έχουν

Αφηρημένο

miRNAs έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση των πολλών μονοπατιών κυτταρικής σηματοδότησης του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (CRC). Παρά το γεγονός ότι οι αναδυόμενες στοιχεία αποδεικνύουν ότι microRNA (του miR) -106a εκφράζεται ιδιαίτερα στην πρωτοπαθή όγκο και τα δείγματα κοπράνων των ασθενών CRC? έστω και miR-106a μεσολαβεί μετάσταση του καρκίνου είναι άγνωστος. Δείχνουμε εδώ ότι miR-106a εκφράζεται έντονα σε μεταστατικά κύτταρα CRC, και ρυθμίζει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή θετικά

in vitro

και

in vivo

. Αυτές οι φαινότυποι δεν συνεπάγονται σύγχυσης επιρροές επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. MiR-106α αναστέλλει την έκφραση του

μετασχηματισμού υποδοχέα αυξητικού παράγοντα-β 2

(

TGFBR2

), με αποτέλεσμα την αύξηση της μετανάστευσης CRC κυττάρων και εισβολή. Είναι σημαντικό, τα επίπεδα έκφρασης του miR-106a στην πρωτοβάθμια CRCs συσχετίζεται με την κλινική εξέλιξη του καρκίνου. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το miR-106a αναστέλλει την αντι-μεταστατική στόχο άμεσα και τα αποτελέσματα στη μετανάστευση CRC κυττάρων και εισβολή

Παράθεση:. Feng Β, Dong TT, Wang LL, Zhou HM, Zhao HC, Dong F, et al. (2012) καρκίνο του παχέος εντέρου Μετανάστευση και εισβολή Πρωτοβουλία των microRNA-106a. PLoS ONE 7 (8): e43452. doi: 10.1371 /journal.pone.0043452

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Απρίλη 2012? Αποδεκτές: 24 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Αυγούστου του 2012

Copyright: © Feng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία χρηματοδότηση ή υποστήριξη στην έκθεση

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι μεταστάσεις οδηγήσει σε περίπου 90% του καρκίνου του παχέος εντέρου ( CRC)-σχετικές θνησιμότητας, αλλά οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφές [1]. Η μετάσταση είναι μια σύνθετη, πολλές διεργασίες σύμφωνα με την οποία τα κύτταρα CRC εισβάλλουν στους περιβάλλοντες ιστούς, intravasate μέσα στην αγγείωση, μετατοπίζονται μέσω της συστηματικής κυκλοφορίας, εξαγγειώνονται στο παρέγχυμα του μακρινό ιστούς (ήπαρ και τους πνεύμονες), καθορίζει μικρομεταστάσεις, και σχηματίζουν μακροσκοπικές δευτερογενείς όγκους [2]. Τα τελευταία χρόνια, έχουν πολλαπλές μελέτες που έχουν διεξαχθεί για τη διερεύνηση των γονιδίων και των προϊόντων τους που εμπλέκονται στη μετάσταση [3] – [7].

Τα microRNAs (miRRNs) περιλαμβάνουν ένα εξελικτικά συντηρημένη κατηγορία των μικρών RNA που μπορεί γονιδιακή έκφραση σιωπή μετα-μεταγραφικά μέσω αλληλουχία-ειδικές αλληλεπιδράσεις με το 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (UTRs) του συγγενή στόχους mRNA [8]. Πρόσφατα, ο ρόλος των miRNAs στην δημιουργία και την εξέλιξη της CRC έχει γίνει εμφανής. Περισσότερο από το 50% των γονιδίων miRNA βρίσκονται σε εύθραυστη χρωμοσωμικές περιοχές που έχουν αλλοιωθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου [9], και ορισμένα miRNAs έχουν ταυτοποιηθεί ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκων σε CRC [10] – [14]. Επιπλέον, η έκφραση ανάλυσης των χαρακτηριστικών αποκάλυψε χαρακτηριστικό υπογραφές miRNA που μπορεί να προβλέψει τις κλινικές εκβάσεις της CRC [15], [16]

miR-106a. (MiRBase: MIMAT0000103) έχει αποδειχθεί ότι είναι άκρως εκφράζονται σε καρκίνου ιστούς και δείγματα κοπράνων των ασθενών CRC [16] – [18]? Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος που διαδραματίζουν οι miR-106 στο CRCs είναι άγνωστη. Ως εκ τούτου, συσχετίζονται miR-106a με τη μετανάστευση CRC και της εισβολής, ελπίζοντας ότι μια τέτοια ένωση μπορεί να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τους μηχανισμούς με τους οποίους τα κύτταρα CRC μεταστάσεις.

Αποτελέσματα

miR-106a εκφράζεται έντονα σε μεταστατικό CRC κύτταρα

Θα καθοριστεί πρώτα τα επίπεδα έκφρασης miR-106a σε μια ποικιλία των ανθρώπινων κυττάρων CRC. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [16] – [18], miR-106α ήταν ρυθμισμένη σε όλες τις έξι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC σε σύγκριση με αυθόρμητα αθανατοποιημένη, φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα παχέως εντέρου (NCM640? Σχήμα 1Α.). miR-106a ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε πιο επεμβατικές κυττάρων σε σχέση με τα κύτταρα με λιγότερο επεμβατικές χωρητικότητα (Εικ. 1Α και Β). Για παράδειγμα, το επίπεδο έκφρασης του miR-106a ήταν 9 φορές υψηλότερη σε πιο επεμβατικές κυτταρική σειρά SW480 από την λιγότερο επεμβατική ΗΤ29 κυτταρική σειρά.

