Αφηρημένο

Οι κυτταρικές σειρές LNCaP και C4-2B αποτελούν ένα εξαιρετικό προκλινικό μοντέλο για τη μελέτη της ανάπτυξης των μεταστατικών ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη, δεδομένου ότι τα κύτταρα C4-2B προήλθαν από μετάσταση στα οστά που μεγάλωσε στο γυμνό ποντίκια μετά από εμβολιασμό με το LNCaP που προέρχεται, ευνουχισμός-ανθεκτικά κύτταρα C4-2. αλληλούχιση exome ανιχνεύεται 2188 και 3840 μεταλλάξεων σε LNCaP και C4-2B κύτταρα, αντίστοιχα, από τα οποία 1.784 βρέθηκαν στις δύο κυτταρικές σειρές. Παραδόξως, τα γονικά κύτταρα LNCaP έχουν πάνω από 400 μεταλλάξεις που δεν βρέθηκαν στο γονιδίωμα C4-2B. Περισσότεροι από τους μισούς από τις μεταλλάξεις που βρέθηκαν στα exomes επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση των δεδομένων RNA-seq, και παρατηρήσαμε ότι τα εκφραζόμενα γονίδια είναι πιο επιρρεπή σε μεταλλάξεις από τους μη-εκφρασμένα γονίδια. Οι transcriptomes αποκάλυψαν επίσης ότι 457 γονίδια εμφανίζουν αυξημένη έκφραση και 246 γονιδίων δείχνουν μειωμένη έκφραση σε C4-2B σύγκριση με κύτταρα LNCaP. Με το συνδυασμό του καταλόγου των C4-2B-ειδικών μεταλλάξεων με τη λίστα των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, ανιχνεύσαμε σημαντικές αλλαγές στις εστιακές οδούς αλληλεπίδρασης προσκόλλησης και ECM-υποδοχέα. Ενσωμάτωση αυτών των οδών συγκλίνει στο γονίδιο της κινάσης της ελαφριάς αλυσίδας μυοσίνης (MLCK) που θα μπορούσαν να συμβάλουν στην μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων C4-2B. Εν κατακλείδι, παρέχουμε εκτεταμένες βάσεις δεδομένων για μεταλλαγμένα γονίδια και διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη LNCaP και C4-2B. Αυτά μπορεί να είναι χρήσιμα για άλλους ερευνητές που χρησιμοποιούν αυτά τα μοντέλα κυττάρων

Παράθεση:. Εκτείνεται L, Helsen C, Clinckemalie L, Van den Broeck Τ, Prekovic S, Joniau S, et al. (2014) Συγκριτική Γονιδιωματική και Transcriptomic αναλύσεις των LNCaP και C4-2B καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών. PLoS ONE 9 (2): e90002. doi: 10.1371 /journal.pone.0090002

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Δεκέμβρη 2013? Αποδεκτές: 24η Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 28 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Εκτείνεται et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο ήταν δυνατό χάρη σε ερευνητικές επιχορηγήσεις από το FWO-Vlaanderen (G.0684.12N), από τη βελγική ομοσπονδιακή κυβέρνηση (Εθνικό σχέδιο Καρκίνου KPC_29_023) και από την KU Leuven (OT /11/081). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος και τρίτη κύρια αιτία θανάτου μεταξύ των ανδρών στην Ευρώπη [1]. Παρά την επικράτηση της, η πλειοψηφία των ανδρών έχει διαγνωστεί με προστάτη εντοπισμένη, χαμηλού κινδύνου και ποτέ δεν θα πεθάνουν εξαιτίας του καρκίνου τους, όταν αφεθούν χωρίς θεραπεία [2]. Ωστόσο, οι ασθενείς με υψηλού κινδύνου και ιδιαίτερα μεταστατικής νόσου έχουν πολύ υψηλότερο κίνδυνο θανάτου από προστάτη με αναφερθεί PCA-συγκεκριμένα ποσοστά θνησιμότητας έως και 28,8% για τη νόσο υψηλού κινδύνου και 66,1% για μεταστατική νόσο στα 10 έτη παρακολούθησης [ ,,,0],3]. Πρόσφατα επιδημιολογικά δεδομένα έχουν δείξει ότι σχεδόν το 10% όλων των ασθενών προστάτη είναι μεταστατικά κατά τη στιγμή της διάγνωσης, υπογραμμίζοντας την κλινική σημασία της ανάπτυξης μιας καλύτερης εικόνα στα υποκείμενων μηχανισμών του μεταστατικού προστάτη [4]. Οι γονιδιωματικές και transcriptomic αλλαγές που συνοδεύουν το μετασχηματισμό της εντοπισμένη ασθένεια σε μεταστατική ευνουχισμό ανθεκτικά PCa ανακαλύπτονται, αλλά παρεμποδίζονται από τις δυσκολίες για τη λήψη βιοψιών από τα διάφορα στάδια της νόσου [5], [6].

ως εναλλακτική λύση, οι κυτταρικές σειρές μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοντέλα για τη μελέτη της μετάβασης σε μεταστατικό ευνουχισμό ανθεκτικά PCa [7]. Ένα από τα καλύτερα μελετημένα κυτταρικές σειρές προστάτη αναμφίβολα είναι η κυτταρική σειρά LNCaP. Αυτή η κυτταρική γραμμή προήλθε από βιοψία βελόνα που λαμβάνονται από την αριστερή υπερκλείδιους λεμφαδένα ενός 50 ετών καυκάσιος αρσενικό [8]. Αυτός ο ασθενής υπέφερε από ένα ταχέως προχωρούν PCa με ελάχιστη και σύντομη απάντηση σε ορμονική θεραπεία και χωρίς απόκριση στη χημειοθεραπεία. Στη συνέχεια, η υπογραμμή C4-2 προήλθε από έναν όγκο που αναπτύχθηκε σε ευνουχισμένους γυμνά ποντίκια ενέθηκαν με κύτταρα LNCaP. Τέλος, η κυτταρική γραμμή C4-2B προήλθε από μετάσταση οστού μετά ορθοτοπική μεταμόσχευση κυττάρων C4-2 σε γυμνά ποντίκια [9], [10]. Με άλλα λόγια, C4-2B είναι ένα μεταστατικό παράγωγο των κυττάρων LNCaP. Συνεπώς, η εξέλιξη μοντέλο LNCaP και C4-2B μιμείται εξέλιξη της νόσου από κακώς ογκογόνων, ανδρογόνο-ευαίσθητα και μη μεταστατικό σε LNCaP, σε μεταστατική και ανδρογόνα αναίσθητη (ή ευνουχισμός ανθεκτικά) σε C4-2B.

