Αφηρημένο

Περίπου το 40% των καρκίνων του ορθού λιμανιού ενεργοποίηση K-RAS μεταλλάξεις, και αυτές οι μεταλλάξεις που σχετίζονται με την κακή κλινική ανταπόκριση στη χημειοακτινοθεραπεία. Έχουμε ως στόχο να εντοπίσει μικρά μόρια αναστολείς (ΜΜΘ) που συνεργούν με ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR) ( «ραδιοευαισθητοποιητών») που θα μπορούσαν να ενσωματωθούν σε τρέχουσες στρατηγικές θεραπείας για τοπικά προχωρημένο ορθού (LARCs) εκφράζουν μεταλλαγμένες K-RAS. Έχουμε βελτιστοποιημένες πρώτα μία δοκιμασία υψηλής απόδοσης για τη μέτρηση μεμονωμένων και συνδυασμένων αποτελεσμάτων της ΜΜΒ και IR που παράγει παρόμοια αποτελέσματα με τη δοκιμασία σχηματισμού αποικίας χρυσό πρότυπο. Χρησιμοποιώντας αυτή την πλατφόρμα ελέγχου και K-RAS μεταλλαγμένο ορθού καρκινικές κυτταρικές σειρές, ελέγξαμε ΜΜΒ στοχεύουν διαφορετικές οδούς σηματοδότησης για τη ραδιοευαισθητοποίηση δραστηριότητα και στη συνέχεια αξιολογούνται κορυφή επιτυχίες μας σε πειράματα παρακολούθησης. Οι δύο πιο ισχυρές ραδιοευαισθητοποιητών ήταν η Chk1 /2 AZD7762 αναστολέα και ο αναστολέας ΡΙ3Κ /mTOR BEZ235. Το χημειοθεραπευτικό παράγοντα 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), η οποία χρησιμοποιείται για τη θεραπεία LARC, synergized με AZD7762 και ενισχυμένη ραδιοευαισθητοποίηση με AZD7762. Αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που συγκρίνουν τις διάφορες ΜΜΒ σε συνδυασμό με IR για τη θεραπεία του K-RAS μεταλλαγμένο καρκίνου του ορθού, και τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι αναστολείς Chk1 /2 θα πρέπει να αξιολογούνται σε νέες κλινικές δοκιμές για LARC.

Παράθεση : Kleiman LB, Krebs AM, Κιμ SY, το Χονγκ TS, Haigis KM (2013) Συγκριτική Ανάλυση των Ακτινοευαισθητοποιητικά για K-RAS Mutant ορθού. PLoS ONE 8 (12): e82982. doi: 10.1371 /journal.pone.0082982

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Ιούλη του 2013? Αποδεκτές: 29 Οκτωβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 του Δεκέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Kleiman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από την αμερικανική Εταιρεία Καρκίνου (MGO-114877 σε KMH και PF-11-260-01 να LBK) και με επιχορήγηση πιλοτικό έργο από το πρόγραμμα δέσμη πρωτονίων Ομοσπονδιακή Share. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

εκτιμάται ότι 1,2 εκατομμύρια άνθρωποι σε όλο τον κόσμο έχουν διαγνωστεί με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) κάθε χρόνο, και περίπου 600.000 άνθρωποι πεθαίνουν από την ασθένεια [1]. Πιο αποτελεσματικές θεραπευτικές επιλογές χρειάζονται επειγόντως. CRCs Χαμηλής ποιότητας μπορεί να θεραπευτεί μόνο με χειρουργική επέμβαση, ενώ αργότερα καρκίνων στάδιο επιπροσθέτως αντιμετωπίζονται με κάποιο συνδυασμό χημειοθεραπείας, IR, και στοχευμένες θεραπείες, ανάλογα με την ανατομική θέση και σταδιοποίηση του όγκου. Στοχευμένες θεραπείες (ΠΜΕ και μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs)) επηρεάζουν μονοπάτια έκτροπα ενεργοποιείται σε καρκινικά κύτταρα σηματοδότησης και σιγά-σιγά το δρόμο τους στην κλινική για τη θεραπεία διαφόρων μορφών καρκίνου, είτε ως μονοθεραπείες ή αλλιώς να βελτιώσει τις απαντήσεις στο πρότυπο θεραπείες. Τρία τέτοια φάρμακα (όλα τα mAbs) έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του μεταστατικού CRC: cetuximab και panitumumab, οι οποίες αναστέλλουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR? ένα μέλος της οικογένειας ErbB των κινασών τυροσίνης υποδοχέα) και δείχνουν όφελος μόνο για K-RAS άγριου τύπου καρκίνους και bevacizumab, η οποία αναστέλλει την αγγειογένεση προώθηση αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) [2]. Αυτά τα μονοκλωνικά αντισώματα μέχρι στιγμής δεν έχουν δείξει όφελος για τοπικά προχωρημένη νόσο [3,4], και δεν στοχευμένες θεραπείες που έχουν εγκριθεί για μη μεταστατικό CRC.

Λόγω της ανατομικής θέσης τους, χειρουργικές εκτομές είναι πιο δύσκολο για τον καρκίνο του ορθού σε σύγκριση με καρκίνο του παχέος εντέρου, και ως εκ τούτου υπάρχει ένας μεγαλύτερος κίνδυνος τοπικής υποτροπής [5,6]. Προεγχειρητική ακτινοθεραπεία μειώνει το τοπικό ποσοστό υποτροπής και χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία για τη θεραπεία LARC [7,8]. Παρ ‘όλα αυτά, μόνο το 10% αυτών των ασθενών επιτυγχάνουν μία παθολογικά πλήρη ανταπόκριση (PCR) και το ένα τρίτο της μήτρας εντός 5 ετών [9,10]. Στρατηγικές για τη βελτίωση της απόκρισης στοχεύουν στην αύξηση την κυτταροτοξική δράση του IR στα κύτταρα του όγκου χωρίς να επηρεάζουν παρομοίως φυσιολογικό ιστό, προκειμένου να ελαχιστοποιηθούν οι παρενέργειες της θεραπείας. Προσδιορισμός των chemoradiosensitizing φαρμάκων είναι ιδιαίτερα σημαντικό για το ~ 40% των ασθενών με καρκίνο του ορθού που φιλοξενούν K-RAS μεταλλάξεις [8]. Μεταλλαγμένα K-RAS έχει εκτεταμένα συνδεθεί με ραδιοαντοχή σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές [11-17]. Επιπλέον, η απόκριση των ασθενών LARC να χημειοραδιοθεραπεία είναι εξαιρετικά μεταβλητή, με ορισμένους ασθενείς που εμφανίζουν PCR και άλλοι μια ελάχιστη απόκριση. K-RAS μεταλλάξεις είναι πιο συχνή σε ασθενείς με μη-PCR [18], το οποίο σχετίζεται με μειωμένο ελεύθερη νόσου επιβίωση [10].