Α, σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR του miR-106a έκφραση σε αθανατοποιημένα, φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου παχέος εντέρου και μια ποικιλία κυττάρων CRC. U6 μικρού πυρηνικού RNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται εις τριπλούν, και οι ράβδοι υποδεικνύουν τυπικά σφάλματα. Β, Διηθητική ικανότητα μιας σειράς κυττάρων CRC προσδιορίζεται με προσδιορισμούς Matrigel εισβολή. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα εις τριπλούν παρουσιάζεται, μαζί με τα τυπικά σφάλματα. C, ανάλυση στυπώματος Western των Ν-καδερίνης, E-cadherin, βιμεντίνη, και έκφραση σε κύτταρα ZEB1 CRC. D, ποσοτική ανάλυση με ενισχυτή εικόνας.

n

= 3,

μπαρ,

± SD.

Η

Επιπλέον, η έκφραση της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης (EMT) δείκτες (E-cadherin, N- cadherin, βιμεντίνη και ZEB1) προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. EMT μπορεί να θεωρηθεί μια παθολογική διαδικασία που συμβάλλει στην εξέλιξη του καρκίνου, ιδίως όσον αφορά την εισβολή και τη μετάσταση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C και D, τα επίπεδα έκφρασης των Ε- και Ν-cadherin ποικίλη μεταξύ επτά κυτταρικές γραμμές. Ε-καδερίνης εκφράστηκε σε NCM640 και πέντε κυτταρικές γραμμές CRC, αλλά όχι SW480, και πιο έντονα εκφράζεται σε NCM640, ΗΤ29, SW620, και LOVO. Ν-cadherin, βιμεντίνη, και η έκφραση ήταν χαμηλότερη ZEB1 στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές.

Οι δύο κυτταρικές σειρές CRC, RKO και SW480, τα οποία έχουν το υψηλότερο δυναμικό εισβολής, παρουσίασαν σταθερά χαμηλή έκφραση Ε-καδερίνης και υψηλής έκφραση της Ν-cadherin, βιμεντίνη και ZEB1.

miR-106a Ξεκινά CRC μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

in vitro

Η

επόμενο ανέλαβε

in vitro

απώλεια-του-λειτουργία αναλύσεις για να προσδιοριστεί ο ρόλος που διαδραματίζουν οι miR-106a στη μετανάστευση CRC κυττάρων και εισβολή. miR-106a σίγησε

in vitro

μέσω αντι-νόημα ολιγονουκλεοτίδια, τότε τα επίπεδα έκφρασης προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR [19]. Βρήκαμε ότι η επιμόλυνση του αντι-νόημα ολιγονουκλεοτίδια miR-106a σε κύτταρα SW480 οδήγησε σε 7,3 φορές χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης miR-106α (Σχ. 2Α). αναστολείς αντι-νόημα του miR-106a οδήγησε σε 2,5-φορές μείωση στη μετανάστευση των κυττάρων SW480, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασίες μετανάστευσης

in vitro

, σε σχέση με τα ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου (Εικ. 2Β). αναστολείς miR-106a προκάλεσε μια 2,7-πλάσια μείωση της διεισδυτικής ικανότητας των κυττάρων SW480 μετρηθεί με προσδιορισμούς εισβολής

in vitro

σύγκριση με τα ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου (Σχ. 2C). Είναι σημαντικό ότι, η μείωση αυτή δεν θα μπορούσε να αποδοθεί στην καταστροφή των κυτταρικών βιωσιμότητας (Εικ 2Δ, Ρ & gt?. 0.05). Έτσι, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι miR-106a είναι αναγκαία για την μετανάστευση και την εισβολή από αυτά τα πιο μεταστατικών κυττάρων CRC

in vitro

, αλλά δεν απαιτείται για την βιωσιμότητα.

