Αφηρημένο

Το μονοπάτι Notch συμβάλλει στην αυτο-ανανέωση των κυττάρων και την αναστολή της κανονικής παχέος διαφοροποίησης επιθηλιακών κυττάρων του όγκου-κίνηση. Απορυθμισμένη έκφραση του Notch1 και Jagged1 παρατηρείται σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Τριχωτές /ενισχυτής του διαχωρισμού οικογένειας (HES), οι πιο χαρακτηρισμένο στόχοι του Notch, που εμπλέκονται στην ανάπτυξη πολλών καρκίνων. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο της Hes1 στην ογκογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Να χτυπήσει κάτω Hes1 που προκαλείται από τη γήρανση των κυττάρων CRC και μείωσε την ικανότητα εισβολής, ενώ η υπερέκφραση του Hes1 αυξημένη δραστηριότητα φωσφορυλίωση STAT3 και up-ρυθμίζονται επίπεδο πρωτεΐνης ΜΜΡ14. Ερευνήσαμε περαιτέρω την έκφραση του Hes1 σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου και βρήκε έκφραση υψηλού Hes1 mRNA σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς CRC. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι Hes1 ρυθμίζει την ικανότητα εισβολής μέσω της STAT3-ΜΜΡ14 οδού στα κύτταρα CRC και υψηλή έκφραση Hes1 είναι ένας προγνωστικός δείκτης κακής πρόγνωσης του CRC

Παράθεση:. Weng Μ, Τσάο P, Lin Η, Tung C , Αλλαγή Μ, Chang Y, et al. (2015) Hes1 αυξάνει την ικανότητα της εισβολής των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω της STAT3-ΜΜΡ14 Pathway. PLoS ONE 10 (12): e0144322. doi: 10.1371 /journal.pone.0144322

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, την Κίνα

Ελήφθη: 24 του Ιουνίου του 2015? Αποδεκτές: 15 Νοέμβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 9 Δεκεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Weng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το ήπαρ Πρόληψης Νοσημάτων & amp? Ίδρυμα Ερευνών θεραπεία, την Ταϊβάν, στην MTW. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου [1] και η χειρουργική εκτομή είναι η τυπική θεραπεία για την πρόωρη CRC στάδιο. Χημειοθεραπείες, συμπεριλαμβανομένων οξαλιπλατίνη, ιρινοτεκάνη, και flouracil είναι εξωφρενικά χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της νόσου σε προχωρημένο στάδιο [2]. Θεραπείες κατά αγγειακών ενδοθηλιακών αυξητικών παραγόντων ή των υποδοχέων τους, όπως bevacizumab [3], αφλιβερσέπτη [4], και regorafenib [5], παρατείνει την επιβίωση των ασθενών με προχωρημένο παχέος εντέρου. Ωστόσο, παρά τις προόδους σε χειρουργική εκτομές και συστηματικές θεραπείες, περιλαμβανομένης και της επικουρικής χημειοθεραπείες, πολλοί ασθενείς εξακολουθούν να πεθαίνουν από CRC, και καρκίνο του παχέος εντέρου είναι η τέταρτη στη σχετίζονται με τον καρκίνο θανάτους παγκοσμίως [1].

Γενετικές και επιγενετικές αλλαγές οδηγούν την έναρξη και εξέλιξη της ακολουθίας αδενώματος-καρκινώματος σε καρκίνο του παχέος εντέρου [6] και ανώμαλη ενεργοποίηση της σηματοδότησης Notch 1 είναι μία από τις προσδιοριζόμενες οδού [7, 8]. σηματοδότηση Notch συμβάλλει στην αυτο-ανανέωση των κυττάρων ογκογενή, επέκταση του εντερικού πισίνα προγονικών, και η αναστολή της κανονικής κολονικής διαφοροποίησης επιθηλιακών κυττάρων [9-11]. σηματοδότηση Notch ενεργοποιείται μέσω σύνδεσης των δύο ομάδων συνδετών, Jagged (Jagged1, 2) και Delta-σαν (Dll1, 3, 4). Υψηλότερη έκφραση του Notch 1 και Jagged1 mRNA και πρωτεϊνών τους παρατηρήθηκαν σε ιστούς CRC σε σύγκριση με παρακείμενες μη καρκινικό ιστό [12]. Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης Notch 1 συσχετίστηκε θετικά με το στάδιο του όγκου [12] και το βαθμό παθολογίας (υψηλή έκφραση Notch 1 σε φτωχά διαφοροποιημένο καρκίνωμα) [8, 13].

