Αφηρημένο

Η κακή πρόγνωση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) που συνδέονται με την καθυστερημένη διάγνωση απαιτεί την ανάπτυξη συστημάτων έγκαιρης διάγνωσης βιοδεικτών. Έχουμε οριοθετείται στο παρελθόν το τοπίο της μεθυλίωσης του DNA σε ασθενείς HCC διαλεύκανση τη σημασία της υπομεθυλίωσης υποστηρικτής στην ενεργοποίηση των καρκινογόνες και γονιδίων μετάσταση οδήγησης. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να ελεγχθεί η σκοπιμότητα που γονίδια που μεθυλιωμένος εις HCC θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως υποψήφιος διαγνωστικοί δείκτες. Χρησιμοποιούμε ανάλυση τήξης υψηλής ανάλυσης (HRM) ως απλή μεταφράσιμη μέθοδος βασίζεται σε PCR για τον ορισμό μελών μεθυλίωσης σε κλινικά δείγματα. Δοκιμάσαμε επτά περιοχές που επιλέγονται από την λίστα των γονιδίων μεθυλιωμένος σε HCC και έδειξε ότι η ανάλυση HRM αρκετών από τους διακρίνει κρατών μεθυλίωση στο ήπαρ δείγματα καρκίνου από την κανονική δίπλα του ήπατος και χρόνιας ηπατίτιδας στην περιοχή της Σαγκάης. Τέτοιες περιοχές εντοπίστηκαν μέσα σε υποστηρικτές της νευρωνικής γλυκοπρωτεΐνη μεμβράνης M6-Β (GPM6B) και η οικογένειά του αντιγόνου μελανώματος Α12 (MAGEA12) γονίδια. Οι διαφορές στη διαχείριση των ανθρώπινων πόρων στην ανοσοσφαιρίνη υπεροικογένειας Fc υποδοχέα (FCRL1) διαχωρίζεται επεμβατικές όγκους από λιγότερο επεμβατική HCC. Οι εντοπίστηκαν βιοδείκτες διαφοροποιούνται HCC από χρόνια ηπατίτιδα σε ένα άλλο σύνολο δειγμάτων από Ντάκα. Αν και η κύρια ώθηση στη διαγνωστική μεθυλίωση του DNA στον καρκίνο είναι υπερμεθυλιωμένων γονιδίων, η μελέτη μας για πρώτη φορά περιγράφει την πιθανή χρήση των υπο-μεθυλιωμένα γονίδια ως δείκτες για συμπαγείς όγκους. Μετά από περαιτέρω επικύρωση σε μια μεγαλύτερη ομάδα, η εντοπιστεί DNA μεθυλιωμένος περιοχές μπορεί να γίνει σημαντικό υποψήφιο βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου του ήπατος και της πρόγνωσης, ιδιαίτερα σε πληθυσμούς με υψηλό κίνδυνο για την ανάπτυξη HCC

Παράθεση:. Stefanska Β, Bouzelmat Α, Χουάνγκ J, Suderman Μ, Hallett Μ, Han ZG, et al. (2013) Ανακάλυψη και Επικύρωση του DNA υπομεθυλίωσης βιοδείκτες για καρκίνο του ήπατος Χρησιμοποιώντας HRM-ειδικούς ανιχνευτές. PLoS ONE 8 (8): e68439. doi: 10.1371 /journal.pone.0068439

Συντάκτης: William B. Coleman, του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας Σχολή Ιατρικής, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Μαρτίου 2013? Αποδεκτές: 29η Μάη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 7, Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Stefanska et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Ministere du Developpement Economique, de l’Innovation et de l’Εξαγωγή πρόγραμμα (MDEIE) της κυβέρνησης του Κεμπέκ (Νο 215004, με το MS), το καναδικό Ινστιτούτο Έρευνας Υγείας (Αρ MOP-42411, σε MS) και το Διεθνές Κέντρο για διαρροϊκές Νοσημάτων Έρευνας, το Μπαγκλαντές (icddr, β). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

εκτροπές σε επιγενετικές τροποποιήσεις, ιδιαίτερα στα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA, έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου σε πολλές μελέτες των τελευταίων δεκαετιών [1], [2], [3]. Η υπερμεθυλίωση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων που συνδέονται με την μεταγραφική αποσιώπηση, η παγκόσμια απομεθυλίωση DNA συνδέονται με αναδιατάξεις του γονιδιώματος και την αστάθεια, και αναφέρθηκε πρόσφατα υπομεθυλίωση προαγωγό που συνδέεται με την ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και prometastatic γονίδια είναι χαρακτηριστικά της σχεδόν όλων των τύπων καρκίνου [2], [3], [ ,,,0],4], [5]. DNA υπερμεθυλίωση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων έχει αποδειχθεί ότι έχουν διαγνωστική δυναμικό σε αρκετούς καρκίνους [6], [7], [8], ωστόσο πρόσφατες ξήλωμα μας του ευρέος πεδίου εφαρμογής της υπομεθυλίωσης σε καρκίνο του ήπατος πρότεινε ότι το δυναμικό βιοδείκτες θα μπορούσαν να βρεθούν σε υπο-μεθυλιωμένα γονίδια που διαδραματίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην οδήγηση του καρκίνου και του καρκίνου της μετάστασης [4]. Εντοπισμό αξιόπιστων βιοδεικτών του HCC έχει ιδιαίτερη σημασία δεδομένου ότι η καθυστερημένη έναρξη των κλινικών συμπτωμάτων ευθύνεται για την καθυστερημένη διάγνωση και υψηλό ποσοστό θνησιμότητας. Εκτιμάται ότι η έγκαιρη διάγνωση του HCC αυξάνει το ποσοστό ίασης από 5% έως 80% [9].

