Αφηρημένο

Ιστορικό

KIAA0101 είναι ένας παράγοντας πυρηνικό αντιγόνο που σχετίζεται με πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που υπερεκφράζεται σε ορισμένες ανθρώπινες κακοήθειες. Φλοιού νεόπλασμα είναι ένα από τα πιο κοινά νεοπλάσματα του ανθρώπου για τις οποίες οι μοριακές αιτίες δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Επιπλέον, είναι δύσκολο να γίνει διάκριση μεταξύ εντοπισμένου καλοήθων και κακοήθων όγκων του φλοιού των επινεφριδίων. Για τους λόγους αυτούς, μελετήσαμε την έκφραση, τη λειτουργία και πιθανός μηχανισμός της απορρύθμισης των KIAA0101 στην ανθρώπινη φλοιού των επινεφριδίων νεόπλασμα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

επίπεδα KIAA0101 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν σε 112 φλοιού των ιστών δείγματα (21 κανονικό φλοιό των επινεφριδίων, 80 καλοήθεις φλοιού των επινεφριδίων όγκους, και 11 του φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα (ACC). siRNA knockdown χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του λειτουργικού ρόλου του KIAA0101 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, μαλακό άγαρ αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ανάπτυξη και εισβολή στο ACC . κυτταρική σειρά, NCI-H295R Επιπλέον, διερευνήσαμε το μηχανισμό της KIAA0101 απορρύθμισης με την εξέταση του κατάστασης μεταλλάξεων KIAA0101 mRNA (9,7 φορές) και η έκφραση της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ACC (ρ & lt? 0,0001).. KIAA0101 είχε αραιά έκφραση πρωτεΐνης σε μόνο μερικά φυσιολογικά δείγματα φλοιό των επινεφριδίων, η οποία περιορίζεται σε φλοιού των προγονικών κυττάρων. επίπεδα έκφρασης KIAA0101 ήταν 84% ακριβής για τη διάκριση μεταξύ ACC και φυσιολογικό και καλοήθη δείγματα φλοιού των όγκων. Knockdown της γονιδιακής έκφρασης KIAA0101 μειώθηκε σημαντικά αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη κατά 80% και εισβολή κατά 60% (ρ = 0,001? P = 0,006). Εμείς δεν βρήκε μεταλλάξεις σε KIAA0101 στην ACC.

Συμπεράσματα /Σημασία

KIAA0101 υπερεκφράζεται σε ACC. Τα στοιχεία μας υποστηρίζει ότι KIAA0101 είναι ένας δείκτης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, προωθεί την ανάπτυξη και την εισβολή, και είναι ένα καλό διαγνωστικό δείκτη για τη διάκριση καλοήθων από κακοήθεις φλοιού των επινεφριδίων νεόπλασμα

Παράθεση:. Jain M, L Zhang, Patterson EE, Kebebew Ε (2011) KIAA0101 υπερεκφράζεται, και προωθεί την ανάπτυξη και την εισβολή στον Καρκίνο επινεφριδίων. PLoS ONE 6 (11): e26866. doi: 10.1371 /journal.pone.0026866

Επιμέλεια: Irina V. Λεμπέντεβα, Enzo Life Sciences, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 του Ιουνίου του 2011? Αποδεκτές: 5 Οκτώβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 11 Νοέμβρη 2011

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα, το Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επινεφριδίων νεοπλάσματα είναι ένα από τα πιο κοινά ανθρώπινα νεοπλάσματα, συχνά ανιχνεύεται παρεμπιπτόντως [1]. Οι περισσότεροι επινεφριδίων νεοπλάσματα είναι καλοήθη, αλλά είναι συχνά δύσκολο να αποκλείσει έναν κακοήθη όγκο του φλοιού των επινεφριδίων, όπως καρκίνωμα. Φλοιού καρκίνωμα (ACC) είναι μια σπάνια κακοήθεια του φλοιού των επινεφριδίων με ελάχιστα κατανοητή μηχανισμός της ανάπτυξης, καθώς και μια μελαγχολική έκβαση ασθενών λόγω της έλλειψης αποτελεσματικής θεραπείας [2]. Η ετήσια επίπτωση του ACC είναι περίπου 1-2 περιπτώσεις ανά εκατομμύριο [3], [4], [5]. Πλήρη χειρουργική εκτομή είναι η μόνη δυνατή θεραπευτική αγωγή αλλά πάνω από τα δύο τρίτα των ασθενών παρουσιάζουν μεταστατική νόσο και ακόμη και εκείνους τους ασθενείς οι οποίοι έχουν πλήρη εκτομή αναπτύσσουν υποτροπιάζουσα νόσο σε πάνω από 50% των περιπτώσεων [2], [6]. Οι ασθενείς με μεταστατική νόσο έχουν ποσοστό πενταετούς επιβίωσης λιγότερο από 10% και τα άτομα με υποτροπιάζουσα νόσο έχουν πενταετούς επιβίωσης μόλις 50% [2], [6].