Α, τα επίπεδα miR-106a έκφραση σε κύτταρα SW480 μετά την επιμόλυνση με αναστολείς του miR-106a, όπως προσδιορίζεται με πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται με U6 μικρό πυρηνικό RNA. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα εις τριπλούν, μαζί με τα τυπικά σφάλματα παρουσιάζεται. Β, Transwell δοκιμασίες μετανάστευση κυττάρων SW480 επιμολυσμένα με αναστολείς του miR-106a ή φορείς ελέγχου. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται εις τριπλούν και οι ράβδοι υποδηλώνουν τυπικά σφάλματα. Επίσης φαίνονται οι εικόνες αντίθεσης φάσης των κυττάρων SW480 μεταναστεύουν μέσω μεμβρανών. C, Matrigel δοκιμασίες εισβολής των κυττάρων SW480 επιμολυσμένα με ολιγονουκλεοτίδια κατά miR-106a ή ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα εις τριπλούν, καθώς και τυπικά σφάλματα φαίνεται. εικόνες αντίθεσης φάσης των κυττάρων SW480 εισέβαλαν μέσω μεμβρανών παρουσιάζονται επίσης. D, Trypan blue δοκιμασία αποκλεισμού των SW480 κυττάρων με αναστολείς miRNA. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται στο τριπλούν, μαζί με τα τυπικά σφάλματα. Ε, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ανάλυση της έκφρασης miR-106a σε κύτταρα ΗΤ29 μολυνθεί με miR-106a που εκφράζουν ή φορείς ελέγχου. U6 μικρού πυρηνικού RNA χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται εις τριπλούν, και οι ράβδοι υποδεικνύουν τυπικά σφάλματα. F, το δυναμικό μετανάστευση κυττάρων NCM640 μολυνθεί με miR-106a που εκφράζουν ή τον έλεγχο φορέων, όπως καθορίζεται από επικοινωνούντα προσδιορισμούς μετανάστευσης. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα εις τριπλούν, καθώς και τυπικά σφάλματα φαίνεται. εικόνες αντίθεσης φάσης των κυττάρων ΗΤ29 μετανάστευσαν μέσω μεμβρανών παρουσιάζονται επίσης. G, Επεμβατική δυναμικό των κυττάρων ΗΤ29 μετά την μεταγωγή miR-106a ή φορέα ελέγχου μεταγωγής μετρηθεί με προσδιορισμούς Matrigel εισβολής. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται εις τριπλούν και οι ράβδοι υποδηλώνουν τυπικά σφάλματα. Επίσης φαίνονται οι εικόνες αντίθεσης φάσης των κυττάρων ΗΤ29 εισέβαλαν μέσω μεμβρανών. Η, Καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων ΗΤ29 μολύνθηκαν με τον φορέα miR-106a που εκφράζουν ή ελέγχου

in vitro

. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται στο τριπλούν, μαζί με τα τυπικά σφάλματα.

Η

Για να προσδιορίσετε αν η υπερέκφραση του miR-106a ή δεν απονέμεται μεταναστευτικών και επεμβατική δυναμικό για μη μεταστατικό ή λιγότερο μεταστατικά κύτταρα CRC, θα κλωνοποιηθεί η γονιδιωματική αλληλουχία του ανθρώπινου γονιδίου miR-106a σε έναν ρετροϊό που προέρχεται από τον φορέα βλαστικών κυττάρων ποντικού [20]. Στη συνέχεια χρησιμοποιούνται τα προκύπτοντα φορείς να εκφράσουν miR-106a σε αθάνατα κύτταρα NCM640 και ΗΤ29 με λιγότερο μεταστατικό δυναμικό. Επιτυχής μεταγωγές του miR-106a είχαν εξακριβωθεί με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχ. 2Ε).

Σε δύο από αυτές τις δύο γραμμές, έκτοπη έκφραση του miR-106a προκάλεσε σημαντική αύξηση στην κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή ( Σχ. 2F και 2G). Μια τέτοια αύξηση δεν μπορεί να είναι λόγω των αυξημένων ποσοστών πολλαπλασιασμού αυτών των κυττάρων (Σχ 2Η, Ρ & gt?. 0.05 για τις ημέρες 0, 2, 4, και 6). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η υπερέκφραση του miR-106a είναι επαρκής για να κινήσει τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC

in vitro

.

miR-106a Προωθεί CRC εισβολή

in vivo

επόμενο καθοριστεί αν miR-106a ή δεν προκαλείται από την εισβολή

in vivo

. Για το σκοπό αυτό, μπορούμε υπερεκφράζεται miR-106a σε κύτταρα CRC που είναι κανονικά λιγότερο επεμβατική. Πρώτον, εμφυτευμένα κύτταρα ΗΤ29 μεταγωγή με miR-106a ή μολυσμένα με φορείς ελέγχου σε γυμνά ποντίκια υποδορίως. Τα ποντίκια δέκτες μεγάλωσε αξιοσημείωτη όγκους εντός 2 εβδομάδων μετά την ένεση, και έγινε ετοιμοθάνατα κατά την εβδομάδα 8 μετά την ένεση, λόγω του φορτίου του όγκου, όταν το πείραμα τερματίστηκε.

Την εβδομάδα 4 μετά την εμφύτευση, οι όγκοι του miR-106a-υπερεκφράζουν ΗΤ29 κυττάρων και όγκων κυττάρων ελέγχου λοίμωξη ήταν παρόμοια σε μέγεθος, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-106a είχε ελάχιστη επίδραση στην πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου (Σχ. 3Α). Όπως αναμενόταν, οι όγκοι των κυττάρων ελέγχου ήταν μη επεμβατική, εμφανίζεται ως μάζες όγκου περιορίζεται εντός ινώδη κάψουλες (Σχ. 3Β, αριστερό πάνελ). Αντίθετα, οι όγκοι του miR-106a-κύτταρα που υπερεκφράζουν είχε νησιά των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων που εισβάλλουν σε γειτονικούς ιστούς στρωματικά (Σχ. 3Β, αριστερό πάνελ). Έτσι, έκτοπη έκφραση του miR-106a ανατίθενται επεμβατική ικανότητα σε καρκινικά κύτταρα που είναι κατά τα άλλα μη επεμβατική.