Έχουμε χρησιμοποιήσει προηγουμένως μια προσέγγιση γονιδίωμα-ευρεία ώστε να οριοθετηθούν προφίλ μεθυλίωσης υποκινητή DNA σε όγκους HCC και αποκάλυψε σχεδόν 2.000 γονίδια των οποίων η υποκινητές ήσαν υπο-μεθυλιωμένα σε όγκους σε σύγκριση με συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό [4]. Τα γονίδια αυτά εμπλέκονται σε βιολογικές διεργασίες και οδούς ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη του καρκίνου και την εισβολή, η οποία επισημαίνει ένα σημαντικό λειτουργικό ρόλο των παρατηρούμενων αλλαγών. Υπομεθυλίωση παρατηρήθηκε σε αρκετές οικογένειες γονιδίων σε όλη χρωμοσώματα. Το ερώτημα αυτό ανέκυψε κατά πόσον θα σηματοδοτήσει ειδικά όγκους και διαφοροποιούν τα δείγματα όγκων από τους υγιείς ιστούς. Σε προηγούμενη εργασία μας, εστιάσαμε στην σύγκριση μεταξύ των διαφορών στις μέσες μεθυλίωση του DNA σε ολόκληρο το προαγωγό και αντι-συσχετισμένης αλλαγές στην έκφραση γονιδίων. Αναλύσαμε διεξοδικά 230 γονίδια που ήσαν υπο-μεθυλιωμένα και προκλήθηκε σε όγκους HCC. Η πλειοψηφία αυτών των γονιδίων έπεσε σε μια κατηγορία των δικαιούχων με υψηλή περιεκτικότητα σε CpG. Στην παρούσα μελέτη για τους βιοδείκτες υπομεθυλίωσης DNA για τον καρκίνο του ήπατος, επιλέξαμε πρώτα γονίδια που είχαν βαριά μεθυλιωμένος εις τα δείγματα HCC σε σύγκριση με συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (≥2 φορές αλλαγή στη μεθυλίωση προαγωγού με βάση την ανάλυση μικροσυστοιχίας,

P

& lt? 10E-4). Αυτή η ομάδα των γονιδίων στη συνέχεια σαρώθηκε για τα πλέον σταθερά μεθυλιωμένος ανιχνευτή (περιοχή 200-400 bp, ≥1.5 φορές αλλαγή,

P

& lt? 10Ε-3) κατά μήκος των ασθενών, όπως καθορίζεται από την ανάλυση μικροσυστοιχίας. Προκειμένου να αυξηθεί η λειτουργική συνάφεια των πιθανών βιοδεικτών, που στη συνέχεια περιορίζεται σε αυτή τη λίστα σε 47 γονίδια που προκλήθηκαν σε όγκους HCC, όπως μετράται με συστοιχίες Affymetrix (≥1.5 φορές αλλαγή,

P

& lt? 0.05, Πίνακας S1 ). Λαμβάνοντας υπόψη τις αλλαγές στη μεθυλίωση προαγωγού, έκφραση, και την έκταση της απομεθυλίωσης των ειδικών ανιχνευτών, έχουμε επιλέξει επτά γονίδια που έδειξαν την υψηλότερη υπομεθυλίωση υποκινητή, τις περισσότερες υπο-μεθυλιωμένα ανιχνευτές σε όλη τους ασθενείς και υψηλή επαγωγή της έκφρασης. Επιπλέον, περιορίσαμε τη λίστα με τα γονίδια με καρκίνο που σχετίζονται με λειτουργίες που βασίζονται σε δημόσια διαθέσιμες σύνολα δεδομένων, όπως περιγράφεται παρακάτω. επιλέχθηκαν οι επτά υπο-μεθυλιωμένα γονίδια που παρατίθενται στον Πίνακα 1 για τον εντοπισμό και τη βελτιστοποίηση των ειδικών ανιχνευτών του οποίου η μεθυλίωση απόκλιση θα διακρίνει όγκους από φυσιολογικούς ιστούς χρησιμοποιώντας High Resolution Melting ανάλυση (HRM). Η ανάλυση HRM είναι μια απλή μέθοδος που βασίζεται σε PCR μετασχηματίζεται εύκολα στο κλινικό περιβάλλον για την ανίχνευση των διαφορών στα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA [10]. Αυτή η μέθοδος απαιτεί θεραπεία του DNA με όξινο θειώδες, που μετατρέπει τα υπολείμματα κυτοσίνης σε ουρακίλη αφήνει κατάλοιπα 5-μεθυλκυτοσίνη ανεπηρέαστη. Μετά την ενίσχυση, αυτό οδηγεί σε αλλαγές στην αλληλουχία του DNA, όπου η ουρακίλη μετατρέπεται σε θυμιδίνη και 5-methylcytosines παραμένουν ως κυτοσίνες. Μη μεθυλιωμένα amplicon DNA που περιέχει θυμιδίνης αντί κυτοσίνη εντός των αλληλουχιών CpG εμφανίζει διαφορετικές ιδιότητες τήξης από μεθυλιωμένο DNA. Μετά αστάρι βελτιστοποίησης, τρεις ανιχνευτές που αντιστοιχούν σε τρία γονίδια

νευρωνικής μεμβράνης ΓΛΥΚΟΠΡΩΤΕΪΝΗ M6-Β

(

GPM6B

),

αντιγόνα μελανώματος FAMILY A 12

(

MAGEA12

), και

υπεροικογένειας ανοσοσφαιρίνης υποδοχέα Fc

(

FCRL1

), βρέθηκαν να διαφοροποιηθούν HCC από παρακείμενο φυσιολογικό ιστό και /ή επεμβατικές όγκους από μη επεμβατικές όγκους σε ένα κινεζικό σύνολο δειγμάτων ως καθώς και HCC από χρόνια λοίμωξη από ηπατίτιδα Β (CHB) σε δείγματα από το Μπαγκλαντές.

GPM6B

εμπλέκεται στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος και τη ρύθμιση του σχηματισμού των οστών [11], [12]. Η έκφραση αυτού του γονιδίου φαίνεται στο γονιδίωμα ευρεία μεταγραφικό προφίλ για να χρησιμεύσει ως προγνωστικός των όγκων του εγκεφάλου [13], [14] και λεμφοειδών λευχαιμιών [15]. Υψηλή έκφραση του

MAGEA12

, μέλος της ογκογόνων

MAGE

οικογένειας, φάνηκε να σχετίζεται με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [16], το μελάνωμα [17], ο καρκίνος του μαστού [18] και από του στόματος πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα [19].

