονιδιώματος σε επίπεδο υψηλής ανάλυσης χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση του όγκου και φυσιολογικό ΟΝΑ για 53 σποραδικές περιπτώσεις CRC. Πλαίσιο διορθωθεί κοινή εκτροπή (COCA) ανάλυση και custom αλγορίθμων εντοπίστηκαν 64 διαγραφές και 32 τα κέρδη της εστίασης ελάχιστα κοινά περιοχές (FMCR) σε υψηλή συχνότητα (& gt? 10%). Η σύγκριση αυτών των FMCR με δημοσιεύεται γονιδιωματική προφίλ από CRC αποκάλυψε κοινή επικάλυψη (42,2% των διαγραφών και 34,4% των κερδών αντίγραφο). Ανάλυση οδός έδειξε ότι μονοπατιών της απόπτωσης και σηματοδότηση p53 επηρεάστηκαν συνήθως από διαγραφεί FMCR, και ΜΑΡΚ και μονοπάτια διαύλου καλίου από τα κέρδη της FMCR. Υποψήφια γονίδια καταστολείς όγκων σε διαγράφεται FMCR περιλαμβάνονται

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2 και NFKBIA

και των υποψήφιων ογκογονίδια στο απέκτησε FMCR περιλαμβάνονται

PRDM16

,

TNS1, RPA3 και KCNMA1

. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη επιβεβαιώνει κάποιες προηγουμένως εντοπίστηκαν εκτροπές στην MSS CRC και παρέχει

in silico

αποδεικτικά στοιχεία για κάποια νέα γονίδια υποψήφιος οδηγός

Παράθεση:. Burghel GJ, Lin WY, Whitehouse Η, Brock μου , Hammond D, Bury J, et al. (2013) Ταυτοποίηση υποψήφια γονίδια οδηγού στο κοινό εστιακό χρωμοσωμικών ανωμαλιών του μικροδορυφορικού Σταθερό του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (12): e83859. doi: 10.1371 /journal.pone.0083859

Συντάκτης: Amanda Ewart Toland, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 του Ιουλίου του 2013? Αποδεκτές: 8 Νοέμβρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 18, Δεκεμβρίου, 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο του Sheffield (Ιατρική Σχολή Οδοντιατρική και Υγείας) PhD υποτροφία, και Έρευνας και το βραβείο καινοτομίας, καθώς και ένα Yorkshire Cancer Research PhD διδακτορικής (S003PHD). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και η δεύτερη στις γυναίκες [1]. Περισσότεροι από 1 εκατομμύριο νέες CRC περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο και ~ 600.000 θανάτων που συνδέονται με εκτιμήθηκαν σε όλο τον κόσμο για το έτος 2008, καθιστώντας CRC το 3

ου υψηλότερη αιτία του καρκίνου του θανάτου που σχετίζονται με τα δύο φύλα [1,2]. Χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) είναι η πιο κοινή μορφή της γονιδιωματικής αστάθειας στην CRC και συσχετίζεται με 65-85% των σποραδικών περιπτώσεων CRC [3-6]. Οι όγκοι που αναπτύσσονται μέσω της οδού CIN που χαρακτηρίζεται από συχνές αριθμητική ή /και διαρθρωτικές κέρδη και οι ζημίες των χρωμοσωμικών τμημάτων ή ολόκληρα χρωμοσώματα σε σημαντικά αυξημένο ρυθμό σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα [7]. CIN όγκοι είναι γνωστό ότι σχετίζονται με το

TP53

μεταλλάξεις και τα χαμηλά επίπεδα των μικροδορυφόρων αστάθεια (MSI) [8,9]. CIN πιστεύεται ότι οδηγούν την ανάπτυξη CRC μέσω αντίγραφο κέρδος αριθμός των ογκογονιδίων όπως

MYC

και η διαγραφή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως

Smad4

και

TP53

[3,9 -13]. Η άποψη αυτή ενισχύεται από την ένωση που παρατηρείται μεταξύ του αριθμού αντιγράφων ανωμαλίες των γονιδίων του καρκίνου που σχετίζονται με, και τα επίπεδα έκφρασής τους σε δείγματα CRC [14-16].

Παρά το γεγονός ότι οι περισσότερες από τις χρωμοσωμικές ανωμαλίες προκύπτουν σε ένα τυχαίο τρόπο, μερικά είναι επαναλαμβανόμενες και βρίσκονται συνήθως σε άλλους τύπους καρκίνου εκτός από CRC [13,16,17]. Η αυξημένη συχνότητα ορισμένων σωματικών αριθμού αντιγράφων εκτροπές (SCNA) είναι πιθανώς αποτέλεσμα κλωνική επιλογή κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου. Περιοδική SCNA παρέχουν στον όγκο με ένα τρόπο στόχευσης ογκοκατασταλτικών γονιδίων και ογκογονίδια για την απόκτηση ενός ή περισσοτέρων από τα χαρακτηριστικά του καρκίνου και το αυτοκίνητο ογκογένεση [13]. έχουν αρκετά κοινά χρωμοσωμικές ανωμαλίες έχουν ταυτοποιηθεί μέσω συμβατικών κυτταρογενετική τεχνικές, όπως η μετάφαση συγκριτική γονιδίωμα υβριδισμός (CGH) και φθορίζοντα in situ υβριδισμού (FISH) [18-20]. Αυτές οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες περιλαμβάνουν κέρδη 8q, 13q και 20q και οι απώλειες των 18q, 5q, 8p, 17q [18,20]. Ωστόσο, λόγω του μεγάλου μεγέθους τους, την ταυτοποίηση των συγκεκριμένων γονιδίων του οδηγού μέσα σε αυτές τις περιοχές είναι προβληματικό [16,17,21].