Για αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές, οι μεταβολές στους αριθμούς καρυότυπο και γονιδιώματος αντίγραφο, μερικές μεταλλάξεις σημείου, εισαγωγές και διαγραφές έχουν περιγραφεί, αλλά η σύγκριση των αλληλουχιών exome δεν έχουν αναφερθεί ακόμη [9], [11]. Ο πρώτος στόχος αυτής της μελέτης ήταν, επομένως, να λάβουν πλήρη δεδομένα exome για τα κύτταρα LNCaP και C4-2B. Φυσικά, η σύγκριση αυτών των μεταλλάξεων τοπία νόημα μόνο με την παρουσία των πληροφοριών σχετικά με τη δραστηριότητα των επηρεαζόμενων γονιδίων. Ο τελευταίος ελήφθη από μεταγραφικό αναλύσεις.

Ένα πρώτο βήμα στον κατάλογο σημειακές μεταλλάξεις, εισαγωγές και διαγραφές στα κύτταρα LNCaP αναφέρθηκε σε Spans

et al.

[12]. Εδώ, θα υποβάλει έκθεση σχετικά με μια συγκριτική μελέτη αλληλουχίας ολόκληρη exome και μεταγραφικό τόσο LNCaP και κυτταρικές σειρές C4-2B. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη άμεση και διεξοδική σύγκριση αυτού του είδους. Επιπλέον, αυτές οι βάσεις δεδομένων μπορεί να είναι πολύ κατατοπιστική για προκλινικές μελέτες για την οποία χρησιμοποιούνται τόσο LNCaP και C4-2B κύτταρα. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία υποθέσεων σχετικά με την μεταστατική διαδικασία, όπως επεξηγείται για την οδό MLCK.

Υλικά και Μέθοδοι

DNA απομόνωση

Η LNCaP κυτταρική σειρά ελήφθη από η American Type Culture Collection, ενώ τα κύτταρα C4-2B ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Μ Stallcup (Νόρις Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου της Νότιας Καλιφόρνιας, ΗΠΑ) [9]. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε μέσο Roswell Park Memorial Institute (RPMI, Gibco, Invitrogen), που περιέχει γλυκόζη 2 g /L συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FCS). Ο αριθμός πέρασμα των κυττάρων LNCaP και C4-2B ήταν 48 και 42 αντίστοιχα. βάρος DNA υψηλού μοριακού εκχυλίστηκε από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ GenElute θηλαστικών Γονιδιωματικό DNA Miniprep (Sigma-Aldrich). Μετά τον καθαρισμό χρησιμοποιώντας καθίζηση αιθανόλης με οξικό αμμώνιο, η συγκέντρωση ποσοτικά με τη χρήση Nanodrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific) και BioAnalyzer (Agilent).

Σύνολο exome αλληλουχίας

σύλληψης Ολόκληρο-exome των κυττάρων LNCaP διεξήχθη χρησιμοποιώντας το SureSelect Ανθρώπινα Όλα εξόνιο System (Agilent) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αξιόπιστες-end, 100 bp μακρύ αλληλουχίας διαβάζει παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το sequencer GAIIx (Illumina). Η σύλληψη exome των κυττάρων C4-2B διεξήχθη χρησιμοποιώντας την έκδοση 2 σετ SeqCap EZ exome (Roche Nimblegen) και σε συνδυασμό τέλος 100 bp μακρύ διαβάζει παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το HiSeq2000 (Illumina).

Ο ποιοτικός έλεγχος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό FastQC (έκδοση 0.10.1) (https://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) και Picard (έκδοση 1.22) (https://picard.sourceforge.net/). Αλληλουχίας διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με το ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς (hg19, NCBI Build 37) χρησιμοποιώντας BWA, όπου διαβάζει κόπηκαν όταν η ποιότητα ήταν κάτω από 15 (έκδοση 0.5.9) [13]. αρχεία ευθυγράμμιση υποβλήθηκαν σε επεξεργασία περαιτέρω με Γονιδιώματος Analysis Toolkit (GATK) πριν παραλλαγή καλούντος και περιλαμβάνονται εις διπλούν αφαίρεσης, τοπική επανευθυγράμμιση γύρω γνωστή indels και την ποιότητα βάσης αναβαθμονόμηση (έκδοση 1.0.5777) [14]. Τα δείγματα φορτώθηκαν χωριστά στο λογισμικό GATK UnifiedGenotyper. Σημειακές μεταλλάξεις και τα δεδομένα έκφρασης χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Circos (έκδοση 0.52) [15]. Σύγκριση των σημειακών μεταλλάξεων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Venny (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html).

RNA απομόνωση

κυττάρων

LNCaP και C4-2B , με αριθμούς πέρασμα των 30 και 43 αντίστοιχα, καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων (1,75 εκατομμύρια κύτταρα /φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία επί μία νύκτα (18 ώρες) με 1 ηΜ R1881 (Perkin Elmer). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS. Το κυτταρικό σφαιρίδιο χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση ολικού RNA χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit από Qiagen. Η ποιότητα και η καθαρότητα του RNA εξετάστηκε σε ένα Nanodrop ND-1000 Φασματοφωτόμετρο. Η ακεραιότητα του RNA επαληθεύτηκε με BioAnalyzer στο Γονιδιωματική πυρήνα της UZ Leuven.