K-RAS είναι ένα μικρό ΘΤΡάσης που να λειτουργεί προς τα κάτω των υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας , όπως EGFR, και τους διακόπτες μεταξύ ενός ανενεργού, κατάσταση ΑΕΠ-δεσμεύεται και ενεργό, GTP-δεσμευμένη κατάσταση [19]. GTP-δεσμευμένη K-RAS ενεργοποιεί διάφορες καταρρακτών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του κανονικού Raf-ΜΕΚ-ΕΚΚ (ΜΑΡΚ) και οδοί ΡΙ3Κ-Akt-mTOR, για τη ρύθμιση κυτταρικών διεργασιών όπως ο πολλαπλασιασμός και η επιβίωση. Μεταλλάξεις στο K-RAS είναι πιο συχνά βρίσκονται στα κωδικόνια 12 και 13 και υδρόλυση συμβιβασμό GTP διεγείρεται από πρωτεΐνες ΟΤΡάσης ενεργοποίησης (διάκενα), με αποτέλεσμα την υπερδραστήρια K-RAS και ανεξέλεγκτης διάδοσης [19].

IR παράγει διαφορετικά βλάβες DNA, με τους σημαντικότερους είναι DNA δίκλωνα σπασίματα (DSBs), και συχνά συλλαμβάνει κύτταρα σε G1-S ή G2-M μετάπτωση του κυτταρικού κύκλου για να καταστεί δυνατή η επιδιόρθωση του DNA [20]. Εάν υπάρχουν σημαντικές ή ανεπανόρθωτες βλάβες, τα κύτταρα μπορεί να πεθάνουν μέσω απόπτωσης ή νέκρωσης ή υποβάλλονται σε κυτταρική γήρανση [21]. Η ακτινοθεραπεία μπορεί να βελτιωθεί με τη ρύθμιση επιδιόρθωση του DNA, τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, ή μονοπατιών μεταγωγής σήματος, όπως τα ΜΑΡΚ ή ΡΙ3Κ οδών [22,23]. Παρ ‘όλα αυτά, η βέλτιστη στρατηγική για την ενσωμάτωση στοχευμένες θεραπείες σε θεραπευτικά σχήματα είναι ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε βελτιστοποιημένα μια οθόνη ραδιοευαισθητοποίηση υψηλής απόδοσης για πρωκτική καρκινικές κυτταρικές σειρές και προσδιόρισε ραδιοευαισθητοποίησης φάρμακα για K-RAS μεταλλαγμένο ορθού.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και φάρμακο λύσεις

DLD-1 και HCT116 του κόλου καρκινικά κύτταρα ελήφθησαν από το εργαστήριο Vogelstein (Johns Hopkins Kimmel Cancer Center, Baltimore, MD). Του ορθού και καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από το Κέντρο Μοριακής Therapeutics (Γενικό Νοσοκομείο της Μασαχουσέτης, Boston, ΜΑ). DLD-1 και HCT116 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS. Του ορθού και καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F-12 συμπληρωμένο με 5% FBS. Βλέπε Πίνακα S1 για πληροφορίες κυτταρική γραμμή και τον Πίνακα S2 για πληροφορίες φαρμάκου.

φάρμακα και ακτινοβολία θεραπείες

Την ημέρα μετά την σπορά των κυττάρων, το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο που περιέχει όχημα ή φάρμακο, και IR ήταν εφαρμόζονται δύο ώρες αργότερα με ένα JL Shepherd Mark I Μοντέλο 25 ακτινοβόλησης με μια πηγή Cs-137. Sham ακτινοβολημένα (0 Gy) μάρτυρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ακριβώς το ίδιο όπως ακτινοβολημένα δείγματα εκτός του ότι δεν εφαρμόστηκε ακτινοβολία. Δεν φρεάτια άκρη του πλάκες 96-φρεατίων χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση. Drug περιέχουν μέσο αντικαταστάθηκε κάθε δεύτερη μέρα, αλλά τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια ραδιοευαισθητοποίηση όταν το φάρμακο δεν αντικαταστάθηκε.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων έτσι ώστε κάθε φρεάτιο περιείχε στο τουλάχιστον 20 αποικίες που είχαν ελάχιστα αγγίζει μετά από 2-3 εβδομάδες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για 30 λεπτά με ένα μίγμα από 6% γλουταραλδεϋδη και 0,5% κρυσταλλικό ιώδες σε απεσταγμένο νερό. Οι πλάκες σαρώθηκαν και οι αποικίες με τουλάχιστον 50 κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ. Το κλάσμα που επιβίωσαν (SF) μετά του φαρμάκου και θεραπείες IR ορίστηκε ως: (ικανότητα επίστρωσης x αριθμό αποικιών που σχηματίστηκαν) /(αριθμός κυττάρων επιστρώθηκαν), όπου ορίστηκε η απόδοση επιμετάλλωση για ένα δεδομένο κυτταρική γραμμή για την αντίστοιχη θεραπεία ελέγχου ως: (αριθμός αποικιών) /(αριθμός κυττάρων σπάρθηκε).

CyQUANT

ο CyQUANT Direct Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (Life Technologies, Molecular Probes) διεξήχθη σε πλάκες των 96 φρεατίων, σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή, εκτός του ότι η CyQUANT Direct Nucleic Acid Stain χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 1: 1000 και το CyQUANT Direct Ιστορικό Suppressor Ι σε 1: 200, και η περίοδος επώασης ήταν 30 λεπτά. Ο φθορισμός μετρήθηκε με έναν αναγνώστη πλάκας φθορισμού SpectraMax M5 (Ex /Em = 485 /538nm). Το σήμα υποβάθρου από τα φρεάτια με μέσο αλλά χωρίς κύτταρα αφαιρέθηκε έξω.

