Αφηρημένο

Αντιαγγειογενής θεραπεία είναι σημαντική για τη θεραπεία του γυναικολογικού καρκίνου. Ωστόσο, το θεραπευτικό όφελος που προέρχεται από αυτές τις θεραπείες είναι παροδική, κυρίως λόγω της επιλεκτικής ενεργοποίησης των αντισταθμιστικών προ-αγγειογόνος οδούς που οδηγούν σε ταχεία ανάπτυξη ανθεκτικότητας. Επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε και να στοχεύσουν πιθανή εναλλακτική λύση σηματοδότησης σε αντι-αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) θεραπεία, με σκοπό την ανάπτυξη ενός συνδυασμού αντιαγγειογενή παράγοντες για να παρέχουν εκτεταμένη θεραπευτικά οφέλη. Έχουμε αναπτύξει ένα προκλινικό

in vivo

μοντέλο φαινοτυπική αντοχή του καρκίνου των ωοθηκών ανθεκτικές σε αντιαγγειογενετικές θεραπεία. Μετρήσαμε δυναμικές αλλαγές στην εκκρίνονται χημειοκίνες και αγγειογόνων σηματοδότηση σε όγκους και πλάσματος σε απόκριση σε αντι-VEGF θεραπεία, καθώς οι όγκοι προωθείται από την αρχική απόκριση φάσης για προοδευτική ασθένεια. Σε όγκους που εξελιχθεί μετά από θεραπεία επίπεδα sorafenib, γονίδιο και έκφραση της πρωτεΐνης του προ-αγγειογόνος χημειοκινών CXC και οι υποδοχείς τους ήταν σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με απόκριση όγκους. Η χημειοκίνη (C-X-C μοτίβο) συνδέτη 8 (CXCL8), επίσης γνωστή ως η ιντερλευκίνη-8 (IL-8) αύξηση ήταν εξαρτώμενη από το χρόνο και συνέπεσε με τη δυναμική της εξέλιξης του όγκου. Χρησιμοποιήσαμε SB225002, μία φαρμακολογική αναστολέας χημειοκίνης (CXC μοτίβο) υποδοχέα 2 (CXCR2), να διαταράξουν την χημειοκίνη λειτουργίες στις οποίες μεσολαβεί CXC των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε

in vitro

προσδιορισμούς της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων, σχηματισμός σφαιροειδές, και κυτταρική μετανάστευση. Ο συνδυασμός του αναστολέα CXCR2 με sorafenib οδήγησε σε μια συνεργική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης

in vitro

, και περαιτέρω σταθεροποιημένα εξέλιξης του όγκου εξής sorafenib

in vivo

. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CXCR2 μεσολάβηση χημειοκίνες μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό αντισταθμιστικό μονοπάτι που προωθεί αντίσταση στην αντιαγγειογενετικές θεραπεία στον καρκίνο των ωοθηκών. Έτσι, η ταυτόχρονη παρεμπόδιση αυτής της προαγγειογόνος οδού κυτοκίνης χρησιμοποιώντας αναστολείς CXCR2 και τον υποδοχέα VEGF (VEGFR) οδός θα μπορούσε να βελτιώσει τα αποτελέσματα της θεραπείας αντιαγγειογενετικές

Παράθεση:. Devapatla Β, Sharma A, Woo S (2015) CXCR2 Αναστολή συνδυασμένη με Sorafenib βελτιωμένη αντικαρκινική και Αντιαγγειογενής απόκρισης σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 10 (9): e0139237. doi: 10.1371 /journal.pone.0139237

Επιμέλεια: Domenico Ribatti, Πανεπιστήμιο του Μπάρι Ιατρική Σχολή, Ιταλία

Ελήφθη: 10 του Ιούν 2015? Αποδεκτές: 10 Σεπτεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 28 του Σεπτέμβρη, 2015

