Αφηρημένο

Στόχος

Στα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη, μια εκλεκτικός αγωνιστής EPAC, 8-CPT-2Me-cAMP, ρυθμίζει προς τα πάνω τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση μέσω ενεργοποίησης του Ras-ΜΑΡΚ και ΡΙ- καταρράκτες 3-κινάση Akt-mTOR σηματοδότησης. Εδώ εξεταστεί ο ρόλος των φλεγμονωδών μεσολαβητών σε Epac1 επαγόμενη κυτταρικό πολλαπλασιασμό με τον προσδιορισμό της έκφρασης των προ-φλεγμονωδών δεικτών ρ-cPLA2, COX-2, και PGE

2 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη σε επεξεργασία με 8-CPT-2Me- cAMP.

Μέθοδοι

χρησιμοποιηθούν αναστολείς της COX-2, mTORC1, και mTORC2 να καθετήρα κυκλικής ΑΜΡ-dependent pathways σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. RNAi στόχευσης Epac1, αρπακτικών, και Rictor χρησιμοποιήθηκε επίσης σε αυτές τις μελέτες.

Αποτελέσματα

θεραπεία 8-CPT-cAMP 2Me-προκάλεσε 2-2.5-πλάσια αύξηση του ρ-cPLA2

S505, COX-2, και PGE

2 επίπεδα σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. Προκατεργασία των κυττάρων με τον αναστολέα της COX-2 SC-58125 ή του ανταγωνιστή ΕΡ4 AH-23848, ή με έναν αναστολέα της mTORC1 και mTORC2, Torin1, μείωσε σημαντικά την Epac1-εξαρτώμενη αύξηση του ρ-cPLA2 και COX-2, π-S6 την κινάση

T389, και π-ΑΚΤ

S473. Επιπλέον, Epac1 επαγόμενη σύνθεση πρωτεϊνών και του DNA ήταν πολύ μειωμένη κατά την προεπεξεργασία των κυττάρων με αναστολείς είτε COX-2, ΕΡ4, ή mTOR. Επιμόλυνση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με Epac1 dsRNA, Raptor dsRNA, ή Rictor dsRNA μειωθεί ριζικά Epac1-εξαρτώμενη αύξηση στην p-cPLA2 και COX-2.

Συμπέρασμα

Θα δείξουμε ότι Epac1, μεταγενέστερος τελεστή του cAMP, λειτουργεί ως προ-φλεγμονώδη διαμορφωτή σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση με προς τα πάνω ρύθμιση Ras-ΜΑΡΚ, και σηματοδότηση κινάσης ΡΙ 3-Akt-mTOR

Παράθεση:. Misra UK, Pizzo SV (2013) Αποδεικτικά στοιχεία για την Pro-πολλαπλασιαστική ανάδραση στον καρκίνο του προστάτη: ο ρόλος των Epac1 και COX-2-εξαρτημένων Pathways. PLoS ONE 8 (4): e63150. doi: 10.1371 /journal.pone.0063150

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: ένατης Ιανουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 29, Μάρτη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 Απριλίου 2013

Copyright: © 2013 Misra, Pizzo. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία χρηματοδότηση ή υποστήριξη στην έκθεση

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. SVP είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται κακοήθεια των ανδρών [1]. Διάφοροι παράγοντες προάγει την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Υπάρχει μια πολύ γνωστή συσχέτιση μεταξύ της απόκτησης των ανδρογόνων-ανεξάρτητη ανάπτυξη και μια δυνητικά μεγαλύτερη πιθανότητα μετάστασης [2]. Υπάρχει επίσης αυξανόμενες ενδείξεις ότι φλεγμονώδεις αλλαγές σε όγκους του προστάτη μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη [3] – [8]. Περίπου το 15-20% όλων των θανάτων καρκίνου παγκοσμίως συνδέονται με μόλυνση και φλεγμονή [9]. Ενώ αυτοί οι θάνατοι μπορούν κυρίως να αποδοθεί σε αυτές τις διαδικασίες, παθολογικές, μοριακής και επιδημιολογικές μελέτες υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η χρόνια φλεγμονή συνδέεται με την πρόοδο του καρκίνου [10]. Η φλεγμονώδης μικροπεριβάλλον των όγκων χαρακτηρίζεται από την παρουσία των λευκοκυττάρων υποδοχής τόσο στα δικαιολογητικά στρώμα και όγκου περιοχές [11]. Επιπλέον, το περιβάλλον του όγκου περιέχει φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως χημειοκίνες, κυτοκίνες, αντιδραστικά είδη οξυγόνου, και προσταγλανδίνες [3] – [8]. ανάπτυξη του καρκίνου με την παρουσία χρόνιας φλεγμονής περιλαμβάνει κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2), και ενεργοποίηση αρκετών παραγόντων μεταγραφής ΝΡκΒ συμπεριλαμβανομένων, STAT3, ενεργοποιητής πρωτεΐνη-1, και υποξία 1α διεγέρσιμο παράγοντα [3] – [8].

οι προσταγλανδίνες και τα λευκοτριένια είναι ρυθμιστές κλειδιά που διαμεσολαβούν αλληλοπαρεμβολές μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων και των γύρω στρωματικά κύτταρα τους [3] – [7]. Το αραχιδονικό οξύ (ΑΑ) είναι ένα σημαντικό συστατικό του ζωικού λίπους και τα βιολογικώς δραστικά λιπίδια που προέρχονται από αυτό το υπόστρωμα έχουν κρίσιμους ρόλους σε χρόνια φλεγμονή και τον καρκίνο. Μετά την κυτταρική διέγερση, ΑΑ απελευθερώνεται από τα φωσφολιπίδια της μεμβράνης με ρ-cPLA2 και στη συνέχεια μετατρέπονται σε διαφορετικές προσταγλανδίνες (PG) από ειδικά ένζυμα [6], [12]. Η COX-2 είναι η διεγέρσιμη ισομορφή του περιορισμού του ρυθμού ένζυμο που μετατρέπει ΑΑ έως προφλεγμονώδεις προσταγλανδίνες. Μεταξύ αυτών PGE