Η χρήση του array-CGH βάση επιτρέπει την απόκτηση του γονιδιώματος σε επίπεδο πληροφοριών με υψηλή ανάλυση (προς τα κάτω σε μερικές κιλοβάσεις) και τον προσδιορισμό των εστιακών και ελάχιστη κοινή περιοχές (FMCR) [16,17]. FMCR είναι συνήθως μικρότερα από 3Mb σε μέγεθος και ως εκ τούτου να περιέχουν ένα σχετικά μικρό αριθμό γονιδίων, ως εκ τούτου, απλοποιώντας την ταυτοποίηση των γονιδίων οδηγού [16,17]. Πρόσφατα, FMCR έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση νέων γονιδίων οδηγού καρκίνου με δυνητική θεραπευτική και προγνωστική αξία σε αρκετούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου CRC [16,17,22-27]. Ο κύριος στόχος αυτής της εργασίας ήταν να εφαρμόσει μια σειρά από αναλυτικές προσεγγίσεις με βάση τα δεδομένα CGH σειρά που βασίζεται σε υψηλής ανάλυσης για ένα σύνολο σποραδικές μικροδορυφόρων σταθερών όγκων (MSS) CRC τόσο αναπαράγουν τις παρατηρήσεις των ανωμαλιών που προσδιορίζονται σε προηγούμενες μελέτες και ταυτοποίηση νέων υποψήφιων γονίδια του οδηγού CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Θέματα έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή δεδομένων και δειγμάτων και η μελέτη εγκρίθηκε από South Yorkshire Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας (UK) (09 /H1310 /54).

Τα άτομα της μελέτης και των δειγμάτων DNA

Τα δείγματα ιστών ήταν διαθέσιμα από 53 ασθενείς με MSS παχέος όγκους. Τριάντα οκτώ από αυτά ήταν που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για πρωτοπαθή όγκο παχέος εντέρου στο Sheffield Royal Hallamshire και τις Σέφιλντ της Βόρειας Γενικά Νοσοκομεία (Μάρτιος 2001 – Ιούνιος 2005). Δεκαπέντε από τα δείγματα ιστού περίπτωση ήταν από το Sheffield Royal Hallamshire Νοσοκομείο τράπεζα ιστών (HTA License 12182). Πριν από τη συμμετοχή στη μελέτη, η κατάσταση του όγκου όλων των δειγμάτων επιβεβαιώθηκε από έναν παθολόγο (JB). Όλα τα δείγματα ιστού όγκου ήταν μικρο-ανατομή πριν από την εκχύλιση του DNA, έτσι ώστε το εκχυλισμένο υλικό περιείχε τουλάχιστον 80% των καρκινικών κυττάρων. δείγματα DNA από περιφερικό αίμα ή φυσιολογικούς ιστούς κόλου ήταν επίσης διαθέσιμα από το σύνολο των προσληφθεί ασθενών. Πρόσθετα στοιχεία, συμπεριλαμβανομένων? το φύλο, τη θέση του όγκου, το βαθμό διαφοροποίησης, το στάδιο και την ηλικία της διάγνωσης ήταν διαθέσιμα από τα αρχεία παθολογία (Υλικά και Μέθοδοι S1). Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από τον όγκο, τον φυσιολογικό ιστό και δείγματα περιφερικού αίματος χρησιμοποιώντας το QIAamp DNA MINIKIT, (Quiagen, Hilden, Germany).

MSI κατάσταση

Η κατάσταση MSI όλων των DNA καρκινικών δείγματα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Σύστημα Ανάλυσης MSI, v1.2 (Promega, Madison, USA), με βάση τους δείκτες μικροδορυφόρων μονονουκλεοτίδιο ΒΑΤ-25, ΒΑΤ-26, NR-21, NR-24 και MONO-27. PCR προϊόντα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ PRISM

TM 3730 DNA αναλυτή και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό v4.0 genemapper (Applied Biosystems, Warrington, UK). Δείγματα χωρίς ασταθή δείκτες ταξινομήθηκαν ως MSS [28]. Το κιτ ανάλυση MSI περιλαμβάνει επίσης 2 πολύ πολυμορφικών δεικτών πεντα-νουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της ταυτότητας του δείγματος.

αλληλουχίας και μετάλλαξης ανάλυση

Για την ανάλυση μετάλλαξης του

BRAF

εξόνιο 15 ,

KRAS

εξόνιο 2,

APC

σύμπλεγμα μετάλλαξη περιοχή (MCR),

TP53

εξώνια 4-9 και

PIK3CA

εξόνια 9 και 12, το αντίστοιχες εξόνια ενισχύθηκαν με PCR (Primer αλληλουχίες που απαριθμούνται στο Υλικά και Μέθοδοι S1), και αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας PRISM

TM BigDye Terminator v3.1 πρότυπο prototcol (Applied Biosystems). Τα δεδομένα αλληλουχίας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Staden [29] και μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με σύγκριση με την αλληλουχία αναφοράς NCBI. Οι αριθμοί πρόσβασης που παρέχονται στα Υλικά και Μέθοδοι S1.

