Αφηρημένο

Η υπερέκφραση και /ή ενεργοποίηση μετάλλαξης κινάσης FLT3 διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο οδήγηση στην παθογένεση της οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας (AML). Ως εκ τούτου, φαρμακολογικές αναστολείς της FLT3 έχουν θεραπευτικό δυναμικό για τη θεραπεία AML. Σε αυτή τη μελέτη, BPR1J-340 ταυτοποιήθηκε ως νέο ισχυρός αναστολέας FLT3 από βιοχημική δραστηριότητα κινάσης (IC

50 περίπου 25 ηΜ) και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (GC

50 περίπου 5 ηΜ) δοκιμασίες. BPR1J-340 ανέστειλε την φωσφορυλίωση της FLT3 και STAT5 και προκάλεσε απόπτωση σε FLT3-ITD

+ κύτταρα AML. Προσδιορίστηκαν οι φαρμακοκινητικές παράμετροι της BPR1J-340 σε αρουραίους. BPR1J-340 κατέδειξε επίσης έντονη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου και οπισθοδρόμηση σε FLT3-ITD

+ AML μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού. Η θεραπεία συνδυασμού της vorinostat αναστολέα HDAC (SAHA) με BPR1J-340 που επάγεται συνεργικά απόπτωση μέσω Mcl-1 ρύθμιση προς τα κάτω σε MOLM-13 κύτταρα AML, υποδεικνύοντας ότι ο συνδυασμός των εκλεκτικών αναστολέων FLT3 κινάσης και HDAC αναστολείς θα μπορούσαν να παρουσιάζουν κλινικά οφέλη σε AML θεραπεία. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι BPR1J-340 μπορεί να αναπτυχθεί περαιτέρω σε προκλινικές και κλινικές μελέτες ως θεραπευτικά μέσα σε θεραπείες AML

Παράθεση:. Λιν WH, Yeh TK, Jiaang WT, γεν KJ, Chen CH, Huang CT, et al. (2014) Αξιολόγηση της αντικαρκινικής Επιδράσεις BPR1J-340, ένας ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας FLT3, μόνη ή σε συνδυασμό με έναν αναστολέα HDAC, Vorinostat, στο Cancer AML. PLoS ONE 9 (1): e83160. doi: 10.1371 /journal.pone.0083160

Επιμέλεια: Zhengqi Wang, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 του Ιουλίου του 2013? Αποδεκτές: 31, Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας (AML) είναι η πιο κοινή αιματολογική κακοήθεια σε ενήλικες με υψηλό ποσοστό επίπτωσης και χαμηλή πιθανότητα επιβίωσης [1], [2], [3]. AML εξελίσσεται γρήγορα, λόγω της ταχείας ανάπτυξης των μη φυσιολογικά λευκά αιμοσφαίρια που συσσωρεύονται στο μυελό των οστών και παρεμποδίζει την παραγωγή των ερυθρών αιμοσφαιρίων, αιμοπεταλίων, και φυσιολογικά λευκά αιμοσφαίρια. Εάν αφεθεί χωρίς θεραπεία, AML είναι συνήθως θανατηφόρα μέσα σε εβδομάδες ή μήνες μετά τη διάγνωση. FLT3 (FMS-όπως τυροσίνη κινάση 3), ένας υποδοχέας κυτταρικής επιφάνειας που ανήκει στην οικογένεια υποδοχέα κινάσης τυροσίνης κατηγορίας III, διαδραματίζει έναν κεντρικό ρόλο στην διαφοροποίηση και την επιβίωση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων στο μυελό των οστών [4], [5].

FLT3

είναι ένα από τα πιο συχνά μεταλλαγμένα γονίδια σε AML [6], [7]. Ενεργοποίηση μεταλλάξεις FLT3, FLT3-ITD (μια εσωτερική μετάλλαξη διαδοχικού διπλασιασμού στην παραμεμβρανική περιοχή) και flt3-TKD (α παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη εντός του τομέα κινάσης), παρατηρούνται συχνά σε περίπου 30% των ενηλίκων ασθενών AML [8], [9] , [10], [11]. mutantions FLT3 ενεργοποίησης ρυθμίζουν κριτικά λευχαιμικών μετασχηματισμό με επιτάχυνση του πολλαπλασιασμού και την καταστολή της απόπτωσης και είναι σημαντικά σχετίζονται με την κακή πρόγνωση [12], [13]. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν FLT3-ITD και FLT3-TKD ως ιδιαίτερα ελκυστική θεραπευτικοί στόχοι για την ανάπτυξη φαρμάκων στην ανθρώπινη AML.

Υπάρχουν πλέον αρκετές τάξεις των μικρών αναστολέων FLT3 μόριο που έχουν τεθεί κλινικές δοκιμές. Ωστόσο, αποτελεσματικά φάρμακα δεν έχουν ακόμα προσδιοριστεί σε κλινικές [14], [15], [16]. Παρά το γεγονός ότι αυτοί οι αναστολείς έχουν επιδείξει ελπιδοφόρα αντικαρκινική δραστικότητα σε

