Αφηρημένο

Ιστορικό

Πολλοί ασθενείς διαγιγνώσκονται με καρκίνο των ωοθηκών εμπειρία υποτροπής και μετάσταση, δύο πτυχές που θα προκαλέσει συχνά θάνατό τους. Επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) είναι μια βασική διαδικασία που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου. Με την αύξηση της στοιχεία που συνδέουν σισπλατίνη και η EMT, θέλαμε να προσδιορίσει μια ένωση είναι σε θέση να αντιμετωπίσει EMT εξέλιξη, όταν τα καρκινικά κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με σισπλατίνη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Ο κυτταρικός θάνατος αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία με αννεξίνη V /PI χρώση στο Α2780 και A2780cp κύτταρα. Ωοθηκών κυτταρικές σειρές καρκίνου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη (24 ώρες, 10 μΜ) και διαφορετικές συγκεντρώσεις ρεσβερατρόλης να αξιολογήσει τα αποτελέσματά της επί Cisplatin επαγόμενη EMT χρησιμοποιώντας Western Blot και ανάλυση RT-PCR. Μορφολογικές μελέτες και πληγή δοκιμασία επούλωσης για την αξιολόγηση κυτταρικής κινητικότητας πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της θεραπείας Cisplatin 72 ώρες με Α2780 και A2780cp κύτταρα. Πυκνομετρία έγινε με Western Blot και ΡΟΚ αποτελέσματα, και η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίσθηκε με τη χρήση One-Way ANOVA που ακολουθήθηκε από Tukey τεστ post-hoc. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η σισπλατίνη που προκαλείται από ΕΜΤ-σχετίζεται μορφολογικές αλλαγές στην Α2780 κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών και σε μικρότερο βαθμό σε Cisplatin ανθεκτικά ομόλογό A2780cp της. Η ρεσβερατρόλη προκάλεσε θάνατο των κυττάρων σε Α2780 και A2780cp κυτταρικές σειρές σε ένα αποπτωτικό-ανεξάρτητο τρόπο. Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει την επαγόμενη από cisplatin έκφραση Σαλιγκάρι με τη μείωση της ενεργοποίησης της οδού Erk, επανήλθε μορφολογικές μεταβολές που προκαλούνται από σισπλατίνη και μειωμένη κυτταρική μετανάστευση.

Συμπεράσματα

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρεσβερατρόλη έχει ενδιαφέρουσες δυνατότητες για την πρόληψη σισπλατίνη– επαγόμενη EMT σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Με την αύξηση του κυτταρικού θανάτου, αντιπροσωπεύει επίσης μια προσέγγιση φιλόξενο ως επικουρική θεραπεία για να χρησιμοποιηθεί με χημειοθεραπεία. Χρησιμοποιώντας αναστολείς της οδού Erk θα μπορούσε επίσης να αποδειχθεί χρήσιμη στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών για να μειωθεί ο κίνδυνος μετάστασης

Παράθεση:. Baribeau S, Chaudhry P, η Μητρική εταιρεία S, Asselin e (2014) Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει την επαγόμενη από cisplatin Τα επιθηλιακά-to- μεσεγχυματικά Μετάβαση στο ωοθηκών Γραμμές Cancer Cell. PLoS ONE 9 (1): e86987. doi: 10.1371 /journal.pone.0086987

Επιμέλεια: Goli Σαμίμι, Kinghorn Κέντρο Καρκίνου, Garvan Institute of Medical Research, Αυστραλία

Ελήφθη: 4 Οκτωβρίου, 2013? Αποδεκτές: 19η Δεκεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Baribeau et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από μια επιχορήγηση από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (MOP-66987). EA κατέχει καναδική Research πρόεδρος στη Μοριακή-Gyneco-Ογκολογίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η έβδομη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η τρίτη πιο συχνή μεταξύ των γυναικολογικών καρκίνων στην καναδική γυναίκες. Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι επίσης το γυναικολογικό καρκίνο με το υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας και ποσοστό επιβίωσης 5 ετών υπολογίζεται ότι μόνο 15-25% [1]. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι οι ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο των ωοθηκών συχνά έχουν ήδη μια ασθένεια υψηλής στάδιο κατά τη στιγμή της διάγνωσης [2], [3]. Η συνήθης θεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών αποτελείται από χειρουργική cytoreduction ακολούθησε με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία [4]. Παρά την αρχική ανταπόκριση στη θεραπεία, πολλοί ασθενείς θα υποτροπιάσουν και τελικά να επηρεάζεται από μεταστάσεις και τελικά ανταποκρίνονται μεταβίβασή τους.

Τα επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) είναι μια φυσιολογική διαδικασία που συμβαίνει κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης και περιστασιακά σε ενήλικες, για παράδειγμα κατά τη διάρκεια της επούλωσης τραύματος [5]. EMT είναι ένα φαινόμενο κατά το οποίο τα κύτταρα θα υποβληθούν σε μια μετάβαση από ένα επιθηλιακό φαινότυπο σε μια πιο κινητικό και επεμβατική μεσεγχυματικών φαινότυπο, καθιστώντας τα ικανά να προσβάλλουν ιστούς και μεταστάσεις μορφή. Το κύριο χαρακτηριστικό γνώρισμα της ΕΜΤ είναι η απώλεια της Ε-καδερίνης, μία πρωτεΐνη διασταύρωση συνήθως εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η απώλεια Ε-καντερίνης διαμεσολαβείται από μεταγραφικοί καταστολείς, και οι μεταλλάξεις του γονιδίου ή της πρωτεΐνης δεν είναι κοινές εκδηλώσεις [6]. Οι πιο συχνά εμπλέκονται καταστολείς περιλαμβάνουν σαλιγκάρι, Slug, και ZEB1 που δεσμεύονται άμεσα με τον υποκινητή Ε-καδερίνης να καταστέλλει τη μεταγραφή του [7], [8]. Πολλοί παράγοντες είναι γνωστό ότι επάγουν EMT, συμπεριλαμβανομένων κυτοκίνες όπως ΤΟΡ-β [9] ή του μονοπατιού ΜΑΡΚ-Erk [10]. Μια πρόσφατη μελέτη για τον καρκίνο των ωοθηκών αναφερθεί σισπλατίνη ως επαγωγέα της EMT [11].

σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκα είναι μεταγραφικοί παράγοντες κυρίως γνωστός για τη συμμετοχή τους σε EMT όπου καταστέλλουν την έκφραση των επιθηλιακών δεικτών, όπως η E-cadherin και κλαουδίνης-1, και να αυξήσει την έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών, όπως ZEB1 και ΜΜΡ-9 [12] – [16]. Μπορούν επίσης να καταστείλει την έκφραση και τη λειτουργία του καταστολέα όγκων ρ53 και προώθηση χημειοαντίσταση [17], [18]. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της EMT, πιστεύεται ότι σαλιγκάρι θα είναι ο πρώτος παράγοντας που πρέπει να γίνουν ενεργά για την έναρξη της μετάβασης, ενώ γυμνοσάλιαγκας θα εκφράζονται σε μεταγενέστερα στάδια για να επιτρέψει τα κύτταρα να διατηρούν τα χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά τους [19]. ZEB1 είναι ένας άλλος σημαντικός υποστηρικτής του ΕΜΤ με καταστολή ΖΟ-1 και Ε-καδερίνης [20], αλλά μπορεί επίσης να συμμετέχει στην αύξηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων [21].

Η ρεσβερατρόλη (trans-3,4 ‘ , 5-τριϋδροξυστιλβένιο) είναι μια φυσική ένωση που παράγεται σε πολλά φυτά, συμπεριλαμβανομένων κόκκινων σταφυλιών [22], και στη συνέχεια υπάρχει στο κρασί, που είναι γνωστή για τις αντιοξειδωτικές και προστατευτικές επιδράσεις του στο καρδιαγγειακό σύστημα και κατά του καρκίνου με τον οποίο μπορεί να αναστείλει πολλά στάδια της νόσου [23]. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, αυτές οι πολλές επιπτώσεις τοποθετούνται ρεσβερατρόλη στο προσκήνιο της έρευνας.

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η επίδραση της ρεσβερατρόλης στην επαγόμενη από cisplatin EMT στον καρκίνο των ωοθηκών. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα συν-θεραπεία με ρεσβερατρόλη και Cisplatin δεν παρουσιάζουν τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της EMT, ως θεραπεία ρεσβερατρόλη ακύρωσε Cisplatin επαγόμενη Σαλιγκάρι πρωτεΐνη και εκφράσεις mRNA σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτό περιελάμβανε την οδό Erk, η οποία ανεστάλη από την ρεσβερατρόλη και η συμμετοχή του επιβεβαιώθηκε μέσω ειδικών MEK1 /2 αναστολή με U0126. Η ρεσβερατρόλη μπλοκάρει επίσης μορφολογικές αλλαγές σε Α2780 και A2780cp κυττάρων και μείωσε την ικανότητα μετανάστευσης των Α2780 και A2780cp κυττάρων κατά τη διάρκεια μιας δοκιμασίας επούλωσης τραύματος. Παρόμοια αναστολή της μετανάστευσης παρατηρήθηκε σε OVCAR-3 και SKOV-3 κύτταρα. Προτείνουμε επίσης β-κατενίνης ως δείκτης της αντοχής στη σισπλατίνη απόπτωση όπως διασπάστηκε μόνο σε Cisplatin ευαίσθητη κυτταρικές σειρές.

Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

τροποποιημένο

κατά Dulbecco Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), και ορό ανάπτυξη των βοοειδών (BGS) αγοράστηκαν από την Hyclone (South Logan, Utah). Γενταμυκίνη, σισπλατίνη, και ρεσβερατρόλη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Ο αναστολέας ΜΕΚ1 /2 και το Γήρανση β-γαλακτοσιδάσης κιτ χρώσης αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Νεκρά kit κυτταρικής απόπτωσης με αννεξίνης-ν /ΡΙ, αντιδραστήριο ΤπζοΙ και ιού λευχαιμίας ποντικού Moloney (Μ-MLV) αντίστροφης μεταγραφάσης αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA).

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών Α2780 και A2780cp (ανθεκτικό σε σισπλατίνη) κύτταρα ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr G. Peter Raaphorst (Ottawa Περιφερειακό Κέντρο Καρκίνου, Ottawa, Canada) και είχαν αρχικά περιγράφεται στο [24]. OVCAR-3 και SKOV-3 κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την ATCC. Α2780 και A2780cp κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 μέσο συμπληρωμένο με 2% BGS. OVCAR-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 και SKOV-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy τόσο συμπληρωμένο με 10% FBS. Γενταμυκίνη (50 μg /mL) προστέθηκε σε όλα τα μέσα καλλιέργειας.

Για να μελετηθεί η επίδραση της ρεσβερατρόλης στην επαγόμενη από cisplatin EMT, Α2780 και A2780cp κύτταρα συν-θεραπεία με ρεσβερατρόλη και 10 μΜ σισπλατίνης για 24 ώρες. Για να μελετηθεί η επίδραση της οδού Erk επί Cisplatin επαγόμενη EMT, κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών προκατεργάστηκαν με 20 μΜ U0126 για 1 h, στη συνέχεια Cisplatin προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας για 24 ώρες σε μία τελική συγκέντρωση 10 μΜ. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για U0126 και ρεσβερατρόλη.