Ένα από τα πιο χαρακτηρισμένο στόχους του Notch είναι το τριχωτό /ενισχυτή του Σπλιτ (HES) της οικογένειας [14]. Ο στόχος αυτός δείχνει υπόσχεση στη διέγερση του εντέρου διαφοροποίησης των κυττάρων του όγκου [15]. Η υπερέκφραση του Hes1 έχει συσχετισθεί με την ανάπτυξη του παγκρέατος [14, 16, 17], του μαστού [18] και των ωοθηκών [19] καρκίνων και ρύθμιση προς τα κάτω της αποτελέσματα σε επιταχυνόμενη διαφοροποίηση και μειωμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε αρκετά μοντέλα του καρκίνου [20, 21 ]. Μέχρι σήμερα, δεν έχει υπάρξει ελάχιστη δεδομένα σχετικά με την έκφραση Hes1 σε καρκίνο του παχέος εντέρου [7, 22, 23]. Δεδομένου ότι η υψηλή έκφραση Notch παρατηρείται σε καρκίνο του παχέος εντέρου και σχετίζεται με το στάδιο του όγκου, μας ενδιαφέρει να μάθει αν Hes1 εμπλέκεται στην ογκογένεση του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την έκφραση της Hes1 σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου και συσχετίστηκε η έκφραση του με τα κλινικά αποτελέσματα. έκφραση υψηλού Hes1 mRNA σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς CRC. Στην λειτουργική ανάλυση, βρήκαμε ότι η καταστολή της έκφρασης Hes1 επάγει περισσότερο γήρανση των κυττάρων CRC και μειώνει την ικανότητα εισβολής των κυττάρων CRC μέσω ρύθμιση της έκφρασης ΜΜΡ14.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταροκαλλιέργειες

Ανθρώπινα κύτταρα 293 Τ και κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου: HCT116, Caco2 και SW48 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Αυτά διατηρήθηκαν σε DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2 εντός υγραινόμενου επωαστήρα.

Αντιδραστήρια

Το πλασμίδιο EF.hHES1.Ubc.GFP και το πλασμίδιο EF.deltaBHES1.Ubc.GFP αποκτήθηκαν από το εργαστήριο Linzhao Τσενγκ [24] μέσω addgene Inc. (Cambridge, ΜΑ). Η σημαία-Hes1 δημιουργήθηκε με πέψη EF.hHES1.Ubc.GFP με BamHI και XhoI, και εισάγοντας το χωνεμένο πλασμίδιο μέσα στις πολλαπλές θέσεις κλωνοποίησης του φορέα pcDNA4-TAG (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stattic ελήφθη από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Ελέγχου siRNA και Hes1 siRNA ελήφθησαν από Qiagen (Venlo, Ολλανδία). Lipofetamine RNAiMAX (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως ένα αντιδραστήριο επιμόλυνσης siRNA. Το πρωτόκολλο έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε τελική συγκέντρωση 10ηΜ.

Western Blot

στυπώματα Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [24]. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν Hes1 (Millipore, Billerica, ΜΑ), ΜΜΡ14 (Abcam, Cambridge, UK), STAT3, φωσφόρου STAT3 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), της σημαίας και ακτίνης (Sigma-Aldrich). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα ειδικό πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα, πλύθηκαν, στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανιού, και αναπτύχθηκε με τη χρήση ECL (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, ΜΑ).

εκχύλιση RNA και σε πραγματικό χρόνος αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Ολικό RNA από δείγματα ασθενών εκχυλίζεται με κιτ εκχύλισης RNA (Qiagen) από τον ιστό ομογενοποιείται με ΤπζοΙ (Invitrogen). Ολικό RNA από τις κυτταρικές γραμμές εκχυλίζεται με ένα κιτ RNeasy Mini (Qiagen). Το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε DNA χρησιμοποιώντας το High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Έκφραση των Hes1 και ΜΜΡ2, ΜΜΡ3, ΜΜΡ7, ΜΜΡ9 και ΜΜΡ14 mRNA εκτιμήθηκαν με τη χρήση δύναμης SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). GAPDH mRNA χρησιμοποιήθηκε σαν ενδογενής έλεγχος. Η έκφραση του RNA αναλύθηκε με τη χρήση της μεθόδου 2-ΔΔCt. Εκκινητές για έκφραση mRNA καταδείχθηκαν στον Πίνακα S1.