FCRL1

είναι μία πρωτεΐνη μεμβράνης κυτταρικής επιφάνειας προτίμηση εκφράζεται σε Β κύτταρα που ρυθμίζουν ενεργοποίηση και διαφοροποίηση Β κυττάρων [20]. Υψηλή έκφραση αυτού του γονιδίου παρατηρήθηκε σε μεταστατικά μελανώματα [21] και σε διαφορετικούς τύπους λευχαιμιών [20]. Κανένα από αυτά τα γονίδια ή την κατάσταση της μεθυλίωσης είχε προηγουμένως συνδέονται με HCC.

MAGEA12

παρουσιάστηκε πριν να κατασταλεί σε φυσιολογικά κύτταρα με μεθυλίωση προαγωγού και ενεργοποιείται σε καρκινικά κύτταρα από απομεθυλίωση [22], [23], ενώ ο ρόλος του

GPM6B

και

FCRL1

μεθυλίωση στη δραστηριότητα υποκινητή δεν είχε προηγουμένως δοκιμαστεί. παρούσα μελέτη μας επικυρώνει για πρώτη φορά η υπερέκφραση του

GPM6B

,

MAGEA12

και

FCRL1

σε ασθενείς HCC σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό και ερευνά μεθυλίωσης του DNA μέσα σε υποστηρικτές τους ως ενδεχόμενοι διαγνωστικός δείκτης καρκίνου του ήπατος. Από την πρώιμη διάγνωση του HCC αυξάνει το ποσοστό ίασης και της επιβίωσης, οι προσδιορίζονται επιγενετικές υποψήφια βιοδείκτες θα μπορούσαν να έχουν επιπτώσεις στην έκβαση της θεραπείας του καρκίνου του ήπατος μετά την επικύρωση σε μια μεγαλύτερη ομάδα.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση, και η επιτροπή δεοντολογίας από ενδιαφερόμενους φορείς (κινεζική Γονιδιώματος Εθνικό Κέντρο Ανθρωπίνων στη Σαγκάη, Κίνα και Bangabandhu Σέιχ Mujib Ιατρικό Πανεπιστήμιο (BSMMU), Ντάκα, στο Μπαγκλαντές) ενέκρινε τη μελέτη .

ασθενείς και δείγματα ιστών

καρκινικά και φυσιολογικά γειτονικά δείγματα ιστού ελήφθησαν από 12 ασθενείς με HCC και 1 ασθενής με φλεγμονώδη ψευδοόγκο (ασθενής έλεγχο) στην κινεζική Εθνική Ανθρώπινου Γονιδιώματος Κέντρο στη Σαγκάη, Κίνα (Dr. Ze-Guang Han) (Πίνακας 2). Μπαγκλαντές ομάδα αποτελούνταν από 4 ασθενείς HCC και 4 ασθενείς με ΧΗΒ με Bangabandhu Σέιχ Mujib Ιατρικό Πανεπιστήμιο (BSMMU), Ντάκα, στο Μπαγκλαντές (Πίνακας 2). Τα δείγματα HCC ελήφθησαν σε υπερηχογράφημα καθοδηγείται λεπτή βελόνα αναρρόφησης, ενώ τα δείγματα CHB ελήφθησαν σε ανά-δερματική βιοψία ήπατος χρησιμοποιώντας Tru-cut βιοψία με βελόνα. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε τοπική αναισθησία.

Η

απομόνωση DNA και κατεργασία οξίνου θειώδους του DNA

DNA από καρκινικό, κανονικός γειτονικός και CHB δείγματα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας τη συνήθη τεχνική εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου. Μετατροπή διθειώδους διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [24]. Εν συντομία, 2 μα DNA έγινε γραμμικό με EcoRI και επωάστηκαν για 3 ώρες στους 37 ° C που ακολουθείται από καθαρισμό χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού Quick Clean PCR (GenScript) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το καθαρισμένο DNA κατόπιν μετουσιώθηκε με 3Μ NaOH και επωάζονται για 15 λεπτά στους 37 ° C. Πρόσφατα παρασκευασμένη 3,6Μ νάτριο όξινο θειώδες /1 μίγμα υδροκινόνη mM (ρΗ 5,0) προστέθηκε σε μετουσιωμένο DNA και επωάστηκαν για 2 λεπτά στους 95 ° C και στη συνέχεια 8 ώρες στους 55 ° C που ακολουθείται από 2 λεπτά στους 95 ° C και 2 ώρες στους 55 ΝΤΟ. Τα δείγματα DNA ήσαν τότε αφαλατώνεται και καθαρίζεται (Purification Kit Γρήγορη Clean PCR, GenScript). Το καθαρισμένο DNA πάλι μετουσιώθηκε με 3Μ NaOH και επωάζονται για 15 λεπτά στους 37 ° C. Το διάλυμα εξουδετερώθηκε με προσθήκη οξικού αμμωνίου σε τελική συγκέντρωση 10Μ και το DNA καταβυθίστηκε με 95% αιθανόλη και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 50 μΙ αποσταγμένου νερού.

PCR ενίσχυση του μετατραπέντος με όξινο θειώδες DNA

αντιδράσεις ενίσχυσης περιείχε 25 μg του κατεργασμένου με όξινο θειώδες ϋΝΑ γονιδιώματος 0,4 μΜ εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές παρατίθενται στον πίνακα S2, 10 μΙ 10 × Light Cycler 480 SybrGreen I κύριο (Roche) σε τελικό όγκο 20 μΙ. Διεξήχθη ενίσχυση σε θερμοκυκλοποιητή χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες: μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, ενίσχυση για 40 κύκλους στους 95 ° C για 1 λεπτό, θερμοκρασία ανόπτησης για 2 λεπτά 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 1 λεπτό, και τελική επέκταση στους 72 ° C για 5 λεπτά. Όπως φαίνεται στον Πίνακα S2, εκτός και ένθετα σύνολα εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για αρκετούς ανιχνευτές προκειμένου να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης. Το ενισχυμένο DNA ακολούθως υποβάλλεται σε υψηλή ανάλυση τήξης (HRM).