in vitro

και

in vivo

προκλινικά μοντέλα, κλινικά θετικές αποκρίσεις σε ασθενείς που λαμβάνουν αναστολείς AML FLT3 μονοθεραπεία περιορισμένη λόγω της παροδική μείωση περιφερικών βλαστών αλλά όχι βλαστών μυελού των οστών ή η εμφάνιση του αναστολέα ανθεκτικών μεταλλάξεων FLT3 σε ασθενείς [17], [18], [19], [20]. Ως εκ τούτου, συνδυαστικές στρατηγικές αναστολέων FLT3 και άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες μπορεί να είναι ευεργετική προσεγγίσεις για τη βελτίωση της θεραπείας με αναστολέα FLT3 και να ξεπεραστούν οι αδυναμίες της θεραπείας [21], [22]. Ο αναστολέας FLT3 CEP-701 (lestaurtinib) σε συνδυασμό με το πρότυπο AML χημειοθεραπευτικούς παράγοντες έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει τις κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς AML [23]. Επιπλέον, αποακετυλάσης ιστόνης (αναστολείς HDACi), μια κατηγορία ενώσεων που μπορεί να προκαλέσει διακοπή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και θάνατο των κυττάρων με την αλλαγή της κατάστασης ακετυλίωση τόσο ιστόνης και μη-ιστόνης πρωτεΐνες, μπορεί να ενισχύσει την δραστικότητα των αναστολέων FLT3 επί AML κυτταρική απόπτωση [ ,,,0],24], [25], [26]. Η vorinostat HDACi (SAHA) παρουσιάζει την κλινική δραστηριότητα στην AML? Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα του ως μοναδικός παράγοντας είναι μόνο μέτρια [27], [28]. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε τα στοιχεία που χαρακτηρίζουν το φαρμακολογικό προφίλ ενός νέου αναστολέα της κινάσης FLT3, BPR1J-340, και διευκρινιστεί ο πιθανός μοριακός μηχανισμός των ισχυρά συνεργιστικά αποτελέσματα σε συνδυασμό με SAHA σε FLT3-ITD

+ κύτταρα.

Η ένωση BPR1J-340 εμφανίζει ισχυρή ανασταλτική δράση FLT3, με 50% ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) της 25ης ± 5 ηΜ και ανάπτυξη ανασταλτικά αποτελέσματα επί FLT3-ITD

+ λευχαιμία MOLM-13 και MV4 ? 11 κύτταρα με GC

50 αξία των 3.4 ± 1.5 και 2.8 ± 1.2 nM, αντίστοιχα. Τα IC

50 τιμές ήταν περίπου 1 nM έναντι FLT3-ITD και 1 nM έναντι φωσφορυλίωση STAT5 στην MV4? 11 κύτταρα. Επιπλέον, BPR1J-340 εμφανίζει ευνοϊκές φαρμακοκινητικές ιδιότητες και σημαντική δραστικότητα κατά των όγκων σε FLT3-ITD μοντέλα ποντικού ξενομοσχεύματος. Ο συνδυασμός του αναστολέα SAHA HDAC με BPR1J-340 εκθέματα ισχυρά συνεργιστική αντι-λευχαιμία αποτέλεσμα σε + κύτταρα FLT3-ITD. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν τη θεραπευτική δυνατότητα της BPR1J-340 και SAHA σε AML και να υποστηρίξει προκλινικά ή κλινικά ανάπτυξή της.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

Οι αναστολείς FLT3, BPR1J-340 και AC220, συντέθηκαν από το εργαστήριο μας. Η vorinostat αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης (SAHA) αγοράστηκε από SelleckBio (Houston, TX, USA). Όλοι οι αναστολείς διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε μία συγκέντρωση αποθέματος 10 mM. Η αντι-FLT3 (SC-480, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), αντι-pFLT3-Tyr591 (# 3461, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) αντι-STAT5 (# 9363, Cell Signaling Technology ), αντι-pSTAT5-Tyr694 (# 9351, Cell Signaling Technology), αντι-διασπάται πολυ ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση (PARP) (# 9542, Cell Signaling Technology), αντι-Mcl-1 (# 4572, Cell Signaling Technology), αντι-κασπάσης 3 (# 9662, Cell Signaling Technology) και αντι-β-ακτίνης (Gtx110546, GeneTex, Irvine, CA, USA) αντισώματα αγοράστηκαν για ανάλυση Western blotting. Η παρασκευή των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, FLT3 (υπολείμματα Y567-S993), VEGFR1 (υπολείμματα R781-I1338) και VEGFR2 (υπολείμματα V789-V1356), για ανάλυση κινάσης βιοχημική περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Οι VEGFR3 (υπολείμματα M800-Y1363) πρωτεΐνες αγοράστηκαν από την Upstate (Billerica, ΜΑ, USA)

Κυτταρική καλλιέργεια

RS4?. 11, MV4? 11, κύτταρα U937 και Κ562 ελήφθησαν από American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). MOLM-13 κύτταρα αγοράστηκαν από Deutsche Sammlung νοη Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Γερμανία). Όλες οι λευχαιμικές κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, USA) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ, USA). Η ΗΕΚ293Τ και FLT3-επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen, USA) μέσο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Τα άλλα 14 μη-λευχαιμικών κυτταρικών σειρών, HCC827, H1975, H1650, H2228, NCIH460, Α431, HCT-116, ΜΚΝ45, MiaPaCa-2, RT4, MCF-7, Huh7, Hep3B και Detroit 551, καλλιεργήθηκαν σε μέσο σύμφωνα με τις συστάσεις ATCC.

σε vitro δραστικότητα κινάσης δοκιμασία

Η FLT3 και δοκιμασίες κινάσης VEGFR1 /2 κινάσης-Glo πραγματοποιήθηκαν όπως αναφέρθηκε από την προηγούμενη μελέτη μας [30]. Η ανάλυση δραστηριότητα VEGFR3 διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο που περιγράφεται εις τον ποσοτικό προσδιορισμό VEGFR1 /2. Το προφίλ αναστολής κινάσης και ανασταλτική δραστικότητα των FLT3-D835Y, CSF1R, και TrkA προσδιορίστηκαν από την Invitrogen SelectScreen® υπηρεσία profiling κινάσης (Carlsbad, California, USA).

