Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι κινάσες τυροσίνης οδηγούν τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση πολλών ανθρώπινων καρκίνων. Έτσι προφίλ της παγκόσμιας κατάστασης της φωσφορυλίωσης τυροσίνης ενός όγκου είναι πιθανό να παρέχει έναν πλούτο των πληροφοριών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταξινόμηση των όγκων για την πρόγνωση και την πρόβλεψη. Ωστόσο, η διεξοδική ανάλυση της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης του μεγάλου αριθμού των ανθρώπινων δειγμάτων καρκίνου είναι τεχνικά δύσκολο, χρησιμοποιώντας τις τρέχουσες μεθόδους.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιήσαμε μια phosphoproteomic μέθοδο που ονομάζεται SH2 ​​προφίλ για να χαρακτηρίσει την παγκόσμια κατάσταση του φωσφοτυροσίνης (ρΤγΓ) σηματοδότηση σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου πνεύμονα. Αυτή η μέθοδος ποσοτικοποιεί τις φωσφορυλιωμένες θέσεις σύνδεσης για SH2 περιοχές, τα οποία χρησιμοποιούνται από τα κύτταρα για να ανταποκριθούν στις αλλαγές κατά την διάρκεια ρΤγΓ σηματοδότησης. Κύτταρα θα μπορούσαν να ομαδοποιηθούν με βάση τα πρότυπα δεσμευτική SH2, με κάποιες συστάδες σχετίζεται με τον υποδοχέα EGF (EGFR) ή την κατάσταση μετάλλαξης K-RAS. Δεσμευτική συγκεκριμένων τομέων SH2, με πιο γνωστή RAS οδού ενεργοποιητές Grb2 και ShcA, συσχετίζονται με μετάλλαξη του EGFR και την ευαισθησία με την erlotinib με αναστολείς του EGFR. μοτίβα δέσμευσης SH2 αντανακλάται επίσης ενεργοποίηση ΚΟΑ και θα μπορούσε να εντοπίσει τα κύτταρα οδηγούνται από πολλαπλές κινάσες. Οι απαντήσεις ρΤγΓ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς της κινάσης προσκόμισε αποδεικτικά στοιχεία των διαφορετικών μηχανισμών αναστολής.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή η μελέτη δείχνει τις δυνατότητες των σπονδυλωτή τομείς πρωτεΐνη και πρωτεομική προφίλ πρόσδεσης τους ως ισχυρό μοριακή διαγνωστική εργαλεία για την ταξινόμηση των όγκων και την ταυτοποίηση βιοδεικτών

Παράθεση:. Machida K, Eschrich S, Li J, Μπάι Υ, Koomen J, Mayer BJ, et al. (2010) Χαρακτηρισμός της φωσφορυλίωσης τυροσίνης Σηματοδοσίας στον καρκίνο του πνεύμονα Χρησιμοποιώντας SH2 προφίλ. PLoS ONE 5 (10): e13470. doi: 10.1371 /journal.pone.0013470

Συντάκτης: Eric J. Bernhard, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3η Μαΐου 2010? Αποδεκτές: 23 Σεπτεμβρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 19 του Οκτώβρη 2010

Copyright: © 2010 Machida et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Κέντρο Λειτουργική Γονιδιωματική (https://nfgc.moffitt.org/nfgc_Site.aspx?spid=E395859332944CBF8AFBDED2CE39B74A) (W81XWH-08-2-0101), τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (http: //grants.nih.gov/grants/oer.htm) (Ρ50-CA119997, R33-CA107785, και RC1-CA146843) και η αξονική τομογραφία μαστού Πρωτοβουλία για την Υγεία, Inc. (https://ctbhi.org/). Η εργασία αυτή έχει υποστηριχθεί εν μέρει από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (P30CA076292) στην Μοριακή Βιολογία πυρήνα και Βιοπληροφορικής βασικές εγκαταστάσεις στο H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Ινστιτούτο Ερευνών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Receptor και κινάσες τυροσίνης μη υποδοχέα ρυθμίζουν πολλές δραστηριότητες σημαντικές για τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επιβίωσης, εισβολή /μετάσταση, και την αγγειογένεση [1]. Συνεπώς, αυτές οι πρωτεΐνες σηματοδότησης αντιπροσωπεύουν μία σημαντική κατηγορία φαρμακευτικών στόχων για τη θεραπεία του καρκίνου, και πολυάριθμες αναστολείς κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙδ) είναι υπό ανάπτυξη ή χρησιμοποιούνται τώρα στην κλινική. Ο καρκίνος του πνεύμονα ευθύνεται για πάνω από 160.000 θανάτους ετησίως στις ΗΠΑ [2], ώστε να υπάρχει ένα ισχυρό σκεπτικό για τον εντοπισμό βασικές κινητήριες δυνάμεις του καρκίνου του πνεύμονα που μπορεί να αξιοποιηθεί θεραπευτικά. Η δραστικότητα του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι συχνά αυξημένη σε καρκίνο του πνεύμονα, και η αναστολή του EGFR μέσω της erlotinib ΤΚΙ μπορεί να επεκτείνει την επιβίωση σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα πυρίμαχο στη χημειοθεραπεία [3]. Εκτός από EGFR, ένας αριθμός άλλων κινασών τυροσίνης έχουν προταθεί ως θεραπευτικοί στόχοι στον καρκίνο του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένου του ΜΕΤ, υποδοχείς αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGFR), SRC κινάσες, υποδοχείς αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGFR), προερχόμενο από αιμοπετάλια αυξητικό παράγοντα υποδοχείς (PDGFR), αναπλαστικού λεμφώματος κινάσης (ALK), και ΕΡΗ υποδοχείς [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12] .