Ανίχνευση του κυτταρικού θανάτου με κυτταρομετρία ροής

Α2780 και A2780cp κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη και σισπλατίνης για 24 ώρες. Κατά τη συγκομιδή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 500 rpm για 5 λεπτά, πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν 300 rpm για 5 λεπτά. Ο κυτταρικός θάνατος αξιολογήθηκε με Annexin-V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διπλή χρώση χρησιμοποιώντας κιτ νεκρός κυτταρικής απόπτωσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ο φθορισμός διαβάστηκε χρησιμοποιώντας ένα ροής Cytomics FC 500 MPL κυτταρομετρητή (Beckman Coulter). Θετικά κύτταρα για Annexin-V ή /και ΡΙ θεωρήθηκαν ως νεκρά κύτταρα.

ΜΤΤ δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των Α2780 και A2780cp κυττάρων αξιολογήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εις διπλούν σε πλάκες 96-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα βρίσκονται σε φάση ανάπτυξης υπέστησαν επεξεργασία με 0-60 μΜ ρεσβερατρόλη με ή χωρίς 10 μΜ σισπλατίνης για 24 ώρες σε μέσο καλλιέργειας 100 μL. 4 ώρες πριν από το τέλος της θεραπείας, 10 μι διαλύματος ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε επωαστή. 4 ώρες αργότερα, 100 μL διαλύματος διαλυτοποίησης (10% SDS σε 0.01 Μ HCl) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες αφέθηκαν στον επωαστήρα όλη τη νύχτα. Την επόμενη ημέρα, η απορρόφηση αναγνώσθηκε στα Α

595 nm με ένα μετρητή πλακιδίων Fluostar Optima.

Western Blot

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες ρεσβερατρόλη-Σισπλατίνη ή U0126-Cisplatin θεραπεία και πλύθηκε δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Τα κύτταρα στη συνέχεια υπέστησαν λύση σε RIPA ρυθμιστικό λύσης που περιέχει πλήρες κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Applied Science) και υποβλήθηκε σε τρεις κύκλους ψύξης /απόψυξης στους -20 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία πρωτεΐνης BioRad DC. Ίση ποσότητα των πρωτεϊνών (20-40 μg) στη συνέχεια διαχωρίστηκαν πάνω σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (BioRad, Hercules, CA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% άπαχο γάλα αποβουτυρωμένο σε PBS-Tween 20 0.05% (ΡΒδ-Τ) για 1 ώρα πριν από την επώαση με πρωτογενές αντίσωμα (αραιωμένο 1:1000 σε ΡΒδ-Τ /γάλακτος) όλη τη νύκτα στους 4 ° C (όλα αντισώματα είναι από την Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, εκτός από GAPDH Abcam (Cambridge, ΜΑ)). Πρωτογενής αντίσωμα που στοχεύει Σαλιγκάρι επωάστηκε 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και συζευγμένο με HRP-GAPDH επωάστηκε 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση, οι μεμβράνες πλύθηκαν τέσσερις φορές σε PBS-T πριν από την επώαση με ραφανιδική υπεροξειδάση δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο (BioRad, Hercules, CA) αραιωμένο 1:3000 σε ΡΒδ-Τ /γάλα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τέσσερις φορές σε PBS-T και τα αντισώματα αποκαλύφθηκαν χρησιμοποιώντας SuperSignal West Femto υπόστρωμα (Thermo Scientific, Rockford, IL), όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή χρησιμοποιώντας UVP Bio System Imaging. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

μορφολογία κυττάρων

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2,5 μΜ Cisplatin και /ή 60 μΜ ρεσβερατρόλη για 72 ώρες σε Α2780 και A2780cp κύτταρα για να δοθεί επαρκής χρόνος για να συμβεί EMT μορφολογικές αλλαγές. Μετά την κατεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν με φρέσκο ​​μέσο για την απομάκρυνση των νεκρών κυττάρων. Τέλος, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο Zeiss Axio τον Carl observerZ1 να προσδιοριστεί μορφολογία και την εικόνα τους ελήφθησαν μικροσκοπία αντίθεσης φάσης χρησιμοποιώντας 20Χ μεγέθυνση. Τα κύτταρα που παρουσιάζουν χαρακτηριστικά μεσεγχυματικών, με μια πιο ινοβλάστη μορφολογία που μοιάζει και η κυτταρική προεξοχές, θεωρήθηκαν ως έχουν υποστεί EMT.

πληγών επούλωσης δοκιμασία

Για την αξιολόγηση κυτταρικής κινητικότητας, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκες και αναπτύχθηκαν σε συρροή. Ένα αποστειρωμένο άκρο χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει μια γρατσουνιά στο στρώμα κυττάρων. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2,5 μΜ Cisplatin και 60 μΜ ρεσβερατρόλη και οι φωτογραφίες πάρθηκαν σε κατάλληλους χρόνους για να αξιολογήσει το κλείσιμο του τραύματος. Τα τραύματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ να μετρήσει την περιοχή της πληγής σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Το ποσοστό του κλεισίματος του τραύματος υπολογίστηκε ως τραύματος περιοχή σε μια δεδομένη στιγμή σε σχέση με την αρχική επιφάνεια του τραύματος. Εικόνες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν.