Hoechst χρώση και ανάλυση

Κύτταρα σε πλάκες 96-φρεατίων σταθεροποιήθηκαν για 10 λεπτά σε 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με Hoechst νουκλεϊκό οξύ λεκιάζει 33342 (Molecular Probes) αραιωμένο 1: 40,000 σε PBS για 30 λεπτά. Για κάθε φρεάτιο, οι εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο Zeiss Axio Παρατηρητής Ζ1 σε τέσσερις θέσεις που απέχουν μεταξύ τους 100 μm και στη συνέχεια αναλύονται με το λογισμικό ανάλυσης εικόνας κυττάρων CellProfiler2 (www.cellprofiler.org). Οι μέσες πυρήνες μετρούν για τις τέσσερις εικόνες του κάθε φρεάτιο χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω ανάλυση.

Κυττάρων μετρώντας

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 ή 12-φρεατίων και στο τέλος του πειράματος αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας τρυψίνη /ΕϋΤΑ και συλλέχθηκαν σε μέσο ανάπτυξης. Το κυτταρικό εναιώρημα αραιώνεται 1: 1 σε 0,2% trypan blue και η συγκέντρωση των κυττάρων και η βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας έναν μετρητή κυττάρου Nexcelom Cellometer Auto Τ4. Ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω ανάλυση.

CellTiter-Glo

Το CellTiter-Glo φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητας Δοκιμασία (Promega) διεξήχθη σε πλάκες 96-φρεατίων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή , εκτός από το ότι το 1/4 της συνιστώμενης ποσότητας του αντιδραστηρίου CellTiter-Glo χρησιμοποιήθηκαν ανά καλά. Το σήμα υποβάθρου από τα φρεάτια με μέσο αλλά χωρίς κύτταρα αφαιρέθηκε έξω.

Υπολογισμός των επιζώντων κλασμάτων

είναι

ΔΤ περιγράφεται ως το κλάσμα των κυττάρων που παραμένουν μετά τη θεραπεία. Οι μέσοι όροι των τριπλών πειραμάτων παρίστανται γραφικώς και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τις τυπικές αποκλίσεις. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε όχημα συν φενάκη IR. Για οικόπεδα των δεδομένων μετά την αγωγή IR, να λογοδοτήσουν για τις επιπτώσεις των ναρκωτικών και μόνο, τα ναρκωτικά καθώς και IR ήταν επιπλέον κανονικοποιούνται στο φάρμακο συν φενάκη IR για κάθε συγκέντρωση του φαρμάκου (που αντιπροσωπεύεται από μια διακεκομμένη γραμμή στην τιμή 1). Μια SF για τα ναρκωτικά, καθώς και IR λιγότερο από το SF για το όχημά συν IR υποδηλώνει συνέργεια. t-tests του Student χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί κατά πόσον οι μέσες ΔΤ για θεραπείες και τους ελέγχους ήταν σημαντικά διαφορετική. Οι τιμές ρ ≤ 0,05 για φάρμακο συν θεραπεία IR σε σύγκριση με το έκδοχο ελέγχου συν IR υποδεικνύονται με αστερίσκους στα σχήματα.

κηλίδωση Western

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με την χρησιμοποίηση RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως και πρότυπες μεθόδους. Για διασπάται μετρήσεις PARP, τα επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν κάθε φορά που το μέσο άλλαξε και στο τέλος του πειράματος, και μετά από λύση σε συνδυασμό με προϊόν λύσεως από τα προσκολλημένα κύτταρα. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα αραιωμένα σε Οδύσσεια Blocking Buffer όλη τη νύκτα στους 4 ° C, πλύθηκαν σε PBS που περιέχει 0.1% Tween-20, και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με δευτερογενή αντισώματα αραιωμένα 1: 10.000 σε Οδύσσεια Blocking Buffer. Μεμβράνες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας μια θερμική απεικόνιση LI-COR Οδύσσεια και την Οδύσσεια 2.1 λογισμικό που χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση. Βλέπε Πίνακα S3 για μια λίστα των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται.

προφίλ κυτταρικού κύκλου

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και μετά την αγωγή πλύθηκαν σε PBS, σε επεξεργασία με θρυψίνη, και συλλέγεται σε μέσα. Όλες οι επόμενες βαθμίδες διεξήχθησαν επί πάγου ή σε ένα σετ φυγόκεντρο στους 4 ° C. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 5 λεπτά και πλύθηκαν σε PBS, και στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε Mg2 + – και Ca2 + PBS. 95% EtOH προστέθηκε στάγδην ενώ στροβιλισμό σε χαμηλή ταχύτητα, και τα κύτταρα φυλάχθηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Τα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στις 2000 rpm, πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, επαναιωρήθηκαν σε 1 mg /ml RNaseA, και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε σωλήνες FACS. Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) αραιωμένο σε PBS προστέθηκε σε μια τελική συγκέντρωση PI του 1 μg /mL. Τα κύτταρα φυλάσσονται στο σκοτάδι μέχρι να αναλυθούν σε ένα LSR ΙΙ quad-λέιζερ κυτταρομετρητή τρέχει το λογισμικό FACSDiva (BD Immunocytometry). FlowJo έκδοση 7.6 χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων με τον Dean-Jett-Fox (DJF) μαθηματικό μοντέλο.

Αποτελέσματα

Βελτιστοποίηση της δοκιμασίας υψηλής απόδοσης (HTA)

Οι επιδράσεις της ακτινοβολίας σε καλλιεργημένες κυτταρικές γραμμές συνήθως αξιολογούνται μέσω ενός προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας (CFA). Η προσέγγιση αυτή δεν είναι επιδεκτική σε ανάλυση υψηλής διεκπεραιωτικότητας, ωστόσο, επειδή είναι χρονοβόρα, δαπανηρή και απαιτεί σημαντικές βελτιστοποίηση για κάθε κυτταρική σειρά και θεραπεία. Ως εκ τούτου, η αρχική μας στόχος ήταν να βελτιστοποιήσουν μια HTA για τη μέτρηση της αντιμετώπισης των ναρκωτικών και IR. Πρώτον, δημιουργείται ένα σύνολο δεδομένων αναφοράς με την CFA, όπου τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων, ένα εύρος δόσεων IR εφαρμόστηκαν στη μετέπειτα ημέρα, και ο αριθμός των αποικιών εκτιμήθηκε 2 εβδομάδες αργότερα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων, IR εφαρμόστηκε στη μετέπειτα ημέρα, και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε με την δοκιμασία CyQUANT μετά από 3 έως 8 ημέρες (Σχήμα S1). Το χρονικό σημείο 1 εβδομάδα για πλάκες 96-φρεατίων που παράγονται παρόμοια αποτελέσματα με το CFA.

