Abstract

N-Μγο κατάντη-ρυθμιζόμενο γονίδιο 2 (

NDRG2

) είναι ένα γονίδιο καταστολής όγκου υποψήφιος, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ανάπτυξης του όγκου. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η έκφραση του

NDRG2

γονιδίου σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης (BC) σε ιστούς και διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης, και να αναζητήσουν κλινική και παθολογική σημασία. Ενενήντα επτά καρκίνωμα κύστης και 15 κανονικές τομές ιστού της ουροδόχου κύστης αναλύθηκαν αναδρομικά με ανοσοϊστοχημεία. Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης ανθρώπινη κυτταρική σειρά Τ24 μολύνθηκε με LEN-

NDRG2

ή LEN-LacZ. Τα αποτελέσματα του

NDRG2

υπερέκφραση σε κύτταρα Τ24 και Τ24 ξενομοσχεύματα γυμνού ποντικού μετρήθηκαν με καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων, καμπύλες ανάπτυξης όγκων, ανάλυση κυτταρομετρίας, Western Blot και δοκιμασία Transwell ροής.

NDRG2

ήταν άκρως εκφράζεται σε φυσιολογικό ιστό της ουροδόχου κύστης, αλλά απουσιάζει ή σπάνια εκφράζονται σε cacinomatous ιστούς (χ

2 = 8.761, p 0.01).

Group

G0/G1

G2/M

S

Apoptosis

Control48h62.42±2.053.55±0.5534.03±1.655.53±0.6272h69.84±2.602.79±0.4427.73±0.905.57±0.59LEN-LacZ 48h48h64.24±1.923.56±0.5632.21±0.666.49±1.2572h69.63±2.403.08±0.4027.29±0.616.52±1.17LEN-NDRG2 48h48h71.40 ± 0.378.50 ± 0.4720.10 ± 0.3010.25 ± 2.4372h77.61 ± 0.997.05 ± 0.1515.34 ± 0.1712.88 ± 3.01Table 3. Το ποσοστό της φάσης του κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική απόπτωση που προκαλείται από LEN- NDRG2 στα κύτταρα Τ24.

CSV Λήψη CSV

(Α) LEN-

NDRG2

κατέστειλε την ανάπτυξη όγκων σε σύγκριση με το LEN-LacZ. Εκτός από ακαταπίεστος την ανάπτυξη του όγκου, η ομάδα LEN-LacZ ήταν βρέθηκαν να έχουν μεταστάσεις λεμφαδένα. (Β) καμπύλες ανάπτυξης του όγκου. (C) Οι αναλογίες των μαζών όγκου σε μάζες ποντικού σε διαφορετικές ομάδες. (D) μάζες των όγκων σε δύο ομάδες. Οι καμπύλες και τα ιστογράμματα καταρτίστηκαν με βάση τις μέσες τιμές ( . n = 5) σε δύο ομάδες Τα αποτελέσματα φαίνονται ως μέση τιμή ± SD (*, ** ρ & lt?. 0.001)

η

δείχθηκε με μικροσκοπία φθορισμού ότι η αποτελεσματικότητα της μόλυνσης ήταν υψηλή ον περισσότερο από 95% (Σχήμα 3Α). Real-time PCR ανάλυση έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της

NDRG2

στην LEN-

NDRG2

ομάδα ήταν σημαντικά υψηλότερο από ότι στο LEN-lacZ (αρνητική ομάδα) και οι ομάδες CON (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 3Β). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι το

NDRG2

επίπεδο πρωτεΐνης στο LEN-

NDRG2

Ομάδα ήταν υψηλότερη από ότι στο LEN-LacZ και ομάδες CON (Σχήμα 3C). Η LEN-

NDRG2

προκάλεσε επίσης η υπερέκφραση του

NDRG2

στα κύτταρα Τ24. Ο σχηματισμός καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων και αποικιών έδειξε ότι η υπερέκφραση του

