Αφηρημένο

Η εμφάνιση του ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη ( CRPC) συμβάλλει στην υψηλή θνησιμότητα των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με καρκίνο του προστάτη (PCA), η οποία εν μέρει μπορεί να αποδοθεί στην ύπαρξη και την εμφάνιση του καρκίνου βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η απορρύθμιση της έκφρασής του microRNAs (miRNAs) συμβάλλει στην έναρξη και την εξέλιξη του προστάτη. Μεταξύ των πολλών γνωστών miRNAs, ας-7 οικογένειας φαίνεται να παίζει καθοριστικό ρόλο στην επανάληψη και την εξέλιξη του προστάτη με τη ρύθμιση ΚΕΠ? Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο ας-7 οικογένειας συμβάλλει στη προστάτη επιθετικότητα είναι ασαφής. Enhancer του Zeste ομολόγου 2 (ΕΖΗ2), ένα υποθετικό στόχο ας-7 οικογένεια, αποδείχθηκε για τον έλεγχο της λειτουργίας των βλαστικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε απώλεια let-7 οικογένεια με αντίστοιχη υπερ-έκφραση της ΕΖΗ2 σε δείγματα ιστών ανθρώπινου προστάτη, ειδικά σε υψηλότερες όγκους βαθμό Gleason. Η υπερέκφραση του ας-7 με επιμόλυνση των προδρόμων ας-7 μειωμένη έκφραση ΕΖΗ2 και καταστέλλεται κλωνογονική ικανότητα και την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας των κυττάρων προστάτη, η οποία ήταν σύμφωνη με την αναστολή της δραστηριότητας της λουσιφεράσης ΕΖΗ2 3’UTR. Βρήκαμε επίσης ότι η επεξεργασία των κυττάρων του προστάτη με BR-DIM (διατυπωθεί DIM: 3,3-Diindolylmethane από την Bio Response, Boulder, CO, συντομογραφία BR-DIM) up-ρυθμίζεται ας-7 και κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση ΕΖΗ2, συνεπής με την αναστολή της αυτο-ανανέωσης και κλωνογόνο ικανότητα. Επιπλέον, BR-DIM παρέμβαση στην εν εξελίξει κλινική δοκιμή μας φάσης ΙΙ σε ασθενείς πριν από ριζική προστατεκτομή έδειξε αυξητική ρύθμιση του let-7 συνάδουν με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΕΖΗ2 σε δείγματα ιστών προστάτη μετά BR-ΔΗΜ παρέμβαση. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η απώλεια του ας-7 μεσολάβηση αυξημένη έκφραση του ΕΖΗ2 συμβάλλει προς PCA επιθετικότητα, η οποία θα μπορούσε να ελαττωθεί με την BR-ΔΗΜ θεραπεία, και έτσι BR-DIM είναι πιθανό να έχει κλινική επίδραση

Αιτιολογική αναφορά.: Κονγκ D, E Heath, Chen W, Cher ML, Πάουελ I, Heilbrun L, et al. (2012) Απώλεια Let-7 Up-Ρυθμίζει ΕΖΗ2 στον καρκίνο του προστάτη Σύμφωνα με την Απόκτηση καρκινικά βλαστικά Υπογραφές κελί που εξασθενούν από τον BR-ΔΗΜ. PLoS ONE 7 (3): e33729. doi: 10.1371 /journal.pone.0033729

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 15 του Νοέμβρη 2011? Αποδεκτές: 16 Φεβρουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Μαρτίου 2012

Copyright: © 2012 Κονγκ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (5R01CA108535-06 και 5R01CA083695-08) απονέμεται σε FHS. (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm? new=1 icde=4342569 loc=2 CFID=28929570 CFTOKEN=80568291). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες, σκοτώνοντας πάνω από 32.050 άνδρες το 2010 [1]. Κατά τα τελευταία δέκα χρόνια, υπήρξαν σημαντικές βελτιώσεις στις χειρουργικές θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς που διαγιγνώσκονται με εντοπισμένο προστάτη. χειρουργική επέμβαση στον προστάτη έχει επίσης επωφεληθεί από τις τεχνικές και τεχνολογικές εξελίξεις, όπως η νευρική φειδωλοί προστατεκτομή και ρομποτική προστατεκτομή. Επικουρική θεραπεία, που ορίζεται ως επιπρόσθετη θεραπεία για τη μείωση ή την εξάλειψη των τοπικών και μακρινό ασθένεια, προσφέρεται στους ασθενείς [2], ειδικά εκείνων που βρίσκονται σε υψηλό κίνδυνο υποτροπής (όπως ορίζεται συχνά από τα κριτήρια d’Amico του PSA & gt? 20 ng /ml, Gleason 8-10, και το στάδιο T2c με Τ4) [3].

η θεραπεία ακτινοβολίας και η συστηματική θεραπεία ειδικά θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) θεωρούνται λογικές επικουρικό θεραπευτικές επιλογές. Οι ασθενείς στην κατηγορία υψηλού κινδύνου έχουν ένα ποσοστό υποτροπής μεγαλύτερο από 50% μέσα στη διάρκεια ζωής τους, η οποία είναι απαράδεκτη. Ωστόσο, μία από τις ανησυχίες στην προσφορά επικουρική θεραπεία για όλους τους ασθενείς στην ομάδα υψηλού κινδύνου είναι ότι αν και μεγαλύτερη από το 50% των ασθενών θα επαναληφθούν, υπάρχουν 38-50% των ασθενών οι οποίοι δεν [4]. Για να μειωθεί η επιβάρυνση των υπερ-θεραπεία σε αυτή την ομάδα ασθενών, τα πρόσθετα εργαλεία που απαιτούνται για τον εντοπισμό των πραγματικά τους ασθενείς υψηλού κινδύνου. Τρέχοντα εργαλεία που μελετώνται περιλαμβάνουν την έξυπνη νομογράμματα [5] και μελέτες που αξιολογούν την έκφραση του γονιδίου προφίλ, τα οποία έχουν εντοπίσει μερικά δείκτες της επιθετικότητας του όγκου [6], [7] παρόλο που αυτές οι διαπιστώσεις δεν έχουν μεταφραστεί στη διαχείριση των ασθενών.