Κυτταρική βιωσιμότητα και ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορισμούς

η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με μία δοκιμασία MTS ως διεξάγεται όπως η μέθοδος που περιγράφεται προηγουμένως [31]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 10.000 κυττάρων ανά φρεάτιο για 16 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με φορέα ή διάφορες συγκεντρώσεις της ένωσης σε μέσο. Η αλλαγή στην βιώσιμων κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με χρήση της μεθόδου MTS (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με το συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή ή από κύτταρο μετρώντας κάτω από ένα μικροσκόπιο. Το

50 τιμή GC ορίστηκε ως η ποσότητα της ένωσης που προκάλεσε μια μείωση κατά 50% της βιωσιμότητας των κυττάρων σε σύγκριση με DMSO επεξεργασμένο (όχημα) ελέγχου και υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Prism έκδοση 4 του λογισμικού (Graph-Pad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με trypan μέθοδο αποκλεισμού μπλε βαφής. Κύτταρα (1 χ 10

4 mL

-1) καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές ποσότητες της δοκιμαστικής ένωσης και τις ίδιες ποσότητες των όχημα για 72 ώρες. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε με χρώση trypan blue dye χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο στον υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο μετά τη θεραπεία φαρμάκου. Το αποτέλεσμα εκφράστηκε ως η μέση τιμή ± S.D. από εις τριπλούν προσδιορισμούς.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris, ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 1 mM PMSF, και 1 mM DTT). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA). Οι μεμβράνες ανοσοστυπώθηκαν με κατάλληλα αντισώματα και ανιχνεύθηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου SuperSignal (Pierce, Rockford, IL, USA) που ακολουθείται από έκθεση σε φιλμ ακτίνων Χ.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) αναλύσεις χρησιμοποιώντας χρώση αννεξίνης V-FITC. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση μετά την επεξεργασία φαρμάκου και επαναιωρήθηκαν σε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα πρόσδεσης που περιέχει 2,5 mM ασβεστίου (Ca2 +). Τα κύτταρα επωάστηκαν με Αννεξίνη V-FITC (Biolegend, San Diego, CA) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, τα δείγματα ανασυστάθηκαν με ρυθμιστικό σύνδεσης 1 χ και υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρία ροής FACS Calibus (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) για την ανάλυση της αννεξίνης V-θετικά πληθυσμού που χρησιμοποιεί CellQuest Pro (BD Bioscience) και FlowJo (Treestar, Inc., San Κάρλος, CA).

η φαρμακοκινητική ανάλυση του BPR1J-340

Οι χρήσεις των ζώων εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών των Εθνικών Υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα. Εν συντομία, αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley βάρους 300-400 g το καθένα ελήφθησαν από BioLASCO, Ταϊβάν Co., Ltd., Ilan, Ταϊβάν. Μία ημέρα πριν από τη χορήγηση, οι αρουραίοι χειρουργικά παρασκευάζονται με κάνουλα σφαγίτιδας φλέβας και-νηστικά όλη τη νύκτα (~18-20 hr). Το νερό ήταν διαθέσιμο

κατά βούληση

. Τρόφιμα παρεσχέθη στις 4 ώρες μετά τη χορήγηση. Ενιαία 1,5 mg /kg ενδοφλέβια δόση BPR1J-340, ως PEG400 /νερό (80/20, ν /ν) διάλυμα, χωριστά χορηγήθηκε σε ομάδες των 3 αρουραίων η καθεμία μέσω της σφαγίτιδας φλέβας κάνουλα. Στους 0 (πριν από την δόση), 2, 5, 15 και 30 λεπτά. και σε 1, 2, 4, 6, 8 και 24 ώρες μετά την δοσολόγηση, ένα δείγμα αίματος συλλέχθηκε. Το πλάσμα διαχωρίστηκε από το αίμα με φυγοκέντρηση (14.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C σε φυγόκεντρο Beckman Model AllegraTM 6R) και αποθηκεύτηκε σε καταψύκτη (-20 ° C) μέχρι την ανάλυση. Όλα τα δείγματα πλάσματος αναλύθηκαν με LC-MS /MS. δεδομένα συγκέντρωσης στο πλάσμα αναλύθηκαν με μη-διαμερισματική μέθοδος φαρμακοκινητικής αποφασιστικότητα.

Υποδόρια πειράματα ξενομοσχεύματος όγκου

Άντρας γυμνά ποντίκια (Nu-Fox1nu) των οκτώ εβδομάδων αγοράστηκαν από BioLasco (Ilan, Ταϊβάν ). Τα γυμνά ποντίκια (η = 5~7 ανά ομάδα) εμβολιάστηκαν υποδόρια με MOLM-13 (1 χ 10

6 κύτταρα /πλευρό). Όλα τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προσδιορίστηκαν να είναι απαλλαγμένα από Mycoplasma spp πριν τον εμβολιασμό. Όταν οι όγκοι έφθασαν μέγεθος 100~200 mm

3 και ένα μεγάλο μέγεθος & gt? 500 mm

3, τα ζώα ομαδοποιήθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το BPR1J-340 (5 και 20 mg /kg, ίν) ή όχημα όπως ελέγχει μία φορά την ημέρα για 5 ημέρες την εβδομάδα για δύο ή τρεις εβδομάδες. μεγέθη του όγκου μετρήθηκαν και υπολογίστηκαν με τον τύπο του μήκος Χ πλάτος

2/2 μετά την έναρξη των θεραπειών. Το μέγεθος του όγκου και το σωματικό βάρος των ζώων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα μετά τον ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Στο τέλος της μελέτης, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με εισπνοή διοξειδίου του άνθρακα ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση. Η σημαντική διαφορά μεταξύ του επεξεργασμένου και του οχήματος ελέγχου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη

ANOVA

και

Student-Newman-Keuls

δοκιμή. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

In vitro προφίλ κινάσης της BPR1J-340

BPR1J-340 , μία ουρία-υποκατεστημένες 3-φαινυλ-1

H

-5-pyrazolylamine ένωση με βάση, σχεδιάστηκε μέσω χημικής τροποποίησης του σουλφοναμιδίου σειρά παραγώγων (BPR1J-097 series) με σχέση δομής-δραστικότητας (SAR) μελέτης (Εικ. 1) [31], [32]. Για κινάσης διαλογή ειδικότητα αναστολής, BPR1J-340 ελέγχθηκε έναντι 59 κινασών πρωτεΐνης που καλύπτουν τις μεγάλες ογκογόνο κινάσες της ανθρώπινης πρωτεΐνης kinome. Αυτό το προφίλ αναστολής κινάσης απεκάλυψε ότι BPR1J-340 είναι ένας πολύ εκλεκτικός αναστολέας κινάσης και οι περισσότεροι από δοκιμάστηκαν κινασών δεν ανέστειλε σημαντικά σε συγκέντρωση 100 ηΜ (Πίνακας S1). Στη συνέχεια, οι πιο ισχυρές κινάσες από την διαλογή 59 κινάσες περαιτέρω αξιολογήθηκαν. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, BPR1J-340 αναστέλλεται ισχυρά άγριου τύπου FLT3 (IC

50 = 29 ± 5 ηΜ, σε σύγκριση με ABT869 με IC

50 από 38 ± 3 ηΜ,), μεταλλαγμένο FLT3-D835Y (IC

50 = 19 nM), CSF1R (FMS) (IC

50 = 78 nM), ΚΟΚ (VEGFR2) (IC

50 = 28 ± 9 nM), και FLT4 (VEGFR3) (IC

50 = 29 ± 7 nM). Επιπλέον, BPR1J-340 ανέστειλε TrkA, η οποία συνδέεται με την ανάπτυξη και τη μετάσταση των καρκίνων του μαστού, με μια IC

50 τιμή 8 ηΜ. Με δεδομένη την υψηλή ομοιότητα των θυλάκων δέσμευσης ΑΤΡ του FLT3 και τις κινάσες Aurora, μετρήθηκαν η ανασταλτική δράση προς την κατεύθυνση Aurora Α και Aurora Β. Το IC

’50 της BPRJ-340 προσδιορίστηκαν να είναι 1,040 nM και 1.344 nM για Aurora Α κινάση και κινάση Aurora Β, αντίστοιχα. Στο σύνολό τους, BPRJ-340 είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας κινάσης με

in vitro

δραστικότητα έναντι υποδοχέων κινασών τυροσίνης FLT3, VEGFR2, VEGFR3 και TrkA

BPR1J-340.:

N

1-(3-4-[([(5-ethyl-3-isoxazolyl)amino]carbonylamino)methyl]phenyl-1

H

-5-pyrazolyl)-4-[(4-methylpiperazino)methyl]benzamide. BPR1J-097:

N

1-(3-3-[(phenylsulfonyl)amino]phenyl-1

H

-5-pyrazolyl)-4-(4-methylpiperazino)benzamide.

BPR1J-340 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των FLT3-ITD

+ κύτταρα

Μετά τις εκλεκτικός και ισχυρός δράση αναστολής αναπτύξεως της BPR1J-340 αποδείχθηκε σε FLT3-ITD φέρουν λευχαιμικά κύτταρα, η ανασταλτική δράση πολλαπλασιασμού των κυττάρων ελέγχθηκε σε ένα πάνελ των λευχαιμικών και μη-λευχαιμικών κυττάρων. BPR1J-340 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό του FLT3-ITD

+ κύτταρα (MOLM-13 και MV4? 11 FLT3-εξαρτώμενη κυτταρικές γραμμές) με GC

50 περίπου 5 ηΜ. Κύτταρα που δεν εξαρτώνται από τη FLT3 σηματοδότησης για την ανάπτυξη, συμπεριλαμβανομένης της RS4? 11, U937, και Κ562 λευχαιμικά κύτταρα [33], [34], [35], και οι μη-λευχαιμικές κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν ήταν είτε ασθενώς αναστέλλεται ή δεν ανεστάλησαν με BPR1J-340 (Πίνακας 2). Η ανάπτυξη του FLT3-ανεξάρτητο RS4? Κυτταρική γραμμή 11, η οποία περιέχει άγριου τύπου FLT3 ήταν μόνο ασθενώς αναστέλλεται από BPR1J-340 με GC

50 τιμή 770 ± 360 ηΜ. Η ευαισθησία προς BPR1J-340 ποικίλλει μεταξύ των FLT3 κυττάρων που εξαρτώνται από MOLM-13 /MV4? 11 και FLT3-ανεξάρτητο κύτταρα RS4? 11, γεγονός που υποδηλώνει ότι η οδός σηματοδότησης FLT3 σε + κύτταρα FLT3-ITD είναι σχεδόν εντελώς διαταραχθεί από BPR1J-340. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι BPR1J-340 θα μπορούσε να αναστείλει δραστηριότητα FLT-ITD από

in vitro

βιοχημικές και κυτταρικές δοκιμασίες. Συνολικά, BPR1J-340 είναι ένας ισχυρός και εξαιρετικά εκλεκτικός αναστολέας για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων FLT3-οδηγείται.