Copyright: © 2015 Devapatla et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η έρευνα που αναφέρθηκαν σε αυτή τη δημοσίευση υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα της Γενικής Ιατρικών Επιστημών του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας στο πλαίσιο Βραβείο Αριθμός P20GM103639. Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικών καρκίνων στις ΗΠΑ Όταν αντιμετωπίζεται με την τρέχουσα χημειοθεραπεία πρότυπο-of-care, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης της νόσου σε προχωρημένο στάδιο παραμένει σε χαμηλά επίπεδα. Ωοθηκών όγκοι είναι πλούσια vascularized? Υπάρχει ένας συσχετισμός μεταξύ καταμέτρηση μικροαγγειακή και βιολογικών επιθετικότητα [1, 2]. Η αγγειογένεση παίζει έναν κεντρικό ρόλο τόσο στην κανονική λειτουργία των ωοθηκών και την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών [3]. Tumor αγγειογένεση είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη ασκίτη και της μετάστασης του καρκίνου των ωοθηκών στην περιτοναϊκή διάστημα [4]. Καθώς η αγγειογένεση είναι ένα κρίσιμο βήμα στη διάδοση των κακοήθων ανάπτυξη και μετάσταση όγκου [5], η αγγειογένεση είναι ένας έγκυρος στόχος στην αγωγή του καρκίνου των ωοθηκών [6]. Πολλαπλές προαγγειογόνος παράγοντες προωθούν τη διαδικασία σχηματισμού αιμοφόρων με VEGF ως κεντρικός παίκτης στην μεσολάβηση του όγκου αγγειογένεση [5]. Ένας αριθμός παραγόντων αντιαγγειογενετική, συμπεριλαμβανομένου του θεραπευτικού αντισώματος έναντι VEGF bevacizumab και πολυ-στοχευμένη αναστολείς κινάσης των υποδοχέων VEGF (VEGFR), έχουν ενεργά διερευνηθεί ή βρίσκονται σε ανάπτυξη ως θεραπείες για προχωρημένη νόσο. Η θεραπεία με bevacizumab παρέχεται μια ελεύθερη εξέλιξης επιβίωση (PFS) όφελος σε προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών όταν χορηγείται σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία [7, 8]. Αρκετές VEGFR-στόχευση multi-αναστολείς κινάσης όπως nintedanib, trebananib, pazopanib, το sunitinib, sorafenib, cediranib έχουν δοκιμαστεί σε διάφορες φάσεις κλινικών δοκιμών του καρκίνου των ωοθηκών [9]. Μερικοί από αυτούς τους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των pazopanib, nintedanib, cediranib και trebananib, έχουν αξιολογηθεί σε τυχαιοποιημένες κλινικές δοκιμές Φάσης ΙΙΙ, και όλα έδειξαν μια ελεύθερη προόδου επιβίωση (PFS) όφελος [10]. Ωστόσο, το θεραπευτικό όφελος του αντι-VEGF θεραπεία είναι βραχύβια. την εξέλιξη του όγκου τελικά αποκαθίσταται μετά από μια αρχική απάντηση, αναφέροντας τις αναδυόμενες αντίσταση. Η κατανόηση των μηχανισμών διαφυγής όγκου από αντι-VEGF θεραπεία είναι κρίσιμη για την εύρεση στρατηγικές για την παράκαμψη της αντίστασης. Οι διάφοροι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην επίκτητη ανθεκτικότητα σε αντι-VEGF θεραπεία, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης των εναλλακτικών δρόμων για να παρακάμψει την αναστολή του VEGF, συνεχίζοντας έτσι την αγγειογένεση των όγκων και την ανάπτυξη του όγκου [11]. Έτσι, συνδυάζοντας διαφορετικές αντιαγγειογενετικές θεραπείες μπορεί να είναι μια στρατηγική για να παρέχει διαρκή θεραπευτικά οφέλη.

Πολλοί παράγοντες ανάπτυξης που εμπλέκονται στην εισβολή του καρκίνου των ωοθηκών είναι επίσης εμφανές στην αγγειογένεση του [4]. Φλεγμονώδεις χημειοκίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση και εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ χημειοκίνες που παράγονται από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και υποδοχείς χημειοκινών που εκφράζονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και το μικροπεριβάλλον του όγκου την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου με διέγερση της αγγειογένεσης και την αύξηση της μετανάστευσης, εισβολή, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [12-14]. Μεταξύ των υποσυνόλων των χημειοκινών, οι CXC χημειοκίνες με την 3-αμινο οξύ (Glu-Leu-Arg /ELR) μοτίβο (ELR

+), συμπεριλαμβανομένων των CXCL1, 2, και 3 (GRO-α, β και γ), CXCL5 , CXCL6, CXCL7, και CXCL8 (IL-8), είναι ισχυροί ρυθμιστές της αγγειογένεσης και να μεσολαβήσει αγγειογόνο δραστικότητα τους μέσω του υποδοχέα χημειοκίνης CXCR2 [14]. Η υπερέκφραση των προ-αγγειογόνος χημειοκινών και CXCR2 συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών [12, 15-17]. Έτσι, ELR

+ CXC μονοπάτια προαγγειογόνος χημειοκινών είναι μια πιθανή εναλλακτική λύση για την προώθηση της αγγειογένεσης σε όγκους των ωοθηκών.

Για τον εντοπισμό αποτελεσματικών στρατηγικών για την παράκαμψη του μηχανισμού με τον οποίο ο καρκίνος των ωοθηκών παρακάμπτει αντι-VEGF θεραπεία, δημιουργήσαμε ένα ξενομόσχευμα μοντέλο του αντιαγγειογενετικές αντίστασης θεραπεία που μιμείται στενά την κλινική αντίσταση σε καρκίνο των ωοθηκών. Ταυτοποιήσαμε αλλαγές στην κυτοκίνης και αγγειογόνου οδών σε όγκους ανθεκτικό σε αντιαγγειογενετικές θεραπείες, όπως οι όγκοι εξελίχθηκαν από την αρχική απόκριση φάσης στο πυρίμαχο φάση. Μας

in vitro

και

in vivo

αποτελέσματα έδειξαν ότι η συνεργασία με στόχο την προαγγειογόνος άξονα κυτοκίνης CXCR2 με αναστολή αντι-VEGF είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για να παρέχει παρατεταμένα θεραπευτικά οφέλη σε προ-κλινικά μοντέλα των ωοθηκών του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα και αντιδραστήρια

Η ωοθηκική καρκινική κυτταρική σειρά SKOV-3 λήφθηκε από την American Type Culture Collection. Α2780 και OVCAR429 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών ευγενικά από τον Dr. Danny Dhanasekharan (Stephenson Cancer Center, OUHSC). Το Α2780 κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών αρχικά ελήφθη από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). είναι OVCAR429 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα τα οποία έχουν προηγουμένως δημοσιευθεί [18, 19]. Α2780 και OVCAR429 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI (Invitrogen). SKOV-3 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Invitrogen). Μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen), 100 IU /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνης (Invitrogen) στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2. Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) και των μέσων ενημέρωσης ενδοθηλιακών κυττάρων αγοράστηκαν από την Cell Applications (San Diego, CA). Sorafenib ελήφθη από τα εργαστήρια LC (Woburn, ΜΑ). SB225002 (

N

– (2-υδροξυ-4-νιτροφαινυλο) –

N

‘- (2-βρωμοφαινυλ) ουρία) είναι ένας ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας μη-πεπτίδιο CXCR2 (IL- 8R) υποδοχέα χημειοκινών. SB225002 είχε αγοραστεί από Tocris Bioscience (Bristol, UK). προετοιμασίες φάρμακο για sorafenib και SB225002 διεξήχθησαν σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται αλλού [20, 21].