Βρήκαμε ότι η θεραπεία ορισμένων ορθού καρκινικές κυτταρικές σειρές με IR ή /και ΜΜΒ προκάλεσε πυρήνες και τα κύτταρα για μεγέθυνση και θα ισιώσει. Σε αυτές τις περιπτώσεις, CyQUANT και άλλες δοκιμασίες κοινά πολλαπλασιασμού που βασίζονται σε περιεχόμενο DNA (π.χ. Syto-60) παρήγαγε μια ανακριβή ανάγνωση του αριθμού των κυττάρων που διαφωνούν με σαφήνεια με αυτό που παρατηρήθηκε με οπτικό έλεγχο. Αυτό το αποτέλεσμα ήταν ιδιαίτερα εντυπωσιακό για IR επεξεργασμένο RCM-1 κύτταρα (Σχήμα S2A), αλλά όχι για SW837 κυττάρων. Αποφασίσαμε να λεκιάζουν πυρήνες στις πλάκες 96 φρεατίων με τη Hoechst, την εικόνα των πλακών, και στη συνέχεια, εκτιμούν ότι ο αριθμός των κυττάρων σε κάθε φρεάτιο με τμηματοποίηση πυρήνων με το λογισμικό CellProfiler. Η δοκιμασία αυτή παράγονται ποιοτικά παρόμοια αποτελέσματα στο κελί μετρώντας μία εβδομάδα μετά-IR (χαμηλή απόδοση) και το CFA και για τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα S2B). Το πρωτόκολλο ( «ΗΤΑ») που χρησιμοποιείται για την οθόνη ραδιοευαισθητοποίηση φαίνεται στο Σχήμα S3.

Radiosensitization οθόνη

Τα φάρμακα που επιλέγονται για την οθόνη επηρεάζουν διάφορους μονοπάτια σηματοδότησης, όπως εκείνες με ένα γνωστό ρόλο σε ραδιοευαισθητοποίηση, καθώς και εκείνα σκέψη να υπερδραστηριοποιημένο στον καρκίνο, αλλά χωρίς ένα καθιερωμένο ρόλο στην απόκριση ακτινοβολία. Εμείς περιλαμβάνονται φάρμακα σε αγωγούς ογκολογία στις μεγάλες φαρμακευτικές εταιρείες με πολλά υποσχόμενο προ-κλινικά ή κλινικά δεδομένα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, πολλαπλά φάρμακα που στοχεύουν το ίδιο μονοπάτι συμπεριλήφθηκαν για σύγκριση ισχύς τους και να εξεταστεί ο ρόλος των επιδράσεων εκτός στόχου. Η τελική επιλογή των φαρμάκων που αποτελείται 28 ΜΜΘ (Πίνακας 1). Χρησιμοποιήσαμε συγκεντρώσεις του φαρμάκου που κυμαίνονται από ~ 10 ηΜ έως 1 μΜ, δεδομένου ότι αυτά είναι τυπικά κλινικά επιτεύξιμες συγκεντρώσεις. δόσεις IR κυμαίνονταν από 2 Gy και 8 Gy αφού οι ασθενείς LARC συχνά λαμβάνουν κλασματοποιημένα δόσεις των 1,8 Gy IR, αλλά μερικές φορές λαμβάνουν υψηλότερες δόσεις.

Drug

Πρωτοβάθμια target

GefitinibEGFRAZD8931pan-ErbBGDC-0941PI3KBKM120pan-PI3KBEZ235PI3K/mTORGDC-0980PI3K/mTORPerifosineAKT/mTORSorafenibRaf/VEGFR/etc.PLX4032Raf (V600E) Raf265Raf /VEGFRCI-1040MEKAZD6244MEKGSK1120212MEKPD325901MEKSP600125JNK IILY2228820p38DovitinibFGFR/PDGFRAbt888PARPAT-406IAPsAZD1480JAK1/2PD0332991CDK4/6AZD7762Chk1/2KU-55933ATMVorinostatHDACAUY922Hsp90AZD1152Aurora kinaseSunitinibmultiple targetsMidostaurinmultiple targetsTable 1. Φάρμακα αξιολογούνται ως ενιαίο πράκτορες και σε συνδυασμό με την ακτινοβολία στην οθόνη.

CSV Λήψη CSV

Τα μεταλλαγμένα καρκίνου του ορθού κυτταρικές σειρές K-RAS SW837 και ΠΚΜ-1 χρησιμοποιήθηκαν για την οθόνη, καθώς και τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα S4. Η ΜΜΒ είχε ένα ευρύ φάσμα των ισχύων, με ΜΕΚ αναστολείς γενικά είναι το ισχυρότερο από μόνοι τους (Σχήμα S5A). Χρησιμοποιήσαμε δύο μέτρα για τον χαρακτηρισμό ποσοτικά ραδιοευαισθητοποίηση. Πρώτον, υπολογίσαμε το βαθμό της ραδιοευαισθητοποίησης συγκρίνοντας τις διαφορές στο ΔΤ προκύπτει από την επεξεργασία SMI με και χωρίς IR (π.χ. Σχήμα S5B). Δεύτερον, θα χρησιμοποιηθούν για την ανεξαρτησία Bliss (BI) για να διαπιστωθεί αν τα αποτελέσματα είναι ανταγωνιστικά, πρόσθετο, ή συνεργιστική. BI υποθέτει ότι οι δραστηριότητες της SMI και IR αλληλοαποκλείονται. Το αναμενόμενο συνδυασμένη επίδραση (F

Cexp) είναι το κλασματικό προϊόν των αποτελεσμάτων των μεμονωμένων θεραπειών. Η διαφορά μεταξύ F

Cexp και η παρατηρούμενη συνδυασμένο αποτέλεσμα (F

στάχυα) καθορίζει εάν οι δύο θεραπείες είναι ανταγωνιστικές (F

Cexp & lt? F

στάχυα), πρόσθετο (F

Cexp = F

στάχυα), ή συνεργιστική (F

Cexp & gt? F

στάχυα). Δεν ανταγωνισμό (αρνητική BI αξία) ανιχνεύθηκε μεταξύ οποιουδήποτε SMI και IR. Οι BI τιμές για τις έξι ισχυρότερες ραδιοευαισθητοποιητές που απεικονίζεται στο Σχήμα 1. Μόνο το ΡΙ3Κ /mTOR αναστολέας BEZ235 και το σημείο ελέγχου κινάσες 1 και 2 (Chk1 /2) αναστολέα AZD7762 synergized με 2 Gy IR στις δύο κυτταρικές σειρές.