2 παίζει έναν κυρίαρχο ρόλο στην προώθηση της ανάπτυξης του όγκου. PGE

2 ανυψώνει την έκφραση της πρωτεΐνης αντιαποπτωτικών Bcl2 και ενεργοποιεί την παραγωγή cAMP [13]. PGE

2 αυξάνει την έκφραση EPAC, η ενεργοποίηση Rap1, και η φωσφορυλίωση της Akt [14], [15]. Υπό κανονικές συνθήκες, η έκφραση COX-2 είναι χαμηλή ή δεν ανιχνεύεται στους περισσότερους ιστούς? Ωστόσο, η υπερέκφραση του μαζί με την ενεργοποίηση της κυτοσολικής PLA2 με φωσφορυλίωση είναι ένα χαρακτηριστικό φλεγμονωδών αντιδράσεων [16]. Αρκετές οδοί μεταγωγής σήματος ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου της COX-2, συμπεριλαμβανομένων Ras-ΜΑΡΚ, ΡΚΑ, PKC και [17] – [20]. Η υπερέκφραση της COX-2 εμφανίζεται σε μαστού, πνεύμονα, του παχέος εντέρου, και καρκίνοι του προστάτη [3] – [8].

In vitro

, ανθρώπινες σειρές καρκίνου του προστάτη PC-3, DU145, και LnCap εκφράζουν COX-2 [6], [12]. Η αναστολή της COX-2 επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό και /ή ρυθμίζει αυξητικά την απόπτωση και στους δύο ανδρογόνα ανεξάρτητες και εξαρτημένες καλλιέργειες ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Θεραπεία των LNCaP κυττάρων με την COX-2 αναστολέα ή NS398 celecoxib επάγει την απόπτωση και μειώνει την έκφραση του Bcl2,

in vivo,

και αναστολή της COX-2 καταστέλλει την ικανότητα εισβολής των DU-145 και PC-3 κύτταρα [12 ]. Η αγωγή των ποντικών PC-3 που φέρει όγκο με NS-398 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και επάγει την υποχώρηση του όγκου [21]. Ένα πρόσθετο αποτέλεσμα είναι ότι οι αναστολείς της COX-2 καταστέλλουν προς τα πάνω ρύθμιση του VEGF η οποία είναι σημαντική για την αγγειογένεση όγκων [3] – [7], [12]. Η φλεγμονή που σχετίζεται με ιστολογική επιθετικότητα σε καρκίνους του προστάτη συσχετίζεται με μια αύξηση στα επίπεδα του PSA [22]. Σε κλινικές μελέτες ασθενών με καρκίνο του προστάτη, οι αναστολείς COX-2 να προκαλέσει μείωση του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) και των κυττάρων του όγκου χρόνο διπλασιασμού. Επιπλέον, η ενεργοποίηση της COX-2 και αυξημένα επίπεδα της PGE συμβαίνουν

2 σε ασθενείς με όγκο [23] – [26]. PGE

2 πράξεις μέσα από τέσσερις υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων είναι γνωστή ως ΕΡ1, ΕΡ2, ΕΡ3 και ΕΡ4 [27] – [31].

PGE

2 υποδοχείς που εκφράζονται από τις γραμμές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη είναι η ΕΡ2 και ΕΡ4 υποτύπους [28]. Η δέσμευση του PGE

2 έως ΕΡ2 είναι συζευγμένο με G πρωτεΐνες οι οποίες ενεργοποιούν αδενυλική κυκλάση που οδηγεί σε αύξηση της ενδοκυτταρικής cAMP. Αυτό ενεργοποιεί κινάσες όπως ΡΚΑ, Epacs, ΡΙ 3-κινάσης, και GSKβ3. PGE

2 αυξάνει το mRNA του υποδοχέα ΕΡ2, αυξάνει τα επίπεδα cAMP, και ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Η έκφραση του ΕΡ2 και των υποδοχέων ΕΡ4 αυξάνεται σημαντικά κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη και έκτοπη έκφραση αυτών των υποδοχέων σε LNCaP κύτταρα ενισχύει την παραγωγή PSA [32].

Ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) είναι ένα Ser /Thr κινάση που ενσωματώνει σήματα από εξωτερικά ερεθίσματα [33] – [39] ρυθμίζει πολλές διεργασίες που συμπεριλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. mTOR υπάρχει σε δύο διακριτές συγκροτήματα, mTOR1 και mTORC2. Αρκετές πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι PGE

2 απορυθμίζει mTORC1 και σηματοδότηση mTORC2. Για παράδειγμα, PGE

2-διαμεσολαβούμενη επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων ρυθμίζεται από mTORC2 [40]. PGE