από επανεμφάνιση του όγκου και μετάσταση συμβάλλουν στην υψηλή θνησιμότητα, μελέτες έχουν δείξει ότι η επιθετικότητα του προστάτη θα μπορούσε να συνδέεται στενά με την απόκτηση καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (CSLCs) χαρακτηριστικά. Αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η απορυθμισμένη έκφραση πολλών microRNAs (miRNAs), συμπεριλαμβανομένης της οικογένειας let-7 συμβάλλει στην εξέλιξη του καρκίνου και στην επανάληψη [8]. Τα microRNAs είναι μια κατηγορία μη-κωδικοποίησης RNAs από περίπου 20 έως 22 νουκλεοτίδια σε μέγεθος. Ρυθμίζουν γονίδιο εκφράσεις μετα-μεταγραφικά με σύνδεση προς μία θέση στην 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή (3’ UTR) του mRNA στόχου. Έχουν αποδειχθεί να ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο, και την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του [9]. Ας-7 ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά και καλά μελετηθεί σε Caenorhabditis elegans. Το ανθρώπινο ας-7 οικογένεια αποτελείται από ας-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7c, αφήστε-7δ, αφήστε-7ε, αφήστε-7F, αφήστε-7g, αφήστε-7θ και miR-98. Η οικογένεια ας-7 συνήθως αντιμετωπίζεται ως καταστολέας όγκου σύμφωνο με ρύθμιση προς τα κάτω ογκογονιδίων όπως Ras [10], η ομάδα υψηλής κινητικότητας Α2 (HMGA2) [11] και c-myc [12] με δέσμευση σε 3’UTR του αυτά τα mRNA στόχου. Επιπλέον, η μειωμένη ας-7 έκφραση βρέθηκε σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη [13], και έχει συνδεθεί με κακή πρόγνωση ασθενών σε καρκίνο πνεύμονα [14], το κεφάλι και το λαιμό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [15], και τον καρκίνο των ωοθηκών [16 ].

Είναι ενδιαφέρον, έχουν αφήσει-7 μέλη της οικογένειας έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των κυττάρων καρκίνου του μαστού [17] και τα κύτταρα του προστάτη με τη ρύθμιση των βλαστικών κυττάρων που σχετίζεται με παράγοντες όπως Oct4, Sox2, και Nanog έκφραση [18]. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης τεκμηριωθεί ότι ας-7 θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση των Lin28 και Lin28B, η οποία με τη σειρά τους εμποδίζουν τη συσσώρευση του ώριμου ας-7 [19]. Αυτή η ρύθμιση ανάδρασης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση των «βλαστική ικανότητα» με τον έλεγχο αυτο-ανανέωση [20] – [23], η οποία είναι η κυτταρική χαρακτηριστικό του ΚΕΠ ή CSLCs που σχετίζονται με την επιθετικότητα του όγκου και υποτροπή. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η οικογένεια let-7 θα μπορούσε να παίξει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του προστάτη με τη διατήρηση και τη ρύθμιση μοριακά χαρακτηριστικά των ΚΕΠ ή CSLCs σε προστάτη? Ωστόσο, πώς ας-7 οικογένειας συμβάλλει στη προστάτη επιθετικότητα είναι άγνωστη.

Enhancer της Zeste ομόλογο 2 (ΕΖΗ2) είναι ένας από τους στόχους της οικογένειας let-7 των miRNAs, και ότι η έκφραση του ΕΖΗ2 είναι έντονα που σχετίζονται με μοριακά χαρακτηριστικά των δύο φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα και ΚΕΠ ή CSLCs. ΕΖΗ2 είναι ένα ιστονών-λυσίνη Ν-μεθυλοτρανσφεράσης, μια υπομονάδα Polycomb κατασταλτικά συγκρότημα 2 (PRC2). Η Polycomb ομάδα των πρωτεϊνών είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη ρύθμιση της γονιδιακής καταστολής μέσω τροποποιήσεων της χρωματίνης, η οποία είναι απαραίτητη για τη διατήρηση των εμβρυϊκών και ενήλικων βλαστικών κυττάρων [24], [25]. PRC2 περιέχει ΕΖΗ2, Suz12, ΕΕΔ, και RBAP υπομονάδες και αυτό το σύμπλοκο είναι γνωστό ότι λειτουργεί στα εμβρυϊκά και ενήλικα βλαστικά κύτταρα για την καταστολή της ανάπτυξης τα γονίδια που ενεργοποιούνται επιλεκτικά κατά την διάρκεια της διαφοροποίησης [26]. Επιπλέον, περαιτέρω μελέτες έχουν δείξει ότι PRC2 γονίδια στόχοι είναι συν-καταλαμβάνεται από τις ρυθμιστικές αρχές των βλαστικών κυττάρων, όπως Oct4, Sox2, και Nanog [27]. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης προτείνει ότι Polycomb πρωτεΐνες ομάδα δεν είναι απαραίτητη μόνο για την εμβρυϊκή ανάπτυξη, αλλά παίζει επίσης κρίσιμο ρόλο στην έναρξη του όγκου και της προόδου [25]. Υπερ-έκφραση του ΕΖΗ2 έχει συνδέεται στενά με την εξέλιξη του καρκίνου εν μέρει επειδή PRC2 αναστέλλει την έκφραση Ε-καδερίνης, η οποία προωθεί τα επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) σε καρκινικά κύτταρα [28], ένα φαινόμενο που θυμίζει ΚΕΠ ή CSLCs. Suz12 έχει βρεθεί ότι μεσολαβεί αναστολή Ε-καδερίνης με snail1 [29]. Το πιο σημαντικό, ΕΖΗ2 ρυθμίζει άμεσα μεθυλίωσης του DNA λειτουργώντας ως πλατφόρμα πρόσληψης για μεθυλτρανσφεράση DNA [30]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, βρήκαμε ότι τα επίπεδα του ΕΖΗ2 και Suz12 mRNA αυξήθηκαν σε PC3 κύτταρα PDGF-D (ΕΜΤ-φαινοτυπικά κύτταρα) συγκριτικά με κύτταρα PC3 Neo [18]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι PRC2 μπορεί να συμβάλει στην EMT χαρακτηριστικά των κυττάρων PC3 PDGF-D, η οποία είναι συνεπής με τις υπογραφές των ΚΕΠ ή CSLCs που σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου και στην επανάληψη.