Ζώα και φαρμακευτική αγωγή

Έξι εβδομάδων θηλυκούς αθυμικούς

nu /nu

γυμνοί ποντικοί αγοράστηκαν από Charles River Laboratories, Inc., μέσω NCI (Frederick, MD). Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC), και το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο της Οκλαχόμα Κέντρο Επιστημών Υγείας (OUHSC) Θεσμική Φροντίδα Ζώων και Επιτροπή Χρήσης (Αριθμός Πρωτοκόλλου: 12-154-Η). Τα ποντίκια δόθηκαν υποδόριες ενέσεις 5 × 10

6 SKOV-3 κύτταρα στο δεξί πλευρό. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ψηφιακό παχύμετρο (Mitutoyo) με ακρίβεια ± 0,02 χιλιοστά. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε ως 4/3 π μήκος χ πλάτος χ ύψος. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με φυσιολογικό ορό ή sorafenib όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 80 mm

3 κατ ‘όγκο, 32 ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Sorafenib χορηγήθηκε ημερησίως από το στόμα σε δόση 30 mg /kg. Η θεραπεία συνεχίστηκε μέχρι όγκοι αναπτύχθηκαν σε 20 mm (η μέγιστη επιτρεπτή αύξηση από IACUC), στο οποίο σημείο έγινε ευθανασία στους ποντικούς. Ξενομοσχεύματος όγκους που αυξήθηκε λιγότερο από το 50% του αρχικού όγκου του όγκου στην αρχή της θεραπείας θεωρήθηκαν θεραπεία ανταποκρινόμενων, καθώς αυτό έδειξε μια μακροπρόθεσμη τάση προς στάσιν όγκου [22]. Όγκοι που προχώρησε με μια μακροπρόθεσμη τάση προς τη συνεχή ανάπτυξη μετά από μια αρχική ανταπόκριση στη θεραπεία θεωρήθηκαν για να εμφανιστεί αναδυόμενες φαινοτυπική θεραπεία αντίστασης. Σε διάφορα χρονικά σημεία, χρησιμοποιήσαμε οπισθοκογχική παρακέντηση για τη συλλογή περίπου 30 μΐ αίματος σε σωλήνες που περιέχουν EDTA για να καθορίσει τα χρονικά προφίλ των κυκλοφορούντων κυτοκινών και αγγειογόνων παραγόντων. Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν πριν την οπισθοκογχική συλλογής αίματος χρησιμοποιώντας 2% ισοφλουράνιο σε ένα θάλαμο εισπνοής ρυθμίζεται με ένα βαθμονομημένο ψεκαστήρα. Οι ποντικοί παρακολουθούνται καθημερινά και σε ευθανασία μόλις υπήρχαν αποδείξεις ότι το ποντίκι ήταν στον πόνο από τον όγκο ή φάρμακα ή αν το βάρος του όγκου έφθασε 20 mm. Τα πρώτα τελικά σημεία ευθανασίας περιλαμβάνουν μέτρια ή σοβαρή τοξικότητα, συμπεριλαμβανομένων ταχεία απώλεια βάρους μεγαλύτερη από 10% του σωματικού βάρους, σταδιακή απώλεια βάρους μεγαλύτερη από 15%, αδυναμία, μη-ανταπόκρισης, αναπνευστικές δυσκολίες, σοβαρή μη φυσιολογική νευρολογικά συμπτώματα, αιμορραγία, τραύμα ή η αδυναμία να φάει ή να πιει. Μετά από οκτώ εβδομάδες θεραπείας φαρμάκου, όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με τη χρήση CO

2 ασφυξία και υποβάλλονται σε νεκροψία. ιστούς του αίματος και όγκου συλλέχθηκαν για τις αναλύσεις που περιγράφονται παρακάτω. Το πλάσμα απομονώθηκε και αποθηκεύθηκε στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση.

Για την

in vivo

συνδυασμό μελέτη, SKOV-3 ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 30 mg /kg /ημέρα sorafenib μέχρι την εμφάνιση της φαινοτυπική αντίσταση όπως ορίζεται παραπάνω. Sorafenib ανθεκτικά ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες για να λάβουν sorafenib, SB225002, ή συνδυασμός των sorafenib και SB225002. SB225002 χορηγήθηκε μία φορά την ημέρα με ενδοπεριτοναϊκή ένεση (ΙΡ) σε δόση 10 mg /kg. ομάδα θεραπείας συνδυασμού καθημερινή έλαβε μια από του στόματος δόση 30 mg /kg sorafenib συν 10 mg /kg SB225002 (IP) μέχρι το τέλος της μελέτης.

κυτταροκινών και αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων multiplex δοκιμασία

εκτέλεσε ένα multiplex δοκιμασία για τον προσδιορισμό των μεταβολών των επιπέδων κυκλοφορίας αγγειογόνων αυξητικών παραγόντων σε ζώα θεραπεία ευαίσθητα και ανθεκτικά. Οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα του από όγκο και στρώματος /αγγειογενετικές πρωτεΐνες ανάπτυξης ξενιστή που προέρχονται ξεχωριστά προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανθρώπινο (Millipore, cat # HAGP1MAG-12Κ) και ποντικού (Millipore, cat # MAGPMAG-24K) αγγειογένεσης /αυξητικού παράγοντα πάνελ μαγνητικών σφαιριδίων, αντίστοιχα. Ένα σύνολο διαλυτών αγγειογόνων παραγόντων 17 ανθρώπινα και 24 ποντικού προσδιορίστηκαν ποσοτικά. Μια λίστα των ποσοτικοποιημένων αναλυτών παρέχεται στις μεθόδους στήριξης (S1 αρχείου). Τα διαλυτά επίπεδα CXC χημειοκινών CXCL1, 2, 5, και 6 σε δείγματα πλάσματος ποντικού προσδιορίστηκαν μέσω ενός πολυπλέκτη δοκιμασίας (Bio-Rad, cat # 171- AK99MR2).