RNA αλληλουχίας

Μετά την επιλογή του πολυΑ + RNA, το RNA μετατράπηκε σε cDNA βιβλιοθήκες χρησιμοποιώντας το Δείγμα TruSeq RNA προετοιμασία kit (Illumina). Μετά την αλληλούχιση σε συνδυασμό τέλος σύντομο διαβάζει 100 bp με την HiSeq2000 (Illumina), κανονικοποιημένες μετρήσεις γονίδιο (θραύσματα Ανά κιλοβάσεων ανά εκατομμύριο χαρτογραφηθεί διαβάζει, FPKM) υπολογίστηκαν μέσω του αγωγού Tuxedo (ΤΟΡΗΑΤ C – Μανικετόκουμπα – ζωνάρι) [16]. Με λίγα λόγια, τα δεδομένα RNA-επόμενα ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα αναφοράς χρησιμοποιώντας ΤΟΡΗΑΤ C (έκδοση 2.0.6) που χρησιμοποιεί Bowtie ως αλγοριθμική πυρήνα. Το πακέτο Μανικετόκουμπα (έκδοση 2.0.2) συναρμολογούνται τις μεταγραφές και ανιχνεύονται διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων και μεταγραφές. Ζωνάρι (έκδοση 2.0.0) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης. Παραλλαγή καλώντας χρησιμοποιώντας τα δεδομένα RNA-επόμενα διεξήχθη με GATK (έκδοση 2.2), μετά την ευθυγράμμιση με ΤΟΡΗΑΤ C [14]. RNA-seq και για τις δύο κυτταρικές σειρές διεξήχθη εις τριπλούν, επιτρέποντας την ταυτοποίηση διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Για παραλλαγή κλήση, τα τριπλότυπα αθροίστηκαν για να αποκτήσουν υψηλότερη κάλυψη. Pathway-Express χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό, από μια λίστα των γονιδίων, είτε σε ένα συγκεκριμένο μονοπάτι είναι περισσότερα γονίδια εμπλέκονται από ό, τι θα αναμενόταν από την τύχη [17].

Ποσοτική RT-PCR

cDNA δημιουργήθηκε από RNA (1 μ§) με τυχαίους εξαμερείς εκκινητές και RevertAid ανάστροφης μεταγραφάσης (Thermo Scientific). Ποσοτική Real Time PCR χρησιμοποιώντας Platinum SYBR Green Supermix QPCR-UDG (Invitrogen). Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν στο γονίδιο οικοκυρική β-ακτίνης και κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Η αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιούνται είναι: β-ακτίνη προς τα εμπρός 5′-ACCCAAGGCCAACCG-3 ‘και αντίστροφος 5′-TGTACGTTGCTATCCAGGCTGT-3′, TMPRSS2 εμπρός 5’-CCTGCATCAACCCCTCTAACTG-3 ‘και αντίστροφος 5′-AGGCGAACACACCGATTCTC-3′, IGF1 εμπρός 5’-TGGATGCTCTTCAGTTCGTG-3 ‘και αντίστροφη 5′-TCATCCACGATGCCTGTCT-3′, IGF1R μπροστά 5’-GTACAACTACCGCTGCTGGA-3 ‘και αντίστροφη 5′-TGGCAGCACTCATTGTTCTC-3’.

αριθμούς

προσχώρησης

δυαδική ακολουθία ευθυγράμμιση /χάρτη (BAM) αρχεία από τα δεδομένα σύνολό της αλληλουχίας exome, καθώς και τα στοιχεία του RNA-επόμενα κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων της Ευρωπαϊκής Αρχείο νουκλεοτιδίου με αριθμό ένταξης PRJEB4877 και είναι προσβάσιμες μέσω https://www.ebi.ac.uk /ΕΝΑ /data /view /PRJEB4877. Οι αριθμοί προσχώρησης του δείγματος είναι ERS363578 και ERS363580 για τα δεδομένα ολόκληρη αλληλουχίας exome των LNCaP και C4-2B αντίστοιχα. Για την RNA-αλληλουχίας, οι αριθμοί ένταξη του δείγματος είναι ERS363579 και ERS363581 για LNCaP και C4-2B κύτταρα αντίστοιχα.

Η επιβεβαίωση της μη συνώνυμες παραλλαγές

Παραλλαγές του ενδιαφέροντος επιβεβαιώθηκαν από Sanger αλληλουχίας του ενισχυμένα προϊόντα PCR. Εκκινητές ειδικά για την περιοχή που περιέχει την παραλλαγή που πρόκειται να δοκιμαστεί σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το NCBI Blast Primer-(https://ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) και λαμβάνεται από Integrated DNA Technologies. αντιδράσεις αλυσίδας πολυμεράσης εκτελέστηκαν ακολουθώντας πρότυπα πρωτόκολλα χρησιμοποιώντας Taq DNA πολυμεράση (Thermo Scientific). Ενίσχυση ειδικών θραυσμάτων PCR επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. αλληλούχιση Sanger διεξήχθη σε LGC Genomics. αρχεία ίχνος ακολουθίας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας χρωματισμών Lite.