Προηγούμενη προ-κλινικές μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν δείξει ότι η ινδόλη-3-καρβινόλη (I3C) που βρίσκεται σε σταυρανθή λαχανικά και του

in vivo

μεταβολίτη 3,3′-Diindolylmethane (DIM) ειδικά ο διαμορφώνονται DIM (BR-DIM ή Β-DIM), ότι εμείς έχουν χρησιμοποιήσει για τη φάση μας Ι κλινική δοκιμή [31], είναι ισχυροί παράγοντες στην αναστολή της ανάπτυξης κυττάρων προστάτη, η οποία διαμεσολαβείται από μεταβολές στην κυτταρική σηματοδότηση πολλαπλούς [32]. Τα τελευταία αποτελέσματα μας έδειξαν ότι BR-ΔΗΜ προκάλεσε αυξητική ρύθμιση του miR-200b και miR-200c που συνήθως χάνεται στα κύτταρα του προστάτη [33]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε απώλεια της έκφρασης της ας-7 οικογένεια συνεπής με υπερ-έκφραση ΕΖΗ2 σε προστάτη κύτταρα και σε δείγματα ιστών ανθρώπινου προστάτη, ειδικά σε όγκους με υψηλότερο βαθμό Gleason. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση συσχέτισης έδειξε ότι ας-7 έκφραση συσχετίστηκε αντίστροφα με την έκφραση ΕΖΗ2 σε ασθενείς με υψηλότερα όγκους βαθμό Gleason. Εδώ πρέπει επίσης να παρέχουν αποδείξεις για το ρόλο της BR-DIM (διατυπωθεί DIM: 3,3-Diindolylmethane, συντομογραφία είτε BR-ΔΗΜ ή Β-DIM) στη ρύθμιση του let-7 και ΕΖΗ2 στα κύτταρα του προστάτη, όπως τεκμηριώνεται από μας προ-κλινικά ευρήματα, καθώς και ευρήματα από τις συνεχιζόμενες κλινικές δοκιμές μας φάσης ΙΙ σε ασθενείς προστάτη έλαβαν BR-ΔΗΜ πριν από ριζική προστατεκτομή.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και την κατάσταση του πολιτισμού

LNCaP, C4-2B, και CWR22RV1 διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 10 mmol /L Hepes, 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη. Σταθερές κυτταρικές γραμμές που υπερεκφράζουν PDGF-D και άδειο pcDNA3 φορέα δημιουργήθηκαν με επιμόλυνση κυττάρων PC3 με το pcDNA3-PDGF-D: His ή αντίστοιχο κενό φορέα pcDNA3 Neo όπως περιγράφηκε προηγουμένως και αναφέρεται ως PC3 Neo, ή PC3 PDGF-D κύτταρα [34], αντίστοιχα, σε όλο αυτό το χειρόγραφο. Το PC3 Neo, PC3 PDGF-D, PC3, τα κύτταρα DU145 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 με 2 mmol /L γλουταμίνη, 10 μmol /L Hepes (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS), 50 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη. PZ-HPV-7 και κύτταρα RWPE-1 αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA). Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού κερατινοκυττάρων (K-SFM) που παρέχεται από την Invitrogen (GIBCO) και παρέχεται με 0.05 mg ml εκχύλισμα /βόειας υπόφυσης (ΒΡΕ) και 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ένα 5% CO

2-υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C, και γονοτυπικά χαρακτηριζόμενη να υποστηρίξει την αυθεντικότητα αυτών των κυττάρων, η οποία ήταν σύμφωνη με την προέλευσή του.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Το αντίσωμα έναντι ΕΖΗ2 αγοράστηκε από την BD Biosciences (Bedford, ΜΑ). Αντίσωμα προς γλυκεραλδεϋδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση (GAPDH) αγοράστηκε από την Affinity Bioreagents (Χρυσή, CO). IgG (H + L) προϊόν σύζευξης αίγας-αντι -HRP ελήφθησαν από την Bio-Rad (Reinach, BL). BR-DIM, ένα διατυπώθηκε ΔΗΜ με υψηλότερη βιοδιαθεσιμότητα, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Michael Zeligs (συντομογραφία BR-ΔΗΜ ή Β-ΔΗΜ? Bio Response, Boulder, CO) και διαλύθηκε σε DMSO για να κάνει τις λύσεις 50 mmol /L απόθεμα και αποθηκεύονται στους -20 ° C σε πολλαπλά δείγματα για

in vitro

μελέτη.