Ένα βασικό ερώτημα σε ΤΚΙ θεραπεία για τον καρκίνο του πνεύμονα είναι ποιοι ασθενείς θα ωφεληθούν από αυτά τα φάρμακα, δεδομένου ότι το κόστος είναι σημαντικό και πολλοί λαμβάνουν κανένα όφελος από τη θεραπεία. Ένα σημαντικό επίτευγμα ήταν η ανακάλυψη της ενεργοποίησης σωματικές μεταλλάξεις στο EGFR που ενισχύουν την σηματοδότηση του υποδοχέα και να προβλέψει την ευαισθησία να TKIs στόχευση του EGFR, όπως erlotinib και gefitinib [13], [14], [15]. Σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα που φιλοξενούν αυτές τις μεταλλάξεις, τα ποσοστά ανταπόκρισης σε EGFR TKIs μπορεί να είναι υψηλή και η επιβίωση είναι καλύτερη από εκείνη που παρατηρείται με κυτταροτοξικούς παράγοντες [16]. Παρ ‘όλα αυτά, ορισμένοι ασθενείς χωρίς μετάλλαξη EGFR μπορούν να επωφεληθούν από τους αναστολείς EGFR, και δείκτες, όπως ενίσχυση EGFR γονιδίου, αυτοκρινή παραγωγή TGFa, ή προφίλ γονιδιακής έκφρασης έχουν προταθεί για τον εντοπισμό αυτών των ασθενών [17], [18], [19]. Επιπλέον, οι μηχανισμοί αντίστασης, όπως η ενίσχυση ΚΟΑ ή δευτερεύουσα μεταλλάξεις στο EGFR μπορεί γρήγορα να οδηγήσει σε ανθεκτικότητα στα φάρμακα [20], [21], [22]. Τέλος, ορισμένα καρκινικά κύτταρα είναι πιθανόν να οδηγείται από πολλαπλές κινάσες τυροσίνης, και μεθόδων για την ταυτοποίηση και την ταξινόμηση αυτά είναι απαραίτητα [23].

πρωτεομικής στρατηγικών (που εξετάζουν τα παγκόσμια πρότυπα έκφρασης πρωτεΐνης ή φωσφορυλίωση) επίσης είναι για την ταξινόμηση των όγκων [24]. Η φασματομετρία μάζας (MS) σε συνδυασμό με αντι-φωσφοτυροσίνης αντισώματα που προσδιορίζονται διαφορετικά πρότυπα σηματοδότησης της κινάσης της τυροσίνης στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων και όγκων, και αυτή η προσέγγιση ήταν σε θέση να προσδιορίσει τα κύτταρα οδηγούνται από ογκογόνο EGFR, PDGFR, και ALK [4]. Άλλες μελέτες χρησιμοποιώντας την ίδια προσέγγιση που βρέθηκαν πρότυπα φωσφορυλίωσης τυροσίνης που σχετίζεται με μετάλλαγμα EGFR σηματοδότηση [25], [26]. Συνολικά, το έργο αυτό παρέχει απόδειξη της αρχής ότι τα παγκόσμια πρότυπα φωσφορυλίωσης τυροσίνης μπορεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες για την ταξινόμηση των όγκων. Ωστόσο, οι τρέχουσες μέθοδοι MS απαιτούν σχετικά μεγάλες ποσότητες δείγματος και η ποσοτικοποίηση των φωσφορυλιωμένη sites είναι οι προκλήσεις, έτσι νέες phosphoproteomic στρατηγικές που απαιτούνται.

Έχουμε αναπτύξει μια εναλλακτική phosphoproteomic μέθοδο, που ονομάζεται SH2 ​​προφίλ, που συμπληρώνει προσεγγίσεις MS-based [27], [28]. SH2 προφίλ είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη και διακίνηση είναι σχετικά υψηλή, έτσι είναι ιδανικό για προφίλ φωσφοτυροσίνης (ρΤγΓ) σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα. Η εννοιολογική βάση του SH2 προφίλ είναι να χρησιμοποιήσετε το δικό συσκευή απόκριση σήματος ρΤγΓ του κυττάρου για να ανακρίνουν την κατάσταση της ρΤγΓ σηματοδότησης. Μετά κινάσης τυροσίνης υποδοχέα (RTK) ενεργοποίηση, η προκύπτουσα αύξηση στην φωσφορυλίωση τυροσίνης πρωτεϊνών δημιουργεί θέσεις δέσμευσης για σπονδυλωτή περιοχές δέσμευσης ρΤγΓ-ειδική? είναι η επανατοπικοποίηση της ενδοκυτταρικής τελεστές που περιέχουν ρΤγΓ περιοχές σύνδεσης σε αυτές τις φωσφορυλιωμένες sites που είναι το βασικό βήμα για την μετάδοση του σήματος [29]. Μέχρι στιγμής η πιο άφθονη ενότητα δεσμευτική ρΤγΓ στον άνθρωπο είναι η Src ομολογίας 2 ή SH2 τομέα [30]. Υπάρχουν 120 SH2 περιοχές που κωδικοποιούνται από το ανθρώπινο γονιδίωμα, και κάθε τομέας SH2 δεσμεύει ένα μοναδικό φάσμα φωσφορυλιωμένη τυροσίνη χώρων [28], [31]. Επειδή SH2 περιοχές είναι αυτό που χρησιμοποιεί το κύτταρο για να ανταποκριθεί ή να «διαβάζουν» τις αλλαγές στη φωσφορυλίωση της τυροσίνης κατά τη διάρκεια της σηματοδότησης, ο βαθμός δέσμευσης των διαφορετικών τομέων SH2 μπορεί να παρέχει έναν πλούτο των πληροφοριών σχετικά με τους μηχανισμούς και το καθεστώς των ρΤγΓ σηματοδότησης.

για να ελεγχθεί αν αυτή η προσέγγιση είναι χρήσιμη στον χαρακτηρισμό και την ταξινόμηση συγκρότημα τύπους όγκων, όπως ο καρκίνος του πνεύμονα, όπου πολλαπλές κινάσες τυροσίνης οδήγησης κατάντη σηματοδότησης και να διατηρήσει την ανάπτυξη του όγκου, εφαρμόσαμε SH2 profiling να κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. Θεωρούμε ότι ρΤγΓ πρότυπα θα μπορούσαν να σχετίζονται με γνωστά χαρακτηριστικά των κυττάρων συμπεριλαμβανομένου του καθεστώτος της μετάλλαξης του EGFR και την ευαισθησία να EGFR ΤΚΙ. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι SH2 ​​προφίλ παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με ρΤγΓ σηματοδότησης που είναι πιθανό να είναι χρήσιμη για την πρόβλεψη και την πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

SH2 προφίλ προσδιορίζει υποσύνολα του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών

Έχουμε επιλέξει μια ομάδα 22 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές με γνωστές EGFR και την κατάσταση της μετάλλαξης K-RAS και γνωστή ευαισθησία στο EGFR ΤΚΙ erlotinib (Συμπλ. Πίνακας S1). Η συνολική στρατηγική για τις μελέτες μας φαίνεται στην Εικ. 1. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από ενεργά αναπτυσσόμενα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με ορό. Δύο προσεγγίσεις για τη δημιουργία προφίλ SH2 χρησιμοποιήθηκαν, δέσμη πρωτεΐνης αντίστροφης φάσης και πολύ-κηλίδωση Western [28]. Στην πρώτη μέθοδο, τα πολλαπλά δείγματα πρωτεΐνης (κυτταρολύματα) διαφανεί σε συστοιχίες σε αντιστοιχία με τα πηγάδια μιας συσκευής θαλάμου 96 φρεατίων. Κάθε φρεάτιο στη συνέχεια γεμίζεται με ένα διάλυμα που περιέχει ένα διαφορετικό ανιχνευτή τομέα GST-SH2, και μετά την επώαση και πλύση, το δεσμευμένο ανιχνευτή ποσοτικοποιείται για κάθε κηλίδα. Η ποσότητα σύνδεσης εξαρτάται από τον αριθμό και την συγγένεια των φωσφορυλιωμένη τυροσίνη θέσεις πρωτεΐνης στο δείγμα. Με αυτή την προσέγγιση, την οποία χαρακτηρίζουν ως «ροζέτα» δοκιμασία, είναι δυνατόν να προφίλ το συνολικό επίπεδο δέσμευσης για σχεδόν όλους τους τομείς SH2 στο γονιδίωμα (94 ανιχνευτές τομέα SH2 και έναν τομέα ΡΤΒ που αντιπροσωπεύουν το 90 διακριτές πρωτεΐνες) χρησιμοποιώντας ελάχιστες ποσότητες πρωτεϊνών δείγμα.

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (Suppl. Πίνακας S1) καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία αναστολέων κινάσης τυροσίνης erlotinib ή dasatinib. πρωτεΐνες κυττάρων εκχυλίστηκαν και αναλύθηκαν με ροζέτα και πολύ-κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας μια σειρά SH2 ιχνηλατών τομέα (Suppl. Πίνακας S3). Βιοπληροφορική ανάλυση ποσοτικών δεδομένων που χρησιμοποιούνται για την ταξινόμηση και βιοδεικτών διαλογής.

Η

Για τη διερεύνηση της συσχέτισης των διαφορετικών κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα, ποσοτικές τιμές δεσμευτική SH2 υποβλήθηκαν σε ανεξέλεγκτους ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης (βλέπε Μέθοδοι). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται σε μορφή χάρτη θερμότητας στο Σχ. 2Α και τα δεδομένα των πρώτων εικόνα παρουσιάζεται στο Suppl. Σύκο. S1. Δεδομένων με χαμηλό σήμα /φόντο απορρίφθηκαν? στοιχεία για τα υπόλοιπα 70 ανιχνευτές είχαν διάμεση επίκεντρο για την ομαδοποίηση? κόκκινο δείχνει υψηλότερη από μέση δεσμευτικό, πράσινο κάτω. Τα επεξεργασμένα δεδομένα μπορούν να βρεθούν σε Suppl. Πίνακας S2. Τα δεδομένα μπορούν επίσης να προσεγγιστεί χρησιμοποιώντας μια web-based θεατή (https://proteome.moffitt.org/sh2/). Στην ανάλυση αυτή, κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν μεταλλαγμένο σύμπλεγμα EGFR μαζί σε τρεις διακριτές υπο-ομάδες, ενώ δύο μεγάλες συστάδες (τεσσάρων και οκτώ κυτταρικές σειρές) αποτελούνται εξ ολοκλήρου από τις γραμμές με άγριου τύπου (wt) EGFR. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι SH2 ​​προφίλ μπορεί να προσδιορίσει υποσύνολα του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων, και ότι αυτές οι συστάδες εμφανίζονται σχετίζονται με την κατάσταση μετάλλαξης του EGFR.

(Α) δεδομένα Ροζέτα συγκεντρωμένα από SH2 τομέα και την κυτταρική γραμμή. Κάθε σειρά αντιπροσωπεύει ένα μόνο τομέα SH2 και κάθε στήλη αντιπροσωπεύει ένα μονό κυτταρική γραμμή. Τα βιολογικά χαρακτηριστικά (μετάλλαξη του EGFR, η μετάλλαξη του K-RAS, ευαισθησία ερλοτινίμπη) φαίνεται παραπάνω σε μαύρο και άσπρο. Για την ευαισθησία erlotinib, θετική /ευαίσθητα: IC

50 & lt? 10 nM? ενδιάμεση /μετρίως ευαίσθητα: 10-1000 nM? αρνητική /αναίσθητος: & gt? 1000 nm. (Β) Άπω Δυτική στοιχεία συγκεντρωμένα από SH2 περιοχή-ειδικά bin και κυτταρική σειρά. Κάθε σειρά αντιπροσωπεύει ένα μόνο κάδο MW (20 κάδοι /λωρίδα) για έναν συγκεκριμένο τομέα SH2 και κάθε στήλη αντιπροσωπεύει μια ενιαία γραμμή κυττάρων.

Η

Η δεύτερη προσέγγιση SH2 προφίλ χρησιμοποιεί πολύ-κηλίδωση Western για να αποκτήσετε πιο λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με την σχετική αφθονία και φαινόμενο μοριακό βάρος (MW) φωσφοπρωτεϊνών που δεσμεύονται διαφορετικοί ανιχνευτές τομέα SH2. Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με βάση το μέγεθος με ηλεκτροφόρηση γέλης και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες, οι οποίες στη συνέχεια διερευνήθηκαν με επισημασμένα SH2 περιοχές. Οι πρωτεΐνες δέσμευσης SH2 αποκαλύπτεται ως ζώνες, και η φαινομενική MW αυτών των ζωνών μπορεί να παρέχει ενδείξεις για την ταυτότητά τους. Έχουμε αναπτύξει εργαλεία λογισμικού που επιτρέπουν δεσμευτικές SH2 δεδομένων από πολύ-Western blots να ποσοτικοποιηθεί σε «κάδους» από την προφανή MW, π.χ. 20 κάδους ανά λωρίδα. Τα δεδομένα από κάθε κάδο (που αντιστοιχεί σε φωσφοπρωτείνες από ένα συγκεκριμένο εύρος MW που δεσμεύονται με τον ανιχνευτή SH2) μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί ως βάση για την ταξινόμηση των δειγμάτων. Έτσι, αντί για μια ενιαία τιμή για κάθε δείγμα και τον τομέα SH2, όπως στη δοκιμασία ροζέτα, ποσοτικά πολύ-κηλίδωση Western προσφέρει τουλάχιστον 20 διαφορετικά σημεία δεδομένων, αυξάνοντας σημαντικά τις δυνατότητες διάκρισης μεταξύ των δειγμάτων.