ανάλυση τήξης υψηλής ανάλυσης (HRM)

Το ενισχυμένο DNA μεταφέρθηκε στο Φως Cycler 480 QPCR μέσο (Roche) που επιτρέπει HRM. Τα δείγματα θερμάνθηκαν σταδιακά από 40 ° C για 1 λεπτό στους 60 ° C για 15 s και τελικά το DNA τήχθηκε στους 95 ° C για 15 s. Η τήξη του προϊόντος PCR επάγει μία μείωση στο φθορισμό του SybrGreen αφού SybrGreen ως χρωστική παρεμβολής DNA απελευθερώνεται από δίκλωνο DNA μετά διαστάσεως. Το σήμα φθορισμού που αποκτήθηκαν κατά τη φάση της τήξης και αναλύονται από το λογισμικό Light Cycler 480. Η θερμοκρασία μιας κορυφής τήξης του DNA amplicon ορίζεται από το μέσον της φάσης τήγματος στο οποίο ο ρυθμός των αλλαγών του φθορισμού είναι η μεγαλύτερη. Αυτό το σημείο τήξης εξαρτάται από την αλληλουχία και το μήκος του αμπλικονίου και είναι συγκεκριμένη για κάθε προϊόν. Όπως ακόλουθη μετατροπή διθειώδους μεθυλιωμένο DNA μετά την ενίσχυση περιέχει CG ζεύγη βάσεων, η θερμοκρασία τήξης ενός μη μεθυλιωμένου έκδοση που περιέχει TA ζεύγη βάσεων είναι διαφορετική. Το μεθυλιωμένο amplicon τήκεται σε υψηλότερη θερμοκρασία από ό, τι όταν μη μεθυλιωμένη και τα δείγματα των διαφορετικών κατάσταση μεθυλίωσης μπορούν να διαχωριστούν με σύγκριση των κορυφών της καμπύλης τήξης. Χρησιμοποιώντας 0% και 100% του DNA μεθυλιωμένο ελέγχου, δείξαμε ότι οι δοκιμαζόμενες ανιχνευτές αποκαλύπτουν σαφείς διαφορές μεταξύ μη μεθυλιωμένων και πλήρως μεθυλιωμένα DNA. 0% μεθυλιωμένο έλεγχος δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ενίσχυσης γονιδίωμα σύνολο (Sigma), ενώ το 100% έλεγχος δημιουργήθηκε από

in vitro

αντίδραση μεθυλίωσης που καταλύεται από μεθυλτρανσφεράση SSSI παρουσία ενός δότης μεθυλίου S-αδενοσυλ-L μεθειονίνη ( SAM). Τήξη κορυφές καμπύλη σε όγκους HCC συγκρίθηκαν με το μέσο όρο των κορυφών τήξης στην κανονική παρακείμενους ιστούς από 7 άτομα με μη-επεμβατική HCC. Αυτή η μέση καμπύλη που ονομάζεται εδώ ως κανονική παρακείμενων τιμών αναφοράς (NorAdjRef).

Pyrosequencing

Ειδικές όξινο θειώδες μετατρέπεται υποκινητή ενισχύθηκαν με HotStar Taq DNA πολυμεράση (Qiagen) με χρήση βιοτινυλιωμένων εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S2. Τα βιοτινυλιωμένα κλώνοι ΟΝΑ pyrosequenced στο όργανο PyroMarkTMQ24 (Biotage, Qiagen) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό PyroMarkTMQ24.

εκχύλιση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (QPCR)

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 1 μg του ολικού RNA χρησίμευσε ως μήτρα για σύνθεση cDNA χρησιμοποιώντας 20 U AMV αντίστροφης μεταγραφάσης (Roche Diagnostics), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Η αντίδραση QPCR διεξήχθη στο Φως Cycler 480 μηχάνημα (Roche) χρησιμοποιώντας 2 μΙ cDNA, 400 ηΜ πρόσθιο και αντίστροφο εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα S2 και 10 μl του Φωτός Cycler 480 SybrGreen I κύριο (Roche) σε τελικό όγκο 20 μΐ . Διεξήχθη ενίσχυση χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες: μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, ενίσχυση για 60 κύκλους στους 95 ° C για 10 s, θερμοκρασία ανόπτησης για 10 s, 72 ° C για 10 s, και τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Ποσοτικοποίηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη και αναλύθηκαν από το λογισμικό 480 Roche LightCycler.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας unpaired δύο όψεων

t-test

ή Mann -Whitney

U

δοκιμή. Η Mann-Whitney

U

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις μεταξύ των δύο ομάδων, όπου τα μεγέθη του δείγματος ήταν μικρό και ήταν, επομένως, δύσκολο να εξακριβωθεί κατανομής υποθέσεων. Σε κάθε περίπτωση, η δοκιμασία συνοδεύεται από ένα διάγραμμα διασποράς που δείχνει όλες τις τιμές που χρησιμοποιήθηκαν στη δοκιμή. Οι μέσες τιμές δίδονται ± S.D. Εφόσον είναι αναγκαίο,

P

-τιμές προσαρμόζονται για πολλαπλές δοκιμές χρησιμοποιώντας διόρθωση Bonferroni. Για τις συγκρίσεις των τεσσάρων εναντίον τεσσάρων δειγμάτων (Μπαγκλαντές ομάδα), χρησιμοποιήσαμε επίσης μια δοκιμή μετάθεση όπου τα στοιχεία ανακατεύονται 10.000 φορές και το στατιστικό αποτέλεσμα της δοκιμής ήταν υπολογίζονται εκ νέου για κάθε ανακάτεμα. Το περιβάλλον του λογισμικού R για στατιστικούς υπολογισμούς χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις, εκτός από τη δοκιμή μετάθεση όπου οι Αναδόμηση Στατιστικά Add-in για το λογισμικό Excel χρησιμοποιήθηκε (Stan Blank, Charles Seiter, Peter Bruce και Αναδόμηση Στατιστικά, Inc. 2000, το Ινστιτούτο Στατιστικής εκπαίδευση, USA).