δήλωση Ηθικής

ιστούς των ασθενών συλλέχθηκαν μετά τη λήψη της έγκρισης από το Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne Διοικητικό κριτική Θεσμικών (IRB). Αυτό το κλινικό πρωτόκολλο έχει ταξινομηθεί ως απαλλασσόμενες # 4 κατηγορίες στο πλαίσιο της πολιτικής ΝΙΗ, επειδή οι μελέτες αυτές είναι αναδρομικές μελέτες με τη χρήση αρχειακών δειγμάτων. Η IRB παραιτήθηκε από την ανάγκη για συναίνεση για τη χρήση των δειγμάτων αρχείου, η οποία ήταν σύμφωνη με τις κατευθυντήριες γραμμές ΝΙΗ και τα δείγματα αναλύθηκαν ανώνυμα. δείγματα προστάτη ιστών από μας εν εξελίξει κλινική δοκιμή της BR-DIM (Β-DIM) παρέμβαση πριν από ριζική προστατεκτομή ελήφθησαν επίσης μετά τη λήψη έγκρισης από το Διοικητικό Συμβούλιο Wayne State University Institutional Review (IRB) και πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλα τα υποκείμενα της μελέτης. Επειδή αυτή η μελέτη είναι μια συμβατική κλινική δοκιμή, η IRB διαδικασία που απαιτείται έγγραφη συγκατάθεσή από ασθενείς πριν δεδουλευμένη βάση στην κλινική δοκιμή, η οποία συνήθως συντονίζονται μέσω της δοκιμαστικής έκδοσης του Office κλινική (ΚΟΤ). Η έγκριση μέσω της IRB εμπλέκει τη συμμόρφωση με συναινούντων και σε δεδουλευμένη βάση, χωρίς την οποία οι ασθενείς δεν μπορούν να εγγραφούν στη μελέτη, και ως εκ τούτου η μελέτη μας πληρούσε όλες τις απαιτούμενες κατευθυντήριες γραμμές για την τήρηση από τον ΚΟΤ και το IRB. Ο τοπικός αριθμός κλινικών μελετών πρωτόκολλο είναι 2007-128, το οποίο μπορεί να βρεθεί στην κλινική trials.gov ΝΙΗ. (https://clinicaltrials.gov/show/NCT00888654). Κατά τη στιγμή της απόκτησης του δείγματος για την τρέχουσα έρευνα, το πρωτόκολλο της μελέτης των δεδουλευμένων 20 ασθενείς? Ωστόσο, η μελέτη έχει πλέον δεδουλευμένων συνολικά 33 ασθενείς. Αναμένεται ότι θα κλείσουμε αυτή τη μελέτη με 37 ασθενείς στις αρχές του 2012.

Ασθενείς και προστατικό ιστό συλλογή δείγματος

Μετά την απόκτηση της έγκρισης του σκάφους αναθεώρηση των θεσμικών, αναδρομική αρχειακό προ-θεραπεία του προστάτη τους ιστούς και τα συμφωνημένα γειτονικών φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν από Biospecimen Πυρήνας της Karmanos Ινστιτούτου Καρκίνου (ΚΟ) συλλέγονται από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ριζική προστατεκτομή 2.004-2010 σε ΚΟΙ. Λάβαμε επίσης δείγματα ιστού του προστάτη από μας εν εξελίξει κλινική δοκιμή της BR-DIM (Β-DIM) παρέμβαση πριν από ριζική προστατεκτομή των νεοδιαγνωσθέντων ασθενών προστάτη 2009 – 2011 σε ΚΟΙ και Henry Ford Συστήματος Υγείας (HFHS), Ντιτρόιτ, Μίσιγκαν . Φορμόλη-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστοί κόπηκαν για miRNA και mRNA ανάλυση. κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων του νοσοκομείου συμπεριλαμβανομένων φυλή, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1. παθολογικά χαρακτηριστικά διαπιστώθηκαν από μικροσκοπική αξιολόγηση των διαφανειών όγκου από παθολόγους τόσο σε KCI και στη HFHS. σκορ Gleason (βαθμού) ελήφθη σε κάθε περίπτωση από την κλινική βάση δεδομένων.

Η

Κλωνογόνος δοκιμασία

C4-2B, PC3 PDGF-D κύτταρα PDGF-D PC3, και επιμολυσμένα με το ας-7 οικογένεια για 24 ώρες συλλέχθηκαν μετά θρυψινοποίηση και επανα-αιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο. εναιωρήματα μονών κυττάρων απλώθηκαν σε τακτική 10 εκατοστά σε διάμετρο πιάτα Petri στην πυκνότητα αποικία του 2000 κύτταρα ανά τρυβλίο. Μετά από 2-3 εβδομάδες επώασης με μεταβαλλόμενες φρέσκα μέσα κάθε 3-4 ημέρες, οι αποικίες κηλιδώνονται με κρύσταλλο ιώδες για επιπλέον 10 λεπτά, και πλύθηκαν με 1 χ PBS. Οι αποικίες φωτογραφήθηκαν.

μαλακό άγαρ

δοκιμασία

κύτταρα C4-2B συλλέχθηκαν και αιωρούμενα σε μέσο καλλιέργειας. Soft δοκιμασία άγαρ έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως από το εργαστήριο μας [18]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ή 25 μΜ BR-DIM με μεταβαλλόμενο φρέσκα μέσα με BR-DIM κάθε 3 ημέρες. Μετά από τρεις εβδομάδες ανάπτυξης, οι αποικίες βάφτηκαν με επώαση με 0,5 mg /ml ΜΤΤ για 4 ώρες, και έπειτα φωτογραφήθηκαν (40 φορές). Οι αριθμοί αποικιών μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως αριθμοί αποικιών (έλεγχος%).