2-χημειόταξη και απελευθέρωση χημειοκίνης από τα σιτευτικά κύτταρα ρυθμίζεται από ενεργοποίηση mTORC2 και αυτό μειώνεται δια προκατεργασίας των κυττάρων με το ενεργό αναστολέα mTOR θέση Torin1 [41]. Επιπλέον, η αναστολή της COX-2 και mTOR δείχνουν άμεσα και έμμεσα αποτελέσματα κατά των όγκων σε καρκίνους, και οι δύο celecoxib και ραπαμυκίνη προκαλέσει σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου [42]. mTORC1 εκτός από mTOR, περιέχει το ρυθμιστικό σχετιζόμενη πρωτεΐνη mTOR (Raptor), και ένα σύμπλεγμα από άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες [33] – [39]. Raptor ρυθμίζει το συγκρότημα της mTORC1, την πρόσληψη των υποστρωμάτων κινάσης, και υποκυτταρικός εντοπισμός της mTORC1. Akt ενεργοποιεί mTORC1 με άμεση φωσφορυλίωση του συμπλόκου TSC1 /TSC2 αναστέλλοντας έτσι GAP δράση του και την αποδέσμευση GTP-δεσμευμένη Rheb να ενεργοποιήσετε mTORC1 [33] – [39]. Όταν ενεργοποιηθεί, mTORC1 φωσφορυλιώνει δύο κύριους ρυθμιστές της μετάφρασης του mRNA και ριβοσωμικού γένεση, p70 S6 κινάσης (S6-κινάση) και 4EBP1, διεγείροντας έτσι την πρωτεϊνοσύνθεση [33] – [39]. Το συγκρότημα mTORC2, εκτός από την mTOR, περιέχει Raptor ανεξάρτητη σύντροφος του mTOR (Rictor) και άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες. mTORC1 και mTORC2 φωσφορυλιώνει διάφορα υποστρώματα για τη ρύθμιση διακριτές κυτταρικές λειτουργίες. mTORC1 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αυξάνοντας καπάκι που εξαρτώνται από την έναρξη της μετάφρασης που διαμεσολαβείται από δύο κύριους στόχους κάτω από το ρεύμα S6 κινάση και 4ΕΒΡ του. mTORC2 δεν είναι ευαίσθητη στην οξεία θεραπεία με ραπαμυκίνη και ρυθμίζει πολλές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την επιβίωση, με φωσφορυλίωση κινασών όπως Akt, SG-κινάσης και PKC [33] – [39]. Απώλεια ή αδρανοποίηση καταστολείς όγκων όπως p53, LKB1, ΡΤΕΝ, και TSC1 /2, οι οποίες ανταγωνίζονται ΡΙ ενεργοποίηση 3-κινάσης που εξαρτάται από mTORC1, μπορεί να προωθήσει ογκογένεση μέσω αυξημένης σηματοδότησης [33] – [39]. Αυξημένα επίπεδα ή /και φωσφορυλίωση κατάντη στόχοι της mTORC1 συμβαίνουν σε διάφορες ανθρώπινες κακοήθειες και συσχετίζονται με επιθετική συμπεριφορά όγκου και κακή πρόγνωση [33] – [39]. δραστηριότητα mTORC2 είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη που προκαλείται από ΡΤΕΝ διαγραφή [43].

cAMP ρυθμίζει ένα ευρύ φάσμα διαδικασιών συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης μέσω των καθοδικούς τελεστές συμπεριλαμβανομένων ΡΚΑ. Η επίδραση της cAMP είναι ιδιάζον και μπορεί είτε να αναστέλλουν ή να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ένα ΡΚΑ εξαρτώμενη ή ΡΚΑ-ανεξάρτητο τρόπο [44], [45]. Σε κύτταρα όπου cAMP διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ένα ΡΚΑ-ανεξάρτητο τρόπο, cAMP ενεργοποιεί Rap1 μέσω EPAC [45] – [48]. Εδώ είναι τα αποτελέσματα της cAMP που προκαλείται από ΡΙ 3-κινάση /Akt σηματοδότηση [45] – [48]. Θεραπεία των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με τον αγωνιστή EPAC 8-CPT-2Me-οΑΜΡ ρυθμίζει προς τα πάνω έκφραση Epac1, η ενεργοποίηση Rap1, ενεργοποίηση ΜΑΡΚ, φωσφορυλίωση Akt στο T308 και S473 στην ΡΙ 3-κινάση εξαρτώμενη και την ενεργοποίηση mTORC1 και mTORC2 όπως κρίνεται από φωσφορυλίωση του S6 την κινάση σε T389, 4EBP1 στο Τ37 /36 και Akt σε κατάλοιπα S473, αντίστοιχα [47],. Σίγαση της έκφρασης Epac1 με RNAi ή προκατεργασία με ΡΙ 3-κινάσης ή αναστολείς mTOR καταστέλλει 8-CPT-2Me-οΑΜΡ που επάγεται προς τα πάνω ρύθμιση της ενεργοποίησης Epac1 του ΜΑΡΚ, mTORC1 και σηματοδότηση mTORC2, και τελικά το DNA και των πρωτεϊνών [47], [48 ]. EPAC παραγωγής ζευγάρια cAMP σε Rap1 και PI ενεργοποίηση 3-κινάσης. Rap1, η οποία συχνά αυξημένα σε ιδιαίτερα μεταστατικά κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, ρυθμίζει σήματα που εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και τη μετάσταση [49]. Epac1 αυξορρυθμίζεται μετά τη φλεγμονή και διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ενεργοποίηση της PKC-εξαρτώμενη PGE

2 σηματοδότηση μέσω της ενεργοποίησης Rap1 [50].

Όπως ανασκοπήθηκε παραπάνω, χρόνια φλεγμονή προάγει την έναρξη του όγκου, πολλαπλασιασμό, και μετάσταση με προς τα πάνω ρύθμιση του COX-2-PGE

2-οΑΜΡ καταρράκτη σηματοδότησης. 8-CPT-cAMP 2Me-, ένα συγκεκριμένο ανάλογο της cAMP, δεσμεύεται σε Epac1, αλλά όχι ΡΚΑ. Σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, αυτό το ανάλογο προκαλεί ρύθμιση προς τα πάνω του Epac1, Rap1GTP, σύνθεση πρωτεϊνών, τη σύνθεση του DNA, και ΜΑΡΚ, και ΡΙ 3-κινάση Akt-mTORC1-mTORC2 σηματοδότηση. Κατά συνέπεια, οι πρωτεΐνες και τη σύνθεση του DNA διεγείρονται. Αυτές οι επιδράσεις έχουν απενεργοποιηθεί δια προκατεργασίας των κυττάρων με αναστολείς της ΜΑΡΚ, ΡΙ 3-κινάσης, mTORC1, ή RNAis που στοχεύουν Epac1, αρπακτικών ή Rictor [47], [48]. Εδώ θεωρούμε την υπόθεση ότι Epac1 λειτουργεί ως ένας μεσολαβητής φλεγμονώδους στον καρκίνο του προστάτη, με την προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την επιβίωση. Διερευνήθηκε η ρύθμιση των προ-φλεγμονωδών δεικτών ρ-cPLA2, COX-2, και PGE