Α, καμπύλες ανάπτυξης των όγκων που σχηματίζονται από ΗΤ29 κύτταρα μολυσμένα με miR-106a που εκφράζουν ή φορείς ελέγχου. Κάθε τελεία δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα 3-4 ποντίκια. Β, αιματοξυλίνη και τμήματα ηωσίνη-βάφονται του ΚΕΣ που αποτελούνται από κύτταρα ΗΤ29 μολυνθεί με miR-106a που εκφράζουν ή τον έλεγχο φορέων 8 εβδομάδες μετά την εμφύτευση.

Η

TGFBR2

αποτελεί άμεσο στόχο της miR-106a

για να κατανοήσουμε το μηχανισμό με τον οποίο miR-106a επάγει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή, χρησιμοποιήσαμε δύο αλγορίθμους (PicTar και TargetScan) να εντοπίσει τους στόχους της ανθρώπινης miR-106a [21], [22]. Μεταξύ των 990 στόχων που προβλέπονται από TargetScan, η

LAMA3

(ID Gene: 3909) και

TGFBR2

γονίδια (ID Gene: 7048) έχουν ήδη εμπλακεί στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης και /ή εισβολή [23] – [27].

TGFBR2

είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον, επειδή η έκφραση του

TGFBR2

έχει δειχθεί να χαθεί προοδευτικώς κατά τη διάρκεια κακοήθη εξέλιξη των διαφόρων τύπων καρκίνου [23], [25], [27], [28 ]. Επιπλέον, TGFBR2 mRNA που κωδικοποιεί έχει ένα 3’UTR στοιχείο που είναι συμπληρωματικό προς miR-106α (Σχ. 4Α).

Α, της προβλεπόμενης σχηματισμό του διπόλου μεταξύ ανθρώπινου

TGFBR2

3’UTR και miR-106a. B, Real-time RT-PCR αναλύσεις

TGFBR2

στα κύτταρα ΗΤ29 μολυνθεί με miR-106a που εκφράζουν ή τον φορέα ελέγχου.

GAPDH

mRNA χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται στο τριπλούν, μαζί με τα τυπικά σφάλματα. C, λουσιφεράσης δραστηριότητα του άγριου τύπου

TGFBR2

γονιδίου αναφοράς 3’ΙΙΤΡ στα κύτταρα ΗΤ29 μολυνθεί με miR-106a που εκφράζουν ή φορείς ελέγχου. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται στο τριπλούν, μαζί με τα τυπικά σφάλματα. D, λουσιφεράσης δραστηριότητα του μεταλλαγμένου τύπου

TGFBR2

γονιδίου αναφοράς 3’ΙΙΤΡ στα κύτταρα ΗΤ29 μολυνθεί με miR-106a που εκφράζουν ή φορείς ελέγχου. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται στο τριπλούν. Μπαρ δηλώνουν τα τυπικά σφάλματα.

Η

Πράγματι, η υπερέκφραση του miR-106a οδήγησε στην υποβάθμιση του

TGFBR2

mRNA, όπως μετράται με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Εικ. 4Β). Στην συνέχεια προσδιορίσαμε έστω

TGFBR2

είναι άμεσος στόχος του miR-106a-παρεμπόδιση που προκαλείται δι ‘ανιχνεύσεως τη δραστικότητα ενός γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης συντηγμένο στην 3’UTR του άγριου τύπου

TGFBR2

γονίδιο. miR-106a μείωσε την δραστηριότητα της λουσιφεράσης σημαντικά (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 4C.). Αναστολή της

TGFBR2

διαμεσολαβείται από miR-106a εξαρτάται από την παρουσία των θέσεων δέσμευσης miR-106a ομόλογο στην 3’UTR του

TGFBR2

γονίδιο. Επειδή ο δημοσιογράφος λουσιφεράσης φέρει ένα μεταλλαγμένο

TGFBR2

3’UTR, η υποκατάσταση των 4 νουκλεοτιδίων εντός της θέσεις δέσμευσης miR-106a δεν ανεστάλησαν από miR-106a έκτοπη έκφραση (Σχήμα 4D, η P & gt?. 0.05). Συλλογικά, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι

TGFBR2

μπορεί να λειτουργήσει ως άμεσο στόχο του miR-106a-μεσολάβηση αποσιώπηση.

TGFBR2

είναι ένα λειτουργικό στόχος του miR-106a

επόμενο καθοριστεί εάν ή όχι μειωμένη έκφραση του

TGFBR2

γονίδιο είναι απαραίτητη για την επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης και της εισβολής που παρατηρήθηκαν μετά miR-106a υπερέκφραση. Υπερεκφράσαμε miR-106a και ένα κατασκεύασμα που εκφράζει

TGFBR2

συστατικά. Αυτό το κατασκεύασμα κωδικοποιεί ολόκληρη την αλληλουχία κωδικοποίησης

TGFBR2,

ενώ λείπει το στοιχείο 3’UTR, αποδίδοντας έτσι ένα είδος ανθεκτικό σε miR-106a παρεμπόδιση που προκαλείται mRNA. Είναι αξιοσημείωτο ότι το προκύπτον συστατικώς εκφρασμένο

TGFBR2

κατήργησε την προηγουμένως αυξημένα μετανάστευση και εισβολή ξεκίνησε από miR-106a (Σχήμα 5Α.), Αλλά δεν είχε καμία επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου (Σχήμα 5Β, Ρ & gt?. 0.05), γεγονός που υποδηλώνει ότι

TGFBR2

είναι πράγματι ένα λειτουργικό στόχο του miR-106a.