NDRG2

θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων Τ24 περισσότερο από εκείνη των στις άλλες δύο ομάδες. Στις δοκιμασίες καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων, η αναστολή ξεκίνησε στην τρίτη ημέρα και έγινε πιο προφανώς μετά (F≥44.58,

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 4). Η FCA έδειξε ότι τα κύτταρα Τ24 με LEN-

NDRG2

θα μπορούσε να αυξήσει το ποσοστό των κυττάρων σε G

0 /G

1 σε σύγκριση με τις ομάδες LEN-LacZ και αρνητικό μάρτυρα, υποδεικνύοντας ότι η ovexpression του

NDRG2

είχε κάνει τα Τ24 κύτταρα να συλλάβουν του κύκλου G1 (48 ώρες: F = 41.92,

P

& lt? 0,01? 72 h: F = 24.11,

P

& lt? 0,01). (Σχήμα 5, Πίνακας 3) Η κηλίδα western έδειξε ότι η υπερέκφραση του

NDRG2

μειωτικά CDK4 και cyclinD1, ενώ ρυθμίζουν προς τα πάνω p21 στα κύτταρα Τ24 (Σχήμα 6α, β).

(Α) Η επίδραση του

NDRG2

υπερέκφραση σε κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και τη μετάσταση των ρυθμιστικών αρχών, όπως προσδιορίστηκε με κηλίδα western. (Β) Σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεϊνών, κανονικοποιημένη σε επίπεδα GAPDH. Κηλίδες Western αναλύθηκαν με λογισμικό μονοδιάστατη Kodak Digital Science. Το σχήμα δείχνει την τάση της κάθε ομάδας όπως υποδεικνύεται. Όλες οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα για τουλάχιστον τρεις φορές. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD (* ρ & lt? 0,01).

Η

δοκιμασίες μετανάστευσης Transwell και επικαλυμμένα με Matrigel δοκιμασίες εισβολή transwell διεξήχθησαν με κύτταρα Τ24. Οι αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες ελήφθησαν από την κάτω επιφάνεια του φίλτρου transwell, και τα κύτταρα που μετανάστευσαν ή εισέβαλαν βάφτηκαν με Kristallviolet. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 7Α, η επεμβατική δυναμικό, το οποίο καθορίζεται από την ικανότητα των κυττάρων να εισβάλλουν ένα φράγμα Matrigel, ήταν επίσης σημαντικά κατέστειλε σε

NDRG2

κύτταρα που υπερεκφράζουν (

P

& lt? 0,01 ). Επιπλέον, η αναγκαστική έκφραση του

NDRG2

σε κύτταρα Τ24 κατέστειλε σημαντικά μετανάστευσή τους μέσα από το transwell (Ρ & lt? 0,01). (Εικόνα 7Β)

Σε δοκιμασίες κηλίδος Western, σε σύγκριση με το LEN-LacZ ομάδα και τυφλές, η ομάδα του LEN-

NDRG2

μπορεί να καταστείλει MMP-2, το επίπεδο έκφρασης της ΜΜΡ-9 πρωτεΐνης σε Τ24 κυττάρων (Σχήμα 7C, D). ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 εκφράζεται υψηλά σε μετάσταση καρκίνου της ουροδόχου κύστης, οπότε η

NDRG2

πιθανό ανέστειλε την μετάσταση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης με τη ρύθμιση της έκφρασης της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9.

Οι καμπύλες ανάπτυξης όγκου συντάχθηκε με μέτρηση του μεγέθους των όγκων. Όλα τα γυμνά ποντίκια επέζησαν μετά από ενέσεις με φακοϊό. Τα κύτταρα Τ24 ενέθηκαν δύο εβδομάδες αργότερα, ο όγκος του όγκου των δύο ομάδων άρχισαν να εμφανίζονται με διαφορετικό τρόπο. Από τρεις εβδομάδες, η διαφορά στον όγκο του όγκου άρχισε να παρουσιάζει στατιστικά σημαντική (F≥31.65, ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 8Β). Σε σύγκριση με την ομάδα LEN-LacZ, το βάρος του όγκου με LEN-