BI τιμές αντιστοιχούν σε (F

Cexp – F

στάχυα) x 100 και υπολογίστηκαν με βάση τα πρωτογενή δεδομένα από την οθόνη που απεικονίζεται στο Σχήμα S4. Οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου κυμάνθηκαν από 10 ηΜ έως 1.25 μΜ. Radiosensitization δεν θεωρήθηκε εάν ο επιζών κλάσμα (SF) μετά από θεραπεία φάρμακο μόνο ήταν μικρότερη από 0.125, δεδομένου ότι ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα του συνδυασμού με IR μπορεί να μην είναι ανιχνεύσιμη. Αν και CI-1040, Raf265 και GDC-0980 ήταν ελαφρώς ραδιοευαισθητοποίησης, δεν είχαν συμπεριληφθεί στις μελέτες παρακολούθησης, δεδομένου άλλους αναστολείς των ίδιων οδών (AZD6244 και BEZ235) παρουσίασαν πιο ισχυρή συνέργεια.

Η

για τους πέντε αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν και που στοχεύουν το μονοπάτι PI3K /Akt /mTOR, SW837 κύτταρα πιο ευαίσθητα σε φάρμακο μόνο, ενώ ΠΚΜ-1 κύτταρα πιο έντονα radiosensitized. Όλα αυτά τα φάρμακα τουλάχιστον ελαφρώς radiosensitized κύτταρα ΠΚΜ-1 σε 8 Gy IR, αλλά μόνο BEZ235 ήταν έντονα ραδιοευαισθητοποίησης σε 2 Gy IR. Από την άλλη πλευρά, οι τέσσερις αναστολείς στόχευση ΜΕΚ ήταν πιο ισχυρός από μόνοι τους σε RCM-1 κύτταρα και έδειξε μια τάση προς ελαφρά ραδιοευαισθητοποίηση του RCM-1 αλλά όχι SW837 κυττάρων.

BEZ235 και AZD7762 ραδιοευαισθητοποιεί

Radiosensitization επιβεβαιώθηκε για BEZ235 και AZD7762 με CFA (Σχήμα S6). Αυτές οι ΜΜΒ radiosensitized σε ένα εύρος δόσεων IR τόσο χαμηλά όσο 0,5 ή 1 Gy (Σχήμα S7). Από 1.8 Gy IR συνήθως χορηγείται για πέντε συνεχόμενες ημέρες για πολλές εβδομάδες κατά τη διάρκεια της θεραπείας για LARC, ρωτήσαμε αν η ΜΜΒ εξακολουθούν ραδιοευαισθητοποίησης με κλασματοποιημένα δόσεις IR. Αξιολογήσαμε πρώτα τα αποτελέσματα της εφαρμογής 2 Gy IR σε τέσσερις διαδοχικές ημέρες, αλλά αυτό άφησε πολύ λίγα κύτταρα που παραμένουν για ανάλυση ραδιοευαισθητοποίηση (Σχήμα S8A-Β). Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι φάρμακα που ραδιοευαισθητοποίησης με μία εφαρμογή της IR είναι επίσης ραδιοευαισθητοποίησης χρησιμοποιώντας αυτό το πρωτόκολλο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να είναι σε θέση να αξιολογήσει τις επιδράσεις των διαδοχικών ημερών από IR, εφαρμόσαμε 0,5 ή 1 Gy σε τέσσερις διαδοχικές ημέρες. Διαπιστώσαμε παρόμοια ραδιοευαισθητοποίηση από BEZ235 και AZD7762 όπως όταν IR εφαρμόστηκε μία φορά (Σχήμα S8C-D).

Οι περισσότεροι καρκίνοι του παγκρέατος λιμάνι K-RAS μεταλλάξεις [19], και αυτοί οι όγκοι συχνά αντιμετωπίζονται με ακτινοθεραπεία. Για να διερευνήσουν το πεδίο εφαρμογής των ευρημάτων μας, μελέτες παρακολούθησης έγιναν με τις μόνο δύο άλλες καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του ορθού (SW1463 και το αυτοκίνητο-1) και με καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές. Όλες αυτές οι γραμμές λιμάνι K-RAS μεταλλάξεις εκτός από τα κύτταρα Car-1. BEZ235 radiosensitized έντονα όλες ορθού καρκινικές κυτταρικές γραμμές, αλλά μόνο ασθενώς radiosensitized ένα παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική γραμμή (PANC-1) σε 2 Gy IR (Σχήμα 2Α). AZD7762 radiosensitized όλα ορθού καρκινικές κυτταρικές σειρές, αλλά μόνο τα MIAPaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα σε 2 Gy IR (Σχήμα 2Β). AZD7762 έχει αξιολογηθεί κυρίως για τον καρκίνο του παγκρέατος σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη, και τα κύτταρα MIAPaCa-2 που χρησιμοποιούνται πιο συχνά σε αυτές τις προ-κλινικές μελέτες [24,25]. Radiosensitization ανιχνεύθηκε επίσης σε κύτταρα PATU8988T σε 5 Gy IR (Σχήμα 3), μία δόση η οποία αξιολογείται σε κλινικές δοκιμές. Παρ ‘όλα αυτά, καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές παρουσίασαν μια πιο μεταβλητή απάντηση AZD7762 με την παρουσία του IR σε σύγκριση με το ορθό καρκινικές κυτταρικές σειρές, και τα δεδομένα μας δείχνουν ότι BEZ235 και AZD7762 μπορεί πιο καθολικά ραδιοευαισθητοποιεί του ορθού.

