Αφηρημένο

Στόχοι

Cervicovaginal υγρού (CVF) μπορεί να θεωρηθεί ως πιθανή πηγή των βιοδεικτών για ασθένειες του κατώτερου γυναικείο αναπαραγωγικό σύστημα. Το υγρό μπορεί εύκολα να συλλεχθεί, προσφέροντας έτσι νέες δυνατότητες, όπως η ανάπτυξη της αυτο δοκιμές. Ο στόχος μας ήταν να εντοπίσει μια πρωτεΐνη βιοδείκτη CVF για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ή προκαρκινικών κατάσταση.

Μέθοδοι

Μια μελέτη διαφορικών πρωτεομική συστάθηκε χρησιμοποιώντας δείγματα CVF από υγιή και προκαρκινικές γυναίκες. φασματική καταμέτρηση ετικέτα χωρίς εφαρμόστηκε για την ποσοτικοποίηση αφθονία πρωτεΐνης.

Αποτελέσματα

Η ανάλυση proteome αποκάλυψε 16 υποψήφιες βιοδείκτες της οποίας

άλφα-actinin-4

(p = 0,001) και

ισοένζυμο πυροσταφυλική κινάση M1 /​​M2

(p = 0.014) ήταν πιο ελπιδοφόρα. Επαλήθευση της

άλφα-actinin-4

με ELISA (n = 28) έδειξε ότι ο υποψήφιος βιοδεικτών διάκριση μεταξύ των δειγμάτων από υγιή και τόσο χαμηλού κινδύνου και HPV λοίμωξη από γυναίκες υψηλού κινδύνου (p = 0,009). Επιπρόσθετη ανάλυση του διαμήκους δειγμάτων (n = 29) έδειξε ότι

α-ακτινίνη-4

επίπεδα συσχετίζονται με επιμονή του ιού και της εκκαθάρισης, με διάκριση των περίπου 18 pg /ml.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CVF είναι μια εξαιρετική πηγή πρωτεΐνης βιοδεικτών για την ανίχνευση των κάτω γυναικείων παθήσεων γεννητικού συστήματος και ότι

άλφα-actinin-4

προέρχεται από CVF είναι ένα πολλά υποσχόμενο υποψήφιο βιοδείκτη για την προκαρκινική κατάσταση Καρκίνος του τραχήλου της μήτρας. Περαιτέρω μελέτες σχετικά με την ευαισθησία και την εξειδίκευση αυτού του βιοδείκτη θα αποδείξει τη χρησιμότητά του για τη βελτίωση τρέχοντα προγράμματα προσυμπτωματικού ελέγχου ή /και η χρήση του για ένα τεστ αυτο-διάγνωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Van Raemdonck GAA, Tjalma WAA, Coen ΕΚ, Depuydt CE, Van Ostade XWM (2014) Προσδιορισμός των πρωτεϊνικών βιοδεικτών για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας χρησιμοποιώντας ανθρώπινα Cervicovaginal Fluid. PLoS ONE 9 (9): e106488. doi: 10.1371 /journal.pone.0106488

Επιμέλεια: Rakesh Ν Veedu, Το Πανεπιστήμιο του Κουίνσλαντ, Αυστραλία

Ελήφθη: 24, Μάρτη του 2014? Δεκτές: 1 του Αυγούστου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Van Raemdonck et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. GVR έλαβε επιχορήγηση από το Ινστιτούτο για την Επιστήμη και την Τεχνολογία (https://www.iwt.be/english/welcome) (nr έργου . 093132). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Christophe Depuydt δηλώνει ότι είναι ο εργοδότης του Sonic Υγείας Μπενελούξ, Emiel Vloorstraat 9, 2020 Antwerpen, Βέλγιο και ότι για το καλύτερο της γνώσης του, δεν υπάρχει αντίθετα συμφέροντα, ούτε οικονομικό, επαγγελματικό ή προσωπικό, μεταξύ των δραστηριοτήτων του στο Sonic Υγείας της Μπενελούξ και αυτό το χειρόγραφο [pone-D-14-13187] ( «Αναγνώριση της πρωτεΐνης βιοδείκτες για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας με χρήση ανθρώπινων cervicovaginal ρευστό «). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Οι ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) είναι υπεύθυνη για όλες σχεδόν τις καρκίνων του τραχήλου [1]. Παρόλο που υπάρχουν περισσότερες από 150 παραλλαγές αυτού του ιού, μόνο ορισμένοι γονότυποι, όπως HPV 16, 18, 33, 45 και 58 είναι γνωστή ως υψηλού κινδύνου τύπους (HR-HPV) [2]. τύποι χαμηλού κινδύνου HPV (LR-HPV), κυρίως HPV 6 και 11, προκαλούν σπάνια γεννητικών όγκων? Ωστόσο, προκαλούν οξυτενή κονδυλώματα (κονδυλώματα anogenital) [3]. Επίμονη HPV ογκοπρωτείνης έκφρασης (Ε6 /Ε7) σε HPV μολυσμένα επιθηλιακά βασικά κύτταρα απορυθμίζει την κυτταρική διαίρεση [4]. Η υπερέκφραση αυτών των ιικών γονιδίων προκαλεί την απορρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, το μεταβολισμό, την απόπτωση, τη διαφοροποίηση και την γενωμική αστάθεια, όλα εκ των οποίων μπορεί να οδηγήσει σε διαδοχικά στάδια της αυχενικής ενδο-επιθηλιακά νεοπλασία (CIN 1, 2 και 3) ή πλακωδών ενδο-επιθηλιακές αλλοιώσεις (χαμηλή -grade SIL και υψηλής ποιότητας SIL). Περίπου το 85% όλων των σεξουαλικά ενεργών ατόμων θα εκτεθεί σε HPV, και η πλειοψηφία όλων των μολύνσεων HR-HPV είναι ιοσωματίου παράγουν (η οποία είναι χρονικά περιορισμένη) υποδηλώνοντας ότι εκτός από το ιικό γονότυπο, αρκετές συμπαράγοντες είναι στενά συνδεδεμένες με την επιμονή των ιικών ογκοπρωτεϊνών και τον μετασχηματισμό του τραχηλικού βλεννογόνου σε κακοήθη ιστό [5], [6].