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με την ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) 2,5- διφαινυλτετραζωλίου, Sigma-Aldrich Co.] δοκιμασίας.

In vitro εισβολή

δοκιμασία

Η επεμβατική δραστικότητα μετρήθηκε με τη χρήση ενός συστήματος μεμβράνης εισβολή καλλιέργειας στην οποία μια πολυανθρακική μεμβράνη με 8-μm πόρους (Millipore , Billerica, ΜΑ) επικαλύφθηκαν με Matrigel (R &? D Systems Inc., Minneapolis, ΜΝ) στα 5 mg /mL τοποθετήθηκε μεταξύ των άνω και κάτω φρεάτια του θαλάμου συστήματος καλλιέργειας εισβολή της μεμβράνης. Μετά από αυτό, 5 × 10

4 HCT116 ή κύτταρα SW48 τοποθετήθηκαν σε κάθε ανώτερο φρεάτιο του θαλάμου. Μετά από μια επώαση 48 ώρα στους 37 ° C, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου της μεμβράνης επικαλυμμένη αφαιρέθηκαν από τον κατώτερο θάλαμο με 1 mM EDTA σε PBS και dot στυπώθηκαν πάνω σε μεμβράνη πολυανθρακικού με 3 μm πόρους. Οι κηλιδωμένες κύτταρα βάφτηκαν με Giemsa (Sigma Chemical Co., St. Louis, ΜΟ), και ο αριθμός των κυττάρων σε κάθε κηλίδα μετρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 50 ×. Κάθε πείραμα διεξήχθη τρεις φορές, και κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν.

SA-β-gal δοκιμασία δραστικότητας

κύτταρα Caco2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα Γήρανση β-Γαλακτοσιδάσης Χρώση Kit (Cell Signaling) . Το πρωτόκολλο έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2 * 10

κύτταρα Caco2 5 επιμολύνθηκαν με siRNA και επιστρώνονται σε 35 mm καλά για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα στερεωτικό 1Χ για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και ξεπλένονται δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με διάλυμα χρώσης β-γαλακτοσιδάσης για 10 ώρες στους 37 ° C. Μπλε-χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν στα 400 × μεγέθυνση.

Ανθρώπινο CRC ιστού

παχέος κρυοτομές παρασκευάστηκαν από καρκίνο του παχέος εντέρου χειρουργική δείγματα που συλλέχθηκαν από Σεπτέμβριος 2000 – Ιούνιος 2003, μετά από γραπτή συγκατάθεση . Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο δεοντολογικής εξέτασης στο Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο. Όλοι οι ιστοί καταψύχθηκαν φρέσκα ή βυθίζεται σε βέλτιστη θερμοκρασία κοπής ένωση (OCT) (Ames Company, Elkhart, ΙΝ), και διατηρήθηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Κλινική σταδιοποίηση των καρκίνων προσδιορίστηκε με βάση την ταξινόμηση UICC-ΤΝΜ.

Η στατιστική ανάλυση

Οι συγκρίσεις των μεταβλητών μεταξύ των δύο ομάδων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test δύο ουρά του Student με εκφράζονται ως μέσο + τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν. Paired t-tests χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση της έκφρασης του mRNA όγκου και μη όγκου. Χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο Spearman να αναλύσει τις συσχετίσεις μεταξύ Hes1 και ΜΜΡ14. Υψηλή και χαμηλή έκφραση Hes1 και ΜΜΡ14 ορίστηκαν σύμφωνα με το διάμεσο επίπεδο έκφρασης σε κάθε ομάδα. Η επιβίωση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Οι τιμές Ρ μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτέλεσμα

Η κατάρριψη του Hes1 γονίδιο μειωμένη ικανότητα εισβολής

Για να διερευνήσουν το ρόλο των Hes1 στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, που εξετάστηκαν τα επίπεδα έκφρασης Hes1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του κόλου 6 χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR και βρήκε επίπεδα έκφρασης υψηλά Hes1 σε CaCo2 και κυττάρων SW48 και χαμηλά επίπεδα έκφρασης Hes1 σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 1Α). Στη συνέχεια εκφράζονται σταθερά HES1 ή ένα μεταλλαγμένο Hes1 έλλειψη του πεδίου σύνδεσης ϋΝΑ, σε HCT116 και ΗΤ29 καρκινικά κύτταρα κόλου (Σχήμα 1Β). Παρατηρήσαμε υψηλότερη ικανότητα εισβολής στα κύτταρα που υπερεκφράζουν Hes1 σε σύγκριση με κύτταρα μολυσμένα με το πλασμίδιο pcDNA4 ελέγχου. Δεν παρατηρήσαμε αυξημένη ικανότητα εισβολής σε HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο Hes1, υποδηλώνοντας ότι η περιοχή πρόσδεσης DNA είναι σημαντική για την ικανότητα εισβολής του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (Σχ 1C). Εμείς επόμενη απεμπλουτισμένο Hes1 στα κύτταρα SW48 και Caco2 χρησιμοποιώντας siRNA (Σχ 1D), και παρατηρήθηκαν λιγότερο εισβολή σε κύτταρα επιμολυσμένα με Hes1 siRNA από εκείνους με έλεγχο siRNA (Σχ 1Ε). Για να προσδιοριστεί περαιτέρω ο ρόλος των Hes1 σε χαρακτηριστικές καρκίνο των κυττάρων CRC, ένας προσδιορισμός πολλαπλασιασμού διεξήχθη και έδειξε καμία σημαντική μεταβολή μετά την εξάντληση Hes1 (S1 Σχήμα).

(Α) έκφραση Hes1 mRNA στις κυτταρικές σειρές του κόλου . (Β) Hes1 και σημαία έκφραση της πρωτεΐνης κατά την υπερέκφραση Hes1 και μεταλλαγμένα Hes1 σε HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα. ικανότητα (C) Cell εισβολή αλλάζει κατά υπερέκφραση Hes1 και μεταλλαγμένα Hes1 σε HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα. (D) Η έκφραση της πρωτεΐνης Hes1 σε Caco2 και SW48 κύτταρα κατά siRNA Hes1 διαμόλυνση. (Ε) ικανότητα των κυττάρων εισβολή αλλάζει κατά siRNA Hes1 επιμόλυνση. (F) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του γηρασμού β-γαλακτοσιδάσης στο Caco2 και κυττάρων SW48. (G) Ποσοτικοποίηση των γηρασμό β-γαλακτοσιδάσης θετικά κύτταρα στο Σχ 1F. (* P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.005).

Η

Καταστρέφουν το γονίδιο Hes1 που προκαλείται περισσότερα κύτταρα CRC σε γήρανση

Έχει αναφέρθηκε ότι Hes1 απαιτείται για την αναστρεψιμότητα της κυτταρικής ηρεμίας και προλαμβάνει την πρόωρη γήρανση σε αδρανείς ινοβλάστες [25]. Εμείς γκρέμισε Hes1 στα κύτταρα SW48 και Caco2 και παρατηρούνται σημαντικά περισσότερο έκφρασης β-γαλακτοζιδάσης Hes1 γκρέμισε κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει πιο γήρανση των κυττάρων Hes1depleted (Σχήμα 1F και 1G).

Νοκ ντάουν του γονιδίου Hes1 μειώνεται εισβολή μέσω ρύθμισης ΜΜΡ14

Καθώς πολλές μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) μεσολαβούν εισβολή των καρκινικών κυττάρων [26], μελετήσαμε την έκφραση ενός πάνελ των MMPs σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα κατά Hes1 knockdown. Παρατηρήσαμε ότι μόνο επίπεδο έκφρασης ΜΜΡ14 μειώθηκε κατά Hes1 knockdown σε επίπεδο mRNA σε κύτταρα Caco2 (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια βρέθηκε knock-down Hes1 οδηγούν σε ΜΜΡ14 μείωση επίπεδο πρωτεΐνης στα κύτταρα SW48 (Σχήμα 2Β). Αντιστρόφως, υπερέκφραση Hes1 οδήγησε σε αύξηση της έκφρασης ΜΜΡ14 mRNA (Σχήμα 2C). Εμείς εκτοπικά εκφραζόμενη ένα μεταλλαγμένο γονίδιο HES1, το οποίο φέρει μία κολόβωση στο πεδίο λειτουργίας του, και δεν παρατηρήσαμε την αύξηση ΜΜΡ14 στα HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα (Σχ 2C).