Αποτελέσματα

Η ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων με όλη exome αλληλουχίας

Πραγματοποιήσαμε μια μελέτη εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας ολόκληρου του exome τόσο για LNCaP και C4 2Β κύτταρα χρησιμοποιώντας 100 ζευγών βάσεων, σε συνδυασμό τέλος διαβάζει στην πλατφόρμα Illumina. Αυτό που παράγεται 49 και 80 εκατομμύρια διαβάζει για LNCaP και C4-2B αντίστοιχα (Πίνακας S1)? για τα κύτταρα LNCaP, το 74% του exome καλύφθηκε τουλάχιστον 20χ, έναντι 88% για τα κύτταρα C4-2B. χαρακτηριστικά αλληλουχίας και τα στοιχεία του ελέγχου ποιότητας είναι παρόμοια και για τα δύο σύνολα δεδομένων (Πίνακας S1 και το σχήμα S1)

Οι σημειακές μεταλλάξεις στα exomes ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τον αγωγό GATK στην οποία εφαρμόστηκε επιπλέον φιλτράρισμα:. μόνο μεταλλάξεις οι οποίες είχαν τουλάχιστον 12 × κάλυψη και συχνότητα μετάλλαξης άνω του 30% ελήφθησαν υπόψη. Τα δεδομένα επίσης φιλτράρεται για την απουσία της αλλαγής ζεύγους βάσεων σε dbSNP130. Επιπλέον, η προκατάληψη σκέλος αποβλήθηκε με το χέρι (Πίνακας S2). Αυτό οδήγησε σε καταλόγους των 2188 και 3840 μεταλλάξεων μη συνώνυμες σημείο LNCaP και C4-2B κύτταρα, αντίστοιχα (Πίνακας S3-4). Μόνο 1784 μεταλλάξεις ήταν κοινά μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών, υποδεικνύοντας σαφώς την συσσώρευση περισσότερων από 2.000 επιπρόσθετες μεταλλάξεις στο γονιδίωμα C4-2B. Αυτή η μεγάλη διαφορά στο φορτίο μετάλλαξη δεν μπορεί να εξηγηθεί από την ελαφρώς χαμηλότερη κάλυψη του exome LNCaP. Το πιο πιθανό, αυτές οι πρόσθετες μεταλλάξεις C4-2B έχουν προκύψει κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου και μετάσταση στα οστά.

Ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων στο μεταγραφικό αλληλουχίας

αλληλουχίας μεταγραφικό έγινε αρχικά για να καθοριστεί η διαφορική γονιδιακή έκφραση. RNA απομονώθηκε από LNCaP και C4-2B κύτταρα που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία για 18 ώρες με το συνθετικό ανδρογόνο μεθυλοτριενολόνη. Έχουμε λάβει 157 και 131 εκατ 100 ζευγών βάσεων, σε συνδυασμό τέλος διαβάζει για τα κύτταρα LNCaP και C4-2B. Σε αυτές διαβάζει, το ποσοστό των ριβοσώματος, εσωνίων και διαγονιδιακές βάσεις ήταν πολύ χαμηλή (1,6% συνολικά), με αποτέλεσμα ένα υψηλό ποσοστό κάλυψης των βάσεων mRNA (Πίνακας S1). Ως μέτρο για την ποιότητα των δεδομένων μεταγραφικό, η διακύμανση στην κάλυψη κατά μήκος κάθε μεταγραφής φαίνεται στο Σχήμα S2. Αυτό δείχνει No 5 ‘ή 3’ μεροληψία αν και υπάρχει μια κάπως χαμηλότερη κάλυψη κοντά στα άκρα των μεταγράφων.

Η ροή εργασιών για την ανίχνευση και μετέπειτα φιλτράρισμα των σημειακών μεταλλάξεων ήταν παρόμοια με εκείνη που χρησιμοποιείται για την ανάλυση αλληλουχίας exome περιγράφεται υψηλότερη. Βρήκαμε 1505 και 1882 μεταλλάξεων σε κύτταρα LNCaP και C4-2B αντίστοιχα, εκ των οποίων 1,054 ανιχνεύθηκαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Πίνακας S5)? 451 ήταν ειδικά για LNCaP και 828 για C4-2B.

Συγκρίνοντας exome με αλληλούχιση μεταγραφικό

δεδομένων

Μια σύγκριση των αλληλόμορφο-ειδικές μετρήσεις ανάγνωσης από γονιδιώματος και αλληλούχιση μεταγραφικό δεδομένων όλων ανιχνεύονται σημειακές μεταλλάξεις μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα μέτρο της ποιότητας προσδιορισμού αλληλουχίας. Η πλειονότητα των μεταλλάξεων έχουν μια παρόμοια συχνότητα αλληλίου σε DNA και RNA αλληλουχίας (Σχήμα 1Α-Β). Ακόμα και οι λίγες ομόζυγο μεταλλάξεις με συχνότητα αλληλόμορφο κοντά στο 1 στα δεδομένα exome, έχουν παρόμοια συχνότητα αλληλόμορφου στα δεδομένα αλληλουχίας RNA.

Α-Β. Σύγκριση της συχνότητας αλληλική παραλλαγή των μεταλλάξεων ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας ολόκληρο exome και αλληλούχιση μεταγραφικό. Μαύρες κουκίδες είναι οι μεταλλάξεις που έχουν βρεθεί τόσο αλληλουχίας exome και αλληλουχίας μεταγραφικό? κόκκινες κουκίδες ανιχνεύθηκαν μόνο με αλληλούχιση exome και πράσινες κουκκίδες μόνο με ανάλυση της αλληλουχίας RNA. Για παραλλαγή κλήση, εφαρμόστηκε ένα cut-off του 30% της συχνότητας αλληλική παραλλαγή. Δίπλα από το γράφημα ένα σχήμα δείχνει τον αριθμό των μεταλλάξεων από αλληλουχίας exome, αλληλουχίας μεταγραφικό και τον αριθμό που βρίσκεται και από τις δύο μεθόδους. Τα γραφήματα παρουσιάζονται για LNCaP (Α) και C4-2B κύτταρα (Β) αντίστοιχα. Γ Επικάλυψη όλων των μεταλλάξεων που παρατηρήθηκαν από exome και αλληλούχιση μεταγραφικό στα κύτταρα LNCaP και C4-2B.