υπάρχουν διάφοροι λόγοι για τους οποίους η ανάπτυξη μιας διαγνωστικής δοκιμασίας, με βάση cervicovaginal ρευστού (CVF), για την πρόωρη ανίχνευση του καρκίνου του τραχήλου θα ήταν επωφελής. Κατά την πρώτη, οι τρέχουσες δοκιμασίες διαλογής δεν είναι οι βέλτιστες. Λόγω της υψηλής επικράτησης του καρκίνου του τραχήλου, τα θηλυκά ηλικίας μεταξύ 25 και 65 συχνά διαλογή χρησιμοποιώντας Pap (anicolaou) επιχρίσματα, μια δοκιμή η οποία βασίζεται στην ανίχνευση των μορφολογικών αλλαγών των τραχηλικών κυττάρων του βλεννογόνου. Δυστυχώς, η χαμηλή ευαισθησία αυτής της δοκιμής μπορεί να οδηγήσει σε καρκίνο του τραχήλου διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο [7]. Τα στοιχεία σχετικά με τυχαιοποιημένες δοκιμές δείχνουν ότι HPV DNA διαλογής είναι πιο ευαίσθητη από την κυτταρολογία, αλλά η ειδικότητα είναι χαμηλότερη, πράγμα που θα οδηγήσει αναπόφευκτα σε μια υπερθεραπεία επειδή περίπου το 80% των ασθενών θετικών HPV αυθόρμητα καθαρίσει τον ιό [3]. Επιπλέον, colposcopic εξέταση είναι εντάσεως εργασίας, είναι δύσκολο να αυτοματοποιηθεί και ευάλωτα σε διεπιστημονικές και διακύμανση ενδο-παρατηρητή [8]. Η εισαγωγή ενός νέου βιοδείκτη που βοηθά τη βελτίωση της ευαισθησίας και της ειδικότητας των τρεχόντων προγραμμάτων προσυμπτωματικού ελέγχου είναι, συνεπώς, περισσότερο από ευπρόσδεκτη. Ο δεύτερος λόγος έγκειται στην εφαρμογή του CVF για τη διάγνωση. Επειδή το ρευστό μπορεί εύκολα να συλλεχθεί από το άτομο με την βοήθεια ειδικών συσκευών [9], ένα γρήγορο και απλό τεστ με βάση μια δοκιμασία δείκτη στάθμης, που εκτελούνται από τη γυναίκα τον εαυτό της, θα μπορούσε να αναπτυχθεί. Ένας τέτοιος αυτοέλεγχος θα μπορούσε να εισαχθεί π.χ. σε πληθυσμούς με περιορισμένους πόρους, όπου η άνιση επιβάρυνση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας συμβαίνει συχνά. Μάλιστα, υπολογίζεται ότι μόνο το 5% των γυναικών στις χώρες χαμηλού πόρων διαλέγονται κατάλληλα για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [10]. Η έλλειψη υποδομών υγειονομικής περίθαλψης και οικονομικό κόστος είναι οι βασικοί λόγοι για τους οποίους δεν εφαρμόζονται προγράμματα κυτταρολογίας-based. Από τις εναλλακτικές μεθόδους σήμερα διερευνηθεί σε αυτές τις περιοχές, θα μπορούσε να θεωρηθεί η χρήση ενός τεστ αυτοδιάγνωσης CVF-based. Επιπλέον, θα μπορούσαν επίσης να χρησιμοποιηθούν αυτο δοκιμές σε μελέτες παρακολούθησης των προγραμμάτων εμβολιασμού, δεδομένου ότι η επίδραση του εμβολιασμού σε σεξουαλικά ενεργές γυναίκες είναι αβέβαιη [11]. Επιπλέον, η τρέχουσα εμβόλια μόνο διεύθυνση νεοπλασίας που προκαλεί γονότυπων HPV 16 και -18 γεγονός που υποδηλώνει ότι υπό ιδανικές συνθήκες, μόνο κατ ‘ανώτατο όριο το 70% όλων των καρκίνων του τραχήλου μπορεί να προληφθεί [7], [12]. Έτσι, τουλάχιστον για τις επόμενες δεκαετίες, η προσεκτική αξιολόγηση των προγραμμάτων εμβολιασμού συνιστάται ανεπιφύλακτα και ένα απλό τεστ αυτο-διάγνωση μπορεί να βοηθήσει πολύ στην επίτευξη αυτής της ερώτησης.

Κατά το παρελθόν, αρκετές μελέτες πρωτεομική έγιναν για τον εντοπισμό βιοδείκτες για την (πρόωρη) ανίχνευση του τραχήλου. Σε διάφορες μελέτες, προκαρκινικών και υγιή τραχηλικού ιστού συγκρίθηκε και Lee

et al.

Μελετηθεί η

in vitro

συμβολή του ογκοπρωτεΐνης Ε7 στην ανάπτυξη του τραχήλου χρησιμοποιώντας μία κυτταρική γραμμή HPV-μολυνθεί [ ,,,0],13] – [20]. Αρκετοί δείκτες που συνδέονται με απορρύθμιση του κανονικού κυτταρικού κύκλου, όπως ρ16, Κί67 και κυκλίνη Ε χαρακτηρίστηκαν. Τα ευρήματα αυτά οδήγησαν σε καλύτερη κατανόηση του HPV που προκαλείται από την καρκινογένεση, αλλά μέχρι στιγμής όλα έδειξαν χαμηλή ευαισθησία ή /και ειδικότητα και, ως εκ τούτου, δεν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην κλινική.

Για την ανακάλυψη βιοδεικτών και επικύρωση, τα υγρά του σώματος είναι καλύτερα από ό, τι δείγματα ιστού επειδή τα ακόλουθα πλεονεκτήματα είναι σύμφυτα με τα περισσότερα υγρά του σώματος: (1) εύκολη πρόσβαση? (2) αποφυγή των κινδύνων δειγματοληψίας? και (3) την πιθανότητα ύπαρξης πολλαπλών δειγματοληψίας [21]. Σήμερα, το πλάσμα είναι το πιο αναλύεται βιολογικό υγρό στην αναζήτηση βιοδείκτες και έχει ήδη χρησιμοποιηθεί σε καρκίνο του τραχήλου της έρευνας [22], [23]. Ωστόσο, το πλάσμα έρχεται σε επαφή με όλα σχεδόν τα όργανα του σώματος, καθιστώντας βιοδείκτες πλάσμα λιγότερο ειδικά επειδή είναι δύσκολο να προσδιοριστεί από ποιο όργανο προέρχονται [21].