δοκιμασία αναστολής ανάπτυξης

In vitro

αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης μετρήθηκε μέσω MTS δοκιμασία (Promega). Εν συντομία, 5 χ 10

3 HUVEC ή κύτταρα SKOV-3 σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Προσθέσαμε διάφορες συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0,01 έως 100 μΜ sorafenib ή SB225002 σε 100 μΙ φρέσκου μέσου και επωάζονται τα κύτταρα για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Προσθέσαμε 20 μλ CellTiter 96 υδατική αντιδραστήριο διάλυμα και επωάστηκαν των κυττάρων για 1 ώρα. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm. Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίσθηκε σε σχέση με τους ελέγχους (κύτταρα κατεργασμένα με φορέα μόνο). Μέσοι όροι τριών επαναλήψεων ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση.

Οι συνδυασμένες επιδράσεις του sorafenib και SB225002 προσδιορίστηκαν με τη χρήση διαφόρων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και HUVECs. IC

50 τιμές καθορίστηκαν για τα δύο φάρμακα με κάθε κυτταρική σειρά. Η κορυφή συγκέντρωση του συνδυασμού παρασκευάστηκε με ανάμιξη του sorafenib και SB225002 σε 1: 2 αναλογία του IC τους

50 για τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και 1: 1 αναλογία για HUVECs με βάση την IC τους

50 αξίες. Serial αραίωσης (3χ) διεξήχθη από την κορυφή συγκέντρωση για να ληφθεί ένα σύνολο 5 αραιώσεις (

n

= 3 αντίγραφα). Τα κύτταρα (5000 κύτταρα /φρεάτιο) στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 48 ώρες. Η επιβίωση των κυττάρων μελετήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία MTS όπως περιγράφεται παραπάνω. Η φύση των combinatory επιδράσεων των δύο φαρμάκων προσδιορίστηκε με τον υπολογισμό του δείκτη συνδυασμού (CI) τιμές, η οποία χαρακτηρίζει για συνέργεια (CI & lt? 1), προσθετικότητα (CI = 1), ή ανταγωνισμού (CI & gt? 1), με τη χρήση CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK).

σωλήνα αγγειογένεση δοκιμασία σχηματισμού

αυξητικού παράγοντα-ελαττωμένη Matrigel μήτρα (Corning) αποψύχθηκε στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια κάτω επικαλυμμένο σε ένα 96-φρεατίων πλάκα (50 μΐ ανά φρεάτιο) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, 100 μΙ μέσου που περιείχε HUVECs (10,000 κύτταρα), με ή χωρίς sorafenib και SB225002 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο στην κορυφή της μήτρας στερεοποιείται Matrigel και επωάστηκαν στους 37 ° C για 16 ώρες. Τα φρεάτια σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και δικτύων απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των δικτύων, λογισμικό WimTube χρησιμοποιήθηκε (Wimasis).

Transwell δοκιμασία μετανάστευσης

δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ένθετα 8-μm-πόρου transwell (Corning) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23 ]. Στους κάτω θαλάμους, προστέθηκαν 500 μΙ ενδοθηλιακής μέσο ανάπτυξης. Κλάσματα των 2 × 10

4 HUVECs σε 200 μΙ ενδοθηλιακής βασικού μέσου σπάρθηκαν σε άνω θαλάμους. Τα άνω και κάτω θαλάμους περιείχε sorafenib ή SB225002 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Μετά την δοκιμασία έτρεξε για 24 ώρες στους 37 ° C, μη μεταναστεύσαντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια του φίλτρου χρησιμοποιώντας μπατονέτες. Τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη μεθανόλη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα μετρήθηκαν υπό ένα οπτικό μικροσκόπιο (χ 40).

σφαιροειδές δοκιμασία

SKOV-3 σφαιροειδή κυττάρων αναπτύχθηκαν με τη χρήση της μεθόδου υγρής επικάλυψης [24]. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων αγαρόζη επικαλυμμένα που περιέχει 200 ​​μΙ μέσου (2000 κύτταρα /φρεάτιο). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες μέχρι που σχηματίζεται σφαιροειδή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις sorafenib ή SB225002. Κάθε δεύτερη μέρα, αντικαταστήσαμε 100 μλ παλαιών μέσου με φρέσκο ​​μέσο και τα ναρκωτικά. Τα σφαιροειδή παρακολουθήθηκαν για έως και 10 ημέρες. Τα μεγέθη των σφαιροειδή μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Ανοσοϊστοχημεία

ανοσοϊστοχημεία (IHC) ποσοτικοποίηση των δεδομένων περιγράφεται στις μεθόδους στήριξης ( S1 File). Χρησιμοποιήσαμε αντισώματα ειδικά για CD-31 (Abcam, cat # ab28364) και Ki-67 (Abcam, cat # ab16667) για να προσδιοριστεί η πυκνότητα μικροαγγείων και πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, αντίστοιχα. Μία ολική έκφραση CXCR2 σε κύτταρα όγκου και στρώματος προσδιορίστηκε σε όγκους ξενομοσχεύματος ποντικού χρησιμοποιώντας αντι-CXCR2 αντίσωμα (Abcam, cat # ab14935).