PCR ανάστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR)

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα κατεργάστηκαν χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο ΤπζοΙ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 500 ng RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση και ολίγο (dT) αρχικά τεμάχια. Η αντίστροφη μεταγραφή RNA στη συνέχεια ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Ανθρώπινα Σαλιγκάρι ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τον νοηματικό εκκινητή 5′-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3 ‘και αντιπληροφοριακό εκκινητή 5′-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3′ (θραύσμα μήκους 140 bp). Ανθρώπινη TCF8-ZEB1 ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας νοηματικό εκκινητή 5’-TTACACCTTTGCATACAGAACCC-3 ‘και αντιπληροφοριακό εκκινητή 5′-TTTACGATTACACCCAGACTGC-3′ (θραύσμα μήκους 100 bp). Ανθρώπινα βιμεντίνης ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας νόημα 5’-CGAAAACACCCTGCAATCTT-3 ‘και 5′-αντινοηματικός εκκινητής CTGGATTTCCTCTTCGTGGA-3′ (θραύσμα μήκους 133 bp). GAPDH ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας νόημα 5’-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3 ‘και αντιπληροφοριακό εκκινητή 5′-GACTTGACAAAGTGGTCG-3’ (θραύσμα μήκους 139 bp). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Γήρανση σχετιζόμενη β-γαλακτοσιδάσης χρώση

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα κατεργάστηκαν με 60 μΜ ρεσβερατρόλη και 2,5 μΜ σισπλατίνης για 72 ώρες. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν για να απομακρυνθεί μη προσκολλημένα κύτταρα και βάφονται με την Γήρανση β-γαλακτοσιδάσης κιτ χρώσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα μετά μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός για την αξιολόγηση του ποσοστού των γηρασμένων κυττάρων το οποίο εμφανίστηκε ως μπλε κύτταρα.

Πυκνότητας και στατιστική ανάλυση

Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε στα αποτελέσματα Western Blot και ΡΟΚ εικόνες χρησιμοποιώντας Ποσότητα Ένα λογισμικό (BioRad) για τον προσδιορισμό της αφθονίας των πρωτεϊνών ή ενισχυμένου mRNA μελετήθηκε. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Σε επούλωσης πληγών δοκιμασίες, περιοχή του τραύματος ήταν μετρούνται χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Το κλείσιμο της πληγής αξιολογήθηκε με σύγκριση της περιοχής του τραύματος σε μια δεδομένη στιγμή προς την αρχική περιοχή του τραύματος. Σύγκριση μεταξύ θεραπειών διεξήχθη χρησιμοποιώντας GraphPad Prism έκδοση λογισμικού 5.00 (San Diego, CA) με τη χρήση μονόδρομης ανάλυσης ANOVA και το

post hoc

δοκιμή του Tukey. Η στατιστική σημαντικότητα έγινε δεκτή όταν p & lt? 0,05. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη επαναλήφθηκαν τρεις ανεξάρτητες φορές.

Αποτελέσματα

ρεσβερατρόλη προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα ωοθηκών καρκίνο

Θεραπεία του Α2780 και A2780cp καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με ρεσβερατρόλη αυξημένη κυτταρικό θάνατο σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο όπως φαίνεται από το ποσοστό των ΡΙ-θετικά κύτταρα. Το χαμηλό ποσοστό της χρώσης αννεξίνης-ν σε δείγματα ρεσβερατρόλη επεξεργασμένα, αλλά όχι σε δείγματα Cisplatin επεξεργασμένα υποδηλώνει ότι η ρεσβερατρόλη μπορεί να ωθήσουν τον κυτταρικό θάνατο μέσω ενός διαφορετικού μηχανισμού ή συμβαίνουν πιο γρήγορα από Cisplatin-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 1).

επίπεδα κυτταρικός θάνατος αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής με Annexin-V και χρώση ΡΙ στο Α2780 και A2780cp κύτταρα. Αντιπροσωπευτικά κυτταρομετρίας ροής αποτελέσματα δείχνονται για Α2780 (Α) και τα κύτταρα τα A2780cp (Β) κατεργασία με 10 μΜ Cisplatin και 40 μΜ ρεσβερατρόλη. Στην επάνω δεξιά γωνία, ποσοστό των νεκρών κυττάρων δείχνεται, που αντιστοιχεί σε αποπτωτικών και νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο. Annexin-V και αρνητικά κύτταρα ΡΙ (Β3) είναι μη-αποπτωτικά. Αννεξίνη-ν θετικά και αρνητικά ΡΙ κύτταρα (Β4) είναι στα αρχικά στάδια της απόπτωσης. Αννεξίνη-ν θετικά και ΡΙ θετικών κυττάρων (Β2) είναι σε αργά απόπτωση. Αννεξίνη-V αρνητικά και ΡΙ θετικών κυττάρων (Β1) είναι νεκρωτικό κύτταρα. ποσοστό κυτταρικός θάνατος φαίνεται στο (C) και για τις δύο κυτταρικές γραμμές κατεργάστηκαν με αυξανόμενες δόσεις ρεσβερατρόλης έως 60 μΜ, με ή χωρίς Cisplatin 10 μΜ. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Σε γραφήματα, στήλες ταυτίζονται με διαφορετικά γράμματα είναι σημαντικά διαφορετικές (ρ & lt? 0,05). Σε γραφικές παραστάσεις, μακέτα: μη επεξεργασμένα κύτταρα, R20: Η ρεσβερατρόλη 20 μΜ, R40: Η ρεσβερατρόλη 40 μΜ, R60: Η ρεσβερατρόλη 60 μΜ, CP: σισπλατίνη, R20CP: RESV. 20 μΜ + σισπλατίνη, R40CP: RESV. 40 μΜ + σισπλατίνη, R60CP: RESV. 60 μΜ + σισπλατίνη.

Η

Ερευνήσαμε απόπτωση και αυτοφαγία ως πιθανούς μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου. Στο Α2780 κύτταρα, σισπλατίνη που προκαλείται από την αύξηση της κασπάσης-3 και PARP διάσπαση, υποδηλώνοντας την επαγωγή κυτταρικού θανάτου μέσω απόπτωσης. Αντίθετα, η θεραπεία των Α2780 ή A2780cp κυττάρων με ρεσβερατρόλη δεν επηρέασε τα επίπεδα του διασπασμένη κασπάση 3, παρά την παρουσία των νεκρών κυττάρων, ενισχύοντας την πιθανότητα ότι ένας μηχανισμός, εκτός από την απόπτωση εμπλέκεται (Σχήμα 2). Στη συνέχεια αποφάσισε να μελετήσει την επαγωγή αυτοφαγία με την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης των LC3B-ΙΙ και Beclin-1, δύο πρωτεΐνες γνωστές για τη συμμετοχή τους στην εξέλιξη αυτοφαγία. Η ρεσβερατρόλη προκάλεσε αύξηση των επιπέδων LC3B-ΙΙ στις δύο κυτταρικές σειρές, υποστηρίζοντας τα αποτελέσματα από Opipari

κ.ά.