Far-Western blots του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές ανιχνεύθηκαν με 36 SH2 ή ΡΤΒ τομέων, καθώς και αντι-ρΤγΓ αντίσωμα. Δεδομένα πρωτογενών εικόνα μπορεί να βρεθεί σε Suppl. Ταινία S1, και ποσοτικών δεδομένων σε Συμπλ. Πίνακας S2. Όταν ποσοτικά αποτελέσματα υποβλήθηκαν σε ιεραρχική συσταδοποίηση, τα δείγματα ομαδοποιήθηκαν σε 3 διαφορετικές κατηγορίες, συν δύο ακραίες τιμές (Σχ. 2Β). Ένα από αυτά (cluster 3) αποτελείται εξ ολοκλήρου από κύτταρα με wt EGFR και είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένα για τα κύτταρα με την ενεργοποίηση K-RAS μεταλλάξεις. Αντίθετα, οι συστάδες 1 και 2 εμπλουτισμένα για κύτταρα με μεταλλάξεις του EGFR? σε κάθε μία από αυτές τις ομάδες, τα κύτταρα με wt και μεταλλαγμένων EGFR είναι διαχωρισμένα. Έτσι ποσοτική πολύ-κηλίδωση Western φαίνεται να παρέχει πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τις κρατικές σηματοδότησης κινάσης τυροσίνης που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταξινόμηση λειτουργικά κύτταρα με βάση την κατάσταση ενεργοποίησης RTK. Συνολικά η ομαδοποίηση αποτελέσματα από τις αναλύσεις Ροζέτα και πολύ-Δυτικών είναι παρόμοια, αλλά όχι ταυτόσημες, όπως αναλύεται παρακάτω.

Η σύνδεση ενός συνόλου περιοχών SH2 ενισχύεται σε κύτταρα που φέρουν την ενεργοποίηση μεταλλάξεις του EGFR

επόμενη ρώτησε αν η δέσμευση του κάθε επιμέρους ανιχνευτές τομέα SH2 ήταν ιδιαίτερα σχετίζεται με την ενεργοποίηση μεταλλάξεις του EGFR. Από πειράματα σύνδεσης ροζέτα εντοπίσαμε 7 ανιχνευτές του οποίου η σύνδεση συσχετίζεται σε στατιστικά σημαντικό τρόπο με την κατάσταση μετάλλαξης του EGFR:. Grb2, ShcA (PTB), Grap2, Brk, Txk, CblB και CblA (Εικ. 3Α) (ανατρέξτε στην Συμπλ πίνακα S3 για τα ονόματα τομέα SH2 και αντίστοιχες πρωτεΐνες). Εμείς εισόδου αυτούς τους τομείς σε ΠΠΑ Spider, ένα εργαλείο για την ερμηνεία των δεδομένων πρωτεομική στο πλαίσιο των γνωστών δικτύων αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι πέντε από αυτές τις πρωτεΐνες (ShcA, Grb2, CblA, CblB, και Brk) έχουν αναφερθεί ότι δεσμεύονται άμεσα με EGFR, ενώ Grap2 δυνητικά συνδέεται με EGFR μέσω ShcA (Σχ. 3Β). Το γεγονός ότι οι θέσεις για Grb2 και ShcA (και το κλείσιμο Grb2 σχετική Grap2) δέσμευση συνδέονται στενά με μετάλλαξη EGFR είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα, καθώς η αυξημένη δέσμευση αυτών των περιοχών SH2 θα είναι έντονα προβλέπεται να οδηγήσει στην ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης RAS μέσω πρόσληψης το RAS ενεργοποιητής Sos [32], [33]

(Α) περιοχές SH2 δέσμευσης των οποίων είναι συσχετίστηκε σημαντικά με μετάλλαξη του EGFR (Q & lt? 0,1).. Bar οικόπεδο σήματος SH2 για κυτταρικές σειρές EGFR μεταλλάξεως και αγρίου-τύπου παρουσιάζεται ως μέση με πρότυπο μπάρες σφάλματος. «SH2 domain» χρησιμοποιείται σε ποσά για όλες τις ανιχνευτές, συμπεριλαμβανομένων των τομέων ΡΤΒ και αντι-ρΤγΓ αντίσωμα. (Β) αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης χάρτη για EGFR (γκρι κύκλος) και πρωτεΐνες με SH2 περιοχές δέσμευσης του οποίου συσχετίστηκε σημαντικά με μετάλλαξη EGFR (λευκοί κύκλοι). Γραμμές δείχνουν αναφερθεί άμεσης σύνδεσης αλληλεπιδράσεις. (C) Άπω Δυτική ζώνες συγκεκριμένους τομείς συσχετίζεται σημαντικά με την μετάλλαξη του EGFR. Χρωματιστά κουτιά δείχνουν τα αποτελέσματα της στατιστικής σημασίας σε ένα δοκιμαστικό Mann-Whitney για τις διαφορές (q & lt? 0,1) μεταξύ των κυτταρικών γραμμών 22 που φαίνεται στο Σχήμα 2Β. Το βέλος δεικνύει bin αντιστοιχούν στα μέλη της οικογένειας EGFR. Οι αριθμοί δίπλα σε κάδους υποδεικνύει φαινόμενο ΜΒ, π.χ. «291.0» = MW μεταξύ 256 έως 291 kDa.

Η

Μια παρόμοια ανάλυση έγινε με τη χρήση δεδομένων από πολύ-κηλίδωση Western. Βρήκαμε ότι ένας αριθμός ειδικών ζωνών σε πολύ-κηλίδες Western συσχετίζεται σημαντικά με μετάλλαξη EGFR (Σχ. 3C). Εδώ είναι ενδιαφέρον να εξεταστεί συγκροτήματα των οποίων η σύνδεση τείνει να αυξήσει σε EGFR μεταλλαγμένα κύτταρα (κόκκινο) έναντι εκείνων των οποίων η σύνδεση τείνει να μειώνεται σε EGFR μεταλλαγμένα κύτταρα (πράσινο). Σημειώνουμε ότι για τους ανιχνευτές προβλέπεται (βάσει της γνωστής δραστικότητας σηματοδότησης) που θα σχετίζεται με τη διέγερση της οδού της Ras (Grb2 και Shc), αυξημένη πρόσδεση στο εύρος μοριακού βάρους που περιέχουν φωσφορυλιωμένη μέλη της οικογένειας EGFR (MW194, βέλος) φαίνεται για EGFR μεταλλαγμένα κύτταρα. Αυτό πιθανότατα αντικατοπτρίζει αυξημένη πρόσδεση αυτών των τελεστών σε ενεργοποιημένα αφύσικα EGFR, σε σύγκριση με τον υποδοχέα wt. Αυτό ισχύει επίσης για SH2 περιοχές άλλων γνωστών θετικών τελεστές της σηματοδότησης EGFR, συμπεριλαμβανομένων Vav2, ΡΙ 3-κινάση (ΡΙ3Κ? P85B)., Και ΡΙ_Ογ Plcg1)