Επιπτώσεις του BEZ235 ( Α) ή 250ηΜ AZD7762 (B) 1 εβδομάδα μετά-IR. Διαφορετικές συγκεντρώσεις BEZ235 χρησιμοποιήθηκαν ανάλογα με την ευαισθησία της κάθε κυτταρικής σειράς για θεραπεία BEZ235 απουσία IR (τα παγκρεατικά γραμμές ήταν πιο ευαίσθητα σε BEZ235): 250ηΜ για SW837, RCM-1, και τα κύτταρα SW1463, 50ηΜ για το αυτοκίνητο-1 και Capan-1 κύτταρα, 25ηΜ για κύτταρα PANC-1, και 1 ηΜ για PATU8902 και PATU8988T κύτταρα. Η ΗΤΑ χρησιμοποιήθηκε για τις ορθού καρκινικές κυτταρικές σειρές και τα κύτταρα Capan-1, και την καταμέτρηση των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για τις υπόλοιπες γραμμές.

Αριστερά

, δεδομένα κανονικοποιούνται στο όχημα συν εικονική θεραπεία IR (επιπτώσεις της ΜΜΒ απουσία IR).

Δεξιά

, δεδομένα κανονικοποιούνται με τις αντίστοιχες μη-ακτινοβολημένα ελέγχους. Οι τιμές p ≤ 0,05 για IR συν θεραπεία SMI σε σύγκριση με IR συν όχημα ελέγχου σημειώνονται με αστερίσκο.

Η

Ο προσδιορισμός CellTiter-Glo έγινε 1 εβδομάδα μετά-IR.

Αριστερά

, δεδομένα κανονικοποιούνται στο όχημα συν εικονική θεραπεία IR (επιπτώσεις της ΜΜΒ απουσία IR).

Δεξιά

, δεδομένα κανονικοποιούνται με τις αντίστοιχες μη-ακτινοβολημένα ελέγχους? συμπαγείς ράβδοι αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα της IR μόνο. Οι τιμές p ≤ 0,05 για IR συν θεραπεία SMI σε σύγκριση με IR συν όχημα ελέγχου σημειώνονται με αστερίσκο.

Η

5-FU συνεργεί με AZD7762 και ενισχύει την ραδιοευαισθητοποίηση

Ένα SMI ενσωματωθούν σε ένα κλινική δοκιμή σε ασθενείς LARC θα πρέπει να χορηγείται ταυτόχρονα με IR και 5-FU χημειοθεραπεία με βάση [3]. Αντι-μεταβολίτες όπως 5-FU και γεμσιταβίνη αναστέλλουν την αντιγραφή του DNA και να οδηγήσει σε διακοπή φάσης S. θεραπεία AZD7762 ήταν συνεργική με 5-FU στην πρωκτική κυτταρικές γραμμές καρκίνου απουσία IR (Σχήμα 4Α (βλέπε δεδομένα για 250ηΜ AZD7762) και S9), αλλά καμία συνέργεια ανιχνεύθηκε για BEZ235 και 5-FU (Σχήμα S10). Επιπλέον, η 5-FU ενισχύεται ραδιοευαισθητοποίηση με AZD7762, αλλά όχι από BEZ235 (Εικόνα 4Β (βλέπε δεδομένα για 50ηΜ AZD7762) και S10). Ως εκ τούτου, επικεντρώθηκε στην AZD7762 ως η πιο ελπιδοφόρα chemoradiosensitizer.

Τα αποτελέσματα HTA για SW837 κύτταρα εμφανίζονται. Δείτε το Σχήμα S10 για στοιχεία σχετικά με RCM-1 κύτταρα και θεραπεία BEZ235. (Α) τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε όχημα συν φενάκη IR. (Β) Τα στοιχεία κανονικοποιούνται σε αντίστοιχα μη ακτινοβολημένα δείγματα αναφοράς. Οι τιμές p ≤ 0,05 για IR συν θεραπεία SMI σε σύγκριση με IR συν όχημα ελέγχου σημειώνονται με αστερίσκο.

Η

Η συνδυασμένη αγωγή του AZD7762 και IR προωθεί βλάβες στο DNA και την απόπτωση

IR-επαγόμενη οι DSBs ανιχνεύεται από την σερίνη /πρωτεΐνης θρεονίνης αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ) και ΑΤΜ και Rad 3 που σχετίζονται με κινάση (ATR), η οποία φωσφορυλιώνουν πολλά ενδοκυτταρικά υποστρώματα, συμπεριλαμβανομένων Chk1 /2, Η2ΑΧ και p53 [26]. Chk1 και Chk2 είναι κινάσες σερίνης /θρεονίνης που παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην απόκριση σε DSBs με τη διατήρηση της S- και σημεία ελέγχου G2-φάση και για τη ρύθμιση ομόλογο ανασυνδυασμό επισκευή [26,27]. ATR φωσφορυλιώνει Chk1 στο S317 και S345, το οποίο ενεργοποιεί καταλυτικά Chk1 και οδηγεί σε αυτοφωσφορυλίωση για S296 και ΑΤΜ φωσφορυλιώνει Chk2 για T68, οδηγώντας σε Chk2 ομοδιμερισμό και αυτοφωσφορυλίωση για T383, T387 και S516 [28,29]. αναστολείς Chk1 κινάσης αυξήσει φωσφορυλίωση της Chk1 S345 οφείλεται στην ενεργοποίηση ATR και μειωμένη αποφωσφορυλίωση από ΡΡ2Α [30,31]. Ομοίως, αναστολείς κινάσης Chk2 αυξήσει φωσφορυλίωση Chk2 T68, η οποία είναι ATM-εξαρτώμενη και ρυθμίζεται από πολλαπλά φωσφατάσες πρωτεϊνών [32].