. δείχνοντας autophagy ως δυνητικός μηχανισμός που ευθύνεται για κυτταρικό θάνατο που επάγεται ρεσβερατρόλη [25]. Στο μοντέλο μας, εμείς δεν παρατηρούμε μια αύξηση στα επίπεδα Beclin-1, το οποίο έχει ήδη εκφράσει σε σχετικά υψηλά επίπεδα σε κυτταρικές σειρές Α2780 και A2780cp.

Ο μηχανισμός του κυτταρικού θανάτου μελετήθηκε σε Α2780 και A2780cp κύτταρα ανταπόκριση στη σισπλατίνη και ρεσβερατρόλη. Η απουσία αύξησης των διασπασμένου επίπεδα PARP και διάσπαση της κασπάσης-3, όταν οι υψηλότερες δόσεις ρεσβερατρόλης που χρησιμοποιούνται προτείνει ρεσβερατρόλη θα προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω ενός μηχανισμού ανεξάρτητου της απόπτωσης. Η σημαντική αύξηση των LC3BII προτείνει ρεσβερατρόλη θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο μέσω αυτοφαγία. πυκνομετρική ανάλυση παρουσιάζεται υπό Western Blot για κάθε κυτταρική γραμμή. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Σε γραφήματα, στήλες ταυτίζονται με διαφορετικά γράμματα είναι σημαντικά διαφορετικές (ρ & lt? 0,05). Σε γραφικές παραστάσεις, μακέτα: μη επεξεργασμένα κύτταρα, R40: Η ρεσβερατρόλη 40 μΜ, CP: σισπλατίνη, R20CP: RESV. 20 μΜ + σισπλατίνη, R40CP: RESV. 40 μΜ + σισπλατίνη, R60CP: RESV. 60 μΜ + σισπλατίνη.

Η

Η ρεσβερατρόλη ενισχύει Cisplatin που προκαλείται μείωση της κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να αξιολογήσει την επίδραση της ρεσβερατρόλης στον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών Α2780 και A2780cp. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, χαμηλές δόσεις ρεσβερατρόλης (20-40 μΜ) αυξάνει ελαφρώς τον πολλαπλασιασμό των δύο κυτταρικές σειρές παρά την κυτταρικό θάνατο που συνδέεται με αυτή τη θεραπεία. Στην υψηλότερη δόση που δοκιμάστηκε (60 μΜ) ρεσβερατρόλη προκάλεσε μία ελαφρά μείωση σε πολλαπλασιασμό σε Α2780 κύτταρα και σχεδόν καμία αλλαγή σε κύτταρα A2780cp. Σε κύτταρα Α2780 Cisplatin ευαίσθητα, ρεσβερατρόλη ενισχύει την μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παρατηρείται όταν σισπλατίνη χρησιμοποιούνται ως θεραπεία υποδηλώνοντας μια συνεργική δράση μεταξύ αυτών των δύο ενώσεων. Αυτό δεν παρατηρήθηκε σε Cisplatin ανθεκτικά A2780cp κύτταρα, αλλά η υψηλότερη δόση ρεσβερατρόλη δεν αύξησε τον πολλαπλασιασμό όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με σισπλατίνη.

δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη για να αξιολογηθεί ο πολλαπλασιασμός Α2780 και Α2780 κυτταρικές σειρές σε ανταπόκριση προς 10 μΜ Cisplatin και αυξανόμενες δόσεις μέχρι και 60 μΜ της ρεσβερατρόλης. Α2780 κύτταρα πολλαπλασιασμός αυξήθηκε κατά ρεσβερατρόλη στα 20 μΜ και μειώθηκε στα 60 μΜ ενώ όλες οι δόσεις αναφέρονται σε αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων A2780cp. Η ρεσβερατρόλη ενισχύει επίσης Cisplatin μείωση του πολλαπλασιασμού σε Α2780 κύτταρα. Γράφημα ράβδων με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν στατιστικά (ρ & lt? 0,05). Σε γραφικές παραστάσεις, μακέτα: μη επεξεργασμένα κύτταρα, R20: Η ρεσβερατρόλη 20 μΜ, R40: Η ρεσβερατρόλη 40 μΜ, R60: Η ρεσβερατρόλη 60 μΜ, CP: σισπλατίνη, R20CP: RESV. 20 μΜ + σισπλατίνη, R40CP: RESV. 40 μΜ + σισπλατίνη, R60CP: RESV. 60 μΜ + σισπλατίνη.

Η

Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει Cisplatin μεσολάβηση επαγωγή EMT σε κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών

Για να εκτιμηθεί η επίδραση της ρεσβερατρόλης στην Cisplatin που προκαλείται από EMT, Α2780 και A2780cp κύτταρα συν κατεργασμένους με ρεσβερατρόλη και Cisplatin. Όπως ήταν αναμενόμενο, την κατεργασία των κυττάρων με σισπλατίνη αύξησε τα επίπεδα της πρωτεΐνης του σαλιγκαριού, βιμεντίνη και ZEB1, τρεις από τους κύριους δείκτες της EMT. Κατεργασία των κυττάρων με σισπλατίνη και ρεσβερατρόλη μείωσε τα επίπεδα έκφρασης του σαλιγκαριού, αλλά δεν έδειξε αυτό το αποτέλεσμα για βιμεντίνη και ZEB1 έκφρασης. Αντίθετα, αυτές οι δύο πρωτεΐνες αυξήθηκαν ελαφρώς όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ρεσβερατρόλη μόνη της (Σχήμα 4Α). Η μείωση των επιπέδων Σαλιγκάρι σε Α2780 έλαβαν θεραπεία με ρεσβερατρόλη και Σισπλατίνη συσχετίζεται με μία μείωση στην Σαλιγκάρι mRNA levels.However, αυτό δεν ήταν η περίπτωση σε A2780cp κύτταρα όπου δεν παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή στα επίπεδα mRNA μεταξύ Σαλιγκάρι δείγματα επεξεργασμένα με σισπλατίνη και εκείνων που έλαβαν θεραπεία με Αμφότερες η σισπλατίνη και ρεσβερατρόλη, γεγονός που υποδηλώνει κάποια μετα-μεταφραστικών μηχανισμών θα μπορούσε επίσης να συμμετέχει στην σαλιγκάρι μειορύθμιση σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 4Β). επίπεδα ZEB1 και βιμεντίνης mRNA παρέμεινε ως επί το πλείστον αμετάβλητες σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία είτε με ρεσβερατρόλη, σισπλατίνη ή δύο παράγοντες. Στο μοντέλο των κυττάρων μας, δεν θα μπορούσαμε να αξιολογήσει την πρόοδο EMT βασίζεται στην αρνητική ρύθμιση της E-cadherin επειδή Α2780 και A2780cp κύτταρα δεν εκφράζουν αυτή την πρωτεΐνη.

Western Blot ανάλυση της EMT Σημάδια σαλιγκάρι, βιμεντίνη και ZEB1 στο Α2780 και A2780cp κυττάρων (Α) σε απόκριση σε 10 μm Σισπλατίνη με ή χωρίς αυξανόμενες δόσεις ρεσβερατρόλης. Η πυκνομετρική ανάλυση παρουσιάζεται κάτω από κάθε κυτταρική σειρά Western blots. Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει την επαγόμενη από cisplatin έκφραση Σαλιγκάρι με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά αυξάνει ελαφρά ZEB1 και τα επίπεδα βιμεντίνης. Η ρεσβερατρόλη δοσοεξαρτώμενη μείωση στα επίπεδα P-Erk2 υποδηλώνει την εμπλοκή του μονοπατιού Erk σε ρεσβερατρόλη επαγόμενη σαλιγκάρι μειορύθμιση. Οι δείκτες EMT σαλιγκάρι, βιμεντίνη και έκφραση ZEB1 αναλύθηκαν με RT-PCR σε Α2780 και τα κύτταρα A2780cp (Β) κατεργασία με 10 μm Σισπλατίνη με ή χωρίς αυξανόμενες δόσεις ρεσβερατρόλης. Η ρεσβερατρόλη ή θεραπεία σισπλατίνη είχαν καμία επίδραση στα επίπεδα ZEB1 και βιμεντίνης mRNA. Vimentin και ZEB1 πυκνότητας εμφανίζεται κάτω από κάθε κυτταρική σειρά. έκφραση Σαλιγκάρι mRNA μειώθηκε μόνο σε Α2780 κύτταρα, υποδηλώνοντας άλλος μηχανισμός θα μπορούσε να συμμετάσχει σε κύτταρα A2780cp. Οι εικόνες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Σε γραφήματα, στήλες ταυτίζονται με διαφορετικά γράμματα είναι σημαντικά διαφορετικές (ρ & lt? 0,05). Σε γραφικές παραστάσεις, μακέτα: μη επεξεργασμένα κύτταρα, R40: Η ρεσβερατρόλη 40 μΜ, CP: σισπλατίνη, R20CP: RESV. 20 μΜ + σισπλατίνη, R40CP: RESV. 40 μΜ + σισπλατίνη, R60CP: RESV. 60 μΜ + σισπλατίνη.

Η

Η ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ Erk συνδέεται με σισπλατίνη που προκαλείται από EMT

Είμαστε δίπλα διερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο ρεσβερατρόλη μετρητές Cisplatin έκφραση που προκαλείται από σαλιγκάρι. Η οδός ΜΑΡΚ /ΕΚΚ είναι ένας από τους πιθανούς μηχανισμούς που μπορούν να συμμετέχουν στην επαγωγή ΕΜΤ στα κύτταρα. Σε Α2780 και A2780cp κύτταρα, η φωσφορυλίωση Erk2 ήταν αυξημένη σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη. Η ενεργοποίηση αυτού του μονοπατιού αναστάλθηκε σημαντικά με ρεσβερατρόλη, που αντιστοιχεί σε μείωση των επιπέδων Σαλιγκάρι σε Α2780 και A2780cp κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η εμπλοκή των Erk στην αύξηση των επιπέδων σαλιγκάρι σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη, χρησιμοποιήσαμε U0126, μία ΜΕΚ1 /2 ειδικός αναστολέας (Εικόνα 5). Προκατεργασία των κυττάρων με αυτού του αναστολέα μείωσε σημαντικά τα επίπεδα ενεργοποίησης του Erk2 σε Α2780 και A2780cp κύτταρα, τα οποία επίσης συσχετίζεται με μία σημαντική μείωση σε Σαλιγκάρι πρωτεΐνη στις δύο κυτταρικές σειρές. Ελαφρά αύξηση των επιπέδων πρωτεΐνης του βιμεντίνης και ZEB1 παρατηρήθηκαν επίσης (Σχήμα 5Α). επίπεδα Σαλιγκάρι mRNA μειώθηκαν όταν και οι δύο κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη και U0126, υποδηλώνοντας Cisplatin επαγόμενη έκφραση Σαλιγκάρι μέσω της οδού Erk απαιτεί μεταγραφή του γονιδίου σαλιγκάρι. επίπεδα ZEB1 και βιμεντίνης mRNA δεν παρουσίασαν σημαντικές μεταβολές όταν Α2780 και A2780cp κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη και U0126 μόνες ή σε συνδυασμό (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ρεσβερατρόλη επαγόμενη αναστολή ΕΜΤ μέσω του μονοπατιού Erk.