Σε αντίθεση με μετάλλαξη EGFR, βρήκαμε καμία επιμέρους SH2 περιοχές των οποίων η σύνδεση συσχετίζεται έντονα με την κατάσταση μετάλλαξης RAS με ροζέτα ή πολύ-κηλίδωση Western. Παρ ‘όλα αυτά, έχουμε παρατηρήσει μια ενδιαφέρουσα εμφανή συσχέτιση μεταξύ της ομαδοποίησης με βάση την παγκόσμια προφίλ SH2 και την κατάσταση της μετάλλαξης K-RAS. Αυτό είναι ιδιαίτερα εμφανές στην περίπτωση του πολύ-κηλίδωση Western (Εικ. 2Β), όπου δύο μεγάλες συστάδες αποτελούνται εξ ολοκλήρου από κύτταρα με βάρος K-RAS, ενώ μια τρίτη μεγάλη συστάδα (cluster 3) αποτελείται σχεδόν εξ ολοκλήρου από κύτταρα με wt EGFR αλλά μετάλλαξη του K-RAS. Ήμασταν αρχικά αμηχανία από την εμφάνιση της Η1299 στη συστάδα # 3, ως K-RAS είναι βάρος σε αυτά τα κύτταρα. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω εξέταση των δεδομένων αλληλουχίας αποκάλυψε ότι η K-RAS σχετική Ν-RAS είναι μεταλλαγμένο σε Η1299 (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/), αλλά όχι σε οποιοδήποτε άλλο κύτταρο γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Έτσι, μια πρόβλεψη με βάση την SH2 προφίλ, ότι Η1299 κύτταρα είναι πιθανό να φιλοξενούν ενεργοποιηθεί RAS, επιβεβαιώθηκε, επικύρωση έντονα τη βιολογική σημασία αυτής της προσέγγισης. Αυτό το σύμπλεγμα των μεταλλάξεων RAS (6 από 6 κυτταρικές σειρές που φέρουν μετάλλαξη RAS) είναι εξαιρετικά απίθανο να έχει συμβεί κατά τύχη (p = 0,001, μετάθεση δοκιμών, n = 100.000). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα πρότυπα φωσφορυλίωσης τυροσίνης μπορεί να υπο-ταξινόμηση κυττάρων με βάση την κατάσταση της μετάλλαξης RAS. Η έλλειψη συσχετισμού μεταξύ των ανιχνευτών τομέα μεμονωμένων SH2 και RAS μετάλλαξη (σε αντίθεση με συσχετισμού βασίζονται στην παγκόσμια προφίλ φωσφορυλίωσης τυροσίνης) μπορεί να αντανακλά το γεγονός ότι RAS λειτουργίες κατάντη των κινασών τυροσίνης. Αυτήν τη στιγμή δοκιμάζουμε το μοντέλο που συστατική δραστικότητα του Ras οδηγεί στην ενεργοποίηση των μονοπατιών που ρυθμίζουν προς τα κάτω ανατροφοδότηση ευρέως σηματοδότηση κινάσης τυροσίνης.

Ένα σύνολο SH2 ανιχνευτές συσχετίζεται με την ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με το EGFR ΤΚΙ

στην συνέχεια προσδιορίσαμε αν ο τομέας SH2 πρόσδεση συσχετίζεται με την ευαισθησία των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα με την erlotinib, ένα μικρό μόριο αναστολέα κινάσης EGFR. Τέτοιες περιοχές θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως βάση για την προγνωστική βιοδείκτες για τον εντοπισμό όγκων πιθανό να ανταποκριθούν στη θεραπεία ΤΚΙ. SH2 προφίλ δεδομένα εξετάστηκαν για πιθανή συσχέτιση με την IC

50 για erlotinib για κάθε κυτταρική σειρά (IC

50 αναλύθηκε για τη μελέτη αυτή, υπό τις ίδιες συνθήκες καλλιέργειας που χρησιμοποιούνται για την SH2 προφίλ). Βρήκαμε ότι η σύνδεση του 13 ανιχνευτές που αντιστοιχούν σε 12 πρωτεΐνες συσχετίζονται σε στατιστικά σημαντικό τρόπο με erlotinib IC

50 (Σχ. 4Α). Αυτά περιλαμβάνουν Grb2 (φαίνεται στο Σχ. 4Β), ShcA, ShcA (PTB), p85B, Cis1, Arg, Eat2, Plcg1, Ptk70 /ΕΥΚ, Φες, Lnk, Tem6 και Btk. ανάλυση του δικτύου επιβεβαιώνει τις εκθέσεις της άμεσης αλληλεπίδρασης μεταξύ EGFR και Grb2, ShcA, p85B, Cis1, Arg, Plcg1, Φες, και ΒΤΚ (Εικ. 4C). Συνολικά, τα αποτελέσματα είναι συνεπή με ένα μοντέλο όπου η ευαισθησία erlotinib συνδυάζεται με ιδιαίτερα έντονη σηματοδότηση από ενεργοποιείται EGFR σε γνωστά πυρήνα κατάντη δράστες, συμπεριλαμβανομένης της ΜΑΡΚ (Grb2 και ShcA), PI3K /Akt (p85B), και ΡΙ_Ογ (PLCg1) μονοπάτια.

σήμα τομέα SH2 σε μη επεξεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με το ln IC

50 για erlotinib. (Α) τομείς συσχετίζεται σημαντικά με ln IC

50. Αρνητικές συσχετίσεις δείχνουν δεσμευτική υψηλότερη SH2 στα κύτταρα πιο ευαίσθητα (χαμηλότερη IC

50) στην erlotinib. (Β) Διάγραμμα διασποράς των Grb2 SH2 περιοχής δέσμευσης έναντι του ln (IC

50) για την erlotinib. (Γ) αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης χάρτη για EGFR και πρωτεϊνών με SH2 περιοχές δέσμευσης του οποίου συσχετίστηκε σημαντικά με ευαισθησία erlotinib. Γραμμές δείχνουν αναφερθεί άμεσης σύνδεσης αλληλεπιδράσεις. (D) Heatmap εκπροσωπούν συσχέτιση του κάθε τομέα, ειδικά κάδο με την ευαισθησία erlotinib. συσχέτιση κατά Pearson υπολογίστηκε για κάθε domain-ειδικό κάδο σε 22 κυτταρικές γραμμές και το ln (IC