aCGH προφίλ

Agilent ολόκληρο το γονιδίωμα CGH arrays 4x44K (Σχεδιασμός ID 014950) και 4x180K (Σχεδιασμός ID 022060) εφαρμόστηκαν στις 6 και 47 δείγματα, αντίστοιχα (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Οι συστοιχίες περιείχε 60-μερή ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές για 42.494 (44K) και 170.334 (180K) διακριτές χρωμοσωματικές περιοχές με μέση απόσταση ανιχνευτή 43KB (44K) και 13kb (180K). Οι αναλύσεις διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο v6.0 CGH Agilent ολιγονουκλεοτίδιο array-based. αξιολόγηση της ποιότητας των συστοιχιών βασίστηκε στην αναλογία εξάπλωσης παράγωγο log (DLRS), η ένταση του σήματος και η επαναληψιμότητα, το θόρυβο του περιβάλλοντος, η τοποθέτηση διάταξης πλέγματος και ανιχνευτές ακραία παρουσιάζονται από το λογισμικό εξαγωγή χαρακτηριστικών Agilent (v 10.5.1.1) ως 11 και ορίζεται μετρήσεις QC ( μικροσυστοιχιών πληροφορίες πρόσβασης δεδομένων:. GSE 418.413)

array CGH ανάλυση δεδομένων

Η ανάλυση aCGH πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της γονιδιωματικής λογισμικό πάγκο εργασίας Agilent (v 5.0.14). SCNA ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας την ποιότητα σταθμίζονται αλγόριθμο διάστημα βαθμολογία, που ονομάζεται επίσης η μέθοδος ανίχνευσης εκτροπή 2 (ADM2) αλγόριθμο (Όριο: 6.0) με προεπιλογή συγκεντρωτισμό και ασαφής μηδενική διόρθωση. Προεπιλεγμένη λειτουργία και εκτροπή φίλτρα εφαρμόστηκαν και επαναλήψεις καθετήρα ενδο-array συνδυάστηκαν. δείγματα όγκου θεωρήθηκαν χρωμόσωμα ασταθές εάν εντοπίστηκαν μία ή περισσότερες σημαντικές εκτροπές [8]. Επαναλαμβανόμενες SCNA ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πλαίσιο διορθωθεί κοινή εκτροπή αλγόριθμο (COCA) με μια χρωμοσωμική πεδίο, μια τιμή ρ 0,05 και όριο επικάλυψη των 9.0.

FMCR ορίστηκαν ως περιοχές που είναι λιγότερο από ό, τι 3Mb σε μέγεθος και ορίζεται από τουλάχιστον 2 ανεξάρτητες εστιακή ή επικαλυπτόμενες SCNA (θεωρούνται ως εκδηλώσεις μέγεθος προσδιορισμού (ΣΔΕ)). Μια ελάχιστη συχνότητα & gt? 10% των περιπτώσεων και ένα σκορ COCA του ~ Επίσης απαιτούνται 2,0 (p-value = 0,01).

Τεχνική επικύρωση

Για την επικύρωση των αποτελεσμάτων aCGH, 2 διπλά πειράματα χρησιμοποιώντας 44K και 180K συστοιχίες πραγματοποιήθηκαν. Επιπλέον, 3 FMCR (2 διαγράφεται και 1 ενισχυμένα) επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας τον αριθμό αντιγράφων ποσοτική PCR.

ανάλυση TP53

ΑΕ με βάση τα αποτελέσματα αλληλουχίας χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσετε τις διαγραφές 17ρ.

Αποτελέσματα

CIN, MSI και μετάλλαξης κατάσταση

Τα 53 δείγματα που επιλέγονται για αυτή τη μελέτη ήταν MSS. Η ανάλυση των

APC, TP53

,

KRAS

,

BRAF

και

PIK3CA

μεταλλάξεις έδειξαν ότι η συχνότητα και το πρότυπο αυτών των μεταλλάξεων συμφωνούν με προηγουμένως δημοσιευθεί δεδομένα για MSS σποραδικές CRC [30-33] και (https://www-p53.iarc.fr/index.html). Από τις 53 περιπτώσεις CRC αναλύεται με επιτυχία array CGH, 5 δεν είχε σημαντικές εκτροπές και θεωρήθηκαν χρωμόσωμα σταθερή. Ο αλγόριθμος ADM2 παρέλειψε να καλέσει εκτροπές για 2 δείγματα και ένα επιπλέον δείγμα απέτυχε στο & gt? 4 QC μετρήσεις. Μια περίληψη των μοριακών χαρακτηριστικών των 53 δειγμάτων παρουσιάζεται στον Πίνακα S1 στο S1 αρχείου.

Κατανομή της κοινής SCNA

Ένα σύνολο 3097 SCNA εντοπίστηκαν στις 45 χρωμόσωμα ασταθή περιπτώσεις. Ο αριθμός των SCNA ανά δείγμα κυμαίνονταν 1-411, με διάμεση τιμή των 43 ανά δείγμα. SCNA κυμαίνονταν σε μέγεθος από 0.014Mb-147.48Mb (διάμεση τιμή: 2.29MB). Μια επισκόπηση του προτύπου και συχνότητες αυτών των SCNA παρουσιάζεται στο Σχήμα 1. Οι πιο κοινές κέρδη ήταν σε περιοχές του χρωμοσώματος 20q (73,3%, n = 33), 13 (57,8%, n = 26), 8q (53,3%, n = 24), 7 (51.1%, η = 23) και Χ (51,1%, n = 23) και οι πιο κοινές διαγραφές έγιναν στις περιοχές του χρωμοσώματος 18 (55,6%, n = 25), 8ρ (51,1%, n = 23) και 17β (51,1%, n = 23). Μερικές από αυτές τις περιοχές περιέχουν βασικά γονίδια του οδηγού CRC, όπως

MYC

σε 8q,

Smad4

σε 18q και

TP53

σε 17p. Μια περίληψη της SCNA για κάθε δείγμα παρουσιάζονται στον Πίνακα S1 στο File S1 και Σχήμα 2.