ένα, Matrigel δοκιμασίες εισβολή του miR-106a-μετάγονται ή ελέγχου-μολυσμένα κύτταρα ΗΤ29 παροδικά επιμολυσμένα με

TGFBR2

. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται στο τριπλούν μαζί με τυπικά σφάλματα. Β, Trypan blue δοκιμασία αποκλεισμού του miR-106a-κύτταρα που εκφράζουν ΗΤ29 μετάγονται

TGFBR2

ή φορέα ελέγχου. Παρίσταται ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα εις τριπλούν, μαζί με τα τυπικά σφάλματα. C, Ανοσοκηλίδωση για

TGFBR2

στα κύτταρα ΗΤ29 παροδικά επιμολυσμένα με

TGFBR2

siRNA. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται στο τριπλούν, μαζί με τα τυπικά σφάλματα. D, Σύγκριση της αυξημένης δυναμικό της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων ΗΤ29 μεταγωγή με miR-106a και ΗΤ29 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με

β

siRNA. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται στο τριπλούν. Μπαρ δηλώνουν τα τυπικά σφάλματα.

Η

Επίσης, θέλαμε να διευκρινιστεί κατά πόσον ή όχι την υποβάθμιση του

TGFBR2

είναι επαρκής για την miR-106a-μεσολάβηση αύξηση της μετανάστευσης και της εισβολής. Επιμόλυνση του

TGFBR2

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA), η οποία οδήγησε σε & gt? Μείωση κατά 90% στα επίπεδα του

TGFBR2

πρωτεΐνης (Εικ. 5C), οδήγησε σε μια αξιοσημείωτη, αλλά όχι πλήρης επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολή σε σύγκριση με την επαγωγή που προκαλείται από miR-106a υπερέκφραση (Σχ. 5D). Συλλογικά,

TGFBR2

φαίνεται να είναι αναγκαία, αλλά όχι ικανή στόχο της miR-106a.

Η έκφραση του miR-106a είναι αυξημένη σε μεταστατικό πρωτοπαθές CRC

Είναι σημαντικό, σε πρόσφατη ανάλυση μικροσυστοιχιών έδειξαν ότι miR-106a είναι μεταξύ εκείνων των miRNAs που είναι εντόνως εκφρασμένες σε πρωτογενή CRC σε σύγκριση με φυσιολογικό ορθοκολικό επιθηλιακό ιστό [16], [18]. Έχουμε καθορίζεται κατά πόσον ή όχι η έκφραση του miR-106a στη μετάσταση-θετικούς όγκους είναι υψηλότερη από ό, τι οι όγκοι μετάσταση-free, και αν δεν miR-1061 έκφραση σχετίζεται με κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς με CRC. Έχουμε προσληφθεί 28 ασθενείς CRC που ήταν μακροχρόνια μετάσταση χωρίς επιζώντες μετά από πλήρη χειρουργική εκτομή του πρωτογενούς όγκου, και σε σύγκριση με τους ασθενείς με μια ομάδα ελέγχου των ασθενών με μετάσταση κατά τη στιγμή της διάγνωσης ή μετάστασης σε παρακολούθηση (& lt? 60 μηνών ) (Πίνακας S1). Επιπλέον, τα ποσοστά επιβίωσης μετάσταση χωρίς ασθενών χωρίς μετάσταση κατά τη διάγνωση κατανεμήθηκαν με βάση την κατάσταση έκφρασης του miR-106a. Πράγματι, οι ασθενείς μετάσταση θετικά είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα των miR-106a σε πρωτογενείς όγκους τους σε σχέση με τους ασθενείς χωρίς μεταστάσεις (Εικόνα 6Α, Ρ & lt?. 0.05). Αξίζει να σημειωθεί ότι, μεταξύ όλων αυτών των ασθενών, εκείνοι που είχαν χαμηλότερα επίπεδα των miR-106a είχαν καλύτερα κλινικά αποτελέσματα (Σχήμα 6Β,

σ

& lt?. 0.05). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-106a έχει να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην CRC μετάσταση.

Ένα, τα επίπεδα έκφρασης miR-106a στην πρωτοβάθμια CRCs με ή χωρίς μετάσταση. Υπήρχε μια σημαντική διαφορά στην έκφραση miR-106a σε αυτές τις δύο ομάδες. Β, Kaplan-Meier μετάσταση επιβίωση χωρίς για 28 ασθενείς CRC χωρίς μετάσταση κατά τη διάγνωση, στρωματοποιημένη με βάση τα επίπεδα έκφρασης miR-106a σε πρωτογενείς όγκους τους. Aχ

2 δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση και ένα P & lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Η

Συζήτηση

Η παρούσα εργασία προσδιορίζονται miR-106a ως φιλο-μετάσταση miRNA που οδηγεί στην προώθηση της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων CRC. Αναγωγή αυτού του miRNA σε κύτταρα CRC που διαφορετικά μεταστατικά μείωσε την μεταναστευτικά και επεμβατική δυναμικό των κυττάρων CRC. Αντίθετα, προς τα πάνω ρύθμιση του miR-106a σε κύτταρα CRC με λιγότερη μετανάστευση και εισβολή δυναμικό αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Δείξαμε ότι το miR-106a δεν επηρεάζει σημαντικά τα πολλαπλασιαστικά ποσοστά των κυττάρων CRC

in vitro

και

in vivo

. Τέτοια στοιχεία δείχνουν ότι το miR-106a μπορεί να παίξει μόνο ένα ρόλο στην CRC κυττάρων εισβολής.

Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και από τον ίδιο τον ασθενή, SW480 και SW620 κύτταρα είχαν διαφορετικό δυναμικό εισβολή και την έκφραση του miR-106a (Εικ. 1Α και Β ). Είναι πιθανό ότι αυτό το εύρημα ήταν επειδή τα κύτταρα SW480 είναι από ένα πρωτεύον καρκίνο που υποβάλλονται σε ΕΜΤ και SW620 κύτταρα είναι από ένα δευτερεύον καρκίνο. Η μείωση στην έκφραση των ZEB1 στα κύτταρα SW620 σε σύγκριση με τα κύτταρα SW480 μπορεί να οδηγήσει σε αποκατάσταση των επιπέδων E-cadherin και να προκαλεί μια αντίστροφη διαδικασία της EMT, ή μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ) [29], στην οποία miR-106a μπορούν να παίξουν ένα ρόλο ως ανάντη ή κατάντη παράγοντα ZEB1.

τα ευρήματά μας αναφέρει για πρώτη φορά ότι ένα γονίδιο στόχος του miR-106a,

TGFBR2

μπορεί να ρυθμίζεται αρνητικά από miR-106a κατά τη μεταγραφικό επίπεδο μέσω δέσμευσης του 3’UTR του

TGFBR2

mRNA σε CRC.

TGFBR2

είναι ένα σημαντικό μόριο σηματοδότησης ΤΟΡ-β συχνά βρεθεί να είναι ένα από τα γονίδια μεταβάλλονται σε καρκίνο. Το μονοπάτι σηματοδότησης ΤΟΡ-β παίζει ένα σύνθετο ρόλο, η οποία παραμένει αμφιλεγόμενη, στην κακοήθη εξέλιξη των όγκων. Έχει δειχθεί ότι ο ΤΟΡ-β μπορεί να επάγει την ΕΜΤ και την προώθηση της εισβολής καρκινικών κυττάρων [30], ενώ μια άλλη μελέτη έχει δείξει ότι η μειωμένη

TGFBR2

έκφραση συσχετίζεται με την επιθετική χαρακτηριστικά του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [25]. Στο CRC, ΤΟΡ-β μπορεί να επάγει την αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, και

TGFBR2

ήταν μια πρωτεΐνη καταστολής όγκου που απαιτείται για την ΤΟΡ-β σηματοδότηση [31]. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των

TGFBR2

αυξάνει την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή των ΗΤ29 (Σχ. 2G και 5D). Ως εκ τούτου, σηματοδότηση ΤΟΡ-β μπορεί να είναι μια σημαντική προσέγγιση με την οποία miRNAs ρυθμίζουν την ανάπτυξη των όγκων. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι το miR-17~92, ενεργοποιείται από το c-myc, εξασθενεί η TGFβ μονοπατιού σηματοδότησης, τονώνοντας έτσι την ανάπτυξη των κυττάρων και την αγγειογένεση του όγκου [32]. Παρά το γεγονός ότι

TGFBR2

φαίνεται να είναι αναγκαία, αλλά όχι ικανή στόχο της miR-106a στην παρούσα μελέτη, η σχέση μεταξύ του miR-106a και σηματοδότηση TGF-β αξίζει περαιτέρω μελέτης.

κλινικοπαθολογική ανάλυση κατέδειξε περαιτέρω τη σύνδεση μεταξύ miR-106a και μετάσταση. Η μακροχρόνια επιζώντες χωρίς μετάσταση είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα του miR-106a σε πρωτογενείς όγκους τους σε σχέση με τους ασθενείς με υποτροπή της νόσου, και τα χαμηλότερα επίπεδα των miR-106a δείχνει ένα υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης μετάσταση ελεύθερο (Εικ. 6). Το εύρημα αυτό υποστηρίζει σθεναρά την άποψη ότι η υπερέκφραση του miR-106a είναι στενά συνδεδεμένος με την μετάσταση της CRC.

Εν κατακλείδι, δείξαμε ότι η έκφραση του miR-106a συσχετίσθηκε θετικά με την πιθανή μετανάστευση και την εισβολή του CRC κύτταρα, και προς τα κάτω ρύθμιση του

TGFBR2

, ως ένα από τα γονίδια-στόχους για miR-106a, θα μπορούσε να αυξήσει τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή.