CVF μπορεί να ληφθεί με cervicovaginal πλύσεις, κολπικά επιχρίσματα , ταμπόν ή με μια συσκευή για την αυτο-δειγματοληψίας [9], [24] και έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα σε σχέση με το πλάσμα: (1) διαθέτει ένα κατώτερο υγρό όγκο /όργανο-αναλογία σε σύγκριση με το πλάσμα, με αποτέλεσμα την υψηλότερη ευαισθησία? και (2) έρχεται σε επαφή με λιγότερες συστήματα οργάνων, η οποία πιθανότατα αυξάνει την ειδικότητα των δεικτών [21], [25]. Σε αυτή τη μελέτη, θα επικεντρωθεί στην ταυτοποίηση των υποψηφίων βιοδεικτών για την αυχενική νεοπλασίας συγκρίνοντας την πρωτεϊνική σύνθεση των επιμέρους δειγμάτων CVF από υγιή και προκαρκινικών (LSIL και HSIL) γυναίκες. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι

άλφα-actinin-4

(ACTN4) είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφια βιοδείκτη για την προκαρκινική κατάσταση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και ότι αυτή η πρωτεΐνη CVF είναι πολύ κατάλληλη για την ανάπτυξη ενός τεστ αυτοδιάγνωσης.

Υλικά και Μέθοδοι

σχεδιασμός της μελέτης και το δείγμα συλλογής

Όλοι οι ασθενείς συμφώνησαν να συμμετάσχουν με γραπτή συγκατάθεση και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Αμβέρσας πανεπιστημιακό νοσοκομείο (αριθμός καταχώρησης : B30020108372). Μελέτη ειδικών κωδικών αναγνώρισης των ασθενών είχαν ανατεθεί και μεταδίδονται με τέτοιο τρόπο ώστε το απόρρητο των ασθενών διατηρήθηκε.

Όλα τα δείγματα σε αυτή την προοπτική, τυφλή, μελέτη κοόρτης ελήφθησαν από τον ίδιο γυναικολόγο (WAAT). Σε περίπτωση μη φυσιολογικά αποτελέσματα τεστ Παπανικολάου (λόγω HPV λοίμωξης ή ως ψευδώς θετικό αποτέλεσμα), και οι δύο υγιείς και προκαρκινικών ασθενείς υπόκεινται συνήθως σε ένα colposcopic εξέταση, μια διαδικασία που περιλαμβάνει την έκπλυση του κόλπου με 5% οξικό οξύ. Μετά κολποσκόπηση αυτό το υγρό πλυσίματος (που περιέχει το cervicovaginal υγρών) είναι συνήθως απορρίπτονται, αλλά συλλέχθηκαν για πρωτεομική ανάλυση. Επιπλέον, τα δείγματα του τραχήλου της μήτρας κυτταρολογία συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής colposcopic εξέταση για τον προσδιορισμό της κατάστασης κυτταρολογίας και HPV όπως περιγράφηκε προηγουμένως με τη χρήση ειδικού τύπου PCRs [26]. Όλα τα δείγματα κυτταρολογίας με βάση υγρό BD-SurePath εστάλησαν στο εργαστήριο παθολογίας (RIATOL, Τμήμα Μοριακής Διαγνωστικής, Sonic Υγείας Μπενελούξ, Αμβέρσα, Βέλγιο) για την επεξεργασία. Με βάση το συνδυασμό των colposcopic αποτελεσμάτων, τα αποτελέσματα της κυτταρολογίας και HPV του γονότυπου, υγιή και προκαρκινικών γυναίκες θα μπορούσαν να εντοπιστούν σε έναν αξιόπιστο τρόπο. Έχουμε επιλέξει τα δείγματα που προέρχονται από 6 υγιείς (κανονική κολποσκόπηση /κυτταρολογίας και HPV αρνητικό? Ομάδα Α) των γυναικών και 6 προκαρκινικών (ανώμαλη κολποσκόπηση /κυτταρολογίας και HR-HPV θετικό? Ομάδας Β) άτομα (Πίνακας 1). Όλα τα δείγματα που προέρχονται από μετεμμηνοπαυσιακές (& gt? Τρία χρόνια μετά την τελευταία έμμηνο ρύση) γυναίκες από την ίδια ηλικία (59 +/- 13 ετών). Ασθενείς που χρησιμοποίησαν φάρμακα αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Εκτός αυτού, οι ασθενείς οι οποίοι εμφάνισαν ορατά σημάδια της γυναικολογικές λοιμώξεις (π.χ. γονόρροια) ή υποστεί ένα HIV-λοίμωξης αποκλείστηκαν επίσης. Με βάση τα cervicovaginal υγρά δείγματα, οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε διαλογή για Trichomonas vaginalis. Κατά τη διάρκεια πρωτεομική ανάλυση, υγιή και προκαρκινικών δείγματα CVF πάντα αναλύονται σε ζεύγη για να ελαχιστοποιηθούν οι τεχνικές παραλλαγές της πλατφόρμας LC-MS /MS.

Η

πρωτεομική ανάλυση

Μετά τη συλλογή, τα cervicovaginal πλύσεις (25-40 ml) μεταφέρθηκαν αμέσως σε πάγο στο εργαστήριο και αποθηκεύονται στους -80 ° C. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο συμπυκνώθηκε με λυοφιλοποίηση σε έναν τελικό όγκο των περίπου 200 μL. Δείγματα πρωτεΐνης (1 mg /δείγμα) διαχωρίστηκαν και κλασματώθηκαν στην πρώτη διάσταση σε μία στήλη αντίστροφης φάσης (RP) πρωτείνη C4 HPLC. Η ενζυματική πέψη με θρυψίνη διεξήχθη και τα προκύπτοντα πεπτίδια από κάθε κλάσμα διαχωρίζονται σε μία δεύτερη διάσταση σε ένα σύστημα HPLC μικρο-τριχοειδή RP-C18. Ανάλυση φασματογράφου μάζας διεξήχθη χρησιμοποιώντας όργανο MALDI-TOF /ΤΟΡ. Με αποτέλεσμα MS /MS φάσματα από κάθε δείγμα ελέγχθηκαν ενάντια στην ανθρώπινη βάση δεδομένων Swiss-Prot (έκδοση: 57.1) χρησιμοποιώντας τη μηχανή αναζήτησης ΜΑΣΚΩΤ. Ανάλυση των ληφθέντων σύνολα δεδομένων έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Αναλυτικότερες πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στο έγγραφο S1 και το σχήμα S1.