(α) μια σειρά από ΜΜΡ έκφραση του mRNA κατά siRNA Hes1 επιμόλυνση στα κύτταρα Caco2. μείωση πρωτεΐνη (Β) ΜΜΡ14 κατόπιν siRNA Hes1 επιμόλυνση σε κύτταρα SW48 (C) έκφραση mRNA ΜΜΡ14 κατόπιν Hes1 και μεταλλαγμένα υπερέκφραση Hes1 στα κύτταρα HCT116 και ΗΤ29. (* Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01)

Η

Hes1 ρυθμισμένη έκφραση ΜΜΡ14 εξαρτάται από την οδό STAT3

Έχει αναφερθεί ότι Hes1 ενεργοποιεί μεταγωγείς σημάτων και ενεργοποιητές του μεταγραφής 3 (STAT3) οδού [27, 28], και ότι STAT3 ελέγχει την έκφραση της ΜΜΡ1 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [29, 30]. Ως εκ τούτου, αξιολογούνται είτε δραστηριότητα STAT3 παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση HES1 της ΜΜΡ14 σε καρκινικά κύτταρα κόλου. εξάντληση Hes1 με siRNA knockdown μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης ΜΜΡ14 στα κύτταρα Caco2 και SW48. εξάντληση Hes1 οδήγησε σε μείωση της φωσφορυλίωσης STAT3 και καμία αλλαγή του συνολικού STAT3 στο Caco2 και κυττάρων SW48 (Σχήμα 3Α και 3Β). Εκτοπικά υπερεκφράζουν μια FLAG ετικέτα ουσιαστικά δραστική πλασμίδιο STAT3, οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης ΜΜΡ14 σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 3C και 3D). Έκτοπη υπερέκφραση Hes1 αυξημένης έκφρασης ΜΜΡ14 καθώς και STAT3 phosphyorylation στα κύτταρα HCT116. Επιπλέον, φωσφορυλίωση STAT3 και η έκφραση πρωτεΐνης ΜΜΡ14 μειώθηκε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με stattic, ένας αναστολέας ενεργοποίησης STAT3 (σχήμα 3Ε και 3F). Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι HES1 ρυθμίζουν την έκφραση ΜΜΡ14 μέσω up-ρύθμιση της δραστηριότητας STAT3 στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Η

Hes1 και της έκφρασης ΜΜΡ14 είναι άσχετη με όγκο στάδιο

Ως έκφραση Notch 1 συνδέεται με όγκο στάδιο, αξιολογήσαμε την έκφραση Hes1 σε ανθρώπινους ιστούς CRC. Αναλύσαμε 74 ζεύγη αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου κόλου και των παρακείμενων μη καρκινικών ιστών κόλου τους από τον πληθυσμό των ασθενών Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο (Πίνακας 1). Βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης της Hes1 (Σχήμα 4Α) ή ΜΜΡ14 mRNA (Σχήμα 4Β) ήταν άσχετη με το στάδιο του όγκου.

(Α) Hes1 mRNA (

σ

= 0,06 από Ένας τρόπος ANOVA) και (Β) έκφραση ΜΜΡ14 mRNA (

σ

= 0.60 by One way ANOVA) δεν ήταν συσχετίζεται με το στάδιο του όγκου.

η

Υψηλή έκφραση Hes1 στο CRC είναι που συνδέονται με μικρότερη επιβίωση

Είμαστε ακόμη διερευνηθεί κατά πόσον Hes1 και εκφράσεις ΜΜΡ14 συσχετίζονται με την επιβίωση των ασθενών. έκφραση Hes1 mRNA και η έκφραση του mRNA ΜΜΡ14 σχετίστηκαν θετικά στον ιστό του όγκου (coefficiency συσχετισμός = 0,238, p = 0,035). Υψηλή έκφραση Hes1 στους όγκους συσχετίστηκε με μικρότερους χρόνους επιβίωσης (Σχήμα 5Α). Υψηλή ΜΜΡ14 επίσης συσχετιστεί με μικρότερη επιβίωση (Σχήμα 5Β).

Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε Hes1 /ΜΜΡ14 χαμηλών και υψηλών ομάδες με βάση τη μέση ERH έκφρασης /ΜΜΡ14 και την επιβίωσή τους σχεδίαζε χρησιμοποιώντας την ανάλυση Kaplan-Meier ( άνοδος δείχνει να λογοκρίνει τα γεγονότα). (Α και Β) CRC ασθενή με υψηλή έκφραση Hes1 και ΜΜΡ14 συνδέεται με κακή επιβίωση. (Γ και Δ) Στην υποομάδα των ασθενών με σταδίου Ι-ΙΙΙ CRC, υψηλή Hes1 και την έκφραση ΜΜΡ14 είναι σημαντικά συνδέεται με κακή επιβίωση. (Ε και ΣΤ) Στην υποομάδα των ασθενών με σταδίου IV CRC, Hes1 και η έκφραση ΜΜΡ14 δεν σχετίζεται με την επιβίωση.