γονιδιακή έκφραση των ELR

+ CXC χημειοκινών

αλληλουχίας μεταγραφικό έγινε με τη χρήση του sequencer Illumina MiSeq και Illumina TruSeq RNA v2 κιτ προετοιμασία του δείγματος και τα πρωτόκολλα (Illumina, Inc.). Η προετοιμασία των δειγμάτων και η κατασκευή της βιβλιοθήκης περιγράφεται στις μεθόδους στήριξης (S1 File).

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) τιμές χρησιμοποιώντας t-test του Student, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο

P

& lt? 0.05. συνδυασμού φαρμάκων δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό CalcuSyn χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μέσου-αποτελέσματος από τους Chou και Talalay [25]. δεδομένα ανοσοϊστοχημεία αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Οι σύντομες μεθοδολογίες που δίνονται στα δεδομένα που υποστηρίζουν. Χρησιμοποιήσαμε το λογισμικό GeneSifter (Geospiza, Inc.) για να αναλύσει τα δεδομένα από τις μελέτες μας της γονιδιακής έκφρασης σε όγκους ξενομοσχεύματος.

Αποτελέσματα

In vivo

φαινοτυπική αντίσταση του όγκου σε αντιαγγειογενετικές θεραπεία

Παρατηρήσαμε αναστολή της ανάπτυξης του όγκου για μέχρι τρεις εβδομάδες θεραπείας με sorafenib (Σχήμα 1Α). Μετά από αυτή την αρχική απόκριση της περιόδου, ορισμένοι όγκοι άρχισαν προχωρά, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση του μεγέθους του όγκου παρά τη συνεχή θεραπεία. Κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας των δύο μηνών, 10 από 19 (53%) ποντικούς ξενομοσχεύματος έδειξε την εξέλιξη του όγκου και regrowth. Κανένας από τους ποντικούς αρρώστησε ή νεκρό πριν από την πειραματική τελικό σημείο. Δεδομένα από χρώση IHC αποκάλυψε την τυπική αντιαγγειογόνο ανθεκτικά υπογραφή σε ιστούς όγκων (Σχήμα 1Β). πυκνότητα όγκου δοχείο (CD-31), και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Ki-67) ήταν σημαντικά υψηλότερα (2-4 φορές,

P

& lt? 0,05) σε όγκους που προχώρησε από την επεξεργασία από ό, τι οι ανταποκρινόμενοι όγκοι (Σχ 1C), γεγονός που υποδηλώνει ότι η προοδευτική όγκοι ήταν σε θέση να επαναλάβουν την αγγειογένεση και έτσι να επανανάπτυξη του όγκου.

Α) SKOV-3 ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για οκτώ εβδομάδες με 30 mg /kg sorafenib μέσω ημερησίως από του στόματος καθετηριασμό. Οι έλεγχοι κατεργάστηκαν με όχημα θεραπεία μόνη της. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα και εκπροσωπούνται ως mm

3 ± SEM. Από 19 ποντικούς, 10 ανέπτυξαν αντοχή στη θεραπεία sorafenib. Μαύρο, κόκκινο και πράσινες γραμμές δείχνουν τις μέσες προόδους όγκο του όγκου ελέγχου, SR, και τα ποντίκια SS, αντίστοιχα. Μια σημαντική διαφορά στο μέγεθος του όγκου (*

P

& lt? 0,05) παρατηρήθηκε μεταξύ των ομάδων θεραπείας ανθεκτικά και ευαίσθητα, εκκινώντας από την εβδομάδα πέντε θεραπείας. SS = sorafenib ευαίσθητη? και SR = sorafenib ανθεκτικά. Β) Εκπρόσωπος ανοσοχρώση για CD-31 (πάνω σειρά), και Ki-67 (κάτω σειρά) στον έλεγχο, sorafenib ευαίσθητα (SS), και sorafenib ανθεκτικά (SR) όγκους. Γ) πυκνότητα σκαφών (CD-31) και δείκτη πολλαπλασιασμού (Ki-67) ήταν σημαντικά αυξημένα σε sorafenib ανθεκτικά όγκους σε σύγκριση με τα ευαίσθητα sorafenib όγκων.

Η

Δυναμική αλλαγές των κυκλοφορούντων αγγειογόνων παραγόντων σε απόκριση με αντι-VEGF θεραπεία

για να προσδιοριστούν οι αλλαγές στα εκκρινόμενη αγγειογενετική και κυτοκινών σηματοδότησης, συγκρίναμε κυκλοφορούν συγκεντρώσεις αγγειογενετική παράγοντα σε δείγματα πλάσματος που λαμβάνονται από ποντίκια θεραπεία ευαίσθητα και ανθεκτικά. Τα δείγματα ελήφθησαν κατά τη διάρκεια των αποκρίνεται (2-3 εβδομάδες μετά την αγωγή) και πυρίμαχων φάσεις (6-8 εβδομάδες μετά τη θεραπεία). Επειδή αγγειακού συστήματος του όγκου σε ξενομοσχεύματα σχηματίζεται από ενδοθηλιακά ποντικού προγονικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε multiplex αγγειογενετική πάνελ για τις δύο ποντίκια και ανθρώπους, να διακρίνει την προέλευση.