Η

BPR1J-340 αναστέλλει FLT3-STAT5 σηματοδότησης

Για να αντιμετωπίσει το αν BPR1J-340 ήταν σε θέση να αναστέλλουν την οδό σηματοδότησης FLT3 σε κύτταρα FLT3 με γνώμονα, MV4? 11 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις BPR1J-340 για 1 ώρα, και το καθεστώς φωσφορυλίωσης του FLT3 και STAT5 (Signal Transducer και ενεργοποιητής μεταγραφής 5), ένα κρίσιμη κατάντη διαμορφωτή που παίζει σημαντικό ρόλο στην FLT3-ITD μεταγωγής σήματος για την επέκταση των κυττάρων και την επιβίωση, εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, BPR1J-340 κατέστειλε την φωσφορυλίωση FLT3 και STAT5 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με IC

50 τιμή περίπου 1 ηΜ. Για να διερευνηθεί η διαφορά στην ευαισθησία μεταξύ FLT3-WT και των ενεργοποιώντας μεταλλάξεις FLT3-ITD και FLT3-D835Y να BPR1J-340, κύτταρα ΗΕΚ293Τ γενετική μηχανική για να εκφράζουν flt3-WT ή μεταλλάξεις FLT3 (FLT3-ITD, FLT3-D835Y) αναλύθηκαν [31 ]. Οι ΗΕΚ293Τ-FLT3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με BPR1J-340 σε διάφορες συγκεντρώσεις για 1 ώρα, και FLT3 συνδέτη (50 ng /mL) προστέθηκε για 5 λεπτά για να προετοιμάσει το κυτταρικό λύμα για την ανίχνευση των αλλαγών στην φωσφορυλίωση FLT3 με ανάλυση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η φωσφορυλίωση όλων των FLT3-WT, FLT3-ITD και FLT3-D835Y ανεστάλη από BPR-1J340, με IC

50 τιμές από 10 έως 100 ηΜ. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι BPR-1J340 αναστέλλει τη φωσφορυλίωση κυτταρικής FLT3 και διαμορφώνει το μονοπάτι σηματοδότησης FLT3, ιδιαίτερα την οδό FLT3-ITD

(Α) MV4?. 11 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BPR1J-340 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 1 ώρα. Η κατάσταση φωσφορυλίωσης των FLT3 και STAT5 αξιολογήθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western. (Β) κύτταρα ΗΕΚ 293Τ επιμολύνθηκαν με FLT3-κβ, FLT3-ITD-, ή πλασμίδια FLT3-D835Y εκφράζουν για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις BPR1J-340 για 1 ώρα. Η κατάσταση φωσφορυλίωσης FLT3 στα επιμολυσμένα κύτταρα εκτιμήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western.

Η

BPR1J-340 επάγει απόπτωση σε FLT3-ITD κύτταρα που εκφράζουν

Καθώς η αναστολή της FLT3 αποτελέσματα σηματοδότησης σε ένα απώλεια του δυναμικού ανάπτυξης και επαγωγή απόπτωσης σε FLT3-ITD εκφράζοντα κύτταρα, διερευνήθηκε η επίδραση του BPR1J-340 επί των κυττάρων αποπτωτική απόκριση σε FLT3-ITD

+ κύτταρα. Η MOLM-13 και MV4? 11 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BPR1J-340 σε διάφορες συγκεντρώσεις για 24 ώρες και αναλύθηκαν για την επαγωγή της απόπτωσης με χρήση δραστικής κασπάσης-3 και διασπασμένη PARP (πολυ-ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση) ανάλυση. Η ικανότητα των BPR1J-340 για να επάγει απόπτωση είναι εμφανής, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, όπου παρατηρήθηκε σημαντική διάσπαση της κασπάσης-3 (δραστική κασπάση-3) και PARP (ενεργός PARP) σε MOLM-13 και MV4? 11 κύτταρα κατεργασμένα με BPR1J- 340 σε 10 nm.

κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι BPR1J-340 ήταν σε θέση να επάγει απόπτωση σε FLT3-ITD με γνώμονα FLT3-ITD

+ κυττάρων AML. MOLM-13 (Α) και MV4? 11 κύτταρα (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BPR1J-340 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες και τα κυτταρολύματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι της κασπάσης-3 και PARP (πολυ- πολυμεράση ADP-ριβόζη). (Πλήρους μήκους κασπάση-3 (FL-κασπάσης-3), η διάσπαση της κασπάσης-3 (CL-κασπάσης-3), πλήρους μήκους πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (FL-PARP), η διάσπαση της PARP (CL-PARP) ).

η

SAHA σε συνδυασμό με BPR1J-340 ενισχύει την κυτταροτοξικότητα εναντίον FLT3-ITD

+ κυττάρων που εκφράζουν

Μερικές αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDACi) θα ενισχύσει την κυτταροτοξική δραστηριότητα των FLT3 αναστολέας για FLT3-ITD

+ κυττάρων μέσω της υποβάθμισης των FLT3-ITD και STAT5 [24], [26], [36], [37]. Για να προσδιορίσετε αν SAHA, μια HDACi, να συνεργούν με BPR1J-340 για να ενισχύσει την κυτταροτοξικότητα σε FLT3-ITD κυττάρων που εκφράζουν παρεμβαίνοντας με τον άξονα FLT3-ITD και STAT5, εξετάστηκαν οι συνδυασμένες επιδράσεις της SAHA και BPR1J-340 για κυτταροτοξικότητα. Ο ρυθμός ανάπτυξης κυττάρου του MOLM-13 και MV4? 11 με SAHA και BPR1J-340 συνδυαστικής θεραπείας μειώθηκε σε σύγκριση με την θεραπεία ενός μόνο φαρμάκου (Σχ 4Α.). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της θεραπείας SAHA επί BPR1J-340 επαγόμενη απόπτωση σε FLT3-ITD-εκφράζοντα κύτταρα. θεραπεία Sole με SAHA (στα 300 nm) για 48 ώρες δεν αύξησε το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων στον πληθυσμό ελέγχου 10%, ενώ SAHA /BPR1J-340 συν-θεραπεία οδήγησε σε μεγαλύτερη διέγερση απόπτωσης (αυξημένη κατά 20% σε MOLM-13 και 12% σε MV4? 11 κύτταρα, αντίστοιχα) σε σύγκριση με τη θεραπεία BPR1J-340 φάρμακο μόνο (Εικόνα 4Β και Σχ 4C)… Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι SAHA ενισχύσει BPR1J-340 επαγόμενη απόπτωση σε FLT3-ITD