Αποτελέσματα

Δοκιμές και ταυτοποίηση των υποψήφιων μεθυλιωμένος περιοχές HCC από HRM ανάλυση

Ο στόχος της μελέτης μας ήταν να εντοπιστούν και να βελτιστοποιήσουν μεθυλιωμένος περιοχές HCC ότι θα μπορούσε να διαφοροποιήσει HCC από φυσιολογικό ιστό χρησιμοποιώντας HRM. Εφαρμόσαμε διάφορα κριτήρια που είχαμε προβλέψει θα αυξήσει την πιθανότητα ότι οι ανιχνευτές είναι πανταχού παρούσες διαφορικά μεθυλιώνονται στο HCC. Πρώτον, επιλέγονται επτά γονίδια (αναφέρονται στον Πίνακα 1) που εντοπίστηκαν στην προηγούμενη οθόνη μας μεθυλιωμένος γονιδίων σε καρκίνο του ήπατος χρησιμοποιώντας μεθυλιωμένο ανοσοκατακρήμνισης DNA (MeDIP) και υβριδοποίηση σε γονιδιώματος σε επίπεδο ολιγονουκλεοτιδίου υποκινητή συστοιχίες. Δεύτερον, οι υποκινητές γονιδίων που περιέχονται ανιχνευτές με μέση μείωση φορές σε μεθυλίωση μεταξύ HCC και κανονική λειτουργία του ήπατος ίση ή ανώτερη από 2 και ήταν εξαιρετικά στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 10E-4). Τρίτον, υπομεθυλίωση των υποκινητών τους συσχετίστηκε επίσης με υπερέκφραση σχεδόν σε όλους τους ασθενείς που μελετήθηκαν υποδηλώνει την ευρωστία και τη λειτουργική σημασία αυτών των αλλαγών απομεθυλίωσης DNA σε HCC (Σχήμα 1Α-C). Τέταρτον, η ανάλυση των καθηκόντων τους βάσει των διαθέσιμων στο κοινό σύνολα δεδομένων, όπως Γονιδιακή Οντολογία (GO), KEGG και NCBI αποκαλύπτει βιολογικές διαδικασίες και τα μονοπάτια που είναι ζωτικής σημασίας για την καρκινογένεση, όπως η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, κυτταρική προσκόλληση, σηματοδότηση κυττάρου-κυττάρου, τον πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση (Πίνακας 1). Πέμπτον, τα γονίδια είχαν προηγουμένως συνδέονται με ανθρώπινους καρκίνους, κυρίως

MAGEA12

[16], [17], [18], [19] Ωστόσο, μόνο

ΔΙΣΚΟΙ LARGE (Drosophila) ΟΜΟΛΟΓΟ-πρωτεΐνη που συνδέεται με 5

(

DLGAP5

) και

MATRIX μεταλλοπεπτιδάση 1

(

MMP1

) έχουν αναφερθεί στο παρελθόν να είναι up-ρυθμίζονται σε όγκους HCC [26], [27] . Έκτον, χρησιμοποιώντας δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα μικροσυστοιχιών έκφρασης (Oncomine), αποδεικνύουμε ότι τρία από τα γονίδια που περιέχονται ανιχνευτές βελτιστοποιηθεί για ανάλυση HRM (βλέπε παράγραφο κατωτέρω) δείχνουν αυξημένη έκφραση σε πολλούς διαφορετικούς τύπους καρκίνου, όπως λευχαιμία, των ωοθηκών και του καρκίνου του παγκρέατος (

GPM6B

και

FCRL1

), νεφρική και του παχέος εντέρου (

GPM6B

και

MAGEA12

), HCC και του καρκίνου του μαστού (

MAGEA12

και

FCRL1

), καρκίνος των όρχεων και του μελανώματος (σημαντική υπερέκφραση του

GPM6B

στις δύο καρκίνους και

MAGEA12

σε μελάνωμα) (Σχήμα 1 D-F). Τα δεδομένα είναι συνεπή με ένα γενικό ρόλο αυτών των πρωτεϊνών σε πολλούς διαφορετικούς τύπους καρκίνου και προτείνουν θεμελιώδη ρόλο τους στην πρόοδο ή /και της μετάστασης του καρκίνου.

(Α) heatmap δείχνει log

2 απόκλιση μεθυλίωσης ( Μ) και έκφρασης (Ε) καθετήρας εντάσεις για τις υποδεικνυόμενες επτά γονίδια σε κάθε ασθενή HCC δείγματα, όπως μετράται με μικροσυστοιχίες. (Β, C) Κουτί οικοπέδων αυτών μεθυλίωσης (Β) και έκφραση (C) διαφορές σε ασθενείς με HCC (log

2 [καρκίνου κανονική]). Αρνητικών διαφορών μεθυλίωσης δείχνουν υπομεθυλίωση σε HCC και θετικές διαφορές έκφραση αντικατοπτρίζει υψηλότερη έκφραση σε δείγματα όγκων συγκριτικά με συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. (D, E, F) τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων του καρκίνου που λαμβάνεται από δεδομένα μικροσυστοιχιών για

GPM6B

(D),

MAGEA12

(Ε), και

FCRL1

(F). Η κανονική έναντι δεδομένα γονιδιακής έκφρασης όγκου ελήφθησαν από Oncomine και παρουσιάζονται ως log

2-μετασχηματισμένα διάμεσος επίκεντρο ανά συστοιχία, και SD-κανονικοποιημένο σε 1 ανά συστοιχία. Όλες οι αλλαγές που παρουσιάζονται είναι στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0,05) εκτός από

MAGEA12

του καρκίνου των όρχεων και

FCRL1

του καρκίνου των όρχεων και του μελανώματος. (G, H, I) καμπύλες τήξης και κορυφές της καμπύλης τήξης για 0% και 100% του DNA μεθυλιωμένο ελέγχου ενισχύθηκε για

GPM6B

(G),

MAGEA12

(H) και

FCRL1

(Ι) μαζί με ένα χάρτη των υποκινητών των δοκιμαζόμενων γονίδια που πλευρίζουν τα ανιχνευτές που επιλέγονται για ανάλυση HRM. Τα οριζόντια βέλη υποδεικνύουν τη θέση των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για HRM. HRM για 0% και 100% του DNA μεθυλιωμένο ελέγχου απεικονίζονται. Τα CpG περιοχές που βρίσκονται εντός του ενισχυμένου καθετήρα κύκλο και αριθμημένα. Το υποθετικό παράγοντα μεταγραφής θέσεις πρόσδεσης υποδεικνύονται όπως προβλέπεται από TRANSFAC.