Η

Ο συνδυασμός τόσο της exome και μεταγραφικό αλληλουχίας οδήγησε σε συνολικά 2244 μεταλλάξεις κοινά και στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1 C). Επιπλέον, ο αριθμός των LNCaP-ειδικών μεταλλάξεων (546) είναι πολύ χαμηλότερη από εκείνη των C4-2B ειδικές αλλαγές (2129), και πάλι δείχνοντας ότι οι μεταλλάξεις να έχουν συσσωρευτεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε C4-2B. RNA-αλληλουχίας επιβεβαίωσαν μόνο το 41 και το 35% των εξονικό παραλλαγές που προσδιορίζονται από όλη την αλληλούχιση exome των LNCaP και C4-2B. Ο αριθμός αυτός αυξήθηκε σε 52% όταν πήραμε μόνο τα γονίδια που εκφράζονται υπόψη (FPKM & gt? 1). Αντίθετα, το 60 και το 71% των LNCaP και C4-2B παραλλαγών που προσδιορίζονται από αλληλούχιση μεταγραφικό αντίστοιχα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση exome.

νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις

Τα διάφορα είδη των μεταβάσεων και μεταστροφές στις exomes και transcriptomes των κυτταρικές σειρές LNCaP και C4-2B θα μπορούσε να δώσει εικόνα στα μεταλλάξεων διεργασίες που έλαβαν χώρα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των κυττάρων αυτών. Παρατηρήσαμε ότι οι βασικές μεταλλάξεις (40-42%) σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές ήταν G-προς-Α και C-to-T μεταβάσεις (Σχήμα 2).

Ποσοστά μεταλλάξεις σε κάθε μία από τις έξι πιθανές μεταλλάξεις οι τάξεις εκπροσωπούνται για τα δεδομένα αλληλουχίας αλληλουχίας exome και μεταγραφικό τόσο LNCaP και C4-2B κύτταρα.

η

το πιο διαδεδομένο είδος της επεξεργασίας του RNA σε ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς είναι η μετατροπή της αδενοσίνης σε ινοσίνη. Όπως ινοσίνη διαβάζεται ως γουανίνη μετά αλληλουχίας, αυτός ο τύπος επεξεργασίας εκδηλώνεται σε RNA αλληλουχίας ως A-to-G υποκατάσταση [18]. Ωστόσο, σε σύνολα δεδομένων μας, ο αριθμός των A-to-G μεταβάσεις στην exome και τα δεδομένα αλληλούχισης μεταγραφικό είναι συγκρίσιμη επιχείρημα εναντίον ενός σημαντικού ρόλου των μοντάζ RNA (Σχήμα 2).

Validation σημειακών μεταλλάξεων

στο σύνολο, 80 μεταλλάξεις στα δεδομένα exome από LNCaP (47) και C4-2B (33) επικυρώθηκαν από χειροκίνητη Sanger εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας (Σχήμα 3). Τα γονίδια που επιλέχτηκαν για την επικύρωση κατατάχθηκαν ψηλά σε μία λειτουργική ιεράρχηση όλων των μεταλλαγμένων γονιδίων στην κυτταρική γραμμή C4-2B (υπολογίζεται όπως στο [12]). Εννέα από αυτές τις μεταλλάξεις (σε PIK3R1, TP53BP1, PRKCQ, CHEK2, RIPK2 και KLK3) ανιχνεύθηκαν με DNA και αλληλούχιση RNA στις δύο κυτταρικές σειρές, και αυτά επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση Sanger στο γονιδιακό και συμπληρωματικό DNA των LNCaP και C4-2B. Όταν ελέγξαμε επτά από τις μεταλλάξεις C4-2B exome (PIAS1 P216S και K380M, MKNK2 L229M και T244N, STAT5A I85N και MYO18A A1571T και Q646 *), δεν είχαν εντοπιστεί από αλληλούχιση LNCaP exome, αλλά η παρουσία τους στο γονιδίωμα LNCaP ήταν εμφανής στα δεδομένα αλληλούχισης RNA και επιβεβαιώθηκε επίσης με ανάλυση της αλληλουχίας Sanger σε γονιδιωματικές και συμπληρωματικό DNA.

Validation διεξήχθη χρησιμοποιώντας PCR τόσο γονιδιωματικό DNA και αντιγραφή DNA, ακολουθούμενη από συμβατική ανάλυση αλληλουχίας Sanger. Η πρώτη και η δεύτερη στήλη αντιπροσωπεύει το όνομα του γονιδίου και την υποκατάσταση αμινοξέων αντίστοιχα. Η τρίτη, τέταρτη, έβδομη και όγδοη στήλη αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα αλληλούχισης επόμενης γενιάς για ολόκληρη exome και αλληλούχιση μεταγραφικό, οι οποίες στη συνέχεια επικυρώνονται με αλληλουχίας Sanger στην πέμπτη, έκτη, ένατη και δέκατη στήλη. Α + υποδηλώνει ότι η μετάλλαξη ανιχνεύθηκε, ένα – υποδηλώνει ότι η μετάλλαξη δεν ανιχνεύθηκε, ενώ το 0 σημαίνει ότι δεν PCR-προϊόν θα μπορούσε να ενισχυθεί και /ότι αυτή η θέση δεν ήταν καλυμμένο με αλληλούχιση επόμενης γενιάς

Η.

επίσης, ανιχνευθεί και να επιβεβαιωθεί C4-2B συγκεκριμένες μεταλλάξεις στο CASP9, FLNB, POLR2A και STAT5A στο γονιδιακό DNA και cDNA της C4-2B κύτταρα, αλλά όχι στα κύτταρα LNCaP. Τέλος, οι μεταλλάξεις σε γονίδια που δεν εκφράζονται σε LNCaP ή C4-2B (KIT και Grap) θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί μόνο σε γονιδιακό DNA.

Εν κατακλείδι, η GATK UnifiedGenotyper για την παραλλαγή κλήση οποία σε συνδυασμό με την εκτεταμένη φιλτράρισμα μας παράγεται λίγα ψευδώς θετικά. Παρόμοια αποτελέσματα έδειξαν πρόσφατα από Liu

et al.