ανάλυση ELISA

Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων LC-MS /MS, ενζυμική ανοσολογική αναλύσεις ροφητικού (ELISA) πραγματοποιήθηκαν για

άλφα-actinin-4

(ACTN4) και

ισοένζυμο πυροσταφυλική κινάση M1 /​​M2

(PKM2), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα ανθρώπινο κιτ ACTN4 ELISA (Cusabio Biotech Co. LTD.) Και μια ανθρώπινη κιτ PKM2 ELISA (USCNK Life Science Inc.) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση ACTN4 και PKM2 στην αυχενική κολπικές πλύσεις από υγιείς (n = 16) και HPV-μολύνθηκαν (n = 12) θηλυκά (τόσο πριν όσο και μετά την εμμηνόπαυση). Επιπλέον, αρκετές διαμήκη δείγματα (n = 29) εξετάστηκαν επίσης για αυτές τις δύο υποψήφιες βιοδείκτες.

Στατιστικά

Για να καθοριστεί αν η διαφορά σε αφθονία πρωτεΐνης ήταν σημαντική, κανονικοποιημένα φάσματα παράγοντες αφθονία (τιμές NSAF ) υποβλήθηκαν σε στατιστική δοκιμή. Επειδή οι επιλεγμένες πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν σε πολλά δείγματα, και ως εκ τούτου επίσης περιείχε διάφορες NSAF τιμές, χρησιμοποιήθηκε ένα μη παραμετρική Mann-Whitney U-test. Επιπλέον, ένα chi-square test διεξήχθη, οπότε ελήφθη η συχνότητα όλων των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών αναλύθηκε για να προσδιοριστεί αν ορισμένες πρωτεΐνες ήταν περισσότερο ή αποκλειστικά ανιχνεύεται περισσότερο υπό ορισμένες προϋποθέσεις. T-tests Αζευγάρωτη Student έγιναν για να αναλύσει τα αποτελέσματα ELISA. Όλες οι στατιστικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο των Κοινωνικών Επιστημών (SPSS έκδοση 18).

Αποτελέσματα

Διαφορικές μελέτη για τον χαρακτηρισμό του τραχήλου της μήτρας βιοδείκτες του καρκίνου

Για την αναγνώριση διαφορικά άφθονα πρωτεΐνες, 12 δείγματα χωρίστηκαν σε δύο ομάδες και μεμονωμένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αναλυτική πλατφόρμα πρωτεομική (Πίνακας 1). Ομάδα Α αποτελείται από 6 δείγματα από υγιή άτομα, ενώ η ομάδα Β αποτελούνταν από 6 δείγματα από προκαρκινικές άτομα. Πρωτεομική ανάλυση οδήγησε σε 846 και 825 ταυτοποιήσεις για την ομάδα Α και ομάδα Β, αντίστοιχα, που αντιπροσωπεύουν 371 (ομάδα Α) και 341 (ομάδα Β) μη-περιττές πρωτεΐνες (Εικόνα 1). Η μέση επικάλυψη μεταξύ όλων των δειγμάτων από την ομάδα Α ήταν 54% και από την ομάδα Β ήταν 53% (Πίνακας S1).

Για τα υγιή proteome 371 μοναδικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν, ενώ 341 μοναδικά των πρωτεϊνών για την προκαρκινικών proteome. Μια επικαλυπτόμενες σύνολο 238 πρωτεϊνών βρέθηκαν σε δύο των πρωτεϊνών.

Η

Μια ημι-ποσοτική ανάλυση πραγματοποιήθηκε επίσης με βάση την ετικέτα χωρίς μέθοδος NSAF (Πίνακας S2). Και για τις δύο ομάδες, οι τιμές NSAF των πρωτεϊνών που υπάρχουν στο τουλάχιστον 5 από τα 6 δείγματα αμοιβαία σχέση. Η διακύμανση σε πρωτεΐνη αφθονία μεταξύ των δειγμάτων εκφράστηκε ως το συντελεστή διακύμανσης (CV). Μια μέση τιμή CV του 60% (χαμηλότερες: 19%? Υψηλότερο: 134%) ελήφθη για την ομάδα Α (υγιής), ενώ η μέση τιμή CV του 52% (χαμηλότερες: 14%? Υψηλότερο: 99%) σημειώθηκε για την ομάδα Β .

Αναγνώριση των διαφορικά άφθονες πρωτεΐνες

Για τον εντοπισμό υποψήφιων βιοδεικτών που σχετίζονται με την προκαρκινική κατάσταση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, υγιή και προκαρκινικών των πρωτεϊνών CVF συγκρίθηκαν. Μία ποιοτική ανάλυση διεξήχθη μεταξύ των 371 ταυτοποιημένες πρωτεΐνες για την υγιή ομάδα και τα 341 ταυτοποιήσεις για την προκαρκινικών ομάδα, η οποία οδήγησε σε επικαλυπτόμενες πρωτεΐνες 238 ή 67%. Για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών με στατιστικά σημαντική διαφορά της εμφάνισης, όλοι οι ταυτοποιήσεις υποβλήθηκαν σε στατιστική δοκιμή χρησιμοποιώντας ένα τεστ chi-square Pearson. Πρωτεΐνες με μια τιμή ρ ≤ 0.05 παρατίθενται (Πίνακας 2). Από αυτούς τους υπολογισμούς, ACTN4 ταυτοποιήθηκε σε όλα τα δείγματα από προκαρκινικές ασθενείς, αλλά όχι στα δείγματα από υγιείς ασθενείς. Επιπλέον, ACTN4 πρώτιστα ταυτοποιείται με βάση την πολλά μοναδικά πεπτίδια με μία μέση βαθμολογία MASCOT πρωτεΐνη του 162 (Πίνακας S3). Η διαφορά στην αφθονία αυτής της πρωτεΐνης περαιτέρω επιβεβαιώθηκε με ELISA (βλέπε παρακάτω).