το πιο σημαντικό, τα επίπεδα έκφρασης miR-106a σε οι πρωτογενείς CRCs συσχετίζονται με την κλινική εξέλιξη του καρκίνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-106a μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο στόχο για θεραπευτική παρέμβαση για την πρόληψη της CRC μετάσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων

Η αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά επιθηλιακών κυττάρων ανθρώπινου κόλον, NCM640, ήταν ένα δώρο από JQ Zhang και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS ΗΤ29, SW480, LOVO, SW1116, και κυτταρικές σειρές SW480 αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν κάτω από συνθήκες, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Απομόνωση RNA και miRNAs Αναλύσεις

Το ολικό RNA από καλλιεργημένα κύτταρα εκχυλίζεται με κιτ απομόνωσης mirVana (AM1560, Ambion, Austin, TX, USA). δοκιμασίες miRNAs πραγματοποιήθηκαν με mirVana qRT-PCR miRNA Detection Kit (AM1558, Ambion) μαζί με qRT-PCT Primer Σετ (4395280, Ambion) σύμφωνα με τα εγχειρίδια των κατασκευών. U6 μικρό πυρηνικό RNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

ολιγονουκλεοτιδίων Η επιμόλυνση

Ο αναστολέας miRIDIAN microRNA, miRIDIAN Μιμούνται HSA-miR-106a και siRNA του

TGFBR2

αγοράστηκε από Dharmacon (IH-300526-08, C-300526-07, και D-003930, Dharmacon, Lafayette, CO, USA). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 200 ηΜ των υποδεικνυόμενων ολιγονουκλεοτιδίων χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο Oligofectamine (12.252.011, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για μεταγενέστερα πειράματα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Gene Κλωνοποίηση και έκτοπη έκφραση

Το ανθρώπινο γονίδιο miRNA ενισχύθηκε με PCR από φυσιολογικά γονιδιωματικό DNA και κλωνοποιήθηκε στο MDH1-PGK-GFP 2.0 ρετροϊό προερχόμενο φορέα.

TGFBR2

cDNAs που στερείται της 3’UTR ενισχύθηκε με PCR από φυσιολογικά γονιδιωματικό DNA και εκφράζονται από pWZL-βλαστισιδίνη φορέα. Viral παραγωγή και μόλυνση των κυττάρων-στόχων έχουν περιγραφεί προηγουμένως [33]. Μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με 2 μg /ml πουρομυκίνης (P9620, Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA), 200 μg /ml υγρομυκίνης (H9773, Sigma), και 10 μg /ml του blasticidin (SC-205604, Σάντα Cruz, Santa Cruz, CA, USA).

In vitro μετανάστευση και την εισβολή Αναλύσεις

Το δυναμικό της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων CRC εκτιμήθηκε, όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελαφρές τροποποιήσεις [34].

κύτταρα CRC (2.5 × 10

5), απλώθηκαν σε μη επικαλυμμένων άνω θαλάμων (ένθετα 24 και? μέγεθος πόρων, 8 μm? BD Bioscience, Bedford, ΜΑ, USA) για επικοινωνούντα προσδιορισμούς μετανάστευσης. κύτταρα CRC (2.5 × 10

5) τοποθετήθηκαν σε επικαλυμμένα με Matrigel άνω θαλάμων (ένθετα 24 και? μέγεθος πόρων, 8 μm? BD Bioscience). για δοκιμασίες εισβολή

Το μέσο στην κορυφή συστατικό ήταν αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με μέσο ελεύθερο ορού 2 ώρες μετά τη σπορά, και μέσο που περιέχει 20% ορό χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκυστικό στους κατώτερους θαλάμους. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα και στις δύο πλευρές του θαλάμου μονιμοποιήθηκαν με 50/50% ακετόνη /μεθανόλη. Κύτταρα στον πυθμένα του θαλάμου βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (C3886, Sigma). Στη συνέχεια, η εικόνα της κάθε φρεάτιο μεταφέρθηκε στην εικόνα τους πυρήνες των κυττάρων με το × 10 στόχου, και οι πυρήνες των κυττάρων σε κάθε πεδίο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Image-J (ΝΙΗ? https://rsb.info.nih.gov /θ /).

Πειράματα σε ζώα

Έξι έως οκτώ εβδομάδων γυμνά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη, και όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας ζώων της Σαγκάης Jiaotong Πανεπιστήμιο . 10

6 ΗΤ29 κύτταρα σε 200 μλ DMEM εγχύθηκαν στα πλευρά των ποντικών υποδορίως. Οι διάμετροι των όγκων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα με παχύμετρο ακριβείας. Τρεις έως τέσσερις ποντικοί ανά ομάδα υποβλήθηκαν σε ευθανασία σε καθένα από τα 4 χρονικά σημεία (εβδομάδα 2, 4, 6, και 8 μετά την μεταμόσχευση). Οι όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Τα δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 12 ώρες, μετά πλύθηκαν με PBS και υποβλήθηκαν σε 70% αιθανόλη, που ακολουθείται από εγκλείστηκαν σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (H9627 και E4009, Sigma).

SYBR Green πραγματικό χρόνο RT-PCR

Το συνολικό RNA των κυττάρων εκχυλίστηκε και μεταγράφηκε ανάστροφα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Οι ανάντη και κατάντη εκκινητές για το

TGFBR2

γονίδιο ελήφθησαν από Primerbank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/): 5′-GTAGCTCTGATGAGTGCAATGAC-3 ‘και 5’-CAGATATGGCAACTCCCAGTG-3 ‘. SYBR πράσινο πραγματικού χρόνου RT-PCR και η αντίστοιχη ανάλυση των δεδομένων έχουν περιγραφεί προηγουμένως [35]. β-ακτίνης mRNA χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος (εκκινητές: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 ‘και 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’).