+ κύτταρα. Εμείς διευκρινιστεί περαιτέρω τα επίπεδα της πρωτεΐνης της FLT3-ITD και STAT5 σε αυτό το SAHA /BPR1J-340 ενισχύεται συν-θεραπεία κυτταροτοξικότητα. Εμείς αντιμετωπίζεται MOLM-13 κύτταρα με SAHA, BPR1J-340, ή ο συνδυασμός τους για 20 ώρες. Σε σύγκριση με τη θεραπεία ενός μόνο φαρμάκου, ο συνδυασμός του SAHA και BPR1J-340 μείωσε remarkedly τα επίπεδα πρωτεΐνης του FLT3-ITD και STAT5 (Εικ. 4D). Επιπλέον, η θεραπεία BPR1J-340 /SAHA μειωθεί ριζικά επίπεδα πρωτεΐνης Mcl-1 (μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων-1, ένα αντι-αποπτωτικό μέλος της οικογένειας Bcl-2) σε FLT3-ITD

+ κύτταρα (Σχ. 4D). Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τη μείωση της Mcl-1 μπορεί να εξηγήσει την ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα ακόμη και τη φωσφορυλίωση STAT5 στο Tyr694 πλήρως εμποδίσει από BPR1J-340 (Εικ. 4D) Mcl-1 παίζει ουσιαστικό ρόλο στην αντίσταση στη χημειοθεραπεία σε κύτταρα AML [38]. Έτσι, με στόχο MCL-1 χρησιμοποιώντας SAHA /BPR1J-340 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για να ξεπεράσει την αντίσταση των ναρκωτικών στην FLT3-ITD-θετικών AML. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μείωση των συνολικών επιπέδων της πρωτεΐνης του FLT3-ITD, STAT5 και Mcl-1 με την προσθήκη SAHA παρέχει ένα πιθανό μηχανισμό για να εξηγήσει την αυξημένη κυτταροτοξικότητα με SAHA /BPR1J-340 συγχορήγηση.

MOLM-13 ή MV4? 11 κύτταρα σπάρθηκαν σε μια αρχική συγκέντρωση 1 × 10

5 κύτταρο mL

-1 για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με BPR-1J340 είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με SAHA σε δεικνυόμενες συγκεντρώσεις. (Α) Τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν μετά από χρώση με trypan μπλε χρωστική σε υποδεικνυόμενα χρονικό σημείο (Β) στο 48-ώρες μετά την αγωγή, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο και τα ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Γ) Ο εκπρόσωπος κυτταρομετρία ροής ιστογράμματα των δοκιμασιών αννεξίνης θετικών αποπτωτικών κυττάρων στις 48 ώρες της θεραπείας φαρμάκου (D) MOLM-13 κύτταρα κατεργάστηκαν με φάρμακα για 20 ώρες, και στη συνέχεια ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western για να αξιολογηθούν οι αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης με το υποδεικνυόμενα αντισώματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του Student

t-test

. * Δηλώνει σημαντική διαφορά σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος (* p & lt? 0,05, * * * p & lt? 0,01). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των πολλαπλών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Οι φαρμακοκινητικές παράμετροι του BPR1J-340

Για να αξιολογήσει τις φαρμακοκινητικές ιδιότητες των BPR1J-340, μετρήθηκε η συγκέντρωση στο πλάσμα της BPR1J-340 πάνω ένα χρονικό διάστημα 24-hr μετά από μία μόνο ενδοφλέβια χορήγηση (Σχ. 5 και Πίνακας 3). Μετά από ένα /kg ενδοφλέβια δόση 1,5 mg χορηγήθηκε σε αρουραίους Sprague-Dawley, BPR1J-340 επιτυγχάνεται μέγιστη συγκέντρωση 7,9 μΜ (4296 ng /mL) στο πλάσμα σε 2 λεπτά μετά τη χορήγηση. Η συγκέντρωση στο πλάσμα υπερέβαινε 80 ng /mL για 6 ώρες και παρέμεινε σταθερό στο 9,9 ng /mL (C

24 ωρών, 18 ηΜ) μετά από 24 ώρες δοσολόγηση. Ως εκ τούτου, η συγκέντρωση του BPR1J-340 στο πλάσμα φτάνει επαρκή επίπεδα ώστε να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση των FLT3-ITD

+ κυττάρων με βάση την κυτταρική πειράματα. Η ολική κάθαρση σώματος ήταν 20,4 ± 5,2 ml /min /kg και ο όγκος κατανομής σε σταθερή κατάσταση (Vss) ήταν 10,3 ± 2,5 L /kg για BPR1J-340 σε αρουραίους. Η φαινόμενη ημίσεια ζωή στο πλάσμα ήταν περίπου 8,8 ώρες.