Δεδομένα από τη συστοιχία μορφή 180K απεικονίζονται. Το κόκκινο αντιπροσωπεύει τα κέρδη και το πράσινο αντιπροσωπεύει διαγραφές. Ο γ-άξονας απεικονίζει τη συχνότητα.

Η

Η εκπροσώπηση του συνόλου του ΚΥΠΕ προσδιορίζονται στο 40 χρωμόσωμα ασταθή περιπτώσεις που αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα 180K. Το κόκκινο αντιπροσωπεύει το κέρδος και το πράσινο αντιπροσωπεύει τη διαγραφή. Διακεκομμένες γραμμές σηματοδοτούν κεντρομερίδια. Μοριακή και κλινικά χαρακτηριστικά, ώστε από την κορυφή?

PIK3CA

,

APC

, TP53, KRAS και BRAF κατάσταση μετάλλαξης (μπλε και άσπρο αντιπροσωπεύει μεταλλαγμένων και WT αντίστοιχα), CIMP (κόκκινο, πορτοκαλί και πράσινο αντιπροσωπεύουν CIMP-Η, CIMP-L και CIMP-Ν αντίστοιχα), το φύλο του ασθενούς (ροζ και γκρι αντιπροσωπεύουν θηλυκό και αρσενικό, αντίστοιχα) και τη θέση του όγκου (κίτρινο και κυανό αντιπροσωπεύουν εγγύς και άπω αντίστοιχα).

Η

κοινή ανάλυση εκτροπή και FMCR

από το 3097 SCNA προσδιορίζονται στους 45 χρωμόσωμα ασταθή δείγματα, 1689 εκτροπές ήταν εστίασης (& lt? 3.0MB) που κυμαίνονται σε μέγεθος από 0.014Mb μέχρι 3.00Mb (διάμεση τιμή: 0.71Mb). Οι εστιακές ανωμαλίες αποτελούνταν από 746 κερδών αντίγραφο με ένα εύρος μεγέθους των 0.014Mb-2.99Mb (διάμεση τιμή: 0.92Mb) και 943 διαγραφές, με ένα εύρος μεγέθους των 0.025Mb-3,00 Mb (διάμεση τιμή: 0.58Mb). Για τον προσδιορισμό FMCR, COCA ανάλυση σε συνδυασμό με τους ορισμούς που περιγράφονται στις μεθόδους εφαρμόστηκαν στην έξοδο ADM-2 και η ανάλυση αυτή είχε ως αποτέλεσμα την ταυτοποίηση 64 διαγραφές και 32 κέρδη που πληρούν τα κριτήρια FMCR. Το 64 διαγράφεται FMCR κυμαίνονταν σε μέγεθος μεταξύ 0.03-2.64Mb (διάμεσος: 0.42Mb) και περιείχε συνολικά 714 γνωστών γονιδίων με μια σειρά από 0-69 γονιδίων διαγράφονται ανά περιοχή (διάμεσος: 4 γονίδια) (Πίνακας S2 σε S1 File) . Το 32 αποκτήθηκε FMCR κυμάνθηκε μεταξύ 0.03-1.96Mb σε μέγεθος (μέσος: 0.83Mb) και περιείχε συνολικά 288 γνωστών γονιδίων με μια σειρά από 0-34 γονιδίων που αποκτήθηκε ανά περιοχή (διάμεσος: 3 γονίδια) (Πίνακας S3 σε S1 File) .

Αναγνώριση γνωστά γονίδια του καρκίνου του FMCR

Για την αναγνώριση γνωστά γονίδια του καρκίνου εντός του διαγράφεται και κέρδισε FMCR, οι κατάλογοι γονίδιο FMCR συγκρίθηκαν τόσο πλήρης κατάλογος γονίδιο από το έργο της απογραφής γονίδιο του καρκίνου ( https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census/, πρόσβαση Ιουνίου 2013), και το CRC και του καρκίνου του μαστού τα γονίδια του οδηγού εντοπίστηκαν σε πρόσφατη μελέτη υψηλής απόδοσης εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας [34]. Αυτή η ανάλυση έδειξε την παρουσία 27 «γονιδίων του καρκίνου» που βρίσκεται εντός του διαγράφεται FMCR (~ 3,8% του συνολικού αριθμού των διαγραμμένων γονιδίων? Πίνακας S2 σε File S1) και 11 «γονίδια του καρκίνου» υπό την αποκτήθηκε FMCR (~ 3,8% της συνολικός αριθμός των κερδίσει γονίδια?. πίνακα S3 στο S1 αρχείου)

Η εμφάνιση ενός γονιδίου του καρκίνου εντός ενός FMCR δεν σημαίνει κατ ‘ανάγκην ότι ενεργεί ως ένα γονίδιο του οδηγού. Για ορισμένους «γονίδια του καρκίνου», ο τύπος του FMCR (διαγράφονται ή ενισχυμένα) δεν ήταν σύμφωνη με τη γνωστή λειτουργία του γονιδίου, ένα παράδειγμα είναι η διαγραφή του γνωστού ογκογονιδίου

NRAS

. Ωστόσο, η λειτουργία του γονιδίου και ο τύπος του FMCR ήταν συχνά συνεπής με την προσδοκία, παραδείγματα που περιλαμβάνουν διαγραφές

MAP2K4

και

CDKN2C

(Πίνακας S2 σε File S1) και το κέρδος του

FGFR1

(Πίνακας S3 στο αρχείο S1). Ίσως, το πιο σημαντικό, η κλασική

Smad4

ογκοκατασταλτικό διαγραφή και ογκογόνο

MYC

κέρδος ήταν τόσο παρατηρήθηκαν εντός διαγράφεται και κέρδισε FMCR αντίστοιχα. Η συχνότητα και των δύο

Smad4

διαγραφές και

MYC

κέρδη στα 45 χρωμόσωμα ασταθή περιπτώσεις ήταν υψηλή σε ~ 53% (Πίνακες S2 & amp? S3 στο αρχείο S1).