Η

Τρεις ανιχνευτές που αντιστοιχούν στο

GPM6B

,

MAGEA12

, και

FCRL1

βελτιστοποιημένη για ανάλυση HRM της διαφορικής μεθυλίωσης στο HCC

Αρκετές ομάδες εκκινητών μεθυλίωση-ανεξάρτητο υποβλήθηκαν σε βελτιστοποίηση για ανάλυση HRM (βλέπε αλληλουχίες εκκινητή στον πίνακα S2). DNA ελέγχου που μεθυλιώθηκε σε 0% και 100% (πρότυπα) ενισχύθηκε με τους εκκινητές και τήκονται σε πραγματικό χρόνο. Το μοτίβο τήξης των αμπλικονίων καθιερώθηκε και αναλύθηκαν. Οι καμπύλες τήξης για τα δύο πρότυπα χαράχθηκαν στο ίδιο διάγραμμα και παρουσίασαν διαφορετικές θερμοκρασίες των κορυφών τήξης (Σχήμα 1G-Η). Στη συνέχεια προβλήθηκε 12 HCC και 12 δείγματα φυσιολογικού ήπατος από την ομάδα της Σαγκάης για την κατάσταση μεθυλίωσης στο πλαίσιο όλων των 7 ανιχνευτές που χρησιμοποιούν σχεδιασμένους εκκινητές. Τέσσερις ανιχνευτές έδειξε υψηλή ετερογένεια του προτύπου μεθυλίωσης σε όγκους, η οποία αντικατοπτρίζεται σε πολλαπλές κορυφές τήξης στην ανάλυση HRM για ένα μόνο δείγμα. Τρεις άλλοι ανιχνευτές για

GPM6B

,

MAGEA12

, και

FCRL1

έδειξε ένα σαφές σχέδιο τήξης ενός μη αιχμής και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω αναλύσεις ως δείκτες της μεθυλίωσης του DNA υποψήφιο. Η υπερέκφραση των γονιδίων αυτών δείχθηκε σε άλλους καρκίνους, για παράδειγμα υψηλότερη έκφραση του

GPM6B

συνδέθηκε με εγκεφαλικούς όγκους [13], [14] και λεμφοειδών λευχαιμιών [15],

MAGEA12

ήταν -regulated σε καρκίνωμα ουροδόχου κύστης [16], το μελάνωμα [17], του καρκίνου του μαστού [18] και στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [19], ενώ

FCRL1

επαγωγή παρατηρήθηκε σε μεταστατικά μελανώματα [21] και σε διαφορετικούς τύπους λευχαιμίες [20].

Διαφορικές HRM μοτίβο αμπλικονίων στο

GPM6B

,

MAGEA12

, και

FCRL1

διαφοροποιεί HCC από το φυσιολογικό ήπαρ

HRM όγκων (n = 12) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (n = 12). Οι καμπύλες τήξης απεικονίστηκαν γραφικά και η θερμοκρασία κορυφής τήξεως υπολογίστηκε όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Καθώς το μεθυλιωμένο DNA αμπλικόνιο τήκεται σε υψηλότερη θερμοκρασία από αμπλικόνια από μη μεθυλιωμένο όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA, τα δείγματα των διαφόρων κρατών μεθυλίωσης μπορούν να διαφοροποιηθούν με σύγκριση των κορυφών της καμπύλης τήξης. Είναι κοινή πρακτική να συγκρίνουν όγκων με παθολογικά φυσιολογικό γειτονικό ιστό από τον ίδιο ασθενή. Ωστόσο, μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα, αφού τα λεγόμενα φυσιολογικό ήπαρ μπορεί να έχουν ήδη μετασχηματιστεί μοριακά και εμφανίζεται αλλαγμένη προτύπων μεθυλίωσης του DNA χωρίς να παρουσιαστούν αλλαγές στην ιστοπαθολογία, ιδιαίτερα σε ασθενείς με υψηλά επεμβατικές όγκους. Πέντε ασθενείς στο σύνολο του δείγματος είχαν διαγνωστεί με διηθητικό HCC όπου εντοπίστηκε θρόμβου πυλαίας φλέβας όγκου (PVTT). Υποθέσαμε ότι η κανονική παρακείμενα του ήπατος μπορεί να αλλάξει ήδη σε αυτούς τους ασθενείς. Ως εκ τούτου, δημιουργείται μια κανονική καμπύλη αναφοράς (NorAdjRef) από το μέσο όρο καμπύλες τήξης για όλες τις παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς εκτός από τους ασθενείς με PVTT. Προτείνουμε ότι μια τέτοια καμπύλη αναφοράς θα μπορούσε να βελτιωθεί περαιτέρω με τη συμπερίληψη HRM αποτελέσματα από ένα μεγάλο δείγμα μη καρκινικά ηπατικού ιστού και να χρησιμοποιηθούν ως ένα γενικό πρότυπο για σύγκριση για νέες περιπτώσεις ιδιαίτερα όταν υπάρχει υποψία εισβολή σε παρακείμενο ιστό. Πράγματι, η μεθυλίωση του

GPM6B

καθετήρα στο δείγμα όγκου από τον ασθενή 5 ήταν τα ίδια όπως στο γειτονικό φυσιολογικό ιστό του, ωστόσο, ήταν διαφορετική από NorAdjRef επιβεβαιώνοντας τη χρήση ενός κατά μέσο όρο κανονικό ως πρότυπο για σύγκριση (Σχήμα 2Α , Σχήμα 3Α). Ασθενείς 1-6 με PVTT εμφάνισε την ίδια κατάσταση μεθυλίωσης εντός

FCRL1

ανιχνευτή όταν οι όγκοι τους συγκρίθηκαν με συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό τους, αλλά και πάλι τα προφίλ HRM ήταν διαφορετικές από NorAdjRef (Σχήμα 2C). Έτσι, χρησιμοποιώντας ένα μέσο όρο κανονικό πρότυπο ήμασταν σε θέση να καλέσει αυτά τα δείγματα ως HCC, το οποίο θα ήταν αδύνατο αν χρησιμοποιούσαμε τον παρακείμενο ιστό ως σημείο αναφοράς.