2 σε τρεις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη σε κατεργασία με 8-CPT-cAMP 2Me-. Προκατεργασία των κυττάρων με αναστολείς COX-2, έναν αναστολέα mTORC1 και mTORC2, ή επιμόλυνση των κυττάρων με dsRNA Epac1, αρπακτικών dsRNA, ή Rictor dsRNA κάτω ρυθμίζονται επαγωγή 8-CPT-cAMP 2Me-ρ-cPLA2, και COX-2. τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου επίσης καταστέλλεται. Έτσι ενώ PGE

2 ρυθμίζει την παραγωγή cAMP και EPAC-ενεργοποίηση, ενεργοποίηση EPAC οδηγεί επίσης σε COX-2-εξαρτώμενη PGE

2 παραγωγής. Το καθαρό αποτέλεσμα είναι μια αυτοκρινείς-όπως κυκλική διαδικασία οδήγηση πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση της Ras-ΜΑΡΚ και ΡΙ 3-κινάση Akt-mTOR σηματοδότησης.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά

τα μέσα καλλιέργειας αγοράστηκαν από την Invitrogen. 8-CPT-cAMP 2Me-αγοράστηκε από Axxora LLC (San Diego, CA). Αντισώματα έναντι mTOR, ρ-Akt

S473, Akt1, S6 κινάση, ρ-S6 κινάση

T389, ρ-cPLA2

Ser505 και cPLA2 αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα έναντι Epac1, COX-2, Raptor, Rictor, ΕΡ2 και ΕΡ4 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Τα αντισώματα αντι-ακτίνης ελήφθησαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ). [

3Η] θυμιδίνης (ειδική δραστικότητα 174 Ci /mmol και [

3Η] λευκίνη (ειδική δραστικότητα 115,4 Ci /mmol) ελήφθησαν από την Perkin-Elmer ϋίβ Sciences. Όλα τα άλλα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού και είχαν αγοραστεί τοπικά. COX-2 αναστολέα SC-58125 ή ο ΕΡ4 ανταγωνιστής ΑΗ23848 αγοράστηκαν από Caymon (Ann Arbor, ΜΙ) και Torin1 αγοράστηκε από την Tocris Biosciences (Minneapolis, ΜΝ).

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη

σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τρεις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη, 1-LN, DU145, και PC-3. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [51], το εξαιρετικά μεταστατικό καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή 1-LN προήλθε σε αυτό το ίδρυμα από μετάσταση των λιγότερο μεταστατικά κύτταρα PC-3 σε γυμνά ποντίκια και ήταν ένα είδος δώρο του Δρ Φίλιπ Walther (University Medical Center Duke, Durham, NC). Αυτά τα κύτταρα είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. DU-145 και PC-3 κύτταρα αγοράστηκαν από την ATCC. αυτά αναπτύχθηκαν σε 6, 12 ή 48 φρεατίων σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM γλουταμίνη, 12,5 μονάδες /ml πενικιλλίνη, 6.5 μg /ml στρεπτομυκίνη και 10 ηΜ ινσουλίνης (RPMI-S ) σε ένα υγροποιημένο CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Μετά την επίτευξη του 90% συρροή, το μέσο αναρροφήθηκε και ένα φρέσκο ​​όγκο μέσου RPMI-S και τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα που περιγράφονται παρακάτω.

Ποιοτική PCR για την COX-2, ΕΡ2, ΕΡ4 και στον προστάτη καρκινικά κύτταρα διεγερμένα με 8-CPT-cAMP 2Me-

1-LN, PC-3, DU145 και τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη αναπτύχθηκαν όπως παραπάνω. Μετά την επίτευξη του 90% συρροή, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ισορροπημένο αλατούχο διάλυμα Hanks που περιέχει 10 mM HEPES, ρΗ 7,4, και 3,5 mM NaHCO

3 (HHBSS). Ένας όγκος φρέσκου μέσου RPMI-S στη συνέχεια προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για 5 λεπτά για ισορροπία θερμοκρασίας. Τα κύτταρα εκτέθηκαν είτε ρυθμιστικό ή 8-CPT-cAMP 2Me-(100 μΜ) για 30 λεπτά και επωάστηκαν όπως παραπάνω. Η αντίδραση τερματίστηκε με αναρρόφηση του μέσου. Ολικό RNA από τα κύτταρα εξήχθη χρησιμοποιώντας RNeasy Minikits (QIAGEN, Βαλέντια, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA ποσοτικοποιήθηκε με απορρόφηση στα 260 nm. Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με 1 μg του RNA σε ένα 20-μΙ αντίδραση χρησιμοποιώντας Moloney ιός λευχαιμίας ποντικού αντίστροφης μεταγραφάσης (200 μονάδες) και ολίγο (dT) ως εκκινητή για 1 ώρα στους 40 ° C. Το προκύπτον cDNA (5 μg) χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα, και ένα 225-bp τμήμα των cDNA της COX-2, ΕΡ2 και ΕΡ4 ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ένα 20-μερές ανοδικών εκκινητών για το (1) COX-2-προς τα εμπρός? (5′-TGG TCT GGT GCC ΤΟΟ TCT G-3 ‘) και COX-2-πίσω (5′-AGT ΑΤΤ AGC CTG CTT GTC TGG AAC -3′)? (2) EP2-προς τα εμπρός: (5’-TTC ATC CGG CAC GGG CGG ACC GC-3 ‘) και ΕΡ2-πίσω (5′-ΚΔ ΚΔ GAG ΑΑΑ GAC AGT GCT -3′)? και (3) EP4-προς τα εμπρός: (5’-ΚΔ ΚΔ GAG ΑΑΑ GAC AGT GCT -3 ‘) και EP4-πίσω (5′-AAG ACA CTC TCT GAG TCCT -3’). Μια 302-bp τμήμα του ποντικού β-ακτίνης (συστατική εσωτερικός έλεγχος) cDNA συν-ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύνολο εκκινητών παρέχονται σε μία R &? D Systems κιτ (Minneapolis, ΜΝ). Διεξήχθη ενίσχυση σε θερμοκυκλοποιητή Biometra 2:01 PM3 για 28 κύκλους (ένας κύκλος: 94 ° C για 45 s, 60 ° C για 45 s και 70 ° C για 45 s). Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε /ethedium βρωμιούχο γέλη αγαρόζης 1,2%. Τα πήγματα φωτογραφήθηκαν και η ένταση της COX-2, ΕΡ2, ΕΡ4 και mRNA και μπάντες mRNA β-ακτίνης ποσοστώθηκε.