NDRG2

ήταν σημαντικά ελαφρύτερο (F≥39.82, ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 8D). Η αναλογία του βάρους του όγκου σε βάρος ποντικού έδειξε ότι η φυσική κατάσταση των ποντικών σε LEN-

NDRG2

ομάδα ήταν πολύ καλύτερη από εκείνη των ποντικών στην ομάδα LEN-LacZ (F = 39,81, ρ & lt? 0.001) (Εικόνα 8C), υποδεικνύοντας ότι η υπερέκφραση του

NDRG2

θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη των όγκων. Κατά anatomizing τα ποντίκια, σύστοιχο λεμφαδενικές μεταστάσεις παρουσιάστηκαν στην ομάδα LEN-LacZ, αλλά δεν υπάρχουν άλλα όργανα που εμπλέκονται? Ωστόσο, στην LEN-

NDRG2

Ομάδα καμία οποιαδήποτε μεταστατική βλάβη βρέθηκε (Σχήμα 8Α). κηλίδα Western έδειξε ότι το

NDRG2

πρωτεΐνη υπερεκφράζεται στους όγκους των LEN-

NDRG2

ομάδα, και ότι η υπερέκφραση του

NDRG2

μειωτικά cyclinD1, CDK4, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9? και ρυθμίζεται αυξητικά p21

in vivo

(Σχήμα 9Α, Β).

Συζήτηση

Περίπου το 75% όλων των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης επαναληφθεί μέσα στα πρώτα 5 έτη [14], αυτή η υψηλό ποσοστό υποτροπής του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και των σημαντικών μεταστατικό δυναμικό της έκαναν τη φροντίδα και την πρόγνωση των ασθενών να προσβληθεί. Ως εκ τούτου, να αυξηθούν οι πρώτες ποσοστό διάγνωσης, αλλά και για τη δημιουργία νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων χρειάζονται επειγόντως μέσω της έρευνας του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

NDRG2

είναι ένα γονίδιο καταστολής όγκων υποψήφιος, και μια σειρά από μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και την μετάσταση [15,16]. Τα αποτελέσματά μας στην παρούσα μελέτη προέρχονται από τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης υποστηρίζουν αυτά τα πρώιμα συμπεράσματα.

Έχουμε αποδείξει ότι

NDRG2

παίζει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης που είναι παρόμοια με το ρόλο της σε άλλους κακοήθεις όγκους. Αποτελέσματα Η ανοσοϊστοχημεία έδειξε ότι η θετική επίπεδο έκφρασης του

NDRG2

σε ιστούς καρκινώματος της ουροδόχου κύστης ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς ουροδόχου κύστης. Τα επίπεδα έκφρασης του

NDRG2

μειώνεται καθώς ο βαθμός κακοήθειας καρκινώματος κύστης αυξημένη. Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση του

NDRG2

ήταν αντιστρόφως ανάλογη με c-myc, παρόμοια με αυτή που παρατηρείται σε άλλα κύτταρα του όγκου. Εν τω μεταξύ, η

NDRG2

επίπεδα έκφρασης στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές (Τ24, 5637 και BIU-87) ήταν χαμηλότερη από την κανονική κυτταρική σειρά κύστης (SV-HUC-1).

λεντιϊοί έχουν αποδειχθεί ότι είναι κατάλληλος για γονιδιακή θεραπεία, επειδή μπορούν να σταθερή ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή για να παρέχει μακροπρόθεσμη έκφραση του γονιδίου-στόχου, επιπλέον, έχουν φακοϊούς επιβεβαιώθηκαν να είναι προοδευτικά ασφαλής από την ανάπτυξη των διαιρούμενων συστημάτων πλασμίδιο για παραγωγή φορέα για την πρόληψη της δημιουργίας της ικανότητα αντιγραφής του ιού [17].