Μια εφάπαξ ενδοφλέβια δόση εφόδου (1,5 mg /kg) της BPR1J-340 χορηγήθηκε σε ενήλικες αρσενικούς αρουραίους Sprague-Dawley (n = 3). Τα δεδομένα απεικονίζουν μέσες τιμές (η = 3) ± S.D. των συγκεντρώσεων στο πλάσμα της BPR1J-340 σε κάθε χρονική στιγμή

Η

κατασταλτική δράση αύξηση του όγκου των BPR1J-340

FLT3-ITD

+ MV4?. 11 και MOLM- 13 ξενομοσχεύματα έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την αξιολόγηση του

in vivo

αποτελεσματικότητα των αναστολέων FLT3 κατά AML [39], [40]. Εμείς και άλλες ομάδες έχουν βρει το MV4? Μοντέλο ξενομοσχεύματος 11 είναι αισθητά πιο ευαίσθητος σε αναστολείς FLT3 [30], [31], [39], [41]. Για να εκτιμηθεί η ικανότητα του BPR1J-340 να αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος AML, μπορούμε επομένως επιλέξει το μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου MOLM-13. BPR1J-340 χορηγήθηκε ενδοφλεβίως (5 mg /kg qd) τις ημέρες 1-5 κάθε εβδομάδα για 3 εβδομάδες? από το τέλος αυτής της περιόδου οι MOLM-13 όγκοι είχαν φθάσει σε μέσο όγκο 200 mm

3. Η θεραπεία μέσω αυτής αγωγή οδήγησε σε πλήρη υποχώρηση του όγκου σε όλα τα ζώα την ημέρα 22? πλήρη παλινδρόμηση (CR) συνέβη σε 4 από τα 6 ζώα που έλαβαν θεραπεία εντός 31 ημερών παρατήρησης μετά τη θεραπεία (Εικ. 6Α). Σε αυτή τη μελέτη αποτελεσματικότητας, οι ποντικοί με μεγαλύτερους όγκους (μέσος όγκος όγκου 630 mm

3, η = 3) δόθηκε μια εφάπαξ ενδοφλέβια δόση 20 mg /kg BPR1J-340 τις ημέρες 1-5 κάθε εβδομάδας για 2 εβδομάδες, η οποία οδήγησε σε πλήρη και διαρκή υποχώρηση του όγκου χωρίς να ψηλαφητών όγκων που εντοπίζονται κατά την 48-ημέρα παρακολούθηση (Εικ. 6Β). Καμία απώλεια σωματικού βάρους ή θνησιμότητα παρατηρήθηκε σε ζώα που έλαβαν αγωγή με οποιαδήποτε δόση του BPR1J-340 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι BPR1J-340 μειώνει αποτελεσματικά το μέγεθος του όγκου σε ενδοφλέβιες δόσεις των 5 και 20 mg /kg /ημέρα? BPR1J-340 είναι καλά ανεκτή σε ποντικούς σε αυτές τις αποτελεσματικές δόσεις.

BPR1J-340 (ίν) είναι δραστικό έναντι ανθρώπινης οξείας λευχαιμίας MOLM-13 όγκοι που αναπτύσσονται υποδορίως και μπορεί να μειώσει το μέγεθος των όγκων, ακόμη και μετά οι όγκοι ήταν αφήνονται να αναπτυχθούν σε μέγεθος & gt? 630 χιλιοστά

3. (Α) Η in vivo αντικαρκινική δράση του BPR1J-340 στο γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντίκια MOLM-13. Η ανάπτυξη του ξενομοσχεύματος όγκου ανεστάλη με BPR1J-340 [5 mg /kg, ί.ν.]? p & lt? 0,05 σε σύγκριση με τη θεραπεία του οχήματος. (Β) Η υποδόρια ανάπτυξη ενός MOLM-13 όγκου του μεγάλου μεγέθους (& gt? 630 mm

3) σε γυμνά ποντίκια θα μπορούσε να αναστραφεί σημαντικά από BPR1J-340 [20 mg /kg, IV]

Συζήτηση

Δεδομένου ότι η μη φυσιολογική έκφραση του FLT3 κινάσης, συμπεριλαμβανομένων ενισχυμένων ή ανωμάλως ενεργοποιούνται FLT3, συχνά παρατηρείται στα βλαστοκύτταρα των ασθενών AML, FLT3 αντιπροσωπεύει ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο επιλογής για την ανάπτυξη φαρμάκων σε AML. Μέχρι σήμερα, έχουν αρκετές πιθανοί αναστολείς FLT3 έχουν αναπτυχθεί και εξετάζονται σε ασθενείς AML, συμπεριλαμβανομένων lestaurtinib (CEP701) και MIDOSTAURIN (PKC412) σε κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ και του sunitinib malate (Sutent), sorafenib (Nexavar), quizartinib (AC220), και crenolanib (CP-868,596) σε δοκιμές φάσης ΙΙ. Ωστόσο, FLT3 κινάσης στόχευση με μονο-θεραπεία με σημερινή πειραματική παράγοντες δεν αποδώσει θεραπευτικά οφέλη σε ασθενείς με AML. Επισήμανε ότι η ανώμαλη ενεργοποίηση της FL Τ3 ή /και ανθεκτικών στα φάρμακα FLT3, συμπεριλαμβανομένων των προ-υπάρχουσες και απέκτησε μεταλλάξεις ανθεκτικών στα φάρμακα, θα μπορούσε σπάνια να ανασταλεί πλήρως από τη θεραπεία μονοθεραπεία. Έτσι, υπάρχει μία ανάγκη για την ταυτοποίηση των πιο αποτελεσματικοί αναστολείς της FLT3 και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων, συμπεριλαμβανομένων των στρατηγικών συνδυασμού φαρμάκων που στοχεύουν όχι μόνο FLT3 αλλά επίσης μόρια που σχετίζονται με την οδό επιβίωσης FLT3 να παρακάμπτει ρεύμα αντίστασης στα φάρμακα. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε την αποτελεσματικότητα του νέου αναστολέα FLT3 BPR1J-340 σε διάφορες

in vitro

και

in vivo

μοντέλα AML και να προσδιορίσουν συνεργιστικά αποτελέσματα με HDACi SAHA για την κυτταροτοξικότητα των FL3 -ITD-εκφράζοντα κύτταρα σε

in vitro

αναλύσεις.