Μέτρηση της cPLA2, COX-2, Epac1, ΕΡ2, και έκφραση EP4 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη διεγερμένα με 8-CPT-cAMP 2Me-με κηλίδωση Western

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα (3 χ 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων) επωάστηκαν για μία νύχτα σε μέσο RPMI-S και πλύθηκε δύο φορές με κρύο HHBSS. Ένας όγκος μέσου RPMI-S στη συνέχεια προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά την εξισορρόπηση της θερμοκρασίας, τα κύτταρα στα αντίστοιχα φρεάτια εκτέθηκαν είτε σε ρυθμιστικό διάλυμα ή 8-CPT-cAMP 2Me-(100 μΜ /30 min) και επωάστηκαν όπως παραπάνω. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με αναρρόφηση του μέσου και έναν όγκο ρυθμιστικού λύσης, που περιέχει 50 mM Tris • HCl (ρΗ 7,5), 120 mM NaCl, 1% Nonidet Ρ-40, 2.5 mM φθοριούχο νάτριο, 1 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 0.1 mM ορθοβαναδικό νάτριο , 1 mM PMSF, 1 mM βενζαμιδίνη, και λευπεπτίνη (20 μg /ml), επί πάγου επί 20 λεπτά. Κυτταρολύματα αποξέστηκαν σε νέους σωλήνες Eppendorf και φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα 800 χ g στους 4 ° C και προσδιορίσθηκαν τα περιεχόμενα πρωτεΐνης των προϊόντων λύσης. Για ίσες ποσότητες πρωτεΐνης κυτταρολύματος, ένας όγκος ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος 4χ προστέθηκε και τα δείγματα έβρασαν για 5 λεπτά. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 10% ή 12,5% πηκτή πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PDVF, και ανοσοστυπώθηκαν για ρ-cPLA2S505, COX-2, Epac1, ΕΡ2, ΕΡ4 και. ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν και να ποσοτικοποιηθούν από ECF και Phosphorimaging σε Storm 860 Phosphorimager. Οι αντίστοιχες μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι για μη φωσφορυλιωμένα πρωτεΐνη στόχο ή ακτίνη. Η εξειδίκευση των αντισωμάτων προσδιορίστηκε με κατεργασία του κυττάρου με μη-άνοσο αντισώματα και κυτταρικά λύματα υποβάλλονται σε επεξεργασία όπως παραπάνω. Κάτω από τις πειραματικές συνθήκες, δεν παρατηρήθηκε καμία αντιδραστικότητα αυτών των ελέγχων.

Μέτρηση του PGE

2 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη που διεγείρεται με 8-CPT-cAMP 2Me-

κύτταρα καρκίνου του προστάτη (3 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων) επωάστηκαν όλη τη νύκτα όπως παραπάνω σε μέσο RPMI-S και πλένεται δύο φορές με ψυχρό HHBSS και ένας όγκος μέσου RPMI-S στη συνέχεια προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά την εξισορρόπηση της θερμοκρασίας, τα κύτταρα στα αντίστοιχα φρεάτια εκτέθηκαν είτε σε ρυθμιστικό διάλυμα, ή 8-CPT-cAMP 2Me-(100 μΜ /30 min) και επωάστηκαν όπως παραπάνω. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με αναρρόφηση του μέσου και ένας όγκος ρυθμιστικού λύσης προστέθηκε σε επί 20 λεπτά. Κυτταρολύματα αποξέστηκαν σε νέους σωλήνες Eppendorf και φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα 800 χ g στους 4 ° C και προσδιορίσθηκαν τα περιεχόμενα πρωτεΐνης από τα προϊόντα λύσης. PGE

2 επίπεδα σε κυτταρολύματα προσδιορίστηκαν με ένα κιτ ELISA (ENZO Life Sciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Μέτρηση της πρωτεϊνικής σύνθεσης σε καρκινικά κύτταρα διεγερμένα με 8-CPT-cAMP 2Me-

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα (300 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 48 φρεατίων) αναπτύχθηκαν σε RPMI-S σε ένα υγροποιημένο CO

2 (5%) επωαστήρα στους 37 ° C. Στα 90% συρροή, το μέσο αναρροφήθηκε και ένας όγκος RPMI-S προστέθηκε στα φρεάτια, που ακολουθείται από την προσθήκη: (1) ρυθμιστικό? (2) 8-CPT-cAMP 2Me-(100 μΜ /16 ώρες)? (3) (1 μΜ ΑΗ23848 /3 h)? (4) ΑΗ23848 1 μΜ /3 h) και στη συνέχεια 8 CPT-2Me-cAMP? (5) SC58125 (1 μΜ /3 h)? (6) SC58125 1 μΜ /3 h) και στη συνέχεια 8-CPT-cAMP 2Me-? (7) Torin1 (250 nm /3 ώρες)? ή (8) Torin1 (250 nm /3 h) και στη συνέχεια 8-CPT-cAMP 2Me-. [

3Η] λευκίνη (2 μCi /ml) προστέθηκε στη συνέχεια και τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα όπως παραπάνω. Οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με αναρρόφηση του μέσου και μονοστιβάδες πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο 5% TCA και τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS. Τα κύτταρα λύθηκαν σε έναν όγκο 1 Ν NaOH (40 ° C 2 ώρες), η συγκέντρωση πρωτεΐνης υπολογίστηκε και τα προϊόντα λύσης μετρήθηκαν σε ένα μετρητή υγρού σπινθηρισμού [47], [48].