σύγκριση με στοιχεία που δημοσιεύονται SCNA

για να διασταυρούμενη επικύρωση των αποτελεσμάτων μας με δημοσιευμένα στοιχεία, συγκρίναμε την FMCR σε κοινές χρωμοσωμικές ανωμαλίες λιγότερο από 3Mb εντοπιστεί σε τέσσερις πρόσφατες μελέτες CRC [13,16,22,35] . Το σύνολο των εστιακών εκτροπών που προσδιορίζονται σε αυτές τις μελέτες ήταν 187 κέρδη και 189 διαγραφές. Μεταξύ των 4 δημοσιευμένες μελέτες, υπήρχαν μόνο 10 επικαλυπτόμενες εστιακό διαγραφές (5,3%) και 29 επικαλυπτόμενες εστιακό κέρδη (15,5%). Ένα υψηλότερο ποσοστό του FMCR στη μελέτη μας επικαλύπτονται τα δημοσιευμένα περιοχές. Συνολικά, 27 από μας 64 διαγράφεται FMCR (42,2%) και 11 του μας 32 αποκτήσει FMCR (34,4%) επικαλύπτονται εστιακό διαγραφές και κέρδη στις 4 δημοσιευμένες μελέτες.

Ένα μεγάλο SCNA μελέτη διεξήχθη πρόσφατα σε 26 διαφορετικούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων CRC [17]. Η μελέτη εντόπισε μια λίστα με τα 20 πιο κοινά σωματικά διαγραφές και κέρδη σε όλες τις αναλύονται τύπους καρκίνου. Επιπλέον, ένα γονίδιο υποψήφιος οδηγός είχε επιλεγεί για κάθε ένα από τα κοινά SCNA. Μια σύγκριση μεταξύ FMCR μας και τα πιο κοινά περιοχές στη μελέτη Beroukhim et al αποκάλυψε μια επικάλυψη με 5 από τις περιοχές διαγραφής (25% του συνόλου) και 3 από τις περιοχές κέρδους (15% του συνόλου). Όλα τα υποψήφια γονίδια που προσδιορίζονται από Beroukhim και οι συνεργάτες του στη μελέτη τους περιέχονταν μέσα στις επικαλυπτόμενες περιοχές από FMCR μας.

Διαδρομή ανάλυση

Για να αναζητήσετε οποιαδήποτε συγκεκριμένα μοτίβα ή πορείες επηρεάζονται από τα γονίδια εντός του διαγραφούν ή να αποκτήσει FMCR, η βάση δεδομένων για το σχολιασμό, οπτικοποίηση, και Ολοκληρωμένων Discovery χρησιμοποιήθηκε (David) v6.7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [36]. DAVID πραγματοποιεί εμπλουτισμό ανάλυση (με βάση τις βιολογικές τους σχολιασμούς των γονιδίων-στόχων) για τον εντοπισμό τυχόν βιολογικές οδούς που είναι στατιστικά σημαντικά υπερεκπροσωπούνται στη λίστα αναλύονται γονίδιο [36]. Για τη διαγραφή FMCR, η πιο εμπλουτισμένο οδός σχετίζονται με τον καρκίνο ήταν απόπτωση (P = 0,014) (Εικόνα S1) με 10 αποπτωτικών γονιδίων που συμβαίνουν εντός της διαγράφεται FMCR. Επτά από αυτά τα γονίδια (

CASP3

,

CASP8

,

CASP10

,

NFKBIA

,

CAPN1

,

BAD

,

TNF

και

TNFRSF1A

) έχουν προ-αποπτωτικών ρόλους και 3 (

PIK3R5, PIK3R2 και CFLAR

) είναι αντι-αποπτωτική. Επίσης, το μονοπάτι σηματοδότησης ρ53 εμπλουτισμένο σε διαγραμμένες περιοχές (Ρ = 0.079) με 5 επηρεάζονται γονίδια (Σχήμα S2)?

CCNB1

,

GADD45G

,

SERPINE1

,

SESN2

και

SFN

, τα οποία έχουν αναφερθεί λειτουργίες αντι-επιβίωσης.

Από την άλλη πλευρά, η ογκογόνος σηματοδότηση ΜΑΡΚ μονοπάτι ήταν η πιο υπερεκπροσωπούνται μονοπάτι στο αποκτήθηκε FMCR (Ρ = 0.032) με 9 επηρεάζονται γονίδια (Σχήμα S3). Επτά από αυτά τα γονίδια (

CACNA1H

,

FGF23

,

FGF6

,

FGFR1

,

ΜΑΡΚΑΡΚ2

,

ELK4

και

MYC

) είναι γνωστό ότι έχουν αυξητικών και την επιβίωση λειτουργίες, ενώ τα άλλα 2 (

DUSP8 και DUSP2

) έχουν λειτουργίες αντι-επιβίωσης.