Κατά τη διάρκεια των τριών πρώτων εβδομάδων της θεραπείας, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των Οι συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών αγγειογόνου σε καμία ομάδα (Σχήμα 2Α). Όταν φαινοτυπική αντοχή προέκυψε 6-8 εβδομάδες μετά τη θεραπεία, αγγειογενετική διαφορές παράγοντας ήταν εμφανείς μεταξύ των ομάδων. Διάφοροι αγγειογόνοι παράγοντες ποντικού-προήλθε, συμπεριλαμβανομένων του αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGF) -2, αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF), KC, και η προλακτίνη, οι προς τα πάνω ρυθμισμένη στο sorafenib ανθεκτική ομάδα, αλλά όχι στο sorafenib ευαίσθητη ομάδα (σχήμα 2Α) . Κατά τη διάρκεια της φάσης πυρίμαχο, με όγκο που εκκρίνεται CXCL8 (IL-8) τα επίπεδα αυξήθηκαν & gt? 4 πτυχώσεις (

P

& lt? 0,05). Στο sorafenib ανθεκτικά όγκους

Α) Διπλώστε τις αλλαγές στα κυκλοφορούντα αγγειογενετικών παραγόντων μεταξύ ανθεκτική στη θεραπεία και ευαίσθητες ομάδες κατά τη διάρκεια της απόκρισης (2-3 εβδομάδα) και ανθεκτικά (6-8 εβδομάδες) φάσεις σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με sorafenib. Τόσο ποντικού (στρώμα) και ανθρώπου (κύτταρο όγκου) διαλυτό αγγειογόνοι παράγοντες ποσοτικοποιήθηκαν με multiplex δοκιμασίας. Μόνο αγγειογόνοι παράγοντες που ανιχνεύθηκαν τόσο από ποντικού και ανθρώπου συστοιχίες παριστάνεται ως Log

2 φορές αλλαγές της θεραπείας ανθεκτικοί έναντι της θεραπείας ευαίσθητα ξενομοσχεύματα. Σημαντική (

P

& lt? 0,05) Οι αλλαγές μεταξύ ανταποκρίνεται και ανθεκτική φάσεις υποδεικνύονται με αστερίσκο (*). Β) Χρόνος που εξαρτώνται από τη σύγκριση του πλάσματος IL-8 συγκέντρωση (pg /ml ± S.D.) μεταξύ ανθεκτικούς στη θεραπεία (SR) και ευαίσθητα (SS) ομάδες ποντικών που έλαβαν θεραπεία με sorafenib. προφίλ χρόνου της IL-8 στο πλάσμα ήταν σύμφωνα με την εξέλιξη του όγκου των φαινοτυπικών-ανθεκτικό και ευαίσθητη όγκων. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, το πλάσμα συλλέχθηκε κάθε εβδομάδα με την μέθοδο κλιμακωτή δειγματοληψία, και IL-8 επίπεδα μετρήθηκαν με multiplex δοκιμασίας. Γ) ανάλυση της αλληλουχίας των Illumina του ανθρώπου και του ποντικού ELR

+

CXC

γονιδίων χημειοκινών έκφρασης. Ανθρώπινα ELR

+

CXC

ανάλυση γονιδιακής έκφρασης χημειοκινών έδειξε ότι

CXCL6

έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ανθεκτική ομάδα (2,5 φορές υψηλότερες,

P

& lt? 0,05) σε σχέση με την ευαίσθητη ομάδα. Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ sorafenib-ευαίσθητα και ανθεκτικά ομάδες για CXCL1, 2, 3, 4, 5, και 7 επίπεδα έκφρασης. Ποντίκι ELR

+

CXC

ανάλυση γονιδιακής έκφρασης χημειοκινών έδειξε ότι όλα τα ενδεικνυόμενα κυτοκίνες, εκτός από

Cxcl2

, ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ανθεκτικούς ομάδες (& gt? 2 πτυχώσεις,

P

& lt? 0,05) από τις ευαίσθητες ομάδες. SS = sorafenib ευαίσθητη? και SR = sorafenib ανθεκτικά. Οι συγκεντρώσεις D) CXC χημειοκίνη πλάσματος (pg /ml) σε SKOV-3 ποντικούς ξενομοσχεύματος. CXCL1, CXCL2 και CXCL6 επίπεδα ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0,05). Υψηλότερο σε sorafenib ανθεκτικά ομάδες σε σχέση με το sorafenib ευαίσθητες ομάδες

Η

Επίσης, ποσοτικά επίπεδα IL-8 την εβδομάδα για έως και οκτώ εβδομάδες θεραπείας με sorafenib. Για έως και 4 εβδομάδες χορήγησης sorafenib βρήκαμε σημαντικές διαφορές στην παραγωγή IL-8 επίπεδο μεταξύ των ομάδων θεραπείας ευαίσθητα και ανθεκτικά (Σχήμα 2Β). Αρχίζοντας από την εβδομάδα πέντε, σημαντικά αυξημένη (

P

& lt? 0,05) τα επίπεδα της IL-8 παρατηρήθηκαν σε sorafenib ανθεκτικά όγκους. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η IL-8 επίπεδα αλλάξει δυναμικά την πάροδο του χρόνου, που συμπίπτει με το προφίλ του χρόνου εξέλιξης του όγκου. Εκτός από την IL-8, τα στοιχεία από τη μελέτη γονιδιακής έκφρασης μας (Σχήμα 2C) και κυτοκίνης multiplex δοκιμασία (Σχήμα 2D) έδειξαν ότι η έκφραση άλλων ELR

+ CXC χημειοκίνες (π.χ., CXCL1, -2, -5, και – 6) ήταν υψηλή σε όγκους ανθεκτικούς στη θεραπεία, σε σύγκριση με τους ομολόγους τους.