Μέτρηση της σύνθεσης του DNA σε κύτταρα 1-LN διεγερμένα με 8-CPT-cAMP 2Me-

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα (3 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 48 φρεατίων) αναπτύχθηκαν σε RPMI-S) σε ένα υγροποιημένο CO

2 (5%) επωαστήρα στους 37 ° C. Στα 90% συρροή, το μέσο αναρροφήθηκε και προσετέθη ένα όγκο RPMI-S, που ακολουθείται από την προσθήκη ενώσεων, όπως περιγράφεται παραπάνω. [

3Η] θυμιδίνης (2 μCi /ml) προστέθηκε στη συνέχεια και τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με αναρρόφηση του μέσου και κυτταρικές μονοστιβάδες πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο 5% TCA που ακολουθείται από τρεις πλύσεις με παγωμένο PBS. Τα κύτταρα λύθηκαν σε έναν όγκο 1 Ν NaOH (40 ° C /2 ώρες), η συγκέντρωση πρωτεΐνης υπολογίστηκε και τα προϊόντα λύσης μετρήθηκαν σε ένα μετρητή υγρού σπινθηρισμού [47], [48].

Μέτρηση της COX -2 ή mTOR επιδράσεις αναστολέα στις 8-CPT-cAMP 2Me-επαγόμενη-αυξητική ρύθμιση του π-CPLA

2, και COX-2

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα (3 χ 10

6 κύτταρα /6 φρεατίων) επωάστηκαν για μία νύχτα σε μέσο RPMI-S πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό HHBSS και ένας όγκος μέσου RPMI-S προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα στα αντίστοιχα φρεάτια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με αναρρόφηση του μέσου και ένας όγκος ρυθμιστικού λύσης προστέθηκε σε πάγο για 20 λεπτά. Κυτταρολύματα αποξέστηκαν σε σωλήνες Eppendorf και φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 800 χ g στους 4 ° C και τα περιεχόμενα πρωτεΐνης από τα προϊόντα λύσης προσδιορίστηκε. Τα δείγματα στη συνέχεια μελετήθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω.

Μέτρηση της COX-2 και αναστολέα mTOR επιδράσεις στην 8-CPT-cAMP 2Me-επαγόμενη-αυξητική ρύθμιση του π-S6 κινάση

T389 σε Raptor ανοσοϊζήματα κύτταρα καρκίνου προστάτη

φωσφορυλίωση S6 κινάσης στο T389 θεωρείται ένα μέτρο της ενεργοποίησης mTORC1. Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα (3 χ 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων) επωάστηκαν για μία νύχτα σε μέσο RPMI-S πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό HHBSS και ένας όγκος μέσου RPMI-S προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα στα αντίστοιχα φρεάτια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με αναρρόφηση του μέσου και προσθέτοντας ένα όγκο ρυθμιστικού CHAPS λύσης, που περιέχει 40 mM HEPES (ρΗ 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 10 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 0,5 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 0,3 % CHAPS και η Roche πρωτεάσης κοκτέιλ αναστολέα (1 δισκίο /10 ml). Τα κύτταρα λύθηκαν επί πάγου για 20 λεπτά. Κυτταρολύματα αποξέστηκαν σε νέους σωλήνες Eppendorf και φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα 800 χ g στους 4 ° C και στη συνέχεια προσδιορίστηκε το περιεχόμενο πρωτεΐνης των προϊόντων λύσης. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης κυτταρολύματος (200-250 μ§) ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα Raptor (1:50) Santa Cruz Cat ηο. sc 81537), ακολουθούμενη από την προσθήκη 40 μΙ πρωτεΐνης Α αγαρόζης. Τα μίγματα επωάζονται όλη τη νύκτα με περιστροφή στους 4 ° C. ανοσοϊζήματα Raptor ανακτήθηκαν με φυγοκέντρηση (2000 rpm /5 λεπτά /4 ° C) και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό ρυθμιστικό CHAPS λύσης. Ένας όγκος 4 ρυθμιστικού × δείγμα προστέθηκε στα δείγματα τα οποία στη συνέχεια έβρασε για 5 λεπτά, φυγοκεντρήθηκαν, ηλεκτροφόρηση (10% πηκτή ακρυλαμιδίου), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη Hybond-P. Οι μεμβράνες ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα εναντίον ρ-S6 κινάση

T389. Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν από ECF και ποσοτικά σε ένα Θύελλα

860 Phosphorimager [47], [48].

Μέτρηση της ενεργοποίησης mTORC2 με φωσφορυλίωση της Akt

S473 στην Rictor ανοσοϊζήματα των καρκινικών κυττάρων διεγείρεται με 8-CPT-2Me-cAMP

η φωσφορυλίωση της Akt σε S473 από Rictor θεωρείται ένα μέτρο της δραστηριότητας mTORC2. Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα (3 χ 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων) επωάστηκαν για μία νύχτα σε μέσο RPMI-S πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό HHBSS, και ένας όγκος μέσου RPMI-S προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Ερευνήσαμε την επίδραση των αναστολέων της COX-2 και τον αναστολέα mTOR Torin1 επί της φωσφορυλίωσης της Akt