Η

στρωματοποιημένη περαιτέρω αυτούς τους ασθενείς, σύμφωνα με μεταστατικό ασθενειών τους. Για ασθενείς με πρώιμη ή τοπικά προχωρημένο ασθένειες, υψηλή έκφραση Hes1 ή υψηλή ΜΜΡ14 συσχετίστηκε με σημαντικά μικρότερη επιβίωση. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης Hes1 και ΜΜΡ14 είχαν σχέση με την επιβίωση των ασθενών με μεταστατικό ασθένειες (Σχήμα 5C-5F). Όπως ΜΜΡ παίζει ρόλο στην εισβολή καρκίνου και μετάσταση, μπορεί να είναι λιγότερο προγνωστικός για ασθενείς με όγκους που έχουν ήδη μετασταθεί σε διάγνωση

Σύμφωνα με την πολυμεταβλητή Cox παλινδρόμησης αναλύσεις, Hes1 (HR, 2,41?. 95% CI , 1,07 – 5,43) και ΜΜΡ14 (HR, 2,36? 95% CI, 1,02 έως 5,46) παρέμειναν θετικά που σχετίζονται με θανάτους από καρκίνο του παχέος εντέρου. Μετάσταση συσχετίστηκε επίσης σημαντικά (HR, 10,05? 95% CI, 4,11 να 24,60) με τους θανάτους από καρκίνο του παχέος εντέρου (Πίνακας 2). Όσον αφορά την αλληλεπίδραση μεταξύ Hes1 και μετάσταση, ασθενείς παρουσίασαν υψηλή Hes1 ακόμα είχαν αυξημένο κίνδυνο θανάτου από καρκίνο του παχέος εντέρου.

Η

Συζήτηση

Η ομοιόσταση της αυτο-ανανέωσης, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των βλαστικών και προγονικών κυττάρων ρυθμίζεται από Notch, WNT, FGF και τα μονοπάτια σηματοδότησης Hedgehog [31-33]. Στο έντερο, αυτές οι οδοί συμμετέχουν επίσης στην λάχνες σχηματισμό και την ανάπτυξη όγκων του παχέος [9, 34, 35]. Μονοπάτι Wnt εμφανίζει διασταυρούμενη ρυθμιστικές αλληλεπιδράσεις με το μονοπάτι Notch [36, 37]. APC

Min (πολλαπλή εντερική νεοπλασία) ποντίκια, στα οποία το γονίδιο APC φέρει μία μετάλλαξη στο κωδικόνιο κολόβωση 850 και μονοπάτι Wnt είναι απορυθμισμένη, μπορεί να αναπτύξει εκατοντάδες λεπτού εντέρου και των πολυπόδων του κόλου [38]. ενεργοποίηση Notch είναι απαραίτητο για το σχηματισμό του παχέος αδενώματος στην APC

ποντίκια Min [10]. Αναστολή της Hes1 σε APC

ποντίκια Min μειώθηκε πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και οδήγησε σε διαφοροποίηση των κυττάρων του όγκου σε επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου [15].

Hes1 παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση CRC. Δεσμεύει άμεσα με τον υποκινητή του γονιδίου HATH1 και καταστέλλει την έκφραση Hath1 [39]. Hath1 είναι ένας καταστολέας όγκων ο οποίος αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και αγκύρωση-ανεξάρτητη ικανότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων [40, 41] και προάγει την εντερική εκκριτική κυτταρική διαφοροποίηση [42]. Είναι καλά γνωστό ότι Hes1 προλαμβάνει την πρόωρη γήρανση σε αδρανείς ινοβλάστες [25]. Εδώ, αποδείξαμε ότι καταστρέφουν Hes1 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου δεν επηρέασε την κυτταρική πολλαπλασιασμό αλλά αυξημένη έκφραση β-γαλακτοσιδάσης, δεικνύοντας ότι η εξάντληση Hes1 επάγει καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γήρανση. Κάτω ρύθμιση των Hes1 επαγόμενης από γηρασμό έχει επίσης αναφερθεί σε ηπατοκυτταρικό κυττάρων μέσω ρύθμισης CDKN1C /p57 [43].