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό λύσης . Οι πρωτεΐνες από κυτταρολύματα αναλύθηκαν με PAGE γέλη, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore Corp., Billerica, ΜΑ, USA), τότε μπλοκάρεται σε 5% άπαχο γάλα σε PBS /Tween-20, ακολουθούμενη από επώαση με αντίσωμα againstN-καδερίνης (SC-271386, Santa Cruz), Ε-καντερίνη (SC-21791, Σάντα Κρουζ), βιμεντίνη (SC-373717, Santa Cruz), ZEB1 (SC-25388, Santa Cruz) ή TGFBR2 (SC-17799, Σάντα Κρουζ) . Η ποσότητα της πρωτεΐνης στόχου διαμορφώνεται με τη χρήση β-ακτίνη (SC-130656, Santa Cruz), και λήφθηκαν σχετικές εντάσεις.

Κατασκευάστε

TGFBR2

3’UTR ακολουθίες κλωνοποιήθηκαν σε κατασκεύασμα pMIR-REPORT λουσιφεράσης (AM5795, Ambion) [36]. Μεταλλαγμένα

TGFBR2

3’ΙΙΤΡ δημιουργήθηκε με QuickChange Ιστοσελίδα-Directed Mutagenesis Kit (200519, Stratagene, Palo Alto, CA, USA).

Δοκιμασία λουσιφεράσης

Cells σε 50% συρροή σε πλάκες 24-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με Fugene6 (E2691, Promega, Madison, WI, USA). Το κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης γονίδιο (200 ng) και το κατασκεύασμα λουσιφεράσης pRL-SV40 Renilla (1 ng [χρησιμοποιείται για την ομαλοποίηση]) συν-επιμολύνθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάζονται 24-48 ώρες μετά την επιμόλυνση και μετράται με Dual-Luciferase Reporter System Assay (E1910, Promega).

Κλινική ορθοκολικούς όγκους

Πρωτογενής ορθοκολικούς όγκους και αντίστοιχο φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό ήταν συλλέχθηκαν μεταξύ 2004 και 2006, και υποβάλλονται σε επεξεργασία σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ruijin Νοσοκομείο της Σαγκάης Πανεπιστήμιο Jiaotong της Ιατρικής Σχολής. Το στάδιο TNM του όγκου προσδιορίστηκε σύμφωνα με την κατάταξη που προτείνει η Cancer AJCC Σταδιοποίηση Εγχειρίδιο [37]. δεδομένων παρακολούθησης συνοψίστηκαν στο τέλος του 2011, με διάμεση παρακολούθηση 60 μηνών. Φρέσκο ​​ιστός συλλέχθηκε από τους ασθενείς, snap-κατεψυγμένα, και διατηρούνται στους -80 ° C. Μερική τομές από τους ίδιους τους ιστούς στη συνέχεια βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-eiosin για την επικύρωση της παρουσίας του όγκου και οι ιστοί που περιέχουν & gt? Κύτταρα όγκου 90% χρησιμοποιήθηκε για qRT-PCR όπως όγκους. Ολικό RNA απομονώθηκε από κατεψυγμένα ιστό χρησιμοποιώντας εκχύλιση ΤΚΙζοΙ (15596, Ambion) και ένα κιτ mirVana miRNA Απομόνωση (AM1560, Ambion). δοκιμασίες miRNA πραγματοποιήθηκαν με mirVana qRT-PCR miRNA Detection Kit (AM1558, Ambion) μαζί με qRT-PCT Primer Σετ (4395280, Ambion) σύμφωνα με τα εγχειρίδια του κατασκευαστή. U6 μικρού πυρηνικού RNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Πρωτοπαθείς όγκους κατανεμήθηκαν ως miR-106a χαμηλότερη ή υψηλότερη για να διακρίνουν αν τα επίπεδα miR-106a συσχετίζονται με μετάσταση. Οι όγκοι θεωρήθηκαν miR-106a χαμηλότερα ή υψηλότερα, εάν η ομαλοποιημένη έκφραση του miR-106a διαμείνει στο κάτω μέρος ή στην κορυφή το 50% των όγκων στην ομάδα, αντίστοιχα.

Η ανάπτυξη και βιωσιμότητα κυττάρου Δοκιμασία

Για να προσδιοριστεί ρυθμούς ανάπτυξης, 2,5 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας 12-φρεατίων. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν σε ένα αιμοκυτταρόμετρο κάθε 2 ημέρες μέχρι την ημέρα 6. Για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και αραιώθηκαν με 0,4% trypan blue (302643, Sigma) χρώση διάλυμα και μετρήθηκαν σε ένα Αιματοκυτταρόμετρο.

Στατιστική Ανάλυση

τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση σφάλματα. Ένα t-test Student (two-tailed) χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει δύο ομάδες (P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά (χ

2 τεστ)

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. .

Συσχέτιση της έκφρασης miR-106a με μετάσταση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.

doi: 10.1371 /journal.pone.0043452.s001

(DOC)