Σχέσεις Gene μεταξύ πραγματοποιήθηκε επίσης Εμπλεκόμενος Loci ανάλυση (GRAIL) (https://www.broadinstitute.org/mpg/grail/) [37] για να αναζητήσετε λειτουργικές σχέσεις μεταξύ των γονιδιωματικές περιοχές. Οι όροι της απόπτωσης, αποπτωτικών και κασπάσης ήταν ένα από τα πιο σημαντικά εμπλουτισμένη μεταξύ των διαγράφεται FMCR. Για τα κέρδη, καλίου κανάλια αγωγιμότητα και ο σκαντζόχοιρος μονοπάτια ήταν από τα πιο σημαντικά εμπλουτισμένη όρους.

Αναγνώριση γονιδίων υποψηφίου οδηγού στις υποψήφιες FMCR

Για να πιστοποιηθούν νέα υποψήφια γονίδια του οδηγού CRC, τα κριτήρια FMCR έγιναν πιο αυστηρά. επιλέχθηκαν υποψήφιος FMCR αν είχαν οριστεί από 4 ΣΔΕ, συμβαίνουν σε ≥20% των περιπτώσεων και έχουν μέγιστη των 12 γονιδίων μέσα 3.0MB μέγεθος. Αυτές οι αυστηρότερες ορισμοί FMCR προσδιορίζονται 11 διαγραφές (Πίνακας 1) και 8 κέρδη (Πίνακας 2). Από τις 28 γονιδίων εντός των διαγράφεται περιοχές, 10 (35,7%) ταυτοποιήθηκαν ως γονίδια υποψήφια οδηγός με γνωστές ή πιθανές λειτουργίες ογκοκατασταλτικό και από τα 31 γονίδια εντός των αποκτηθεί περιοχών, 6 (19,4%) ήταν υποψήφιοι με γνωστές ή εν δυνάμει ογκογόνο λειτουργία (πίνακες 1 και 2? βλέπε Συζήτηση). Υποψήφια γονίδια καταστολείς όγκων σε διαγράφεται FMCR περιλαμβάνονται

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2 και NFKBIA

, και υποψήφιος ογκογονίδια στο απέκτησε FMCR περιλαμβάνονται

PRDM16, TNS1, RPA3

και

KCNMA1

. Είναι σημαντικό ότι, η κατάσταση αριθμό αντιγράφων των 2 αυτών των γονιδίων μυθιστόρημα του οδηγού υποψηφίου,

NFKBIA

και

KCNMA1

, επιβεβαιώθηκε από συγκεκριμένους ποσοτικούς προσδιορισμούς RT-PCR.

Θέση Χρωμοσωμικές

Έναρξη

Τέλος

μέγεθος (MB)

Υποτροπή (%)

Σ.Δ.Ε.

γονίδια

υποψήφιες genes

*

3p14.357521404576526910.1324.44433p14.260078018611958231.1231.1171

FHIT

4q22.191340468926745441.3333.3382

TMSL3

6q261623571251630498540.6922.2271

PARK2

11p15.4917244993636100.1922.225312q14.263277389633681090.0920.0041

RASSF3

14q13.234108596349503390.8428.8959

NFKBIA

16p13.3-p13.2613253670182750.8924.4471

A2PB1

17p13.1-p1210957541124009681.4448.8953

MAP2K4

20p12.114376202160711351.6937.78101

MACROD2

21q22.1133554005336512050.1028.8973

IFNAR1, IFNAR2

Πίνακας 1. γονίδια οδηγό Υποψήφιος διαγράφονται FMCR.

* υποψήφια γονίδια που ορίζεται με βάση τον καρκίνο σχετικές λειτουργίες. CSV Κατεβάστε θέση CSV Χρωμοσωμικές

Ξεκινήστε

Τέλος

μέγεθος (MB)

Υποτροπή (%)

Σ.Δ.Ε.

Γονίδια

υποψήφιες genes

*

1p36.32241214436300361.2226.67711

PRDM16

1p34.336881028375358910.6520.00512q352183542272185560810.2020.0051

TNS1

7p22.1-p21.3703316278298870.8048.8954

RPA3

8q23.31138277911145474540.7251.1140NA10q22.378238542790846560.8520.0041

KCNMA1

12p13.32-p13.31428242953649991.0840.00412

FGF23, FGF6

22q11.2118517833186863130.1720.0041Table 2. γονίδια οδηγού Υποψήφιος που έχει αποκτηθεί FMCR.

* υποψήφια γονίδια που ορίζεται με βάση τον καρκίνο σχετικές λειτουργίες. CSV Λήψη CSV

Συζήτηση

Αναγνώριση FMCR και των θιγόμενων οδών

Η συχνότητα και το πρότυπο των μεταλλάξεων στο

APC, TP53

,

KRAS

,

BRAF

και

PIK3CA

ήταν χαρακτηριστικές των όγκων MSS /CIN, γεγονός που υποδηλώνει ότι το δείγμα αναλύεται εδώ είναι αντιπροσωπευτικό αυτού του τύπου όγκου. FMCR αρχικά ορίζεται ως παρεκκλίνουσα περιοχές μικρότερες από 3Mb σε μέγεθος, που συμβαίνουν σε περισσότερο από το 10% των περιπτώσεων, με τουλάχιστον 2 ΣΔΕ και ένα σκορ COCA ~ ≥2 (p-value = 0,01). Συνολικά, 64 διαγράφεται και 32 κέρδισε FMCR αναγνωρίστηκαν σύμφωνα με αυτά τα κριτήρια. Τα προηγούμενα δημοσιευμένες μελέτες έδειξαν ένα μάλλον χαμηλό επίπεδο της αλληλεπικάλυψης των εκτροπών μεταξύ τους (5,3% για την εστιακή διαγραφές και 15,5% για την εστιακή κέρδη) [13,16,22,35]. Αυτό δεν είναι ίσως έκπληξη δεδομένου ότι η χρήση διαφορετικών πλατφορμών, αναλυτικών μεθόδων και δείγμα σύνολα θα έχει ως αποτέλεσμα την αναγνώριση των διαφορετικών hotspots εκτροπών. Η μελέτη μας έδειξε ένα υψηλότερο βαθμό επικάλυψης με τα παλαιότερα δημοσιευμένα δεδομένα (42,2% των διαγραμμένων FMCR και 34,4% των αποκτηθεί FMCR), γεγονός που υποδηλώνει την απουσία σημαντικών επιπέδων προκατάληψη στην δειγματοληψίας και των μεθόδων μας.