50) για την αντίστοιχη κυτταρική γραμμή. Κάθε θέση θερμικός χάρτης αντιπροσωπεύει συντελεστής συσχέτισης για το συγκεκριμένο κάδο? πράσινο υποδηλώνει αύξηση του σήματος SH2 με τη μείωση IC

50 τιμές (μεγαλύτερη ευαισθησία)? κόκκινο δείχνει την αύξηση του σήματος SH2 με την αύξηση της IC

50 τιμές (βλέπε γραμμή χρώματος). Βέλος δείχνει MW bin περιέχει πρωτεΐνες της οικογένειας του EGFR. (Ε) Κατάλογος των 46 domain-ειδικούς κάδους με | συντελεστή συσχέτισης | & Gt?. 0.5

Η

Far-κηλίδωση Western, επίσης, εντοπίστηκαν συγκροτήματα που συσχετίζονται με την ευαισθησία της erlotinib (Σχήμα 4D & amp?. Ε). Για ένα μεγάλο αριθμό περιοχών SH2, αυξημένη φαινομενική σύνδεση προς τα μέλη της οικογένειας EGFR (βέλος στο MW194 στο Σχ. 4D) συσχετίστηκε με ευαισθησία erlotinib, ενώ CSK (η οποία ρυθμίζει προς τα κάτω Src-οικογένειας κινασών) ήταν μοναδική στο εν λόγω χαμηλότερο φαινόμενο δέσμευσης του SH2 του τομέα για να EGFR συνδέθηκε με την ευαισθησία της erlotinib. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν πολύ παρόμοια με εκείνα που παρατηρούνται για μετάλλαξη EGFR (Σχ. 3C), υποδεικνύοντας ότι αυξημένη πρόσδεση του RAS ενεργοποιητών και μειωμένη σύνδεση του CSK να EGFR σχετίζονται τόσο με μετάλλαξη EGFR και την ευαισθησία erlotinib. Ενώ κατ ‘αρχήν ανάλυση μας θα μπορούσε να συγχέεται με τη γνωστή συσχέτιση μεταξύ μετάλλαξης EGFR και της ευαισθησίας erlotinib, συμπεριλάβαμε στην ανάλυσή διάφορες γραμμές μας που είναι ανθεκτικά σε erlotinib παρά την ενεργοποίηση μεταλλάξεων EGFR (H1975, H820, H2279, και H1650), καθώς επίσης και γραμμές με wt EGFR που είναι ευαίσθητα σε erlotinib (H292, H358, H1648, και H322). Είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον ότι CSK είναι το μόνο τομέα SH2 των οποίων η σύνδεση με την περιοχή του στυπώματος που περιέχει EGFR μειώσεις τόσο EGFR μεταλλαγμένα κύτταρα και σε κύτταρα ευαίσθητα σε erlotinib. CSK ρυθμίζει αρνητικά Src κινάσες της οικογένειας, ένα κλειδί κατηγορία μη υποδεκτικές κινάσες τυροσίνης [34]. Αν και δεσμευτική CSK SH2 είναι σχετικά αδύναμη και διαφορές μεταξύ των κυτταρικών σειρών είναι μέτρια, έχουμε επιβεβαιώσει τη στατιστική σημασία του συσχετισμού σε διάφορα ξεχωριστά πειράματα (Συμπλ. Εικ. S2).

ενεργοποίηση ΚΟΑ συλλαμβάνεται από SH2 προφίλ

Μια πιθανή δύναμη του SH2 προφίλ θα ήταν να εντοπίσει τους όγκους στους οποίους πολλαπλά υπερενεργοποιημένη κινάσες τυροσίνης ενεργούν σε συνεννόηση με το αυτοκίνητο προς τα κάτω σηματοδότηση, έτσι ώστε να διερευνηθεί κατά πόσον SH2 προφίλ θα μπορούσε να εντοπίσει κυτταρικές σειρές στις οποίες ΚΟΑ και EGFR είναι συν-ενεργοποιημένη . Η κινάση ΚΟΑ ενισχύεται στο H820 και H1648 κυττάρων [20], [35], η οποία σύμπλεγμα στενά τόσο από Ροζέτα και πολύ-δυτική SH2 προφίλ (Εικ. 2). Σε πολύ-κηλίδες Western, σημειώσαμε επίσης ισχυρή δέσμευση της πολλούς τομείς SH2 συμπεριλαμβανομένων p85a στην περιοχή της ~148 kDa στο H820 και H1648. Παρατηρήσαμε μια παρόμοια ζώνη στα ~148 kDa για έναν αριθμό άλλων κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων των HCC827, H4006, Η358, Η441 και (Εικ. 5Α). Υποψιάζεται αυτό το συγκρότημα ήταν ένας δείκτης για την ενεργοποίηση ΚΟΑ, ελέγξαμε αυτό με σχολαστικά ανοσοστυπώματα με ένα αντίσωμα phosphospecific που αναγνωρίζει ειδικά ενεργοποιημένα ΚΟΑ (Συμπλ. Εικ. S3A). Η ανάλυση αυτή, σε συνδυασμό με ανοσοκαθίζηση και αναστολέα μελέτες κατέδειξαν ότι η φωσφορυλίωση της ζώνης 148 kDa ήταν ισχυρώς εξαρτάται από την ενεργοποίηση ΚΟΑ (παρουσία του συσχετίζεται με ενεργοποιημένα ΚΟΑ και αναστάλθηκε από MET-ειδική ΤΚΙ), αλλά η ζώνη δεν ήταν ο ίδιος ο υποδοχέας ΜΕΤ (Suppl. Σχ. S3b, C). Ταυτόχρονα, εξετάσαμε έμμεσα την δραστηριότητα των μελών της οικογένειας του EGFR με την ποσοτικοποίηση φωσφορυλίωσης τυροσίνης της περιοχής ~194 kDa του ανοσοστυπωμάτων, όπου βρίσκονται τα μέλη της οικογένειας του EGFR (Suppl. Σχ. S3A). Ανοσοκαταβύθιση και μελέτες αναστολέα έδειξαν ότι το μεγαλύτερο μέρος του σήματος πρόσδεσης SH2 σε αυτή την περιοχή των κηλίδων θα μπορούσε να αποδοθεί στα μέλη της οικογενείας EGFR (Suppl. Σχ. S3b, C).