Τα αποτελέσματά μας στα ορθού καρκινικές κυτταρικές σειρές είναι συνεπείς με αυτές τις καθιερωμένες επιπτώσεις της Chk1 /2 αναστολείς και AZD7762. Chk1 και Chk2 δραστηριότητα (Chk1 pS296 και pS516 Chk2) ανεστάλησαν από AZD7762 σε παρουσία και απουσία IR (Σχήματα S11A και S12A), υποδεικνύοντας ότι το φάρμακο μπλοκάρει αποτελεσματικά τους στόχους της. Η φωσφορυλίωση των Chk1 και Chk2 σε ιστοσελίδες /ATR-μεσολάβηση ATM (Chk1 pS345 και Chk2 pT68) αυξήθηκε μετά από θεραπεία AZD7762 (Εικόνες S11B και S12B). Η φωσφορυλίωση των Chk1 επί S345 είναι γνωστή για την προώθηση της Chk1 πρωτεολυτική αποικοδόμηση [33], και βρήκαμε ότι AZD7762 μειωμένα επίπεδα Chk1 (Σχήμα S11C).

Τα καρκινικά κύτταρα συχνά χάνουν G1 σημείο ελέγχου τους, για παράδειγμα μέσω μετάλλαξης του όγκου ρ53, και εξαρτώνται περισσότερο από το σημείο ελέγχου G2 και 2 δραστηριότητα Chk1 /[22]. Chk1 /2 εξάντληση ή την αναστολή, ιδιαίτερα σε ρ53-ελλειπή κύτταρα, καταργεί το G2 σημείο ελέγχου προκαλούνται από γονοτοξικούς παράγοντες και εμποδίζει την επιδιόρθωση του DNA, οδηγώντας τελικά σε μιτωτικά καταστροφή και την απόπτωση ή γήρανση [20,28]. Η έλλειψη της επιδιόρθωσης του DNA συνήθως ανιχνεύεται από την παρατεταμένη φωσφορυλίωση της παραλλαγής ιστόνης Η2ΑΧ σε S139, το οποίο ταχέως φωσφορυλιώνεται από ΑΤΜ, ATR ή DNA-ΡΚ σε απόκριση σε DSBs [34]. Πράγματι, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία AZD7762 κατήργησε την IR επαγόμενη G2 διακοπή (Σχήμα S13) και οδήγησε σε αυξημένη φωσφορυλίωση του Η2ΑΧ (γH2AX) και απόπτωση στα ορθού καρκινικές κυτταρικές γραμμές (Σχήματα 5 και S14).

Western τα λέκιασμα αποτελέσματα για τα κύτταρα ΠΚΜ-1 που παρουσιάζεται. Δείτε το Σχήμα S14 για την ποσοτικοποίηση και δεδομένα σχετικά με SW837 και SW1463 κύτταρα. Ο αριθμός των ημερών ενδείκνυται μετα-IR. (Α) DNA DSBs όπως υποδεικνύεται από τα επίπεδα γH2AX. (Β) Η απόπτωση, όπως υποδεικνύεται από διασπασμένα επίπεδα PARP.

Η

AZD7762 είναι ένας πιο ισχυρός ραδιοευαισθητοποιητής από άλλους /2 αναστολείς ATM-Chk1

Βρήκαμε ότι άλλα φάρμακα που στοχεύουν ATM-Chk1 /2 δεν είναι τόσο καλή όσο AZD7762 σε ραδιοευαισθητοποίησης του ορθού καρκινικές κυτταρικές σειρές. AZD7762 radiosensitized σε περίπου 40-φορές χαμηλότερη συγκέντρωση από την ΑΤΜ αναστολέα KU-55933 (Σχήμα 6). Διάφοροι αναστολείς Chk1 και Chk2 είναι σε προ-κλινική ανάπτυξη και πρώιμες κλινικές δοκιμές [26]. Συγκρίναμε AZD7762 σε δύο άλλα που είναι διαθέσιμα στο εμπόριο (SCH900776 και LY2603618) [35]. AZD7762 είναι εξίσου ισχυρή ενάντια Chk1 και Chk2 in vitro (IC

50 = 5ηΜ και & lt? 10ηΜ, αντίστοιχα), ενώ SCH900776 είναι επιλεκτική για Chk1 (IC

50 = 3ηΜ) πάνω Chk2 (IC

50 = 1.5 μΜ), και LY2603618 φέρεται να είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας Chk1 αλλά δεν υπάρχουν δημοσιευμένα δεδομένα [20]. AZD7762 radiosensitized και ανέστειλε Chk1 δραστικότητα σε μια 10-φορές χαμηλότερη συγκέντρωση από SCH900776 και LY2603618 (Σχήμα 7), μολονότι τουλάχιστον AZD7762 και SCH900776 έχουν παρόμοια in vitro συνάφειες σύνδεσης για Chk1.

Ο προσδιορισμός CellTiter-Glo διεξήχθη με κύτταρα SW837 μία εβδομάδα μετά-IR. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε αντίστοιχα μη ακτινοβολημένα δείγματα αναφοράς. Οι τιμές p ≤ 0,05 για IR συν θεραπεία SMI σε σύγκριση με IR συν όχημα ελέγχου σημειώνονται με αστερίσκο.

Η

(Α) Ο προσδιορισμός CyQUANT έγινε με SW837 κύτταρα μία εβδομάδα μετά-IR. SCH900776 και LY2603618 είναι Chk1 αναστολείς. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε αντίστοιχα μη ακτινοβολημένα δείγματα αναφοράς. Οι τιμές p ≤ 0,05 για IR συν θεραπεία SMI σε σύγκριση με IR συν όχημα ελέγχου σημειώνονται με αστερίσκο. (Β) κύτταρα SW837 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή SMI δύο ώρες πριν από IR, και προϊόντα λύσης πρωτεΐνης συλλέχθηκαν τρεις ώρες μετά τη IR. sites Chk1 και Chk2 αυτοφωσφορυλίωση μετρήθηκαν με κηλίδωση Western.