(Α-Γ) κορυφές της καμπύλης τήξης του

GPM6B

(Α),

MAGEA12

(Β) και

FCRL1

(C) αμπλικόνια σε 12 δείγματα όγκου και 12 συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Οι αιχμές για HCC με PVTT (PVTT-HCC), HCC χωρίς PVTT (μη-PVTT-HCC), και τα θέματα pseudotumor συγκρίθηκαν με το μέσο όρο των κανονικών γειτονικών ιστών από ασθενείς μη PVTT (NorAdjRef). Στο δεύτερο πάνελ, το λιώσιμο των κορυφών για τα δείγματα όγκων των ασθενών HCC με PVTT χαράχθηκαν μαζί με το μέσο όρο της ταιριάζει παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από αυτούς τους ασθενείς, ενώ ο πέμπτος πίνακας δείχνει τη μέση του HCC με PVTT και HCC, χωρίς PVTT σε σύγκριση με NorAdjRef. Οι τιμές θερμοκρασίας για την τήξη κορυφές σε κάθε ασθενή που φαίνεται στο διαγράμματα διασποράς και στον Πίνακα 3.

Η

(Α-Γ) τήξης καμπύλη κορυφές του

GPM6B

(Α),

MAGEA12

(Β) και

FCRL1

(C) αμπλικόνια σε δείγματα όγκων συγκριτικά με συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από τον ίδιο ασθενή. (D) Pyrosequencing του

GPM6B

περιοχή για τον ασθενή 9 (HCC) και ο ασθενής 13 (ψευδο). Η σκεπαστή περιοχή συμπίπτει με την ακολουθία αναλύονται στη Διεύθυνση Ανθρώπινου Δυναμικού.

Η

Έχουμε βελτιστοποιημένες τρεις συγκεκριμένες περιοχές 150 bp DNA που θα μπορούσαν να διαφοροποιηθούν HCC από μη μετασχηματισμένα ιστού χρησιμοποιώντας HRM. Μία περιοχή εντός

GPM6B

προαγωγού μεθυλιωμένος εις όγκους όλων των ασθενών σε σύγκριση με NorAdjRef (Σχήμα 2Α). Όλες οι όγκοι σαφώς διαχωριστούν και να αναγνωριστούν ως HCC βασίζεται στις αξίες της θερμοκρασίας των κορυφών τήξης (Πίνακας 3,

P

= 3.97E-5, το οποίο προσαρμόστηκε

P

= 1.17E-4, Mann-Whitney

U

δοκιμή). Άτομα με μη επεμβατική HCC (μη-PVTT) ήταν πιο μεθυλιωμένος σε σύγκριση με επεμβατικές όγκους ως η διαφορά σε κορυφές τήξης μεταξύ καρκίνου και NorAdjRef δείχνει. Έτσι, το αμπλικόνιο θα μπορούσε να διαφοροποιήσει επίσης HCC, χωρίς PVTT από HCC με PVTT, τουλάχιστον στο μικρό αριθμό των περιπτώσεων που εξετάστηκαν εδώ (Πίνακας 3, Σχήμα 2Α-διαγράμματα 3 και 5,

P

= 0,03, ρυθμίζεται

P

= 0.06, Mann-Whitney

U

δοκιμή). ανάλυση HRM μιας περιοχής μέσα στο

MAGEA12

υποστηρικτής διαφοροποιούνται όλα HCC χωρίς PVTT και 2 από 5 HCC με PVTT από NorAdjRef (Σχήμα 2Β, Εικόνα 3Β,

P

= 1.7E-4, προσαρμόζεται

P

= 5.1e-4, Mann-Whitney

U

δοκιμή). δείγματα όγκων από ασθενείς 5, 6, και 7 που είχαν διαγνωστεί με PVTT εμφάνισαν το ίδιο επίπεδο μεθυλίωσης όπως συμφωνημένα φυσιολογικό γειτονικό ιστό τους (Σχήμα 2Β-διάγραμμα 2, Σχήμα 3Β) και δεν διακρίθηκαν είτε από NorAdjRef (Σχήμα 2Β-διάγραμμα 1) . Η μέση μέγιστη τιμή θερμοκρασίας τήξης για το HCC, χωρίς PVTT ήταν χαμηλότερη από ό, τι για τον μέσο HCC με PVTT αναφέροντας υπομεθυλίωση στο

MAGEA12

καθετήρα σε μη επεμβατικές όγκους (Πίνακας 3, Σχήμα 2Β-διάγραμμα 5), αν και η αλλαγή δεν ήταν στατιστικά σημαντική στην ομάδα μας των δειγμάτων (

P

= 0.64, Mann-Whitney

U

δοκιμή). HRM για το

FCRL1

καθετήρα διαφοροποιεί HCC με PVTT από NorAdjRef (

P

= 2.5E-3, ρυθμίζεται

P

= 7,5 ευρώ-3, Mann-Whitney

U

δοκιμή), αλλά δεν HCC χωρίς PVTT από NorAdjRef (

P

= 0,11, Mann-Whitney

U

τεστ) (Σχήμα 2C-διάγραμμα 1). Η

FCRL1

ανιχνευτής μεθυλιωμένος στην επεμβατική σε σύγκριση με μη-επεμβατικές όγκους (Πίνακας 3, Σχήμα 2C-διάγραμμα 5,