Αυτο-ανανέωση δοκιμασία της ικανότητας

Ενιαία κυτταρικά εναιωρήματα των C4-2B και τα κύτταρα PC3 PDGF-D απλώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλές πηγάδια οπαδός του 6 -Καλά πλάκες (Corning, Lowell, ΜΑ) σε κύτταρα 2000 /φρεάτιο σε DMEM /F12 (Invitrogen) που περιέχει 1 χ Β27 και Ν2 (Invitrogen). κατάσταση Μόνος κυττάρων επιβεβαιώθηκε κάτω από μικροσκόπιο. Φρέσκο ​​μέσο με 10 ή 25 μΜ προστέθηκε κάθε 3-4 ημέρες. Μετά από μία εβδομάδα, οι αριθμοί των prostaspheres μετρήθηκαν υπό ένα μικροσκόπιο και δεδομένα παρουσιάστηκαν ως αριθμοί σφαίρα ανά 1000 κύτταρα εμβολιάζονται. Prostaspheres φωτογραφήθηκαν (40 φορές) κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης.

κηλίδος ανάλυση

Σύνολο κυτταρολύματα Western ελήφθησαν με λύση των κυττάρων σε ρυθμιστικό RIPA. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με χρήση του προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA (Pierce, Rockford, IL). Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35].

miRNA και διαμόλυνση

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 40 nmol /L ας-7 προδρόμων ή miRNA πρόδρομοι αρνητικός έλεγχος # 1 (Ambion, Austin , ΤΧ) χρησιμοποιώντας DharmaFECT3 αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Dharmacon, Lafayette, CO). Μετά από 1 ημέρα από την επιμόλυνση, τα κύτταρα trypsonized, και επανα-αιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο. Ενιαία εναιωρήματα κυττάρων επιβεβαιώθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο για κλωνογονική δοκιμασία. Επιπλέον, μετά από 3 ημέρες από την επιμόλυνση, τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν για ανάλυση Western blot.

Η δραστικότητα λουσιφεράσης δοκιμασία

κύτταρα PC3 PDGF-D με χαμηλότερα επίπεδα ας-7 σπάρθηκαν σε ένα πυκνότητα 6 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε μία πλάκα 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα συν-επιμολυσμένα με πλασμίδιο λουσιφεράσης ΕΖΗ2 3’ΙΙΤΡ (ΟηΟεηε, Rockville, MD) ή πλασμίδιο λουσιφεράσης Renilla και τον έλεγχο miRNA, αφήστε-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7c, και αφήστε-7η πρόδρομων ουσιών με χρήση αντιδραστηρίου DharmaFECT δίδυμο επιμόλυνσης (Dharmacon, Lafayette, CO). Μετά από 48 ώρες επώασης, η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Steady-Glo σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla χρησιμοποιήθηκε ως ένας έλεγχος για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης.

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Για τον προσδιορισμό των επιπέδων του mRNA, το συνολικό RNA από κύτταρα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen ) και το DNA απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας ένα RNase-free kit NDase (Qiagen). Ένα μικρογραμμάριο RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας υψηλή ικανότητα RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Fostor, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Η σχετική ποσότητα του mRNA κανονικοποιήθηκε στην έκφραση του GAPDH. Για τη δοκιμή των επιπέδων miRNA, το συνολικό RNA από κύτταρα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το miRNeasy Mini Kit (Qiagen) και το DNA απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας ένα RNase-free kit NDase (Qiagen). 20 ng από RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα γενικής χρήσης cDNA Synthesis Kit (Exiqon, Woburn, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές miRNA (Exiqon) για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης miRNA χρησιμοποιώντας SYBR® Πράσινο RT-PCR Αντιδραστήρια (Applied Biosystems). Η σχετική ποσότητα των miRNA ομαλοποιήθηκε με την έκφραση της RNU48. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων mRNA ή miRNA στον καρκίνο του προστάτη ιστούς του ασθενούς, το ολικό RNA απομονώθηκε από τους ιστούς FFPE χρησιμοποιώντας miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. δοκιμασία RT-PCR για την έκφραση miRNA και του mRNA εκτιμήθηκε όπως παραπάνω. Η σχετική ποσότητα του mRNA κανονικοποιήθηκε ως προς την έκφραση της β-ακτίνης και η σχετική ποσότητα του miRNA κανονικοποιήθηκε ως προς την έκφραση του RNU1A.

μικροσυστοιχιών για το προφίλ miRNA στον καρκίνο του προστάτη ιστούς ασθενών

miRNA μικροσυστοιχιών καθώς και διεξήχθησαν ανάλυση δεδομένων ακόλουθες διαδικασίες όπως περιγράφηκε προηγουμένως από Kong et al [18].

Όλα τα δεδομένα είναι MIAME συμμορφούμενο και ότι ο ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME. GEO αριθμός ένταξης είναι GSE34310.

Στατιστικές μέθοδοι

Τα πειράματα που παρουσιάζονται στα στοιχεία για τις μελέτες κυτταρικής σειράς είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ή περισσοτέρων ανεξάρτητων επαναλήψεις. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος και τυπική απόκλιση (SD) στα διαγράμματα μπαρ. Τα miRNA και mRNA στοιχεία από δείγμα ιστού ασθενής καταγραφής μετατραπεί πριν από την ανάλυση. Συγκρίσεις των συνεχών μεταβλητών μεταξύ δύο ανεξάρτητων ομάδων έγιναν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Wilcoxon Rank Sum. Για ζεύγη σχετικές ομάδες (δηλ φυσιολογικούς ιστούς και ιστούς αντιστοιχισμένο G6 όγκου), ο Wilcoxon rank test υπέγραψε χρησιμοποιήθηκε. Spearman συσχετίσεις χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη δύναμη της γραμμικής σχέσης μεταξύ δύο μεταβλητών. Στατιστική δοκιμή σημασία της συσχέτισης βασίστηκε στην προσέγγιση

t

διανομής. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων σε επίπεδο σημαντικότητας 0,05, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Για να μειωθεί η ψευδής θετικότητα, με άλλα λόγια τον έλεγχο της οικογένειας-σοφός σφάλματος Τύπου Ι, σε αυτή την προκαταρκτική διερευνητική μελέτη πρώιμη φάση, θα χρησιμοποιείται προσαρμοσμένη σ τιμές από το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη βήμα-up σε δύο στάδια (FDR) ελέγχει τη μέθοδο [36] . Ένα ονομαστικό ποσοστό σφάλματος για την εκτίμηση του αριθμού των πραγματικών υποθέσεων null στη διαδικασία FDR δύο σταδίων ορίστηκε στο 0,05.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της οικογένειας let-7 χάθηκε στον καρκίνο του προστάτη ( PCA) δείγματα ιστών