Συγκρίνοντας GATK με SAMtools, Atlas 2 και glftools [19]. Επιπλέον, θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι επικυρώσεις μας έδειξε ότι η exome αναλύσεις δεν αποκαλύψει όλες τις μεταλλάξεις, αλλά οι παραλλαγές που ανακαλύφθηκαν το πιθανότερο είναι γνήσια μεταλλάξεις

γονίδιο διαφορική έκφραση μεταξύ των LNCaP και κυττάρων C4-2B

Είμαστε δίπλα ήθελε να ψάξετε διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών, δεδομένου ότι αυτά μπορεί να παρέχει ενδείξεις για τους μηχανισμούς πίσω από την εξέλιξη των κυττάρων LNCaP σε κύτταρα C4-2B. Η διαφορική έκφραση κλήθηκε από τον αλγόριθμο Tuxedo βασίζονται σε RNA-seq δεδομένα των τριπλών για κάθε κυτταρική σειρά, με επιπλέον φιλτράρισμα του log2 φορές αλλαγή & gt? 2 και το q-αξίας & lt? 0.001. Όλες οι επαναλήψεις ήταν πολύ παρόμοια, όπως μπορεί να φανεί στο Σχήμα S3. Επιπλέον, η τετράγωνο συντελεστής διακύμανσης, η οποία είναι μια κανονικοποιημένη μέτρο της εγκάρσιας επαναληπτικές μεταβλητότητα, είναι κάτω από 0,05 για εκφραζόμενων γονιδίων.

Η ανάλυσή μας οδήγησε στην ταυτοποίηση 703 διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (Πίνακας S6), εκ των οποίων 457 γονίδια εκφράζονται σε υψηλότερα C4-2B και 246 είναι υψηλότερες εκφράζονται σε κύτταρα LNCaP (Εικόνα S2). Μια επισκόπηση της θέσης των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε όλη του γονιδιώματος μπορεί να βρεθεί στο Σχήμα 4, μαζί με τη συχνότητα των μεταλλάξεων σημείου ανιχνεύεται στις δύο κυτταρικές σειρές, σε κύτταρα C4-2B μόνο, ή σε μόνο τα κύτταρα LNCaP. Ποσοτική RT-PCR επί πέντε διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων επιβεβαίωσαν τα δεδομένα RNA-seq (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα ιδεογράμματα χρωμόσωμα φαίνονται γύρω από το εξωτερικό δακτύλιο και προσανατολίζεται pter-qter σε μια δεξιόστροφη κατεύθυνση με κεντρομεριδίων υποδεικνύεται με κόκκινο χρώμα. Ο εξωτερικός δακτύλιος αντιπροσωπεύει διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων: 457 γονίδια με υψηλότερη έκφραση σε C4-2B (κόκκινες κουκκίδες) και 246 γονίδια με υψηλότερη έκφραση σε LNCaP (μπλε κουκκίδες). Άλλα κομμάτια περιέχουν (από έξω προς τα μέσα): 2244 μεταλλάξεις στο κοινό μεταξύ LNCaP και C4-2B κύτταρα, 2129 μεταλλάξεις ειδικά για τα κύτταρα C4-2B και 546 μεταλλάξεις ειδικά για τα κύτταρα LNCaP φαίνεται από την πυκνότητα ανά 10 μεγαβάσεων

Η.

Fu

et al.

ήδη περιγραφεί ορισμένοι διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων μεταξύ LNCaP και C4-2B, αλλά κανένα από τα γονίδια που ανιχνεύονται εκφράζονται διαφορικά σε δεδομένα μας [20]. Προτείνουμε ότι οι συνθήκες καλλιέργειας και οι διαφορές μεταξύ των πλατφορμών ανίχνευσης πιθανότατα εξηγούν αυτή την ασυμφωνία. Από την άλλη πλευρά, υπάρχει σημαντική επικάλυψη των συνόλων δεδομένων μας με αυτά άλλων μελετών που συνέκριναν LNCaP και transcriptomes C4-2 [21] – [25].

ανάλυση Μονοπάτι της γονιδιωματικής και transcriptomic σύνολα δεδομένων

LNCaP και C4-2B κύτταρα να συνεχίσουν να χρησιμοποιούνται στη βασική και προκλινική έρευνα. Προτείνουμε βάσεις δεδομένων μας μεταλλάξεων και διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων ως σημαντικές πηγές έμπνευσης για περαιτέρω ερευνητικά προγράμματα. Επιπλέον, αυτές οι βάσεις δεδομένων μπορούν τώρα να ελέγχονται για συγκεκριμένες μεταλλάξεις πριν αρχίσει μία χρήση αυτών των κυττάρων για να μελετήσει οποιαδήποτε συγκεκριμένη προστάτη που σχετίζονται με μονοπάτι.

Η παράγραφος αυτή δίνει ένα παράδειγμα μιας υπόθεσης με βάση την

in silico

ανάλυση των δεδομένων μας. Pathway-Express ανάλυση των συγκεκριμένων μεταλλάξεων C4-2B σε συνδυασμό με τα 703 γονίδια που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ LNCaP και κυττάρων C4-2B έδειξε ότι οι πιο σημαντικές αλλαγές που βρέθηκαν στην οδό αλληλεπίδραση ECM-υποδοχέα και σε εστιακό πρόσφυση. Και οι δύο οδοί συγκλίνουν στην υπερέκφραση της κινάσης φωτός αλυσίδα μυοσίνης (MLCK) γονίδιο (Σχήμα 5).

Μεταβολές ορίζεται ως έχον αυξημένη (κόκκινο) ή μειωμένη (μπλε) έκφραση σε σύγκριση με C4-2B LNCaP ή με σωματικές μεταλλάξεις στα κύτταρα C4-2B μόνο (έντονα μαύρες γραμμές). Η υπερέκφραση της κινάσης μυοσίνης ελαφριάς αλυσίδας σε κύτταρα C4-2B θα μπορούσε να τα διακρίνει από τα κύτταρα LNCaP στη μετανάστευση των κυττάρων και τα χαρακτηριστικά εστιακή πρόσφυση.