Α2780 και κυτταρικές σειρές A2780cp προ-επεξεργασία με U0126 να αναστέλλουν δραστικότητα Erk και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σισπλατίνη για 24 ώρες. Western Blot φαίνονται στο (Α). Αντίστοιχες πυκνότητας εμφανίζεται κάτω από κάθε κυτταρική σειρά. αναστολή Erk μειώνεται Cisplatin επαγόμενη έκφραση Σαλιγκάρι αλλά ελαφρώς αυξημένη ZEB1 και έκφραση βιμεντίνης στις δύο κυτταρικές σειρές. Αντίστοιχες αποτελέσματα PCR που φαίνεται στο (Β). Σαλιγκάρι mRNA μείωση στα δείγματα που αντιμετωπίζονται U0126 + σισπλατίνη προτείνει ρύθμιση σαλιγκάρι από σισπλατίνη περιλαμβάνει μεταγραφή του γονιδίου. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Σε γραφήματα, στήλες ταυτίζονται με διαφορετικά γράμματα είναι σημαντικά διαφορετικές (ρ & lt? 0,05). Σε γραφικές παραστάσεις, μακέτα: μη επεξεργασμένα κύτταρα, CP: σισπλατίνη, U + CP:. U0126 + σισπλατίνη

Η

μπλοκ ρεσβερατρόλη Η σισπλατίνη που προκαλείται από μορφολογικές αλλαγές

Για να αποφευχθεί η υπερβολική Η σισπλατίνη που προκαλείται κυτταροτοξικότητα σε Α2780 κύτταρα, αποφασίσαμε να χρησιμοποιήσουμε 2,5 μΜ Cisplatin να εκτιμήσει μορφολογικές αλλαγές σε Α2780 και A2780cp κυττάρων για τη θεραπεία 72 ώρες. Θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων με σισπλατίνη που προκαλείται από μορφολογικές αλλαγές που θυμίζει ΕΜΤ καθώς τα κύτταρα έχασαν επιθηλιακά πλακόστρωτο-όπως μορφολογία τους να αποκτήσουν ένα πιο επίμηκες ινοβλαστών-όπως το σχήμα. Cellular προεξοχές εμφανίστηκε επίσης σε κύτταρα Cisplatin-σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου. Και τα δύο κύτταρα Α2780 και A2780cp έδειξε αυτές τις τροποποιήσεις που δείχνει την εξέλιξη τους μέσω της EMT. Για να ελεγχθεί η επίδραση της ρεσβερατρόλης για το φαινόμενο αυτό, χρησιμοποιήσαμε 60 μΜ, η συγκέντρωση στην οποία Σαλιγκάρι μειορρύθμιση ήταν η πιο προφανής. Η προσθήκη της ρεσβερατρόλης στη θεραπεία Cisplatin μπλοκάρει αυτές τις μορφολογικές αλλαγές, όπως τα κύτταρα δεν αποκτούν οποιαδήποτε από τις χαρακτηριστικές μεσεγχυματικών μορφολογικά χαρακτηριστικά (Σχήμα 6). Είναι επίσης ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι τα κύτταρα ρεσβερατρόλη αγωγή έγινε μεγαλύτερο και εμφανίζεται ακανόνιστη εμφάνιση προτείνοντας ένα άλλο κυτταρικό μετασχηματισμό, όπως ένα πρόγραμμα γήρανση, μπορεί να συμβαίνει [26].

Α2780 (Α) και A2780cp (Β ) κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 72 ώρες με 2.5 μΜ Σισπλατίνη με ή χωρίς 60 μm ρεσβερατρόλη να επιτρέψει EMT μορφολογικές αλλαγές να γίνουν εμφανείς. Η σισπλατίνη που προκαλείται από μορφολογικές αλλαγές που θυμίζει ΕΜΤ σε κύτταρα Α2780 εμφανής μετά από 72 ώρες, οι οποίες καταργείται όταν ρεσβερατρόλη προστέθηκε στη θεραπεία. Η ρεσβερατρόλη που ασκείται το ίδιο αποτέλεσμα στο A2780cp κύτταρα αν και οι μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από σισπλατίνη ήταν λιγότερο έντονη. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν υπό μεγέθυνση 20x, γραμμή κλίμακας στην επάνω αριστερή γωνία των εικόνων αντιπροσωπεύουν το 20 μm. Τα βέλη δείχνουν τα παραδείγματα των κυττάρων που έχουν υποστεί EMT. Εικόνες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Η ρεσβερατρόλη προκαλεί γήρανση

Αξιολογήσαμε την επαγωγή γήρανσης σε κυτταρικές σειρές μας μετά σισπλατίνη και η ρεσβερατρόλη θεραπεία και παρατηρείται μια σημαντική αύξηση σε ρεσβερατρόλη που προκαλείται από τη γήρανση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές μετά από 72 ώρες, με μια πιο έντονη επίδραση στα κύτταρα Α2780 (Σχήμα 7). Παρατηρήσαμε επίσης υψηλότερα επίπεδα γήρανση σε κύτταρα Α2780 αγωγή με σισπλατίνη και δείχνουν ότι η συνεχής έκθεση στη σισπλατίνη θα μπορούσε να προκαλέσει μια οξειδωτικό στρες που οδηγεί σε γήρανση σε αυτές Cisplatin-ευαίσθητα κύτταρα. επαγωγή γήρανσης σε Α2780 και A2780cp κύτταρα θα μπορούσε να είναι άλλος μηχανισμός που εμπλέκεται στην αναστολή της επαγόμενης από τη σισπλατίνη ΕΜΤ με ρεσβερατρόλη.