Στη συνέχεια, χαρακτηριζόμενη από ότι Hes1 προωθείται κύτταρο εισβολή αυξάνοντας την έκφραση ΜΜΡ14. ΜΜΡ14 είναι ένα βασικό πρωτεάσης σε κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή και την αγγειογένεση [44, 45]. Υψηλή έκφραση του ΜΜΡ14 αναφέρθηκε στον καρκίνο του πνεύμονα και του γλοιώματος [46, 47]. Hes1 αλληλεπιδρά με STAT3 και προωθεί τη φωσφορυλίωση της [28]. Επιπλέον, STAT3 αναφέρθηκαν να ρυθμίζουν ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 έκφρασης και δραστηριότητες μέσω απευθείας σύνδεσης προς υποκινητή τους [48-50]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε επίσης ότι STAT3 υπερέκφραση αυξημένη έκφραση του ΜΜΡ14 (Σχήμα 3). Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι τα πάνω ρύθμιση του ΜΜΡ14 με Hes1 σε κύτταρα CRC εξαρτάται από την οδό STAT3.

Τέλος, παρατηρήσαμε ότι τόσο υψηλή Hes1 και έκφραση ΜΜΡ14 συσχετίστηκαν με κακή επιβίωση. Παρόμοια αποτέλεσμα βρέθηκε στην υποομάδα των ασθενών με πρώιμο ή τοπικά προχωρημένο CRC, αλλά όχι σε ασθενείς ότι ο όγκος έχει κάνει μετάσταση. Στη μελέτη Veenendaal του, που παρατηρήθηκε υψηλότερη έκφραση Hes1 σε πρωτογενείς καρκίνους του παχέος εντέρου, αλλά έχασε την έκφραση των περιφερειακών και απομακρυσμένων μεταστάσεων [23]. Αυτό το εύρημα πρότεινε μειωμένη δραστηριότητα Notch σε δευτερογενείς όγκους του παχέος εντέρου και μπορεί να εξηγήσει γιατί το επίπεδο έκφρασης Hes1 δεν σχετίζεται με την επιβίωση όταν όγκος έχει metastasied στη μελέτη μας. Σε αντίθεση, Reedijk et al. έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι η υψηλή Hes1 είναι άσχετη με την επιβίωση των ασθενών με CRC αναλύοντας 130 δεδομένα μικροσυστοιχιών από το αμερικανικό Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου του καρκίνου παχέος εντέρου Οικογενειακό Μητρώο. Υψηλή έκφραση ορίστηκε ως η κορυφή τεταρτημόριο των βαθμολογιών Allred [7]. Παρά το γεγονός ότι λόγω των συγκρούσεων Reedijk με το εύρημα μας, το στάδιο του όγκου, υψηλής ευκρίνειας έκφρασης και μεθοδολογική προσέγγιση είναι διαφορετική σε αυτές τις δύο μελέτες. Η πραγματική προγνωστική ρόλος του Hes1 σε CRC warrants περαιτέρω επιβεβαίωση.

Εν κατακλείδι, παρεκκλίνουσα ενεργοποίηση της οδού Notch αναστέλλει την κυτταρική διαφοροποίηση και συμβάλλει στην καρκινογένεση. Hes1 αποτελεί βασικό καταστολέας της μεταγραφής και ουσιαστική ρυθμιστικές αρχές για την οδό Notch. Εδώ, αποδείξαμε ότι η υπερέκφραση του Hes1 αυξάνει την ικανότητα των κυττάρων εισβολής μέσω της οδού STAT3-ΜΜΡ14. Hes1 έκφραση συσχετίζεται με την έκφραση ΜΜΡ14 σε CRC και είναι ένας προγνωστικός παράγοντας για την επιβίωση των ασθενών. Στόχευση το μονοπάτι Notch-Hes1 θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για θεραπευτικούς σκοπούς σε ενεργοποιημένα Notch καρκίνους.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. (Α) αλλαγή βιωσιμότητα των κυττάρων κατά siRNA Hes1 επιμόλυνση στα κύτταρα SW48

doi:. 10.1371 /journal.pone.0144322.s001

(ΔΕΘ)

S1 πίνακα. Εκκινητές για RT- PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0144322.s002

(DOCX)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον καθηγητή Linzhao Cheng για ευγενικά παρέχοντας Hes1 και δέλτα-Hes1 πλασμίδια μέσω Addgene.