Η

Επιπλέον, μια ημι-ποσοτική σύγκριση πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί αν ορισμένες πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν τόσο στην υγιή και οι προκαρκινικές ομάδες εκφράζονται διαφορικά. Οι NSAF τιμές των αντίστοιχων πρωτεϊνών στατιστικώς δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Mann-Whitney U-test. Μόνο πρωτεΐνες με στατιστική σημαντικότητα του p ≤ 0,05 αναφέρονται (Πίνακας 3). Αυτός ο υπολογισμός οδήγησε σε τέσσερις πρωτεΐνες που χαρακτηρίζονταν από μια σημαντική διαφορά σε αφθονία μεταξύ των δύο καταστάσεων. Μόνο μία πρωτεΐνη,

απτοσφαιρίνης

, έδειξε μια ρύθμιση προς τα κάτω στην προκαρκινική κατάσταση, ενώ τρεις άλλες πρωτεΐνες,

ATP συνθάσης υπομονάδας βήτα

,

αννεξίνη Α2

και PKM2, ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω. PKM2 και

αννεξίνη Α2

έδειξε την χαμηλότερη τιμή ρ (0.01 και 0.03, αντίστοιχα) και ανιχνεύτηκαν σε 5 από τα 6 δείγματα από το προκαρκινικών ομάδα. Επειδή πολύ μεταβλητές πρωτεΐνες δεν είναι κατάλληλο υποψήφιο βιοδείκτες, η διακύμανση των αφθονίες αυτών των πρωτεϊνών υπολογίστηκε. Με τιμές CV 40% και 29% για την υγιή και προκαρκινικών ομάδα για PKM2, αντίστοιχα, αυτή η πρωτεΐνη είναι πιο κατάλληλο ως υποψήφιο βιοδείκτη σε σύγκριση με το

αννεξίνη Α2

, τα οποία είχαν τιμές 77% και 48%, αντίστοιχα.

Η

επαλήθευση των υποψηφίων βιοδεικτών

Μια ELISA διεξήχθη για να ελέγξει τις διαφορικές προφίλ των ACTN4 και PKM2. Υγιή (n = 16) και τα δείγματα του HPV-μολύνθηκαν (τόσο HR-HPV ογκογόνο (n = 8) και LR-HPV μη ογκογόνους δείγματα (η = 4)), τα οποία δεν περιλαμβάνονται στο προηγούμενο πείραμα, εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικώς διαθέσιμα κιτ (Πίνακας 4).

Η

Επίπεδα ACTN4 ήταν σημαντικά υψηλότερα στα δείγματα από μολυσμένα άτομα HR-HPV σε σύγκριση με δείγματα από υγιείς ασθενείς μη-HR-HPV λοίμωξη (p = 0,023), η οποία επιβεβαιωμένα αποτελέσματα LC-MS /MS μας. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ένα δείγμα, που προέρχονται από ένα μη-HR-HPV ασθενούς που έχει μολυνθεί, φαίνεται να είναι μια ακραία λόγω της υψηλής συγκέντρωσης ACTN4 85.6 pg /mL (βλέπε συζήτηση). Επιπλέον, οι ασθενείς με λοίμωξη από HPV-LR είχαν υψηλότερες συγκεντρώσεις ACTN4 σύγκριση με τους ασθενείς τους μη-HPV-μολύνθηκαν (p = 0,052), αλλά κάπως χαμηλότερες τιμές σε σύγκριση με τους ασθενείς μολυσμένους HR-HPV (p = 0,114). Σύγκριση των επιπέδων ACTN4 σε HPV-μολύνθηκαν (τόσο HR-και LR-λοιμώξεις) έναντι μη μολυσμένα δείγματα (υγιείς ασθενείς) έδειξαν μία σημαντική διαφορά, με τιμή ρ 0.009 (Σχήμα 2). Η υψηλότερη συγκέντρωση ACTN4 για την υγιή ομάδα (εκτός από την ακραία τιμή) ήταν 17,3 pg /ml, ενώ η χαμηλότερη συγκέντρωση για την ομάδα HR-μολύνθηκαν ήταν 30,6 pg /ml. Η χαμηλότερη συγκέντρωση του ACTN4 στην LR-μολύνθηκαν ομάδα ήταν 21,3 pg /ml, η οποία είναι υψηλότερη από την υψηλότερη τιμή της υγιούς ομάδας. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, το όριο των 18 pg /ml μπορεί να οριστεί ως η υψηλότερη τιμή του ACTN4 για τη μη-μολυσμένα κατάσταση. Δεν γραμμική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ του ιικού φορτίου και την απόλυτη συγκέντρωση της ACTN4, η οποία θεωρεί ότι ACTN4 δεν είναι απλώς ένας δείκτης για την HPV λοίμωξη, αλλά μάλλον για προκαρκινικές στάδιο.

Η συγκέντρωση των ACTN4 για τα υγιή άτομα (n = 16), οι ασθενείς με λοίμωξη HR-HPV (η = 8) και οι ασθενείς που έχουν μολυνθεί LR-HPV (η = 4). Στατιστική δοκιμή των επιπέδων ACNT-4 μεταξύ μολυσμένων ασθενών και υγιών HR-HPV οδήγησε σε τιμή ρ 0,023 και μεταξύ υγιών έναντι LR-HPV σε τιμή ρ 0.052. Όταν οι ασθενείς με λοίμωξη από HR-και LR-HPV ομαδοποιήθηκαν ως ασθενείς HPV μολυσμένα, μια ρ-τιμή 0.009 βρέθηκε μεταξύ μη μολυσμένων (υγιείς ασθενείς) και μολυσμένα ομάδες.