(Α) Far-κηλίδος Western του πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές γραμμές διερευνήθηκαν με domains p85A SH2. Σημείωση εξέχουσα λωρίδα ~145 kDa σε H820 (βέλος). (Β, C) Ιεραρχική ομαδοποίηση σχετίζονται με την ενεργοποίηση της οικογένειας ΚΟΑ και EGFR. Ιεραρχική συσταδοποίηση με βάση τα δεδομένα ροζέτα (Β) ή πολύ-Western δεδομένων (C), όπως φαίνεται προηγουμένως στο Σχ. 2. χρώματα δείχνουν κυτταρικές σειρές που συν-cluster τόσο ροζέτα και πολύ-ανάλυση Western (συστάδες 1, 2, 2b, και 3). MET ενεργοποίηση = ανοσολογική αντίδραση με phosphospecific MET αντίσωμα. ρΤγΓ MW 194 = ανοσοαντιδραστικότητα με αντι-ρΤγΓ σε 194 bin kDa, η οποία είναι μια ένδειξη της ενεργοποίησης της οικογένειας EGFR (βλέπε Suppl. Εικ. S3). Cutoffs για την ενεργοποίηση ΚΟΑ: θετική, & gt? 50% υψηλότερη τιμή σε ανοσοκηλίδωση με αντι-ΚΟΑ pY1334 /1335? ενδιάμεσο, 25-50%? αρνητικό, & lt? 25%. Αποκοπής για ρΤγΓ MW194: θετική, & gt? 25% υψηλότερη τιμή σε ανοσοκηλίδωση με αντι-ρΤγΓ? ενδιάμεσο, 10-25%? αρνητικό, & lt?. 10%

Η

Στη συνέχεια σχετίζονται ΚΟΑ και κατάσταση ενεργοποίησης EGFR με SH2 προφίλ αποτελέσματα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, χωρίς επίβλεψη ομαδοποίηση των δύο ροζέτα και πολύ-Δυτικής δεδομένων αποκάλυψε ότι (amp σχήμα 5Β &.? C) περισσότερες κυτταρικές σειρές με ισχυρή σύμπλεγμα ενεργοποίησης ΚΟΑ σε μια ξεχωριστή, σφιχτή ομάδα. Τόσο από ροζέτα και πολύ-Δυτικής βασίζεται σε προφίλ, οι περισσότερες κυτταρικές γραμμές με έντονη ενεργοποίηση ΚΟΑ σχηματίζουν ένα ενιαίο σύμπλεγμα (cluster 1) που διαχωρίζεται σαφώς από τις άλλες κυτταρικές σειρές. Όλες αυτές οι κυτταρικές σειρές επιδεικνύουν επίσης ισχυρή φωσφορυλίωση τυροσίνης των πρωτεϊνών συν-μεταναστεύει με EGFR, γεγονός που υποδηλώνει συν-ενεργοποίηση των ΚΟΑ και σηματοδότηση EGFR σε αυτή την ομάδα. Πληροφορίες σχετικά με την ενεργοποίηση του ΚΟΑ και EGFR μας επέτρεψε να συγκρίνουν ευρύτερα αποτελέσματα ομαδοποίησης με βάση την ροζέτα και πολύ-Δυτικής δεδομένων. Αυτή η σύγκριση έδειξε ότι τέσσερις διακριτές συστάδες ήταν κοινά και για τις δύο μεθόδους (Σχ. 5Β, C), που περιλαμβάνει 15 από τις κυτταρικές σειρές 22 (7 γραμμές συμπλέγματος διαφορετικά όταν συγκρίνονται τα δύο μέθοδοι). Ομάδα 1 αποτελείται από κυτταρικές σειρές με έντονη ενεργοποίηση και των δύο EGFR και σηματοδότηση ΚΟΑ. Cluster 3 αποτελείται από κυτταρικές σειρές με μεταλλαγμένο RAS και χαμηλή EGFR και δραστηριότητα ΜΕΤ, τα οποία είναι όλα erlotinib ανθεκτικά. Cluster 2 μπορούν να χωριστούν σε δύο υποομάδες με βάση την κατάσταση μετάλλαξης EGFR. Από κλινική άποψη αυτές οι δύο υποομάδες είναι το πιο ενδιαφέρον: η μία αποτελείται από γραμμές με μεταλλαγμένο EGFR που είναι ανθεκτικά erlotinib (cluster 2β), και το άλλο περιλαμβάνει αρκετές γραμμές με wt EGFR που είναι ευαίσθητα erlotinib

Στη συνέχεια. ελεγχθεί αν η δέσμευση του κάθε ανιχνευτών τομέα ατομική SH2 συνδέθηκε με την ενεργοποίηση ΚΟΑ. Με ανάλυση ροζέτα βρήκαμε ότι η δέσμευση του 46 SH2 τομέων συσχετίστηκε σημαντικά με φωσφορυλίωση ΚΟΑ (Σχ. 6Α). Παρομοίως, πολύ-Western ανάλυση έδειξε ένα μεγάλο αριθμό ζωνών που συνδέονται με την κατάσταση φωσφορυλίωσης ΚΟΑ (Σχ. 6Β). Ο αριθμός των τομέων SH2 και των δεικτών που σχετίζονται με την ενεργοποίηση ΚΟΑ είναι μεγαλύτερες από εκείνες που συνδέονται με την μετάλλαξη του EGFR, γεγονός που υποδηλώνει δραστηριότητα ΚΟΑ έχει μια πιο βαθιά επίδραση στη συνολική μοτίβα ρΤγΓ από μετάλλαξη του EGFR.

(Α) περιοχές SH2 συσχετίζεται με MET φωσφορυλίωση (p & lt? 0,01, q & lt? 0,1). Bar οικόπεδο σήματος SH2 για την υψηλή και χαμηλή φωσφορυλίωση ΚΟΑ. Σημαίνει και δείχνονται τα πρότυπα σφάλματα. Για την ανάλυση αυτή «Low» περιλαμβάνει τόσο ενδιάμεσων και χαμηλής /αρνητική κατηγορίες (Εικ. 5). (Β) Άπω Δυτική ζώνες συγκεκριμένους τομείς συσχετίζεται με φωσφορυλίωση ΚΟΑ. Χρωματιστά κουτιά υποδεικνύουν στατιστική σημαντικότητα σε δοκιμασία Mann-Whitney για τις διαφορές (Q & lt? 0,1). (Γ) H1648 κύτταρα εκτέθηκαν για τον έλεγχο (DMSO), 1000 ηΜ erlotinib (Ε), 1000 ηΜ PHA665752 (Ρ), ή συνδυασμός (Ε + Ρ) για 3 ώρες και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Προϊόντα λύσης από μη επεξεργασμένα κύτταρα H820 χρησίμευσε ως έλεγχος για την p-ΚΟΑ. Αντι-β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει ίση φόρτωση. (D) Η βιωσιμότητα των κυττάρων για H1648 κύτταρα που εκτίθενται σε 60 ηΜ erlotinib (Ε), 300 ηΜ PHA665752 (Ρ), ή συνδυασμός (Ε + Ρ).