P

= 2.5E-3, ρυθμίζεται

P

= 7,5 ευρώ-3, Mann-Whitney

U

δοκιμής) και επιπλέον διαφοροποιεί αυτά τα δύο είδη όγκων. Είναι ενδιαφέρον, αν και όμορφα διαφοροποιούν από τα δείγματα HRM PVTT από NorAdjRef, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά όταν συγκρίνεται

FCRL1

κατάσταση μεθυλίωσης σε κάθε δείγμα όγκου PVTT με την συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από τον ίδιο τον ασθενή, εκτός από τον ασθενή 7 (Πίνακας 3, Το σχήμα 2C-Chart2, Εικόνα 3C). Αυτό υποδηλώνει ότι οι αλλαγές μεθυλίωσης του DNA συνέβη ήδη στο γειτονικό ιστό σε αυτά τα ήπατα. Ασθενής 13 ο οποίος είχε διαγνωστεί με το συκώτι pseudotumor δεν έδειξε διαφορές στο προφίλ τήξης HRM με το δικό παρακείμενο ιστό της και NorAdjRef στις τρεις ανιχνευτές (Πίνακας 3, Σχήμα 2-διαγράμματα 4,

P

& gt? 0,05). Εμείς επιβεβαίωσε αυτή την παρατήρηση από Pyrosequencing του

GPM6B

περιοχή για HCC θέμα 9 και pseudotumor ασθενή, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D.

Η

Εν ολίγοις, ένας συνδυασμός αυτών των τριών βελτιστοποιημένη HRM ανιχνευτές θα διαφοροποιηθούν όγκοι από μη-όγκους (χρησιμοποιώντας το

GPM6B

καθετήρα και

MAGEA12

σε συνδυασμό με

GPM6B

) και HCC με PVTT από μη PVTT HCC (χρησιμοποιώντας το

FCRL1

καθετήρα).

Εκκαθάριση των εντοπισμένων επιγενετικών βιοδεικτών στο Μπαγκλαντές δείγματα βιοψίας από HCC και χρόνια ηπατίτιδα Β (CHB) ασθενείς

Το κρίσιμο ερώτημα στη διάγνωση του HCC είναι η αναγνώριση πρόωρη μετατροπή της CHB να HCC. Ως εκ τούτου, το ερώτημα εάν οι προσδιορίζονται ανιχνευτές θα μπορούσαν να διακρίνουν μεταξύ HCC και CHB σε ένα ανεξάρτητο σύνολο των θεμάτων. Δοκιμάσαμε 4 άτομα με HCC και 4 άτομα με ΧΗΒ (Πίνακας 2 για τα κλινικά χαρακτηριστικά). Η

GPM6B

καθετήρα που διαφοροποιούνται όλο το HCC από NorAdjRef στην ομάδα της Σαγκάης των ασθενών έδειξε επίσης διαφορετικά πρότυπα τήξης σε HCC και CHB, εκτός από έναν ασθενή με HCC που ήταν ομαδοποιούνται με ΧΗΒ με βάση την θερμοκρασία τήξης κορυφής (Πίνακας 3, Εικόνα 4Α,

P

= 0,028, ρυθμίζεται

P

= 0,084, Mann-Whitney

U

τεστ?

P

& lt? 0,0001, μεταθέσεως δοκιμή) . κατάσταση μεθυλίωσης στο

MAGEA12

καθετήρα χωρίζονται σε όλες τις περιπτώσεις HCC από CHB όπως υποδεικνύεται από χαμηλότερη θερμοκρασία τήξης (Πίνακας 3, Σχήμα 4Β,

P

= 0,028, ρυθμίζεται

P

= 0.084 , Mann-Whitney

U

τεστ?

P

= 0,02, μεταθέσεως δοκιμή). Σε ασθενείς HCC, παρατηρήσαμε σαφώς δύο κορυφές τήξης υποδεικνύοντας δύο πληθυσμούς κυττάρων με χαμηλή και υψηλή

MAGEA12

επίπεδο μεθυλίωσης. Ένας ανιχνευτής μέσα στο

FCRL1

ήταν μεθυλιωμένος σε όλους τους όγκους σε σύγκριση με το μέσο όρο όλων των ασθενών με ΧΗΒ (Πίνακας 3, Σχήμα 4C,

P

= 0,028, ρυθμίζεται

P

= 0,084, Mann-Whitney

U

τεστ?

P

& lt? 0,0001, μεταθέσεως δοκιμή). Όταν ομαδοποιούνται λιώνουν οι μέγιστες τιμές της θερμοκρασίας για όλα τα δείγματα HCC και σε όλες τις παρακείμενες φυσιολογικό και CHB δείγματα, η μέση τιμή για κάθε ελεγχόμενο καθετήρα ήταν μικρότερη στον καρκίνο από ό, τι στην κανονική ένδειξη υπομεθυλίωση στον καρκίνο (Σχήμα 4D). Οι διαφορές ήταν ιδιαίτερα στατιστικά σημαντικές για

GPM6B

και

MAGEA12

ανιχνευτές (

P

& lt? 0.001, ρυθμίζεται

P

& lt? 0,003, Mann-Whitney

U

δοκιμή), καθώς και για το

FCRL1

αλλά μετά την αφαίρεση των δειγμάτων HCC χωρίς PVTT (

P

& lt? 0,01, ρυθμίζεται

P

& lt? 0,03 , Mann-Whitney

U

δοκιμή). Έκφραση των γονιδίων δοκιμάστηκαν όπως μετράται από QPCR στο Μπαγκλαντές ομάδα ήταν κατά μέσο όρο υψηλότερες σε HCC σε σχέση με άτομα με ΧΗΒ (βλέπε Εικόνα 4Ε για τις ακριβείς τιμές σε κάθε ασθενή) με τις πιο σχετικές μεταβολές που παρατηρούνται για

FCRL1

(Σχήμα 4Ε,

P

= 0,028, ρυθμίζεται

P

= 0,084, Mann-Whitney

U

τεστ?.

P

= 0,028, μετάθεση δοκιμή)

κορυφές καμπύλη τήξεως του

GPM6B (Α)

,

MAGEA12

(Β) και

FCRL1

(C) αμπλικόνια σε 4 HCC και 4 ασθενείς με ΧΗΒ από Μπαγκλαντές.