για τον προσδιορισμό των επιπέδων της οικογένειας let-7 σε δείγματα ιστών προστάτη, συλλέξαμε προ-θεραπεία του προστάτη τους ιστούς και τα συμφωνημένα γειτονικό φυσιολογικό δείγματα ιστών (που χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για σύγκριση με ιστούς όγκων). Τα αποτελέσματα από την έκφραση miRNA με mircroarray προφίλ έκφρασης έδειξαν ότι όλα τα μέλη της οικογένειας let-7 (MIR-98 ήταν μη ανιχνεύσιμη) μειώθηκε στους ιστούς του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό γειτονικό ιστό δείγματα (Εικ. 1Α). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκφραση της let-7, αφήστε-7b, αφήστε-7c και αφήστε-7η ήταν μετρήσιμη με ακρίβεια σε σύγκριση με άλλα μέλη της οικογένειας, επειδή εκφράσεις τους ήταν πολύ χαμηλή (Εικ. 1Α). Ως εκ τούτου, έχουμε προσδιορίσει και επιβεβαίωσε τις εκφράσεις του let-7, αφήστε-7b, αφήστε-7c, και αφήστε-7d σε όλες τις περιπτώσεις, συμπεριλαμβανομένων των 129 δειγμάτων ιστών προστάτη και 94 γειτονικό φυσιολογικό δείγματα ιστών. Έχουμε ανακαλύψει ότι η έκφραση της οικογένειας let-7 σε ιστολογικά φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη από το βαθμό Gleason 7 ή υψηλότερο όγκο μειώθηκε σε σύγκριση με ιστολογικά φυσιολογικό ιστό από Gleason βαθμό 6 όγκους (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι οι ιστολογικά φυσιολογικούς ιστούς από τον προστάτη αδένας των ασθενών με υψηλότερα όγκους βαθμού δεν είναι φυσιολογικά. Έτσι, πήραμε την κανονική από τον προστάτη όλων των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με βαθμό 6 όγκους για περαιτέρω ανάλυση και χρησιμοποιήθηκαν ότι ως «κανονική έλεγχος ιστού». Παρατηρήσαμε ότι οι εκφράσεις της οικογένειας let-7 στο βαθμό 6 όγκοι δεν είναι στατιστικά διαφορετικά σε σύγκριση με το φυσιολογικό έλεγχο. Ωστόσο, βρήκαμε μια σημαντικά μειωμένη έκφραση της ας-7α, αφήστε-7b, let7c και αφήστε-7d στην ΣΕΣΣ με το βαθμό Gleason 7 ή νεότερη έκδοση όγκους σε σύγκριση με το κανονικό έλεγχο ιστό (Εικ. 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η απώλεια της οικογένειας let-7 θα μπορούσε να σχετίζεται με προστάτη επιθετικότητα ειδικά επειδή οι χαμηλότερες όγκοι βαθμού δεν ήταν διαφορετικό από το κανονικό έλεγχο ιστό, ενώ οι υψηλότερες όγκοι βαθμού ήταν διαφορετικά.

(Α) μικροσυστοιχιών προφίλ έγινε για την αξιολόγηση της έκφρασης των miRNAs χρήση ολικού RNA που εξάγεται από τα τρία δείγματα ιστού του προστάτη και συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του προστάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αφήνω-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7c και αφήστε-7d ήταν άκρως εκφράζεται σε ιστούς του προστάτη και την έκφραση τους χάθηκε σε ανθρώπινα δείγματα ιστού του προστάτη (* p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01). (Β) Τα αποτελέσματα από πραγματικό χρόνο-RT-PCR επιβεβαίωσε ότι τα επίπεδα ας-7b, αφήστε-7c και αφήστε-7η ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε όγκους με υψηλότερο βαθμό Gleason. (7a: ας-7α? Ν: κανονικό? TG6: ιστούς όγκων από ασθενείς με Gleason βαθμού 6. n = 39 για την κανονική, η = 44 για TG6, η = 52 για TG7, η = 33 για TG8, 9). (Γ) Ένα σημαντικό αυξητική ρύθμιση της έκφρασης του ΕΖΗ2 παρατηρήθηκε σε δείγματα ιστών προστάτη με Gleason βαθμού 7 (n = 46) και υψηλότερη (n = 33), αλλά όχι σε PCa δείγματα με Gleason βαθμό 6 (n = 39) . (Δ) τα επίπεδα ΕΖΗ2 συσχετίζονταν αντίστροφα με let-7b και αφήστε-7c εκφράσεις σε δείγματα όγκων με βαθμό Gleason 7.