Η

Επιπλέον, η πιο ελπιδοφόρα ημι-ποσοτική υποψήφιος, PKM2, επαληθεύτηκε με ένα εμπορικό κιτ ELISA. Για την ανάλυση αυτή, χρησιμοποιήθηκαν τα ίδια 28 δείγματα? Ωστόσο, τα αποτελέσματα LC-MS /MS δεν επιβεβαιώθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Στη συνέχεια αναλύονται οι συγκεντρώσεις ACTN4 για ένα επιπλέον χρόνο 29 διαμήκη δείγματα (δηλαδή, τα δείγματα από τον ίδιο ασθενή σε διάφορα χρονικά σημεία) από 9 ασθενείς. Για κάθε ασθενή, τουλάχιστον τρεις διαμήκεις δειγμάτων αξιολογήθηκε (Εικόνα 3). Από αυτά τα εννέα ασθενείς, πέντε ασθενείς εκκαθαριστεί τον ιό, δύο ασθενείς είχαν εμμένουσα λοίμωξη από HPV, ένας ασθενής απέκτησε μια νέα λοίμωξη από HPV και ένας ασθενής ήταν υγιής. Παρά το γεγονός ότι ο αριθμός των ασθενών ανά ομάδα είναι μικρά, τα δείγματα αυτά μπορούν να μας βοηθήσουν να επιβεβαιώσουν τα ευρήματά μας. Μια ACTN4 ELISA πραγματοποιήθηκε σε αρκετά από τα δείγματα για τον προσδιορισμό συσχετίσεων μεταξύ των προφίλ του ιού και τα επίπεδα ACTN4 εντός ενός ασθενούς. Ωστόσο, εκτός από το τίτλο ιού, περιμέναμε επίσης τον γονότυπο και την ώρα της μόλυνσης για να επηρεάσει την έκφραση ACTN4 επειδή διαφορετικοί τύποι του ιού έχουν διαφορετικές ικανότητες και καρκινογόνες καρκίνου του τραχήλου συνήθως αναπτύσσεται μετά από ένα επίμονο HR-HPV λοίμωξης [2]. Πρόσφατα, αποδείχθηκε ότι η ανάπτυξη του τραχήλου της μήτρας προκαρκινικών (τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας τριών βαθμού? CIN3) έχει προηγηθεί μια σταθερή αύξηση του ιικού φορτίου ενός συγκεκριμένου τύπου HR-HPV, ενώ η ταχεία εκθετικά αυξανόμενο φορτίο γενικά εκκαθαρίζονται εντός 6 για 18 μήνες και συνήθως συνδέεται με χαμηλού βαθμού κυτταρολογικές ανωμαλίες [27]. Με αυτούς τους παράγοντες υπόψη, τα ακόλουθα δύο τάσεις που παρατηρήθηκαν από τα πειράματα: (1) ασθενείς που είχαν λοίμωξη σε πρώιμο στάδιο (ασθενής 1) ή εκκαθάριση του ιού (ασθενείς 2, 6, 7 και 9) είχαν αύξηση ή φθίνουσα ACTN4 επίπεδα, αντίστοιχα, και οι ασθενείς με χαμηλή ή καθόλου λοιμώξεις (5 ασθενή) ή συνεχή λοιμώξεις (ασθενείς 4 και 10) είχαν σταθερή χαμηλά ή υψηλά επίπεδα ACTN4, αντίστοιχα? και (2) για μια επίμονη λοίμωξη (ασθενείς 1, 4 και 10), η ACTN4 συσσωρευτεί.

Σύγκριση των επιπέδων ACTN4 με γονότυπο και ιικό φορτίο σε διαμήκη δείγματα από 9 διαφορετικούς ασθενείς. Παρόμοια γονότυπους απεικονίζονται στα ίδια χρώματα. Στην αριστερή πλευρά το ιικό φορτίο (σε αριθμό αντιγράφων /κύτταρο) εμφανίζεται σε μια κλίμακα λογαριθμικός ενώ στη δεξιά πλευρά η συγκέντρωση του ACTN4 εκφράζεται σε pg /ml. Η γ-τσεκούρι υποδεικνύει το χρόνο (που εκφράζεται σε ημέρες), ενώ οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν. Μια μαύρη διακεκομμένη γραμμή απεικονίζει το όριο ACTN4 17,3 pg /ml. επίπεδα ACTN4 προσδιορίστηκαν για τα χρονικά σημεία, όταν ένα δείγμα CVF ήταν διαθέσιμο.

Η

Συζήτηση

Χαρακτηρίζοντας την proteome CVF των υγιών και των προκαρκινικών ασθενείς

Σε αυτή τη μελέτη η CVF πρωτεώματος από 12 (6 υγιείς και 6 προκαρκινικών) μεμονωμένα δείγματα χαρακτηρίστηκε για τον εντοπισμό βιοδεικτών υποψήφια πρωτεΐνη για την ανίχνευση της προκαρκινικών κατάσταση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Η ανάλυση αυτών των 12 δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σε τόσο ποιοτική (παρούσα /απούσα) και ημι-ποσοτικό επίπεδο. Ο αριθμός των πρωτεϊνών ταυτοποιήσεων για κάθε ένα από τα δείγματα είναι πολύ συνεπής με προηγουμένως εκτελείται πρωτεομική μελέτες σχετικά με CVF [28].

Ο προσδιορισμός της ποσότητας των αλληλεπικαλυπτόμενων πρωτεϊνών μεταξύ των δειγμάτων μέσα σε μια ομάδα έδειξαν σημαντικές διαφορές. Μόνο το 10% όλων των πρωτεϊνών παρατηρήθηκαν σε κάθε επιμέρους δείγμα και από τις δύο ομάδες. Αυτή η ομάδα αποτελείται κυρίως από πρωτεΐνες που είναι χαρακτηριστικές του πρωτεώματος CVF, με βάση την εντόπιση τους και η βιολογική λειτουργία. Καλούμε λοιπόν αυτές τις πρωτεΐνες «χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών». Ωστόσο, ένας σημαντικός αριθμός των ταυτοποιήσεων, όπως ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες, είναι λιγότερο χαρακτηριστικό του πρωτεώματος CVF. Αυτό το εύρημα μπορεί να εξηγηθεί από διαδικασίες όπως η διάσπαση της επιθηλιακής κυτταρικής στοιβάδας κατά τη δειγματοληψία και την αποβολή των νεκρών επιθηλιακών κυττάρων. Ως εκ τούτου, μια ομάδα με αυτούς ταυτοποιήσεις ως «μη-χαρακτηριστικό» πρωτεΐνες. Με βάση αυτά τα ευρήματα, τα οποία είναι κοινά σε όλες σχεδόν ολοκληρωμένη μελέτη CVF πρωτεομική, μπορεί κανείς να κάνει διάκριση μεταξύ ενός «πυρήνα proteome» των συχνά εντοπίζονται χαρακτηριστικές πρωτεΐνες CVF και μια «μεταβλητή proteome» που περιέχει τα μη-χαρακτηριστικές πρωτεΐνες CVF [28] .