ανάλυση Pathway έδειξε ότι τα πιο σημαντικά εμπλουτισμένη σχετίζονται με τον καρκίνο μονοπάτια ανάμεσα διαγράφονται FMCR ήταν οδών σηματοδότησης απόπτωση και p53. Δέκα αποπτωτικά γονίδια συνήθως διαγράφονται σε δείγματα μας, 7 από τα οποία έχουν γνωστή προ-αποπτωτικών λειτουργίες και 3 (

PIK3R2

,

PIK3R5

και

CFLAR

) έχουν αντι-αποπτωτική ρόλους. Παρ ‘όλα αυτά,

CFLAR

συμβαίνει μέσα στην ίδια FMCR όπως οι προ-αποπτωτικών γονιδίων

CASP8

και

CASP10

. Ομοίως,

PIK3R5

βρίσκεται 1.2Mb κατάντη του

TP53

, και 81% (n = 17) των διαγραφών είναι κοινά μεταξύ των 2 γονιδίων. Ως εκ τούτου, φαίνεται πιθανό ότι είναι η διαγραφή των προ-αποπτωτικών γονιδίων εντός του FMCR το οποίο ενεργεί ως ένα συμβάν οδηγού, με τους αντι-αποπτωτικών γονιδίων είναι συν-διαγράφεται επιβάτες. Για το μονοπάτι σηματοδότησης ρ53, όλα τα διαγραμμένα γονίδια (n = 5) είναι γνωστό ότι έχουν αντι-ογκογόνο δραστηριότητες. Είναι αξιοσημείωτο ότι

TP53

ίδια έχει επίσης διαγραφεί το 37,8% (n = 17) των περιπτώσεων, αλλά δεν εντοπίστηκε μέσα σε ένα FMCR. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η διαγραφή FMCR θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων του όγκου μέσω απόπτωσης η απενεργοποίηση και /ή του μονοπατιού σηματοδότησης ρ53. Επιπλέον, ο εμπλουτισμός των αποπτωτικών γονιδίων εντός του διαγράφεται FMCR υποστηρίζει την γνωστή συσχέτιση μεταξύ γενωμική αστάθεια και την ελαττωματική απόπτωση [38].

Η πιο σημαντικά εμπλουτισμένη οδός για τις αποκτήσει γονίδια FMCR ήταν το ογκογόνο μονοπάτι ΜΑΡΚ, με 9 γονίδια επηρεάζεται συνήθως. Επτά από αυτά τα γονίδια είναι γνωστό ή προβλέπεται ότι θα έχουν ογκογόνο δραστηριοτήτων με την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου και της επιβίωσης. Παρά το γεγονός ότι, 2 γονίδια έχουν ρόλους αντι-επιβίωσης, μία από αυτές (

DUSP8

), συνέβησαν εντός της ίδιας FMCR ως το ογκογόνο γονίδιο που προάγουν την ανάπτυξη

IGF2

. Συνολικά τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν ότι η εστιακή διαγραφές και να αντιγράψετε τον αριθμό γονιδίων τα κέρδη στόχου εντός ογκοκατασταλτικό και ογκογόνο μονοπάτια αντίστοιχα.

καρκίνο υποψήφια γονίδια του οδηγού

Συνολικά, το εντοπίστηκαν FMCR περιείχε ~ 1000 γονίδια. Προκειμένου να προσδιορίσει ένα σύνολο γονιδίων υποψηφίου οδηγού, η FMCR περαιτέρω προτεραιότητα με τη χρήση μιας αυστηρότερης ορισμό FMCR. Η προεπιλεγείσες υποψήφιες FMCR ήταν 11 διαγραφές και 8 κέρδη, που περιέχει συνολικά 59 επηρεάζονται γονιδίων.

Δέκα από τα 28 γονίδια (35,7%) στα 11 υποψήφια διαγράφονται FMCR είναι ο καρκίνος που σχετίζονται με γνωστές ή πιθανές ογκοκατασταλτικό λειτουργία. Έξι από αυτά τα γονίδια (

FHIT

,

TMSL3

,

PARK2

,

A2BP1

,

MACROD2

και

MAP2K4

) έχουν αναφερθεί με συνέπεια, όπως διαγράφεται στο CRC και άλλων καρκίνων [17,22,26,35]. Από την άλλη πλευρά,

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2

και

NFKBIA

δεν είχαν αναφερθεί προηγουμένως να επηρεάζονται σε CRC.