Η

Συζήτηση

Ένα υψηλό ποσοστό μετάλλαξης σε LNCaP και C4- τα κύτταρα 2Β

C4-2B κύτταρα που προέρχονται από μετάσταση οστών σε άτριχα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με κύτταρα που προέρχονται από τα LNCaP προερχόμενο, ευνουχισμός ανθεκτικά ξενομοσχεύματα ονομάζεται C4-2. Θεωρούνται ένα χρήσιμο προκλινικό μοντέλο για μεταστατικό, ο ευνουχισμός ανθεκτικά και του υποδοχέα ανδρογόνων θετική ΣΕΣΣ. Εδώ, θα παρέχει για πρώτη φορά συγκριτικά χάρτες των σημειακών μεταλλάξεων ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα LNCaP και C4-2B. Επιπλέον, αν και μεταγραφικό αναλύσεις των LNCaP και C4-2 έχουν αναφερθεί, σε γνώση μας, αυτή είναι η πρώτη ανάλυση μεταγραφικό κυττάρων C4-2B.

C4-2B κύτταρα καθώς και κύτταρα LNCaP έχουν μια εκπληκτικά υψηλό αριθμό σημειακών μεταλλάξεων: 4373 και 2790 μεταλλάξεων, αντίστοιχα. Όπως και στην πρωτοβάθμια προστάτη και τον ευνουχισμό ανθεκτικά δείγματα προστάτη, η μετάλλαξης φάσμα κυριαρχείται από G-to-A και C-to-T μεταβάσεις [26] – [28]. Είναι γνωστό ότι αναντιστοιχία ελαττώματα επισκευή προκαλούν μεταλλάξεις μετάπτωσης, ιδιαίτερα G-προς-Α και C-to-T υποκαταστάσεις [29]. Ως εκ τούτου, οι περισσότερες μεταλλάξεις μπορεί να προκληθεί από το ελαττωματικό σύστημα επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων σε κύτταρα LNCaP, λόγω της ομόζυγη διαγραφή του 3 ‘άκρο του γονιδίου MSH2 [30]. Chen

et al.

Ήδη περιγραφεί μια συσχέτιση υψηλού αστάθεια των δορυφορικών DNA σε κύτταρα LNCaP [31].

Ο αριθμός των σημειακών μεταλλάξεων σε κυτταρικές γραμμές μας είναι πολύ υψηλότερο από το μέσο όρο 16-33 μεταλλάξεις ανιχνεύονται σε ολόκληρη exomes δειγμάτων προστάτη [26], [32] – [34]. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές είναι επομένως άτυπα, αλλά θα μπορούσε να θεωρηθεί ένα μοντέλο για τις περιπτώσεις στις οποίες προστάτη επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων είναι ελαττωματικός, όπως περιγράφεται για παράδειγμα με Barbieri

et al.

, Όπου ένα μεμονωμένο όγκο προστάτη harbored μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου της γονίδιο MSH6 μεταξύ 996 άλλων μεταλλάξεων [32]. Προφανώς, τέτοια υψηλότερα ποσοστά μετάλλαξης θα εξηγούσε την ακόμη υψηλότερο αριθμό μεταλλάξεων βρήκαμε σε C4-2B σύγκριση με LNCaP. Δυστυχώς, αυτό θα επισκιάσουν επίσης τις μεταλλάξεις οδηγού που μπορεί να έχουν προσέφερε ένα πλεονέκτημα επιβίωσης κατά τη διάρκεια της μεταστατικής διαδικασίας.

Σύνδεσμος μεταξύ των ποσοστών μετάλλαξης και της έκφρασης

Για τόσο την LNCaP και C4-2B κυτταρική γραμμή, βλέπουμε ότι οι εξαιρετικά εκφραζόμενα γονίδια περιέχουν πιο συχνά σημειακές μεταλλάξεις από τους μη-μεταγράφονται τα γονίδια (p & lt? 0,0001, δοκιμασία πλατεία Chi, για το υψηλότερο έναντι χαμηλότερη εξέφρασε τριτημόριο). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τη γενική σχέση μεταξύ της οργάνωσης ετεροχρωματίνη και τα υψηλότερα ποσοστά των περιφερειακών μετάλλαξη σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [35]. Ενδεχομένως, σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, η ανοικτή χρωματίνη και συνδέονται μεταγραφή επάγει περισσότερο αναντιστοιχίες που κανονικά είναι αποτελεσματικά διορθωθεί, αλλά όχι στην περίπτωση μιας ανεπάρκεια επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων.

σύγκριση LNCaP και C4-2B μεταλλάξεις

Διαπιστώσαμε 1784 μοιράστηκε μεταλλάξεις στα exomes του LNCaP και C4-2B, και 2056 C4-2B ειδικές αλλαγές, το οποίο έχει νόημα επειδή τα κύτταρα C4-2B προέρχονται από τα κύτταρα LNCaP. Ωστόσο, ανιχνεύσαμε επίσης 404 LNCaP-συγκεκριμένες αλλαγές, πολλές από τις οποίες επιβεβαιώθηκαν από αλληλουχίες μεταγραφικό μας. Προφανώς, τα κύτταρα LNCaP αναλύσαμε έχουν αποκλίνει από τα κύτταρα LNCaP που χρησιμοποιήθηκαν αρχικά για την ανάπτυξη των κυττάρων C4-2B [9]. Πράγματι, έχουμε δείξει προηγουμένως ότι ακόμη και LNCaP κύτταρα από διαφορετικούς εργαστήρια είναι γενετικά διαφορετικά και ενώ τα κύτταρα μας ελήφθησαν από την ATCC (πέρασμα 48), ο C4-2B ήταν πιθανότατα προέρχεται από μία πολύ νωρίτερα πέρασμα των κυττάρων LNCaP το 1994 [9] , [12].