Προηγουμένως, εντοπίσαμε μια σειρά σουλφοναμιδίου του 3-φαινυλ-1

H

-5-pyrazolylamine με βάση ενώσεις ως ισχυροί αναστολείς της FLT3 όπως BPR1J-097 [31]. Στο πλαίσιο της συνεχιζόμενης στις προσπάθειές μας για την ανάπτυξη ισχυρών αναστολέων FLT3, σκοπεύαμε να αναζητήσετε άλλες σειρές αναστολέων που όχι μόνο αυξάνεται η

in vitro

ανάπτυξης ανασταλτική επίδραση στα κύτταρα AML, αλλά και παρέτεινε τη διάρκεια της δράσης

στο vivo

. Μέσω ορθολογικό σχεδιασμό, ανακαλύψαμε BPR1J-340, η οποία είναι μια σειρά ουρία 3-φαινυλ-1

H

-5-pyrazolylamine αναστολέως FLT3, με αναστέλλει αποτελεσματικά FLT3-WT ή δραστηριότητα FLT3-ITD

in vitro

και

in vivo

. Επειδή πολλαπλές οδούς σηματοδότησης επηρεάζουν την ανάπτυξη και μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων, πολλοί από τους αναστολείς σε κλινική ανάπτυξη είναι σχεδιασμένα ως πολλαπλών-στόχων αναστολείς που μπλοκάρουν έναν περιορισμένο αριθμό των ογκογόνων κινασών. Έτσι, η επιλεκτικότητα κινάσης προφίλ των BPR1J-340 διεξήχθη για να προσδιορίσει πρόσθετους στόχους σε ένα πάνελ των 59 δοκιμαστεί ογκογόνων κινασών. Σε περαιτέρω βιοχημική δοκιμασία, BPR1J-340 επέδειξε ισχυρή αναστολή (20-190 ηΜ) εναντίον των αγγειογόνων κινασών VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 και, τα οποία όλα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο μικροπεριβάλλον του όγκου (Πίνακας 1). Επιπλέον, BPR1J-340 αναστέλλεται ισχυρά δραστηριότητα TrkA με IC

50 αξία των 8 nM. Στο σύνολό τους, BPRJ-340 χαρακτηρίζεται ως εκλεκτικός πολλαπλών-στόχων αναστολέα με ισχυρή δραστικότητα αναστολής έναντι FLT3-WT, FLT3-D835Y, VEGFR2, VEGFR3, και TrkA. Αυτό το προφίλ της αναστολής μπορεί να επιτρέψει BPRJ-340 να αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου απ ‘ευθείας μέσω της αναστολής της παρεκκλίνουσα οδό σηματοδότησης FLT3 και έμμεσα με τη στόχευση της αγγειογένεσης του όγκου. BPR1J-340 μπορούν επίσης να έχουν κλινικό δυναμικό σε όγκο οδηγείται από αφύσικα εκφράζονται υποδοχείς TrkA, η οποία μπορεί να συμβεί στον εγκέφαλο, τον προστάτη, του παγκρέατος, και του καρκίνου του μαστού [42], [43], [44], [45].

BPR-1J340 ανέστειλε φωσφορυλίωση κυτταρικών FLT3 και διαμορφωμένο το FLT3 οδό σηματοδότησης, η οποία οδήγησε σε αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή απόπτωσης. BPR1J-340 επέδειξε ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης, κυρίως στην FLT3 κυττάρων που εξαρτώνται (MOLM-13 και MV4? 11), αλλά όχι σε FLT3-ανεξάρτητο κύτταρα. BPR1J-340 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των μεταλλαγμένων + κύτταρα FLT3-ITD

με GC

50 2-6 nm και ανέστειλε φωσφορυλίωση FLT3-ITD με IC

50 10 nM? ακόμη και τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τον μεταλλαγμένο FLT3-D835Y επίσης αναστέλλονται από BPR1J-340 με IC

50 από περίπου 100 ηΜ. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, BPR1J-340 που επάγεται αποτελεσματικά απόπτωση σε FLT3-ITD

+ κύτταρα.

αναστολείς HDAC μπορεί να εμφανίζουν δραστικότητα αναστολής ανάπτυξης έναντι κυττάρων AML και να βελτιώσει σημαντικά την θεραπευτική αποτελεσματικότητα των αναστολέων FLT3 [24], [46]. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι HDACi LBH589 συν ένας αναστολέας FLT3 θεραπεία συνδυασμού (PPKC412, AC220) θα μπορούσε να συνεργικά επάγουν την απόπτωση μέσω FLT3-ITD και την υποβάθμιση STAT5 [26]. Κατέδειξε επίσης ότι ενεργοποιούνται κασπάσης-3 (CL-κασπάσης 3) συμβάλλει στην degrdation της FLT3-ITD και STAT5 [26]. αποικοδόμηση FLT3-ITD αναφέρθηκε επίσης δευτερογενώς προς HDACi επαγόμενη πάνω ρύθμιση UBCH8 και προς τα κάτω ρύθμιση της HSP90 [36], [47]. Mcl-1, αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη που προάγει την επιβίωση των FLT3-ITD

+ κύτταρα μέσω ενεργοποίησης STAT5, ρυθμίζεται προς τα κάτω από την αναστολή FLT3 [25]. Η HDACi SAHA επάγεται επίσης ρύθμιση προς τα κάτω του Mcl-1 [48]. Επιπλέον, Mcl-1 πρωτεΐνη είναι μια άμεση υπόστρωμα διάσπασης του ενεργοποιημένου κασπάσης-3 [49].