S473 σε Rictor ανοσοϊζήματα κυττάρων 1-LN υπό τις συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω. Οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με αναρρόφηση του μέσου και προσθέτοντας ένα όγκο ρυθμιστικού λύσης CHAPS (ρυθμιστικό Β). Τα κύτταρα λύθηκαν επί πάγου για 15 λεπτά. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης κυτταρολύματος (200-250 μ§) ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα αντι-Rictor (1:50, της Santa Cruz, CA, ca # 81538) με την προσθήκη 40 μΙ πρωτεΐνης Α πολτού αγαρόζης. Τα περιεχόμενα επωάστηκαν με περιστροφή όλη τη νύκτα στους 4 ° C. ανοσοϊζήματα Rictor πλύθηκαν με (1) ρυθμιστικό λύσης Β συμπληρωμένο με 0,5 Μ NaCl? (2) ρυθμιστικού διαλύματος λύσης Β? και (3) τρις ​​• HCl (ρΗ 7,4) συμπληρωμένο με 1 mM DTT, 1 mM PMSF και 1 mM βενζαμιδίνη με φυγοκέντρηση στις 2500 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C. Για να Rictor ανοσοκαταβυθίζει ένα όγκο ρυθμιστικού δείγματος 4 × προστέθηκε, και τα δείγματα έβρασαν για 5 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε 10% πολυακρυλαμιδίου πηκτές, πρωτεΐνη μεταφέρθηκε σε μεμβράνη PVDF και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα έναντι ρ-ΑΚΤ

S473. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές και ποσοτικά με ECF και Phosphorimaging. Οι αντίστοιχες μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι για Akt ως έλεγχος φόρτωσης [47], [48].

Τα αποτελέσματα της γονιδιακής σίγησης Epac1 στην έκφραση COX-2 σε καρκινικά κύτταρα διεγερμένα με 8-CPT-cAMP 2Me-

Για τον προσδιορισμό του ρόλου του Epac1 στην ενεργοποίηση των mTORC2 στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη σε επεξεργασία με 8-CPT-2Me-cAMP, η έκφραση της Epac1 σίγησε με RNAi [47], [48]. Η χημική σύνθεση του dsRNA ομόλογη προς το στόχο πεπτιδική αλληλουχία Epac1 ακολουθία s204VAHLSN209 mRNA 5′-TGT GGC CCA ΚΔ CTC ΥΠΑ CTC -3 ‘(Swiss Prot Epac1 αριθμό πρωτογενών ένταξη 0953958) πραγματοποιήθηκε από την Ambion (Austin, TX). dsRNAs παρασκευάστηκαν με αναδιάταξη την αίσθηση 5’- UGG CCC ACC UCU CCA ACU CU-3 ‘και 5′-GAG αντινόημα UUG GAG AGG UGG GCA ACA -3’ και τα ανοπτημένα κλώνοι dsRNA καθαρίστηκαν με κιτ Ambion. Σίγαση έκφραση γονιδίου Epac1 πριν από τη διέγερση με 8-CPT-cAMP 2Me-επιτεύχθηκε με επιμόλυνση των καρκινικών κυττάρων με 100 ηΜ (48 ώρες) του Epac1 dsRNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [47], [48]. Τα κύτταρα μάρτυρες επιμολύνθηκαν με ισομοριακή συγκέντρωση των κωδικοποιημένων RNA (Ambion Αριθμός καταλόγου 4610), όπως παραπάνω. Το μέγεθος της Epac1 φίμωση σε επιμολυσμένα κύτταρα, όπως μετράται με Epac1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης Epac1, κυμάνθηκε μεταξύ 60-65% [47], [48]. Τα κύτταρα στα τρυβλία 6 φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ως ακολούθως: (1) λιποφεκταμίνης + ρυθμιστικό? (2) λιποφεκταμίνης + 8-CPT-cAMP 2Me-(100 μΜ /30 min)? (3) Epac1 dsRNA (100 nm /48 h) + 8-CPT-cAMP 2Me-(100 μΜ /30 min)? ή (4) κωδικοποιημένα dsRNA (100 nm /48 h) + 8-CPT-cAMP 2Me-(100 μΜ /30 min) και επωάζονται όπως περιγράφεται ανωτέρω. Οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με αναρρόφηση του μέσου, προστέθηκε ένας όγκος CHAPS ρυθμιστικού λύσης Β, τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν επί πάγου για 15 λεπτά, μεταφέρθηκε σε σωλήνες Eppendorf, φυγοκεντρήθηκαν (1000 RPM /5 λεπτά /4 ° C), και το υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε νέους σωλήνες και προσδιορίσθηκε συγκέντρωση πρωτεΐνης. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω.

Μέτρηση των επιπτώσεων φίμωση Raptor ή Rictor RNAi φίμωση για την έκφραση του ρ-cPLA2 και COX-2 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη σε επεξεργασία με 8-CPT-cAMP 2Me-

η επιμόλυνση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με Raptor dsRNA ή Rictor dsRNA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται κατωτέρω. Για να εξακριβωθεί περαιτέρω η εμπλοκή των mTORC1 σε 8-CPT-2Me-οΑΜΡ που επάγεται προς τα πάνω ρύθμιση S6 κινάσης, εμείς σιγήσει η έκφραση του γονιδίου Raptor με RNAi, η οποία διαταράσσει τη συναρμολόγηση του συμπλόκου mTORC1 και καταστέλλουν φωσφορυλίωση προς τα κάτω στόχος S6 κινάσης του . Η ανόπτηση RNAi του Raptor αγοράστηκε από Sigma και αποτελείται από το ακολουθών νόημα (5′-3 ‘) UCU GCA AAG AUU UGU UGA GDT (ID # SAS1-16Hs01-00048387-AS). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ ανόπτηση Raptor dsRNA και κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν με λιποφεκταμίνη, όπως περιγράφεται προηγουμένως [47], [48]. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα ελέγχου διεγέρθηκαν με είτε ρυθμιστικό διάλυμα, ή 8-CPT-cAMP 2Me-(100 μΜ /30 min /37 ° C). Κύτταρα για τον αρνητικό έλεγχο μεταμολύνθηκαν με περιπλεγμένο dsRNA (100 nm /48 h, Ambion) και στη συνέχεια διεγείρονται είτε με ρυθμιστικό ή 8-CPT-cAMP 2Me-. Οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με αναρρόφηση του μέσου και τα κύτταρα λύθηκαν σε όγκο ρυθμιστικού διαλύματος Β όπως περιγράφηκε παραπάνω. Για ίσες ποσότητες πρωτεΐνης προϊόντος λύσεως, όγκου περίπου 4 × δείγματος προστίθεται ρυθμιστικό διάλυμα, τα δείγματα έβρασαν για 5 λεπτά, φυγοκεντρήθηκαν και ηλεκτροφορήθηκαν επί 10% πηκτής πολυακρυλαμιδίου. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και τα αντίστοιχα ανοσοστυπώθηκε με αντι-COX-2 και αντισώματα ρ-cPLA2. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές και ποσοτικά με ECF και φωσφορο όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και μελετήθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω.