Εισήγηση του ρόλου της MLCK στη μεταστατική διαδικασία

Τα στοιχεία μας μπορεί να οδηγήσει σαφώς στην υπόθεση επί της μεταστατικής διαδικασίας που έλαβε χώρα κατά τη διάρκεια της μετατροπής των LNCaP να C4- κύτταρα 2Β. Αυτό επεξηγείται από την σύγκλιση ενός αριθμού των επηρεαζόμενων οδών σε ρύθμιση προς τα πάνω του MLCK. Πράγματι, υπάρχουν διάφοροι δημοσιεύθηκε δεσμοί μεταξύ MLCK και τη μεταστατική διαδικασία. Διαχωριστική ανάλυση των μικροσυστοιχιών εντοπιστεί το γονίδιο MLCK ως η πιο κατατοπιστική γονίδιο για τη διαδικασία γένεση προστάτη [36], και η αναστολή της MLCK σε αρουραίους PCa κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του διεισδυτικότητας, που ήταν κατά κύριο λόγο οφείλεται σε διαταραχή της κυτταρικής κινητικότητας [37]. Η αναστολή MLCK σε ινοσάρκωμα, καρκίνο του παγκρέατος και κύτταρα καρκίνου του μαστού έχει επίσης ως αποτέλεσμα μειωμένη πρόσφυση, μετανάστευση και εισβολή και αυξημένη απόπτωση [38] – [41]. Αντιστρόφως, ενεργοποιώντας MLCK οδηγεί σε αύξηση της εισβολής στην κύτταρα καρκίνου του μαστού και αυξημένο μεταστατικό δυναμικό σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [42], [43]. Η διαφορική έκφραση του γονιδίου MLCK στις δύο κυτταρικές σειρές ερευνήθηκε εδώ θα μπορούσε επομένως συσχετίζονται με την υψηλότερη μεταστατική ικανότητα των κυττάρων C4-2B.

Συμπέρασμα

Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν σαφώς ότι υπάρχουν σημαντικές διαφορές στον αριθμό και την κατανομή των μεταλλάξεων και της έκφρασης γονιδίων μεταξύ των κυττάρων LNCaP και C4-2B. Δεδομένου ότι αυτές οι κυτταρικές γραμμές είναι παγκοσμίως χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της εξέλιξης από μη μεταστατικό να μεταστατικό PCa, τα στοιχεία αυτά είναι ζωτικής σημασίας για τους ερευνητές να ερμηνεύσει σωστά τα αποτελέσματά τους κατά τη χρήση αυτών κυτταρικών γραμμών. Επιπλέον, οι βάσεις δεδομένων μας θα είναι πολύ χρήσιμες για την ανάπτυξη νέων δοκιμαζόμενων ιδέες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

FastQC τα αποτελέσματα του ελέγχου της ποιότητας των ανά βάση ιδιότητες. Τα αποτελέσματα εξόδου του λογισμικού FastQC ποιοτικό έλεγχο (έκδοση 0.10.1) που παρουσιάζεται εδώ για exome και μεταγραφικό αλληλουχίας των κυττάρων LNCaP και C4-2B

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Κανονικοποιημένη κάλυψη από τη θέση του. Η μέση σχετική κάλυψη παρουσιάζεται σε κάθε σχετική θέση κατά μήκος της μεταγραφής του. LNCaP απεικονίζεται στο πράσινο, ενώ C4-2B απεικονίζεται με κόκκινο χρώμα. Ο άξονας x αναπαριστά το μήκος του γονιδίου στο 100%, όπου 0 είναι το 5 ‘άκρο του κάθε μεταγραφή και 100 είναι το 3’ άκρο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s002

(ΔΕΘ )

Εικόνα S3.

Heatmap των 703 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Η θερμικός χάρτης δείχνει τις τρεις επαναλήψεις της κάθε κυτταρικής σειράς, τα οποία είναι πολύ παρόμοια. Όλα τα διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Tuxedo, με q & lt? 0.001 και log2 φορές αλλαγή & gt? 2 ως cut-off. Είναι σαφές ότι η πλειονότητα των γονιδίων ρυθμίζεται αυξητικά σε C4-2B σύγκριση με LNCaP, ενώ μια μικρότερη ομάδα γονιδίων ρυθμίζεται μειωτικά σε C4-2B

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s003

(TIF )

Πίνακας S1. .

Χαρακτηριστικά αλληλουχίας

doi: 10.1371 /journal.pone.0090002.s004

(XLSX)

Πίνακας S2. .

Φίλτρα που χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό σημειακών μεταλλάξεων στα exomes των κυττάρων LNCaP και C4-2B

doi: 10.1371 /journal.pone.0090002.s005

(XLSX)

Πίνακα S3.

Λίστα σημειακές μεταλλάξεις που εντοπίζονται στην exome των κυττάρων LNCaP

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s006

(XLSX)

Πίνακας S4.

Λίστα σημειακές μεταλλάξεις που εντοπίζονται στην exome των κυττάρων C4-2B

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s007

(XLSX)

Πίνακας S5. .

Φίλτρα που χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό σημειακών μεταλλάξεων στα transcriptomes των κυττάρων LNCaP και C4-2B

doi: 10.1371 /journal.pone.0090002.s008

(XLSX)

Πίνακας S6.

Λίστα των 703 γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των κυττάρων LNCaP και C4-2B

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s009

(XLSX)

Ευχαριστίες

Είμαστε πολύ ευγνώμονες για την Ρίτα Bollen και Hilde De Bruyn για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια τους. Θέλουμε να ευχαριστήσουμε τους συναδέλφους μας στην Ενδοκρινολογία Εργαστήριο Μοριακής για τις χρήσιμες συζητήσεις.