Οι έρευνες διεξάγονται από Liu et al. υποδεικνύεται ότι

NDRG2

ήταν ένα νέο γονίδιο στόχο που ρυθμίζεται από ρ53 και

NDRG2

επίπεδα mRNA και η πρωτεΐνη μπορεί να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ένα ρ53-εξαρτώμενο τρόπο. Και ανέφερε περαιτέρω ότι η αποσιώπηση του

NDRG2

εξασθενεί ρ53 απόπτωση [18]. Εν τω μεταξύ, αναφέρθηκε ότι

NDRG2

μπορούσε πλειορύθμιση της έκφρασης του ρ53 σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [19]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι

NDRG2

ήταν ένας σημαντικός παράγοντας στη ρύθμιση των καρκινικών κυττάρων απόπτωση. Εν τω μεταξύ, ο CDC20 ρυθμιζόταν από το ρ53 να αναστέλλει τα κακοήθη καρκινικά κύτταρα αναπτύσσονται [20]. Η κυκλίνη D1 παίζει σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό κύκλο, δεσμεύεται σε εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες (CDK4 /6), και προωθεί την φωσφορυλίωση της RB1, ενορχήστρωση εξέλιξη από το σημείο περιορισμού G1 [21].

NDRG2

μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση των πρωτεϊνών (ρ21, cyclinD1 και CDK4) σε καρκινικά κύτταρα κύστης μέσω αυξητική ρύθμιση της ρ53. Χρησιμοποιήσαμε φακοϊό μεσολάβηση

NDRG2

υπερέκφραση στρατηγική για να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ24, να προωθήσει την απόπτωση τους τόσο

in vitro

και

in vivo

? ο μηχανισμός αυτός έχει demostracted ρυθμίζοντας την έκφραση των πρωτεϊνών p21, cyclinD1 και CDK4, τα οποία είναι σημαντικά στην απόπτωση των κυττάρων και του κύκλου.

Πρόσφατα, πολλές εκθέσεις δείχνουν ότι

NDRG2

μπορεί να διαδραματίσει ζωτικό ρόλο την αναστολή της μετάστασης όγκου. Έχει αναφερθεί ότι

NDRG2

μπορούσε να ανταγωνισθεί μετασχηματιστικής ανάπτυξης factorβ1 μεσολάβηση εισβολή των καρκινικών κυττάρων από ειδικά κάτω ρύθμιση της έκφρασης της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 2 και λαμινίνη 332 συνιστώσες οδού, με ταυτόχρονη καταστολή της δραστηριότητας Rho ΟΤΡάσης σε ηπατοκυτταρικά καρκινώματα [22 ]. Η ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 ήταν υψηλή έκφραση σε διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης και μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης [21,23]. Σε αυτή τη μελέτη, δοκιμασία κηλίδος Western κατέδειξε ότι LEN-

NDRG2

σε κύτταρα Τ24 σχετίστηκε με σημαντική μείωση της MMP-9 έκφρασης και ελαφρώς μειωμένη ΜΜΡ-2 έκφραση που υποδηλώνει ότι

NDRG2

-overexpression δύναται ρυθμίζουν την έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 και αναστέλλουν την ικανότητα εισβολής μεταστατικών καρκινικών κυττάρων κύστης. Το συμπέρασμα αυτό υποστηρίζεται τόσο από

in vivo

και

in vitro

δοκιμασίες. Έχουμε την υποψία ότι η έκφραση του

NDRG2

καταστέλλει σημαντικά την ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 με τη ρύθμιση της σηματοδότησης του NF-kB στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα [24].

Εν κατακλείδι, έχουμε κατέδειξε την antioncogenic ρόλο του

NDRG2

στην ανάπτυξη και εισβολή καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Δεδομένου ότι

NDRG2

εμπλέκεται σε πολλές πτυχές της εξέλιξης του όγκου, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, εισβολή και τη μετανάστευση, αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, περισσότερες έρευνες εξακολουθούν να χρειάζονται για την περαιτέρω διαλεύκανση του μηχανισμού

NDRG2

. Έρευνα προς αυτή την κατεύθυνση θα δώσει επιτέλους νέες μέθοδοι για την έγκαιρη διάγνωση, νέα θεραπεία και μετεγχειρητική οθόνη στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.