σε σύγκριση με τις μέσες τιμές CV των κοινών ταυτοποιήσεις μεταξύ των τριών τεχνικών επαναλήψεων (25%) [25], οι μέσες τιμές CV πρωτεΐνης αφθονία στην υγιή και τα προκαρκινικά δείγματα (60% και 52%, αντίστοιχα) ήταν σημαντικά υψηλότερα. Αυτό το αποτέλεσμα ήταν αναμενόμενο, διότι, σε αντίθεση με τις τεχνικές επαναλήψεις, τα δείγματα δεν ήταν ταυτόσημα. Σε όλα τα δείγματα, πρωτεΐνες με υψηλή μεταξύ των ατόμων παρατηρήθηκαν διαφορές (μέχρι 134%), ενώ η μετρούμενη μέση τιμή CV των «χαρακτηριστικών πρωτεΐνες» ήταν 38%. Αυτά τα αποτελέσματα είναι παρόμοια με άλλες μελέτες πρωτεομικής των υγρών του σώματος. Για παράδειγμα, Yamakawa

et al.

[29] βρήκαν μια μέση τιμή CV του 63% για το σπερματικό πλάσμα πρωτέωμα, και σύμφωνα με Anderson

et al.

[30], η μέση CV αξία μιας σειράς πρωτεϊνών πλάσματος ήταν περίπου 45%.

ταυτοποίηση διαφορικά άφθονες πρωτεΐνες

Για να εξεταστεί απόκλιση άφθονες πρωτεΐνες, μία μέθοδος φασματικής καταμέτρηση ελεύθερο σήμανσης εκτελέστηκε. Καθώς η μέθοδος αυτή επιτρέπει μόνο για μια ανάλυση ημι-ποσοτική, εξαιρετική επιδράσεις πρώτη ερευνηθεί, όπως αυτά δίνουν συνήθως τα πιο αξιόπιστα αποτελέσματα. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε πρώτα πρωτεΐνες για τις οποίες η παρουσία ή η απουσία τους στην προκαρκινικών ομάδα ήταν χαρακτηριστικό για μια δεδομένη κατάσταση. Στατιστική δοκιμή (chi-square test) οδήγησε σε 12 πρωτεΐνες με σημαντική διαφορά πρόσπτωσης (ρ & lt? 0,05), εκ των οποίων 6 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν αποκλειστικά σε προκαρκινικές δείγματα (Πίνακας 2). Η πιο σημαντική πρωτεΐνη ήταν ACTN4 (Acc Νο: O43707), η οποία ταυτοποιήθηκε σε όλα τα προκαρκινικά δείγματα αλλά κανένα από τα υγιή δείγματα (p = 0,001). Αξιοσημείωτα, SCCA-1, που χρησιμοποιείται συχνά ως βιοδείκτη πλάσματος για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [31], αναγνωρίστηκε επίσης, αν και με μια υψηλότερη τιμή ρ (ρ = 0.046).

ACTN4 είναι ένα κρίσιμο συστατικό του κυτταρικού σκελετού και είναι συμμετέχει στο σχηματισμό των συμφύσεων μεταξύ κυττάρων [32]. Έχει δειχθεί ότι η αναστολή ορισμένων δεσμεύεται μεμβράνη μορίων προσκόλλησης που προκαλούνται από μία κακοήθη μετασχηματισμός καταλήγει σε μείωση της αντοχής προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και προς τα πάνω ρύθμιση του ACTN4 [33]. Με βάση μια μελέτη knockdown του ACTN4 χρησιμοποιώντας κύτταρα καρκίνου του μαστού, Khurana

et al.

Απέδειξαν ότι ACTN4 συμμετείχε στο μηχανισμό ελέγχου της ανάπτυξης των κυττάρων [34]. Επιπλέον, η κυτταροπλασματική συσσώρευση της ACTN4 συσχετίστηκε με διάφορες κακοήθειες και συνδέθηκε με μια κακή πρόγνωση [35], και ο αθροιστικός γονιδιωματική κέρδος ACTN4 συνδέθηκε με το σχηματισμό αδενοκαρκινώματα των ωοθηκών [36]. Επίσης, μεσολάβηση RNAi προς τα κάτω ρύθμιση των ACTN4 έδειξαν συσχέτιση μεταξύ του πάνω έκφραση ACTN4 και έναν επιθετικό φαινότυπο στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [37]. Πρόσφατα, η πρωτεΐνη βρέθηκε ότι συνδέεται με διάφορους παράγοντες με ποικίλες λειτουργίες, προτείνοντας άλλους ρόλους για αυτή την πρωτεΐνη, εκτός από τη ρύθμιση της ακτίνης [38]. Πράγματι, Khurana

et al.

Εντόπισε μοτίβο μοτίφ που ήταν υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση των ACTN4 με τον υποδοχέα οιστρογόνων και συν-ενεργοποιητές [39]. Πρόσφατες μελέτες σε μοντέλα HPV διαγονιδιακό ποντίκι παρέχουν αποδείξεις ότι τα οιστρογόνα και πυρηνικού υποδοχέα του προάγουν τον καρκίνο του τραχήλου, σε συνδυασμό με HPV ογκογονίδια [40]. Ως εκ τούτου, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι ACTN4 παίζει ρόλο σε αυτό το σημαντικό αποτέλεσμα.