έκφραση CXCR2 σε όγκους των ωοθηκών

Πραγματοποιήσαμε χρώση CXCR2 σε όγκους ξενομοσχεύματος θεραπειών sorafenib να συγκρίνει την έκφραση του (σχήμα 3Α) στην ευαίσθητη και στην ανθεκτική ομάδες. έκφραση CXCR2 ανυψώθηκε σε ανθεκτικά όγκους σε σύγκριση με το ευαίσθητο και τον έλεγχο των όγκων. Παρατηρήσαμε μια τριπλάσια αύξηση σε ανθεκτικούς όγκους σε σύγκριση με το ευαίσθητο όγκους (

P

& lt? 0.05, Σχήμα 3Β). Στην ομάδα θεραπείας με sorafenib

Α) Εκπρόσωπος ανοσοχρώση για CXCR2 σε έλεγχο, sorafenib- ευαίσθητα (SS), και sorafenib ανθεκτικά (SR) όγκων. Β) έκφραση CXCR2 ανυψώθηκε σε sorafenib ανθεκτικά όγκους (

P

& lt?. 0,05) σε σύγκριση με το sorafenib ευαίσθητα όγκους

Η

In vitro

συνεργιστικά αποτελέσματα της sorafenib και SB225002

με βάση τις ανωτέρω διαπιστώσεις της προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης CXCR2 και πολλαπλές ELR

+ CXC προαγγειογόνος κυτοκίνες που μεσολαβούν αγγειογενετική δράση τους μέσω CXCR2 υποδοχέα, ερευνήσαμε CXCR2 μεσολάβηση αποτελέσματα κυτοκινών χρησιμοποιώντας SB225002, ένα μικρό αναστολέα μόριο του υποδοχέα χημειοκίνης CXCR2 (IL-8R), σε συνδυασμό με το sorafenib

in vitro

. Εμείς επιλέξαμε αναστολείς CXCR2 υποδοχέα πάνω αντισώματα χημειοκινών αντι-CXC να αποφευχθεί η περιττή λειτουργία του ELR

+ CXC σηματοδότησης χημειοκινών. Ο συνδυασμός του sorafenib και SB225002 παράγονται σημαντικά υψηλότερη αναστολή της ανάπτυξης (

P

& lt? 0.005) σε καρκινικά κύτταρα και HUVECs από ό, τι είτε θεραπεία μόνο (Σχ 4Α και 4Β). Οι τιμές CI σε διαφορετικές αναλογίες συγκέντρωσης στο SKOV-3 (0,32 – 0,61) και HUVECs (0,87 έως 1,1) έδειξε τη συνέργεια ή την προσθετικότητα μεταξύ SB225002 και sorafenib. IC είναι

50 τιμές του sorafenib και SB225002 στις δοκιμαζόμενες κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών και HUVECs που προβλέπονται στα στοιχεία στήριξης (S1 πίνακα). Οι καμπύλες συγκέντρωσης-αποτελέσματος της θεραπείας συνδυασμού σε σύγκριση με μόνη sorafenib φαίνεται στο S1 Σχ.

SB225002 ενισχυθεί σημαντικά τα αποτελέσματα αναστολής της ανάπτυξης του sorafenib στην SKOV-3 (Α) και τα κύτταρα HUVEC (Β). Α) Ένας συνδυασμός 10 μΜ sorafenib και 4 μΜ SB225002 ανέστειλε συνεργικά την ανάπτυξη των κυττάρων SKOV-3, σε σύγκριση με κάθε φάρμακο μόνο (

P

& lt? 0.005). Β) Ένας συνδυασμός 4 μΜ sorafenib και 2 μΜ SB225002 ανέστειλε συνεργικά την ανάπτυξη των κυττάρων HUVEC, σε σύγκριση με κάθε φάρμακο μόνο (

P

& lt? 0,01). Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες σχηματισμού σωλήνος προσδιορισμού του HUVECs σε επεξεργασία με ή χωρίς 1 μΜ SB225002 ή 2 μΜ sorafenib. Ο σχηματισμός σωλήνα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης Wimtube και μήκος σωλήνα παρουσιάζονται σε εικονοστοιχεία. Εκτός των SB225002 να sorafenib θεραπεία προκάλεσε μια στατιστικά σημαντική μείωση στο σχηματισμό σωλήνα HUVECs (

P

& lt? 0.005). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο μήκος του σωλήνα σε pixels ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Δ) Εκπρόσωπος εικόνες της δοκιμασίας μετανάστευσης HUVECs χρησιμοποιώντας transwell θάλαμο. Για την ποσοτικοποίηση των μεταναστευτικών κυττάρων, τρία ανεξάρτητα πεδία των μεταναστευτικών κυττάρων ανά φρεάτιο φωτογραφήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Ο αριθμός των κυττάρων ανά πεδίο μετρήθηκε και ο μέσος όρος. Οι αριθμοί κυττάρων εκφράζονται ως σχετικός αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν προς κατώτερη πλευρά του θαλάμου transwell με τα αποτελέσματα από τα κύτταρα ελέγχου δίνεται ως 1. Η ανασταλτική επίδραση του sorafenib (2 μΜ) για τη μετανάστευση ήταν σημαντικά αυξημένη κατά 1 μΜ SB225002 (

P

& lt? 0,01). Ε) Η αύξηση Σφαιροειδής βλάπτεται από την αναστολή CXCR2 σε SKOV-3 κύτταρα. Σφαιροειδείς τομείς μετρήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού ImageJ. Οι τιμές εκπροσωπούνται στον άξονα y είναι pixels ± Τ.Α. από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Η ενδοθηλιακή σχηματισμό σωλήνα και η μετανάστευση αποτελούν σημαντικά χαρακτηριστικά της αγγειογένεσης του όγκου. Πραγματοποιήσαμε φρεατίων δοκιμασίες μετανάστευσης θάλαμο και δοκιμασίες σχηματισμού σωλήνα matrigel με βάση χρησιμοποιώντας HUVECs για την αξιολόγηση της αντιαγγειογενετικές δυναμικό του sorafenib και SB225002 σε συνδυασμό. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Γ, το sorafenib (2 μΜ) και SB225002 (1 μΜ) θεραπεία συνδυασμού σχεδόν πλήρως καταστέλλεται σχηματισμός σωλήνα HUVEC. Ο συνδυασμός του sorafenib και SB225002 ανέστειλε σημαντικά το μήκος του ενδοθηλίου σωλήνα σε σύγκριση με το sorafenib (≥ 2 φορές,