Για να επιβεβαιωθεί ότι το 8-CPT-cAMP 2Me-επαγόμενη ενεργοποίηση mTORC2 εμπλέκεται στην προς τα πάνω ρύθμιση της cPLA2 και COX-2 θα σιγήσει γονιδιακής έκφρασης Rictor με RNAi, η οποία διαταράσσει τη συναρμολόγηση των συγκροτημάτων mTORC2 και έτσι καταστέλλουν την ενεργοποίηση mTORC2. Ο ανιχνευτής siRNA αγοράστηκε από την Ambion (μικρό παρεμβαλλόμενο RNA ID S226002) της αλληλουχίας νόημα (5′-GGG υυΑ GUU UAC AAU CAG C-3 ‘) και αντινόημα (5′-GCU GAU UGU ΑΑΑ CUA ACC-3’). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ ανόπτηση κυττάρων Rictor dsRNA και ελέγχου επιμολύνθηκαν με λιποφεκταμίνη, όπως περιγράφεται προηγουμένως [47], [48]. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα ελέγχου διεγέρθηκαν είτε με ρυθμιστικό ή 8-CPT-cAMP 2Me-(100 μΜ /30 min /37 ° C). Τα κύτταρα για τους αρνητικούς μάρτυρες επιμολύνθηκαν με περιπλεγμένο dsRNA (100 nm /48 h, Ambion) και στη συνέχεια διεγείρονται είτε με ρυθμιστικό ή 8-CPT-cAMP 2Me-όπως παραπάνω. Οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με αναρρόφηση του μέσου. Τα κύτταρα λύθηκαν επί πάγου για 20 λεπτά σε ρυθμιστικό λύσης CHAPS. Τα λύματα μεταφέρθηκαν σε σωληνάρια Eppendorf, φυγοκεντρήθηκαν στις 800 RPM για 5 λεπτά στους 4 ° C και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των υπερκειμένων προσδιορίστηκε. Για ίσες ποσότητες πρωτεΐνης κυτταρολύματος, ένας όγκος ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος 4χ προστέθηκε, και τα δείγματα έβρασαν για 5 λεπτά, φυγοκεντρήθηκαν, και ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτή polyacrylalmide. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και αντίστοιχες μεμβράνες ανοσοστυπώθηκαν με αντι-ρ-cPLA2 ή COX-2 αντισώματα. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές και ποσοτικοποιούνται με ECF και Phosphorimaging.

Αποτελέσματα

Προς τα πάνω ρύθμιση των φλεγμονωδών δεικτών ρ-cPLA2, COX-2, PGE

2, ΕΡ, και EP4 στον καρκίνο του προστάτη κύτταρα διεγερμένα με 8-CPT-cAMP 2Me-

Αξιολογήσαμε πρώτα την προ-φλεγμονώδη περιβάλλον σε τρεις ανθρώπινες γραμμές καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητη από ανδρογόνο, δηλαδή, 1-LN, DU-145, και PC-3, με ποσοτικοποίηση ρ-cPLA2

Ser505, COX-2, ΕΡ2, ΕΡ4, και PGE

2 σε αυτά τα κύτταρα διεγείρονται είτε με ρυθμιστικό ή 8-CPT-cAMP 2Me-(Σχήμα 1). Θεραπεία του καρκίνου του προστάτη κυττάρων με 8-CPT-cAMP 2Me-προκάλεσε 2-2.5-πλάσια αύξηση στην έκφραση του ρ-cPLA2

Ser505 σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήμα 1). Μια πιθανή μηχανισμός με τον οποίο Epac1 μπορεί να ενεργοποιήσει cPLA2 είναι με την ανύψωση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου και ενεργοποίηση ΜΑΡΚ. ρύθμιση Epac1 του Ca

απελευθέρωση 2+ από το ενδοπλασματικό δίκτυο έχει αναφερθεί στο παρελθόν [52]. Epac1 αυξάνει ενδοκυτταρική Ca

2+ από ΡΙ_Ογ μεσολάβηση υδρόλυσης PIP2 παραγωγή IP3 που ανυψώνει ενδοκυττάριο Ca

2+ [53]. Όλες οι γραμμές του καρκίνου του προστάτη τρία διεγείρονται με ρυθμιστικό έδειξαν αμελητέα ή πολύ χαμηλά επίπεδα COX-2 mRNA και πρωτεΐνης σε σύγκριση με 8-ΟΡΤ 2Me cAMP που διεγείρεται-κύτταρα τα οποία έδειξαν μία 2-3 φορές αύξηση στην COX-2 mRNA και πρωτεΐνης ( Σχήμα 1Α και Β). Παρόμοια με την COX-2, τη θεραπεία του προστατικού καρκινικών κυττάρων με 8-CPT-cAMP 2Me-προκάλεσε 2-3 φορές αύξηση στην ενδοκυτταρική PGE

2 της σύνθεσης σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 1 C).