Θεραπεία του Α2780 και A2780cp κυττάρων με ρεσβερατρόλη αύξησε σημαντικά το ποσοστό των γηρασμένων κυττάρων. Η σισπλατίνη προκάλεσε μια σημαντική αύξηση του γηρασμού σε κύτταρα Α2780. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν για δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός για την εκτίμηση του ποσοστού των γηρασμένων κυττάρων (μπλε). Σε γραφήματα, στήλες ταυτίζονται με διαφορετικά γράμματα είναι σημαντικά διαφορετικές (ρ & lt? 0,05). Η ανάλυση διεξήχθη με τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση

Λαμβάνοντας υπόψη το μορφολογικό μετασχηματισμό συμβαίνουν σε Α2780 και A2780cp κύτταρα, αξιολογήσαμε την ικανότητα επόμενη μετανάστευση αυτών των κυττάρων με ένα τραυμάτων δοκιμασία επούλωσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 μΜ σισπλατίνη, να αποφευχθεί η υπερβολική κυτταροτοξικότητα σε Α2780 κύτταρα και 60 μΜ ρεσβερατρόλη. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, 72 ώρες ήταν απαραίτητα για την πληγή να κλείσει τελείως σε ακατέργαστα κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές δεν έχουν μια πολύ κινητό φαινότυπο. θεραπεία ρεσβερατρόλη σαφώς ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων σε κάθε χρονικό σημείο όπου το κλείσιμο του τραύματος εκτιμήθηκε, μειώνοντας το κλείσιμο της πληγής σε μόνο 20-25% μετά από 72 ώρες και για τις δύο κυτταρικές σειρές, ενώ τα κύτταρα ελέγχου είχαν κλείσει σχεδόν εντελώς τις πληγές (Σχήμα 8Α και 8Β). δράση της ρεσβερατρόλης δεν θα επηρεαστεί από σισπλατίνη σε κύτταρα A2780cp όπου αυτός ο παράγοντας που ασκεί την ίδια επίδραση στα κύτταρα με ή χωρίς Cisplatin.

Η μεταναστευτική ικανότητα Α2780 (Α), A2780cp (Β), OVCAR-3 ( C), και SKOV-3 (D) κύτταρα αξιολογήθηκε με δοκιμασία επούλωσης πληγών. Μια γρατσουνιά έγινε με ένα αποστειρωμένο άκρο σε μια συρρέουσα στιβάδα κυττάρων και το κλείσιμο του τραύματος παρατηρήθηκε μετά από 24, 48, και 72 ώρες σισπλατίνης και ρεσβερατρόλη θεραπεία για Α2780, A2780cp, και OVCAR-3 κύτταρα, και 12 και 24 ώρες για SKOV -3, που αντιστοιχεί στη στιγμή όπου η πληγή ήταν σχεδόν εντελώς κλειστό. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, η ρεσβερατρόλη μείωσε την μετανάστευση των κυττάρων στην πληγή, αποτρέποντας το κλείσιμο του μετά από 72 ώρες. Αντιπροσωπευτικά εικόνες που παρουσιάζονται σε t = 48 h. Γραφική αναπαράσταση του κλεισίματος του τραύματος μετά τα διαφορετικά χρονικά σημεία που μελετήθηκαν φαίνεται στο (Ε). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν. Σε γραφικές παραστάσεις, οι θεραπείες σε σύγκριση σε κάθε χρονικό σημείο που μελετήθηκαν και οι στήλες ταυτίζονται με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά (p & lt? 0,05).

Η

Επίσης, διερευνήθηκε το ενδεχόμενο της ρεσβερατρόλης να αναστέλλει την ικανότητα μετανάστευσης των OVCAR -3 κύτταρα, ένα επιθηλιακό κύτταρο γραμμή που εκφράζει Ε-καδερίνης και χωρίς βασική έκφραση του ZEB1 ή βιμεντίνη που δείχνει μικρή πιθανότητα μετανάστευσης, και SKOV-3 κύτταρα, μια κυτταρική γραμμή μεσεγχυματικά δείχνει βασική έκφραση της βιμεντίνης και ZEB1 καθώς και μεσεγχυματικά μορφολογία και υψηλή μετανάστευση δυναμικό παρά βασική Ε-καδερίνης έκφρασης (Σχήμα S1). Παρόμοια με Α2780 και A2780cp κύτταρα, κύτταρα OVCAR-3 απαιτούνται τουλάχιστον 72 ώρες για να κλείσει το τραύμα. Σε αυτή την κυτταρική γραμμή, η ρεσβερατρόλη μείωσε σημαντικά το κλείσιμο της πληγής μετά από 72 ώρες και σε κάθε χρονικό σημείο που μελετήθηκαν όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με σισπλατίνη. Σε SKOV-3 κύτταρα, μόνο 24 ώρες όφειλαν να τηρούν το κλείσιμο των πληγών 80-85% και ρεσβερατρόλη μείωσε σημαντικά την μετανάστευση αυτών των κυττάρων όταν χρησιμοποιούνται μόνα τους ή σε συνδυασμό με σισπλατίνη σε αυτό το χρονικό σημείο, υποδεικνύοντας ότι αυτό το phytoalexin διαθέτει την ικανότητα να μειώσει η μετανάστευση των κυττάρων τα οποία διαθέτουν υψηλό δυναμικό βασική μετανάστευση καθώς και κύτταρα με τη μετανάστευση δυναμικό χαμηλή (Σχήμα 8C και 8D). Τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε OVCAR-3 και SKOV-3 κύτταρα συσχετίζονται με αυτά που παρατηρούνται σε Α2780 και A2780cp αντίστοιχα, όπου η ευαισθησία στη σισπλατίνη είναι επίσης παρόμοια.

Για να αντιμετωπιστεί η πιθανότητα αύξησης του δυναμικού εισβολής των κυττάρων, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία zymography στο Α2780.