P

& lt? 0.005) ή SB225002 (≥ 3 φορές,

P

& lt? 0.005) μόνο. Επιπλέον, τα αποτελέσματα από την δοκιμασία μετανάστευσης transwell απέδειξαν ότι SB225002 ενίσχυσε σημαντικά την sorafenib μεσολάβηση αναστολή της ενδοθηλιακής μετανάστευσης (Εικ 4D). Ο συνδυασμός αυτός προκάλεσε περίπου διπλάσια μείωση των HUVECs μετανάστευσης σε σύγκριση με το sorafenib και SB225002 θεραπείες μόνο (

P

& lt? 0,01). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η θεραπεία συνδυασμού του sorafenib και SB225002 θα μπορούσαν να επηρεάσουν σημαντικά την αγγειογενετική δυναμικό της HUVECs

in vitro

.

Από την IL-8 παίζει ένα ρόλο στη συσσώρευση των κυττάρων του όγκου, πραγματοποιήσαμε μια σφαιροειδές δοκιμασία για να μελετήσει τα αποτελέσματα της sorafenib και SB225002 σε σφαιροειδές ανάπτυξης. SB225002 διαταραχθεί σχηματισμό SKOV-3 σφαιρίδια σε συγκέντρωση 2 μΜ: sorafenib δεν το έκανε (σχήμα 4Ε). Ένας συνδυασμός του sorafenib και SB225002 μείωσε την ανάπτυξη των σφαιριδίων (Σχήμα 4Ε).

SB225002 και sorafenib συνδυαστική θεραπεία σε ποντίκια ξενομόσχευμα sorafenib ανθεκτικά

αξιολογηθούν περαιτέρω τα αποτελέσματα της συνδυασμένης θεραπείας σε sorafenib- ανθεκτικά μοσχευμάτων όγκων

in vivo

. Έχουμε ποντίκια που έλαβαν αγωγή με sorafenib μέχρι τους όγκους ξενομοσχεύματος αναπτύξει αντίσταση. Μετά από 46 ημέρες θεραπείας sorafenib, ποντίκια με sorafenib ανθεκτικά όγκους έλαβαν sorafenib, SB225002, ή ένα συνδυασμό των δύο φαρμάκων. Οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με sorafenib μόνος προχώρησε, αλλά το έκανε πιο αργά από ό, τι οι όγκοι ελέγχου (Σχήμα 5). Η πρόοδος του όγκου κατεστάλη σημαντικά όταν SB225002 προστέθηκε σε sorafenib (Σχήμα 5). Στο τέλος της θεραπείας, οι όγκοι από ποντικούς που έλαβαν την θεραπεία συνδυασμού ήταν 42% μικρότερο σε όγκο από τους όγκους από ποντικούς που έλαβαν μόνο sorafenib. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με SB225002 μόνο δεν αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου που προχώρησε από sorafenib θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει την ανάγκη για συνεχή παρεμπόδιση της VEGF μονοπατιού σηματοδότησης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η συνδυασμένη αναστολή CXCR2 με sorafenib ανακουφίζεται αποτελεσματικά την εξέλιξη του όγκου και με τον όρο επεκταθεί θεραπευτικό όφελος.

SKOV-3 ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μία ημερήσια δόση των 30 mg /kg sorafenib μέχρι όγκοι αναπτύχθηκαν φαινοτυπική αντίσταση στη θεραπεία (~ 46 ημέρες). Τα ποντίκια με όγκους ανθεκτικά στη συνέχεια τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες για να λάβουν ένα από τα ακόλουθα: 30 mg /kg sorafenib μόνο (

n

= 6), 10 mg /kg SB225002 μόνο (

n = 6

), ή sorafenib συν SB225002 (

n

= 6). Το βέλος υποδεικνύει την έναρξη της θεραπείας κατά την ημέρα 46. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε στους υποδεικνυόμενους χρόνους και παρουσιάζεται ως μέση ± δ.ϋ. Ο συνδυασμός sorafenib και SB225002 οδήγησε σε μείωση 42% στην αύξηση του όγκου σε σύγκριση μόνο με sorafenib (

P

& lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Η αγγειογένεση παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών. Ωοθηκών όγκοι είναι πλούσια αγγειωμένοι, και ένας υψηλός βαθμός της αγγειογένεσης του όγκου σε όγκους των ωοθηκών προβλέπει κακή κλινική έκβαση [1, 2, 26]. Ωοθηκών όγκοι υπερεκφράζουν προ-αγγειογόνος παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων VEGFs, FGFs, αγγειοποιητίνη, προερχόμενο από αιμοπετάλια παράγοντες ανάπτυξης (PDGFs), και αρκετές προ-αγγειογενετική κυτταροκίνες [10]. Μέχρι σήμερα, έχουν ενθαρρυντικά αποτελέσματα έχουν ληφθεί με δοκιμές καρκίνου των ωοθηκών που ενσωματώνουν αναστολείς VEGF-μονοπάτι, το θεραπευτικό μπεβασιζουμάμπη αντίσωμα, και μικρού μορίου αναστολείς κινάσης τυροσίνης υποδοχέα (ΤΚΙδ) [27]. Η προσθήκη bevacizumab στη χημειοθεραπεία μείωσε τον κίνδυνο νόσου επιδείνωση ή /και θάνατο κατά 62% σε σύγκριση με τη χημειοθεραπεία μόνη της [8, 28]. Η διαπίστωση αυτή οδήγησε στην πρόσφατη έγκριση FDA της bevacizumab σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία σε υποτροπή της νόσου.