Η

Συζήτηση

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει νέες θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς LARC με μεταλλάξεις του K-RAS με τη βελτιστοποίηση ενός υψηλού -throughput δοκιμασία διαλογής και ένα πάνελ των ΜΜΒ στόχευση διαφορετικών οδών σηματοδότησης για ραδιοευαισθητοποίηση. βασική υπόθεση μας για αυτό το έργο ήταν ότι ένα SMI με ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα επί των καρκινικών κυττάρων όταν συνδυάζεται με θεραπεία με ακτινοβολία είναι περισσότερο επιθυμητό από ένα που έχει μια εξαιρετικά κυτταροτοξική δράση από μόνη της. Έχουμε εντοπίσει έξι ΜΜΒ που ραδιοευαισθητοποιεί K-RAS μεταλλαγμένα ορθού καρκινικά κύτταρα: BEZ235 (PI3K αναστολέα /mTOR), AZD7762 (Chk1 /2 αναστολέα), AZD8931 (παν-ErbB αναστολέας του υποδοχέα), AT-406 (αναστολέας της πρωτεΐνης απόπτωσης (ΙΑΡ) οικογένειας αναστολέα), AZD6244 (αναστολέας ΜΕΚ), και Abt888 (αναστολέας PARP). Αν και έχουν άλλους αναστολείς των υποδοχέων ErbB και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών έχει αποδειχθεί ότι ραδιοευαισθητοποίησης [23], AZD8931 και ΑΤ-406 δεν έχουν προηγουμένως αναφερθεί ότι είναι ραδιοευαισθητοποιητές. BEZ235 και AZD7762 ήταν οι πιο ισχυροί ραδιοευαισθητοποιητές και εστιάσαμε σε αυτά τα δύο φάρμακα.

BEZ235 έχει δειχθεί ότι ραδιοευαισθητοποιεί όγκους διαφόρων ιστών, συμπεριλαμβανομένων των γλοιοβλαστωμάτων, ινοσαρκώματα, και κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν NCSLC K-RAS μεταλλάξεις [36- 38]. BEZ235 ομαλοποιεί επίσης αγγείωση των όγκων σε πειράματα ξενομοσχεύματος, οδηγώντας σε βελτιωμένη αιμάτωση του όγκου, την οξυγόνωση, και απαντήσεις σε ακτινοθεραπεία [36]. Οι διαφορετικοί μηχανισμοί έχουν προταθεί για να εξηγήσουν την ραδιοευαισθητοποίησης φαινόμενο που παρατηρείται με BEZ235, ακόμα και μέσα στην ίδια κυτταρική σειρά (Η460 κύτταρα): κατάργηση της IR που προκαλείται G

2 σύλληψη και απόπτωση [37], και την αύξηση της G

2 σύλληψη και γήρανση [39]. Κοινό στοιχείο σε όλα τα έγγραφα που περιγράφουν μια ραδιοευαισθητοποίησης επίδραση του BEZ235 καθυστερεί την επισκευή των βλαβών του DNA. Εδώ, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι BEZ235 δρα ως ισχυρός ραδιοευαισθητοποιητής του ορθού και του παγκρέατος καρκινικών κυτταρικών σειρών. Κύτταρα με PIK3CA ενεργοποιούμενες μεταλλάξεις ή απώλεια του γονιδίου καταστολής όγκου ΡΤΕΝ είναι περισσότερο ευαίσθητες στις BEZ235 από κύτταρα που δεν έχουν αυτές τις μεταλλάξεις [40], και την υψηλή ευαισθησία του PATU8902 και κυττάρων PATU8988T να BEZ235 μπορεί να εξηγηθεί από την ανεπάρκεια ΡΤΕΝ τους (Πίνακας S1). Αναστολή της ΡΙ3Κ και mTOR με BEZ235 φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση, ιδιαίτερα σε συνδυασμό με IR για τον καρκίνο του ορθού. Δεν υπήρξαν κλινικές δοκιμές με BEZ235 για CRC ή σε συνδυασμό με IR (www.clinicaltrials.gov).

AZD7762 έχει δειχθεί ότι ραδιοευαισθητοποιεί διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές in vitro και σε μοντέλα ξενομοσχεύματος με την κατάργηση της G2 σημείο ελέγχου και αναστέλλοντας την επιδιόρθωση του DNA. AZD7762 έχει πρωτίστως έχουν αξιολογηθεί για τον καρκίνο του παγκρέατος, αλλά έχει επίσης δειχθεί να ραδιοευαισθητοποιεί προστάτη, του πνεύμονα, του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του κυττάρων [24,25,41-43]. Φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών και το λεπτό έντερο επιθηλιακά κύτταρα δεν radiosensitized από AZD7762 [25,42].

Δεν προηγούμενες μελέτες έχουν συγκρίνει ραδιοευαισθητοποίηση με AZD7762 και άλλους αναστολείς, και βρήκαμε ότι είναι μια καλύτερη ραδιοευαισθητοποιητής του ορθού καρκινικών κυττάρων από αναστολείς άλλων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην απόκριση σε γονοτοξικούς παράγοντες, καθώς και άλλους αναστολείς της /2 μονοπάτι ΑΤΜ-Chk1. AZD7762 έχει σημαντικά διαφορετικά αποτελέσματα σε σύγκριση με το σημείο ελέγχου αναστολείς κινάσης SCH900776 και LY2603618 από το ότι είναι η μόνη που μειώνει τη βιωσιμότητά μόνη της στο 1 μΜ (μέσω DSBs και απόπτωση? Δεδομένα δεν φαίνονται) και είναι το ισχυρότερο ραδιοευαισθητοποιητής. Η απλούστερη εξήγηση για τις διαφορές αυτές είναι ότι AZD7762 αναστέλλει Chk2 ενώ τα άλλα δύο φάρμακα δεν έχουν, και ότι Chk2 παίζει σημαντικό ρόλο στην ραδιοευαισθητοποίησης ορθού καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, πολλές μελέτες (που βασίζονται κυρίως σε siRNA knockdown) έχουν προτείνει ότι χημείο- και ραδιοευαισθητοποίηση προκαλούνται από Chk1 και σε πολύ μικρότερο βαθμό Chk2, και ότι τα αποτελέσματα της AZD7762 οφείλονται στην αναστολή της Chk1 [20,24,44- 46]. Δεν είναι σαφές αν οι αναστολείς Chk2 ειδικά κατέχουν σημαντική χημειοθεραπεία και ραδιοευαισθητοποίησης δραστηριότητα [47-49]. Επιπλέον, δείχνουμε ότι AZD7762 είναι ένα ισχυρότερο αναστολέα της Chk1 από SCH900776 και LY2603618. Έτσι, η ισχυρότερη ραδιοευαισθητοποίηση με AZD7762 είναι πιθανό να οφείλεται στην αυξημένη επιπτώσεις του στην Chk1, και, σε μικρότερο βαθμό, η αναστολή της Chk2.

Βρήκαμε ότι AZD7762 synergized με 5-FU και ότι η 5-FU ενισχυμένη ραδιοευαισθητοποίηση από AZD7762.