Η

Η έκφραση της ΕΖΗ2 αυξήθηκε σε δείγματα ιστού του προστάτη και αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση του let-7 οικογένεια

Επειδή η έκφραση της οικογένειας let-7 είχε χαθεί σε προστάτη τους ιστούς των ασθενών με υψηλότερο βαθμό Gleason, θέτει ένα ερώτημα για το πώς η οικογένεια ας-7 θα μπορούσε να ρυθμίσει προστάτη επιθετικότητα. Έχουμε αναζήτηση στόχων της οικογένειας let-7 χρησιμοποιώντας το λογισμικό TargetScan και βρήκαμε ότι ΕΖΗ2 θα μπορούσε να ρυθμιστεί από την οικογένεια let-7, επειδή υπάρχει μια συγκεκριμένη θέση πρόσδεσης στην 3’UTR του ΕΖΗ2 mRNA. Έτσι, έχουμε αξιολογήσει την έκφραση του ΕΖΗ2 mRNA σε ιστούς του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση ΕΖΗ2 αυξήθηκε σε δείγματα ιστού του προστάτη με Gleason βαθμό 7 και υψηλότερη σε σύγκριση με το κανονικό έλεγχο ιστό (Εικ. 1Γ). Η έκφραση του ας-7b και αφήστε-7c ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση ΕΖΗ2 με r = -0.36 (95% CI: -0,61 έως -0,06), p = 0.0414 και r = -0.43 (95% CI: -0,65 έως – 0,15), ρ = 0.0132, αντίστοιχα (Σχ. 1D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η απώλεια του ας-7 θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για την αυξημένη έκφραση των ΕΖΗ2.

Ας-7 καταπιεσμένη έκφραση ΕΖΗ2 και ανέστειλε κλωνογονικού ανάπτυξη προστάτη κυττάρων

Εξετάσαμε την έκφραση του ΕΖΗ2 σε κυτταρικές γραμμές προστάτη και αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές επιθηλιακών προστάτη, και βρήκαν ότι ΕΖΗ2 εκφράστηκε σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη σε σχετικά υψηλότερα επίπεδα σε σύγκριση με αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές επιθηλιακών προστάτη: PZ-HPV-7 και RWPE-1 κύτταρα (Σχ 2Α, άνω πάνελ. ). Για να προσδιορίσετε περαιτέρω την βιολογική συνέπεια της οικογένειας έκφρασης let-7 στη ρύθμιση της έκφρασης ΕΖΗ2, επιμολύναμε PC3 και PC3 PDGD-D κύτταρα με 7 ας-πρόδρομες ουσίες, και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ας-7 μέλη της οικογένειας θα μπορούσε να αναστέλλουν σημαντικά την έκφραση του ΕΖΗ2 σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχ. 2Α, μεσαίο και κατώτερο πάνελ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η οικογένειά ας-7 ρυθμίζει την έκφραση των ΕΖΗ2. Προκειμένου να αποκτήσουν περαιτέρω μηχανιστική αντίληψη, ελέγξαμε αν αφήσουμε-7 θα μπορούσε να καταστείλει άμεσα την έκφραση της ΕΖΗ2 μέσω σύνδεσης με 3’UTR της ΕΖΗ2 mRNA. Είμαστε συν-επιμολυσμένα πλασμίδιο λουσιφεράσης ΕΖΗ2 3’UTR και αφήστε-7 πρόδρομων ουσιών, και διαπίστωσε ότι αφήνω-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7c, και αφήστε-7b θα μπορούσε να αναστείλει έντονα δραστηριότητα λουσιφεράσης ΕΖΗ2 3’ΙΙΤΡ σε σύγκριση με την επιμόλυνση των κυττάρων με ελέγχου miRNA (Εικ. 2Β). Το let-7 θέσεις στην 3’UTR του ΕΖΗ2 mRNA δέσμευσης φαίνονται στο Σχήμα 2Γ. Στη συνέχεια εξετάσαμε την βιολογική συνέπεια κύτταρα επιμολυσμένα με προ-ας-7 οικογένεια και αξιολογήθηκαν κλωνογονική ανάπτυξη ως έμμεση

in vitro

μέτρο της επιθετικότητας του όγκου. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση ας-7 οικογένεια ανέστειλε σημαντικά την κλωνογόνο αύξηση των κυττάρων PC3 PDGF-D, η οποία έδειξε αρχικά χαμηλότερη έκφραση του ας-7 (Σχ. 2D). Ωστόσο, προς το παρόν δεν υπάρχει μέθοδος που θα μπορούσε να είναι κλινικά χρήσιμα για την ρύθμιση προς τα άνω των χαμένων miRNAs. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε την υπόθεση μας με εξέταση κατά πόσο BR-DIM θα μπορούσαν να είναι χρήσιμα για την ρύθμιση προς τα πάνω του miRNAs.

(Α) Εκφραση του ΕΖΗ2 βρέθηκε να είναι υψηλότερη σε κυτταρικές σειρές προστάτη σε σύγκριση με αθανατοποιημένη κυτταρική επιθηλιακών προστάτη γραμμές: PZ-HPV-7 και RWPE-1 (άνω τμήμα) και επιμόλυνση ας-7 πρόδρομοι ανέστειλε την έκφραση ΕΖΗ2 στα PC3 και τα κύτταρα PC3 PDGF-D 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση (μέση και κάτω πίνακα). (Β) ας-7 μέλη της οικογένειας κατασταλεί δραστικότητα λουσιφεράσης ΕΖΗ2 3’UTR σε κύτταρα PC3 PDGF-D (χαμηλότερα επίπεδα ας-7 οικογένεια σε αυτά τα κύτταρα) συν-επιμολύνθηκαν με let-7 και το πλασμίδιο λουσιφεράσης ΕΖΗ2 3’UTR. (C) ας-7 θέσεις στην 3’UTR του ΕΖΗ2 mRNA δέσμευσης έδειξαν. (Δ) Η επιμόλυνση των πρόδρομων ουσιών ας-7 μείωσε σημαντικά κλωνογόνο ικανότητα ανάπτυξης των κυττάρων PC3 PDGF-D (Con: έλεγχος, 7α: προ-ας-7α, ** p & lt? 0,01)

Η

BR. -DIM θεραπεία οδήγησε στην προς τα πάνω ρύθμιση της οικογένειας let-7 και κατά συνέπεια κάτω ρυθμίζεται η έκφραση των ΕΖΗ2 στα κύτταρα του προστάτη

στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι BR-ΔΗΜ θεραπεία αύξησε την έκφραση ας-7 οικογένεια σε αρκετές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων PCa LNCaP, C4-2B και τα κύτταρα PC3 (Εικ. 3Α και το σχ. S1A-C). Επιπλέον, BR-DIM θεραπεία οδήγησε επίσης σε μειωμένη έκφραση του ΕΖΗ2 mRNA (Σχ. 3Β) και της πρωτεΐνης σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές προστάτη και σε διαφορετικά χρονικά σημεία (Σχ. 3C, 3D και το Σχ. S1D). Επιπλέον, Πιο ενδιαφέροντα, τα δεδομένα από μας που βρίσκονται σε εξέλιξη φάσης ΙΙ κλινική μελέτη έδειξε ότι το BR-ΔΗΜ θεραπεία των ασθενών προστάτη πριν από ριζική προστατεκτομή οδήγησε στην αυξημένη έκφραση ας-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7c, και γράμ- 7d σε δείγματα όγκου μετά BR-DIM παρέμβαση (Σχ. 4Α-C), και τα αποτελέσματα αυτά είναι συνεπή με μειωμένη έκφραση του ΕΖΗ2 (Εικ. 4D). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι BR-ΔΗΜ θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την εκ νέου εκφράζουν τις χαμένες miRNAs ιδιαίτερα την οικογένεια ας-7, το οποίο θα μειώσει το επίπεδο της ΕΖΗ2 έκφρασης και του συμβιβασμού ΚΕΠ ή CSLCs λειτουργία.

( Α) Ολικό RNA απομονώθηκε από LNCaP, C4-2B και PC3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 25 μΜ BR-DIM για 24 ώρες και τα αποτελέσματα από πραγματικού χρόνου RT-PCR που δείχνουν ότι η έκφραση του ας-7 αυξήθηκε μετά BR-DIM θεραπεία σε σύγκριση να μη επεξεργασμένο έλεγχο (c: DMSO ελέγχου). (Β) Τα επίπεδα του mRNA ΕΖΗ2 είχαν κατασταλεί από τον BR-ΔΗΜ θεραπεία σε ένα εξαρτώμενο τιποτένια δόση. (Γ και Δ) Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα επεξεργασμένα με BR-DIM για 48 ώρες και κηλίδα Western που δείχνει τα επίπεδα πρωτεΐνης του ΕΖΗ2, η οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω από τον BR-DIM θεραπεία (PD PC3: κύτταρα PDGF-D PC3, *, p & lt? 0,05? **, p & lt?. 0.01)

η

RNA λήφθηκε από BR-ΔΗΜ παρέμβαση δείγματα κλινική δοκιμή όπου BR-ΔΗΜ δόθηκε στους ασθενείς για 2-4 εβδομάδες πριν τη χειρουργική επέμβαση . RNA ελήφθη επίσης από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα (FFPE) ιστό ασθενών προστάτη με συμφωνημένα όγκου Gleason τάξη, το στάδιο του όγκου και την ηλικία του ασθενούς ως ομάδα ελέγχου. Η έκφραση των miRNAs και mRNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR. Σχετικά επίπεδα miRNA και mRNA ομαλοποιήθηκαν σε RNU1A1 και βήτα-ακτίνη, αντίστοιχα. (Α) BR-ΔΗΜ παρέμβαση οδήγησε στην αυξημένη τάση στα επίπεδα έκφρασης Let-7α. (Β και Γ) ας-7b, αφήστε-7c και αφήστε-7η σημαντικά up-ρυθμίζεται από BR-ΔΗΜ παρέμβαση. (Δ) της έκφρασης ΕΖΗ2 ήταν κάτω-ρυθμίζονται από BR-ΔΗΜ παρέμβαση.

Η

BR-ΔΗΜ θεραπεία αναστέλλεται αυτο-ανανέωση και κλωνογόνο ικανότητα των κυττάρων του προστάτη

Για να ελέγξετε αν BR-DIM θα μπορούσε να ρυθμίσει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης και κλωνογόνο ικανότητα των κυττάρων προστάτη, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς σχηματισμού σφαίρας και διαπίστωσε ότι η θεραπεία των κυττάρων C4-2B και PC3 PDGF-D με 10 ή 25 μΜ BR-DIM μείωσε σημαντικά τον αριθμό και το μέγεθος του prostaspheres σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο έλεγχο (έλεγχος DMSO) (Σχ. 5Α). Επιπλέον, BR-DIM αγωγή ανέστειλε επίσης την κλωνογόνο ικανότητα ανάπτυξης των κυτταρικών σειρών προστάτη κύτταρα C4-2B και PC3 PDGF-D (Σχ. 5Β). Τα αποτελέσματα από δοκιμασία μαλακού άγαρ περαιτέρω έδειξαν ότι η θεραπεία των κυττάρων C4-2B με 10 ή 25 μΜ BR-DIM μείωσε το μέγεθος και τους αριθμούς (Εικ. 5C και 5D) αποικία, γεγονός που υποδηλώνει ότι BR-DIM θα μπορούσε να εξαλείψει τα καρκινικά κύτταρα ειδικά τα κύτταρα με τα ΚΕΠ ή CSLCs χαρακτηριστικά από up-ρύθμιση ας-7 οικογένεια και, κατά συνέπεια, από τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της ΕΖΗ2.

(Α) Ενιαία κυτταρικά εναιωρήματα των κυττάρων C4-2B και PC3 PDGF-D απλώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλή φρεάτια προσκολλημένα του ελάσματος 6-φρεατίων σε 2000 κύτταρα /φρεάτιο εντός DMEM /F12 συμπληρωμένο με Β27 και Ν2 και με 10, 25 μΜ BR-DIM και επωάστηκαν για 6 ημέρες. αριθμοί Prostasphere μειώθηκαν κατά BR-DIM θεραπεία (άνω πάνελ).