Η

Το γεγονός ότι η κυτταρική γραμμή H1648 σύμπλεγμα σφικτά με την κυτταρική γραμμή H820, το οποίο είχε προηγουμένως βρεθεί να έχουν μια ενεργοποίηση μετάλλαξη EGFR, μαζί με το ΚΟΑ ενίσχυση [20], πρότεινε ότι H1648 κύτταρα μπορεί να είναι παρόμοια με H820 στο εν λόγω κατάντη σηματοδότησης οδηγείται από δύο EGFR και ΜΕΤ. Για να δοκιμάσετε αυτό, εκτίθενται H1648 κυττάρων σε αναστολείς του EGFR (erlotinib), ΚΟΑ (PHA665752) [36], ή ο συνδυασμός και εξετάζεται κατάντη Akt και ενεργοποίηση ERK (Εικ. 6C). Παρατηρήσαμε μέτριες μειώσεις στη φωσφορυλιωμένη Akt και ERK σε απόκριση είτε αναστολέα μόνη της, αλλά ισχυρή αναστολή κατά διπλή EGFR και αναστολή ΚΟΑ. Οι επιδράσεις στην κυτταρική βιωσιμότητα αντικατοπτρίζεται τις απαντήσεις σηματοδότησης, καθώς ο συνδυασμός των δύο παραγόντων κατέληξε σε αυξημένη παρεμπόδιση της κυτταρικής ανάπτυξης (Εικ. 6D). Έτσι τα παγκόσμια πρότυπα ρΤγΓ, δοκιμάστηκε με SH2 προφίλ, να προβλέψει την ενεργοποίηση ΚΟΑ και μπορεί να προβλέψουν την ανταπόκριση στην ΚΟΑ ΤΚΙ σε αυτές τις κυτταρικές σειρές.

διατάραξη της παγκόσμιας προφίλ ρΤγΓ από TKIs

Εμείς θα χρησιμοποιηθούν την επόμενη SH2 προφίλ τομέα να διερευνήσει τις αλλαγές στην παγκόσμια φωσφορυλίωση τυροσίνης σε κύτταρα που εκτίθενται σε TKIs. Η προσδοκία μας ήταν ότι οι αλλαγές στα μοτίβα δέσμευσης SH2 θα μπορούσαν να συσχετιστούν με βιολογικές αντιδράσεις σε αναστολείς, και ότι οι ανιχνευτές για την οποία η δέσμευση μειώθηκε έντονα σε ΤΚΙ-ανέστειλε κύτταρα ήταν πιθανό να αποτελούν βασικές οδούς για την ανάληψη δράσης ΤΚΙ. Τέσσερις πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές (Η292, Η441, Η358 και HCC827) έχουν εν συντομία εκτέθηκαν σε erlotinib, έναν αναστολέα του EGFR, ή dasatinib, έναν αναστολέα κινάσης οικογένειας SRC που αναστέλλει πολλαπλά τυροσίνης και σερίνης /θρεονίνης [37], [38], [39]. Αυτές οι κυτταρικές σειρές διαφέρουν σε μεγάλο βαθμό στις απαντήσεις τους σε αυτά ΤΚΙ. Σε HCC827 κυττάρων με την ενεργοποίηση μετάλλαξης του EGFR, και οι δύο αναστολείς επάγει απόπτωση? σε Η358 και Η292 κυττάρων με wt EGFR, και οι δύο παράγοντες επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου? και Η441 κυττάρων με wt EGFR είναι ανθεκτικοί σε δύο παράγοντες ([9] και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Rosette και πολύ-δυτικό προφίλ SH2 διεξήχθη για τις τέσσερις κυτταρικές σειρές σε αμφότερες τις επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ομάδων.

δεδομένα σύνδεσης Rosette (log

2 φορές αλλαγές στην αγωγή έναντι μη επεξεργασμένα ομάδες) έγιναν ορατά σε αγροτεμάχια καταρράκτη κατάταξη αλλαγές στην SH2 δέσμευσης (Σχ. 7Α, Συμπλ. Σχ. S4A). Σε HCC827, ερλοτινίμπη προκάλεσε την πλήρη κατάρρευση της ρΤγΓ σηματοδότησης, όπως μεγάλες μειώσεις στις SH2 σύνδεση παρατηρούνται για όλες σχεδόν τις ανιχνευτές. Οι πιο σημαντικές μειώσεις δεσμευτική συνέβη για την Grb2, Grap2, Vav2, και τους τομείς Vav1 SH2. Σε γενικές γραμμές παρόμοιες αλλαγές παρατηρήθηκαν κατά την αγωγή με dasatinib, υποδηλώνοντας μια επικάλυψη του μηχανισμού, ακόμη πολλαπλές μεταβολές ήταν λιγότερο για τα περισσότερα ανιχνευτές, συνεπής με λιγότερο ισχυρά αποτελέσματά της επί της φωσφορυλίωσης του EGFR [9]. Παρόμοια με HCC827, δέσμευση όλων σχεδόν των ιχνηλατών τομέα SH2 ήταν σημαντικά μειωμένη σε ΤΚΙ επεξεργασμένα Η358 κύτταρα, και υπήρχε ακόμη μεγαλύτερη ομοιότητα μεταξύ των αποκρίσεων σε erlotinib και dasatinib. Σε Η441, το οποίο είναι ανθεκτικό σε ΤΚΙ, erlotinib και dasatinib προκαλούν παρόμοια συνολικά μοντέλα της αλλαγής ως Η358. Ωστόσο, η μείωση στην SH2 πρόσδεση αμβλύνθηκε σε Η441 σε σύγκριση με Η358 και HCC827, και η σύνδεση του μεγαλύτερου αριθμού περιοχών SH2 αυξάνεται με την παρουσία και των δύο αναστολέων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Τέλος, Η292 έδειξε το λιγότερο δραματικές αλλαγές στον τομέα SH2 πρόσδεσης, και συνολικού σχεδίου της ανταπόκρισης στη θεραπεία ΤΚΙ σε αυτή την κυτταρική σειρά ήταν πολύ διαφορετική από τις άλλες τρεις. Επιπλέον, τα προφίλ erlotinib και dasatinib ήταν πιο ανόμοιες σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Τα ίδια δείγματα αναλύθηκαν επίσης με πολύ-κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα περιορισμένο σύνολο SH2 ανιχνευτές (Suppl. Σχ. S4B). Σύκο.