Με βάση την ημι-ποσοτική NSAF-μέθοδο, επιλέχθηκαν πρωτεϊνών για διαφορική έκφραση τους μεταξύ των δύο όρων. Στατιστική δοκιμή (Mann-Whitney U) είχε ως αποτέλεσμα τέσσερις πρωτεΐνες με σημαντική (ρ & lt? 0,05) διαφορά σε αφθονία (Πίνακας 3). Αν και αυτές οι τέσσερις πρωτεΐνες δείχνουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης ανακάλυψη, ένα βήμα επαλήθευσης απαιτείται για να επιβεβαιώσει αυτά τα αποτελέσματα. Όταν ελήφθησαν τόσο το p-αξία και η συχνότητα της παρουσίας υπόψη,

αννεξίνη Α2

και PKM2 ήταν πιο ελπιδοφόρα (p & lt? 0.03), επειδή και οι δύο εντοπίστηκαν σε τουλάχιστον 9 από 12 μεμονωμένα δείγματα, με τρεις φορές σε προς τα πάνω ρύθμιση για την προκαρκινική κατάσταση (Πίνακας 3). Παρά την αναγνώριση της ένα

nnexin Α2

σχεδόν σε κάθε δείγμα (11/12 δείγματα) με ένα αποδεκτό διαφορά στην αφθονία (p = 0.03), οι ενδο-ατομικές διακυμάνσεις (CV 77%) για την υγιή ομάδα ήταν πολύ υψηλότερη σε σύγκριση με PKM2 (35%). Ως εκ τούτου, PKM2 (Acc No: P14618) επιλέχθηκε για έλεγχο με ELISA

PKM2 είναι ένα γλυκολυτικό ένζυμο που συμβάλλει στην παροχή ενέργειας του κυττάρου.. Αυτή η πρωτεΐνη έχει δύο ισομορφές, μια εμβρυολογικές ισομορφή (M2) με αυξημένη ενζυμική δραστηριότητα και έναν ενήλικα ισομορφή (Μ1). Πρόσφατα, καταδείχθηκε ότι κακοήθη μετασχηματισμοί των κυττάρων με HR-HPV ογκογονίδια Ε6 και Ε7 προκάλεσε μία αλλαγή PKM από Μ1 έως Μ2 [41]. Αυτός ο διακόπτης προκαλεί μια μετατόπιση από την κανονική κυτταρικό μεταβολισμό σε αυξημένες γλυκόλυση, η οποία είναι επωφελής για την ανάπτυξη και την νεόπλασμα των καρκινικών κυττάρων [42]. Δυστυχώς, δεν ήταν σε θέση να επιβεβαιώσει τη διαφορά στις συγκεντρώσεις PKM2 μεταξύ CVFs από υγιή και προκαρκινικών άτομα, αν και χρησιμοποιήθηκαν δύο κιτ ELISA από διαφορετικούς προμηθευτές. Είναι πιθανό ότι η μέθοδος ημι-ποσοτική καταμέτρηση φασματική μπορεί να είναι επιρρεπής σε πάρα πολύ παραλλαγή. Εναλλακτικά, έχουμε παρατηρήσει στο παρελθόν ότι η μήτρα CVF δεν είναι η βέλτιστη για ορισμένες διαμορφώσεις ELISA και αυτό μπορεί να είναι η περίπτωση για τις δύο δοκιμασίες PKM2 ELISA.

Επαλήθευση της άλφα-actinin-4 επίπεδα

άλφα-actinin-4, η πιο πολλά υποσχόμενη υποψήφιος βιοδεικτών, επαληθεύτηκε στις 57 επιπλέον δείγματα CVF (28 μεμονωμένα δείγματα και 29 διαμήκη δείγματα) με ELISA, μια σειρά που πληροί σίγουρα τις απαιτήσεις για τη φάση της ανακάλυψης /επαλήθευση των πρωτεϊνικών βιοδεικτών [43] . Τα αποτελέσματα ELISA έδειξαν ότι η συγκέντρωση του ACTN4 είναι αυξημένος στους ασθενείς που έχουν μολυνθεί από HPV σε σύγκριση με τους ασθενείς μη μολυσμένα, με τον τρόπο αυτό επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα LC-MS /MS. Ωστόσο, η μόλυνση με LR-HPV (HPV-6 και HPV-11) είχε ως αποτέλεσμα σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ACTN4 στο CVF. Αν και οι συγκεντρώσεις των ACTN4 μετρήθηκε στα CVFs από LR-HPV-μολυσμένα άτομα είναι υψηλότερες από εκείνες από μη μολυσμένα άτομα, καμία σημαντική διαφορά στο επίπεδο αφθονίας παρατηρήθηκε (p = 0,052). Επειδή αυτά τα ευρήματα βασίζονται στην ανάλυση των δειγμάτων από μόνο τέσσερις ασθενείς μόνο LR-HPV-μολυνθεί, θα πρέπει να αξιολογηθεί περισσότερα από αυτό το είδος του δείγματος πριν μπορούν να εξαχθούν συμπεράσματα. Ένα μη μολυσμένο ασθενή έδειξε μία τιμή ακραία 85.6 pg /ml του ACTN4. Αυτή η ασθενής δεν είχε γνωστό ιστορικό μόλυνσης από HR-HPV, αλλά η κλινική αρχείο έδειξε ισχαιμική καρδιοπάθεια και μια επικράτηση του καρκίνου του μαστού. Συνεπώς, είναι πιθανό ότι αυτή η αυξημένη συγκέντρωση του ACTN4 προκαλείται από την ιατρική θεραπεία ή μια μόλυνση LR-HPV εκτός από HPV-6 ή HPV-11. Ως εκ τούτου, η εκτεταμένη επικύρωση αυτού του δείκτη σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων από ασθενείς που πάσχουν από άλλες ασθένειες και λοιμώξεις (HIV, έρπη, βακτηριακή κολπίτιδα,

Chlamydia

κ.λπ.), είναι το επόμενο βήμα για να καθοριστεί κατά πόσον ACTN4 είναι κατάλληλο για τους σκοπούς διάγνωσης. Σε αυτές τις μελέτες, θα μπορούσε κανείς να θέσει ένα όριο στο 18 pg /ml για τη διάκριση μεταξύ των δειγμάτων από υγιή άτομα έναντι HPV-μόλυνση.

Αν και τα επίπεδα ACTN4 δεν αριθμητικά συσχετίζονται με τις ιικό φορτίο, μια αύξουσα και φθίνουσα τάση θα μπορούσε να σαφώς να παρατηρηθεί σε ασθενείς που είτε ξεκίνησε μια λοίμωξη ή εκκαθαριστεί τον ιό. Παρατηρήσαμε επίσης ότι οι λοιμώξεις σε μεγαλύτερες χρονικές περιόδους προκαλούνται συσσώρευση του δείκτη.