RASSF3

προηγουμένως δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [39]. Τα επίπεδα πρωτεΐνης των υποδοχέων ιντερφερόνης γονιδίων (

IFNAR1 και 2

) έχουν δειχθεί ότι είναι προς τα κάτω ρυθμισμένη σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης, και συνδέεται με προχωρημένο στάδιο και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [40]. Αδρανοποίηση μεταλλάξεις του

NFKBIA

έχουν βρεθεί σε Hodgkin λέμφωμα, και ετερόζυγο

NFKBIA

διαγραφές αναφέρθηκαν στο ~ 25% των περιπτώσεων GBM [23,41] .. Με βάση τις λειτουργίες τους, η βιβλιογραφία και της εμφάνισής τους στο πλαίσιο του υποψηφίου διαγράφονται FMCR, προτείνουμε

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2

και

NFKBIA

ως νέα υποψήφια CRC ογκοκατασταλτικά γονίδια.

Έξι από τα 31 γονίδια (19,4%) στο 8 υποψήφιος απέκτησε FMCR είναι ο καρκίνος που σχετίζονται με την προβλεπόμενη ογκογόνο λειτουργίες (

PRDM16

,

TNS1

,

RPA3

,

KCNMA1, FGF23

και

FGF6

).

FGF23

και

FGF6

έχουν αναφερθεί ως αποκτήθηκε από CRC και άλλων τύπων καρκίνου [15,17]. Ωστόσο,

PRDM16

,

TNS1

,

RPA3

και

KCNMA1

δεν έχουν προηγουμένως αναφερθεί στο CRC. PR που περιέχει την περιοχή 16 γονίδιο (

PRDM16

) είναι ένα γνωστό ογκογονίδιο εμπλέκεται στην οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML) και οστεοσαρκώματος [42,43] tensin 1 γονιδίου (

TNS1

) είναι το μόνο γονίδιο παρόν στη σχετική FMCR, και

TNS1

υπερέκφραση

in vitro

προηγουμένως δειχθεί ότι προάγει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων σε ινοβλάστες [44]. γονίδιο της πρωτεΐνης αντιγραφή Α3 (

RPA3

) δείχθηκε πρόσφατα να αποκτήσει το μεταστατικό μελάνωμα (μέσα σε ένα FMCR) και να διαδραματίσει ουσιαστικό ρόλο στην εισβολή του όγκου [45]. Μεγάλες γονίδιο άλφα υπομονάδας διαύλου καλίου αγωγιμότητας ενεργοποιημένων από ασβέστιο (

KCNMA1

), το μόνο γονίδιο σε FMCR της, έχει δειχθεί ότι έχει αποκτηθεί σε περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη και υπερεκφράζεται σε μεταστατικό καρκίνο του μαστού [46,47]. Βασίζονται σε λειτουργίες τους, η λογοτεχνία και η εμφάνιση μέσα στο υποψήφιο που έχει αποκτηθεί FMCR, προτείνουμε

PRDM16

,

TNS1

,

RPA3

και

KCNMA1

ως μυθιστόρημα υποψήφιος CRC ογκογονίδια.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας, με βάση την ανάλυση των εστιακών ελάχιστες κοινές περιοχές, επιβεβαιώνουν ήδη αναφερθεί CRC τόπους και υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι επαναλαμβανόμενες εστιακές ανωμαλίες στοχεύουν τα γονίδια και τα μονοπάτια σχετίζονται με τον καρκίνο. Επιπλέον, εστιακή διαγραφές και ενισχύσεις είχαν αποδειχθεί ότι επηρεάζουν γνωστά γονίδια καταστολής όγκου και ογκογονίδια αντίστοιχα. Προτείνουμε εδώ αρκετές νέων γονιδίων του οδηγού υποψηφίου CRC. Περαιτέρω επικύρωση και λειτουργικές μελέτες απαιτούνται για τον προσδιορισμό των πιθανών ρόλο τους στην CRC ογκογένεσης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. γονίδια

αποπτωτικά στην διαγράφεται (έξοδος DAVID) FMCR. DAVID εξόδου δείχνει το μονοπάτι σηματοδότησης της απόπτωσης με αφαιρούμενα γονίδια που χαρακτηρίζεται από ένα κόκκινο αστέρι

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083859.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

σηματοδοτικό μονοπάτι Ρ53 στην διαγράφεται (έξοδος DAVID) FMCR. DAVID εξόδου δείχνει το σηματοδοτικό μονοπάτι Ρ53, με αφαιρούμενα γονίδια που χαρακτηρίζεται από ένα κόκκινο αστέρι

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083859.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

ΜΑΡΚ μονοπάτι στο απέκτησε (έξοδος DAVID) FMCR. DAVID εξόδου δείχνει το μονοπάτι σηματοδότησης ΜΑΡΚ με ενισχυμένα γονίδια που χαρακτηρίζεται από ένα κόκκινο αστέρι

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083859.s003

(ΔΕΘ)

Υλικά και Μέθοδοι S1.

Περίληψη των ασθενών και των χαρακτηριστικών του όγκου, εκκινητές αλληλουχιών και θερμοκρασίες ανόπτησης και αριθμούς πρόσβασης NCBI γονίδιο.

doi: 10.1371 /journal.pone.0083859.s004

(DOC)

αρχείου S1.

Πίνακες S1-S3. Πίνακας S1: Περίληψη των μοριακών χαρακτηριστικών των δειγμάτων όγκου 53. Πίνακας S2: Περίληψη του 64 διαγράφεται FMCR. Πίνακας S3: Περίληψη του 32 απέκτησε FMCR.

doi: 10.1371 /journal.pone.0083859.s005

(XLS)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη, Ελένη κράμπα και Dan Connley για τον ασθενή πρόσληψη και διαχείριση των δεδομένων, ο Παύλος Heath για τη βοήθεια με την aCGH και της διευκόλυνσης αλληλουχίας πυρήνα στο Πανεπιστήμιο του Sheffield για την εκτέλεση της αλληλουχίας του DNA.