ACC μπορεί να σχετίζεται με κληρονομικό καρκίνο σύνδρομα όπως το σύνδρομο Beckwith-Wiedemann (που συνδέονται με την βλαστική 11p15 χρωμοσωμικών ανωμαλιών που οδηγούν σε

IGF2

υπερέκφραση, ΟΜΙΜ # 130650), το σύνδρομο Li-Fraumeni (

TP53

μετάλλαξη, ΟΜΙΜ # 151623) , πολλαπλές ενδοκρινική νεοπλασία τύπου 1 (μεταλλάξεις στο Menin ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ΟΜΙΜ # 131100), και σύνδρομο του Gardner (

APC

μετάλλαξη, ΟΜΙΜ # 175100). Οι γενετικές αλλαγές που σχετίζονται με κληρονομικές σύνδρομα καρκίνου έχουν παράσχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τις πιθανές μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ACC. Ωστόσο, οι περισσότερες περιπτώσεις είναι σποραδικές ACC, και τα μοριακά γεγονότα που οδηγούν στην έναρξη και την πρόοδο της φλοιού των επινεφριδίων όγκοι παραμένουν ασαφείς.

Γονιδίωμα-ευρύ προφίλ γονιδιακής έκφρασης παρέχει σημαντικές πληροφορίες για τις μοριακές οδούς που απορυθμίζεται σε καρκίνο και μπορεί να εμπλέκεται σε έναρξη και την εξέλιξη του όγκου. Δεδομένου ότι ο μοριακός μηχανισμός του φλοιού των επινεφριδίων καρκινογένεσης είναι ελάχιστα κατανοητή, cDNA ανάλυση μικροσυστοιχιών του φλοιού των επινεφριδίων όγκων έχει χρησιμοποιηθεί για να αποκαλύψει τα γονίδια των οποίων η misexpression συνδέεται με ACC [7], [8], [9], [10], [11]. Μεταξύ των γονιδίων που βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα πάνω στη θέση ACC, KIAA0101 (επίσης γνωστό ως L5? PAF? OEATC1? NS5ATP9? OEATC-1? Ρ15) είναι ένα νέο δυναμικό διαγνωστικές και προγνωστικές δείκτη, και στόχος για θεραπεία ACC. KIAA0101 κωδικοποιεί ένα πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) -associated παράγοντα με άγνωστη λειτουργία. KIAA0101 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινες κακοήθειες όπως ηπατοκυτταρικό και παγκρεατικού καρκινώματος [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21 ], [22]. Ωστόσο, ο ρόλος της KIAA0101 στον καρκίνο και ο μηχανισμός που οδηγεί σε απορυθμισμένη έκφραση KIAA0101 είναι ασαφής.

Σε αυτή τη μελέτη, θα εξετάσει τα θέματα αυτά και έδειξε ότι KIAA0101 υπερεκφράζεται σε ACC και ένα δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Επιπλέον, η μείωση της έκφρασης KIAA0101 στην ACC οδήγησε σε καταστολή της ανάπτυξης και της εισβολής γεγονός που υποδηλώνει ότι KIAA0101 παίζει ογκογόνο ρόλο στην ACC.

Μέθοδοι

δείγματα ιστών

Το διοικητικό συμβούλιο αναθεώρηση Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου ενέκρινε την εν λόγω πρωτόκολλο έρευνας μετά από ενημέρωση γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες. Επινεφριδίων ιστοί καταψύχθηκαν κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Σε αυτή τη μελέτη, 112 δείγματα ανθρώπινου φλοιού των ιστών αναλύθηκαν συμπεριλαμβανομένων 21 κανονική του φλοιού των επινεφριδίων ιστούς, 80 καλοήθεις φλοιού των επινεφριδίων όγκους και 11 πρωτογενείς καρκινωμάτων του φλοιού (78 καλοήθων όγκων του φλοιού των επινεφριδίων και 11 των πρωτογενών καρκινωμάτων του φλοιού είχαν προηγουμένως αναλυθεί) [11]. Μια ανεξάρτητη ομάδα ACC μεταστάσεις (n = 29) και υποτροπές (n = 2) χρησιμοποιήθηκε επίσης για την επικύρωση. Η διάγνωση της κατηγορηματική ACC και καλοήθους όγκου του φλοιού των επινεφριδίων επιβεβαιώθηκε σε όλες τις περιπτώσεις από την ιστολογική εξέταση και η κλινική παρακολούθηση. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν 26,3 μήνες για τους ασθενείς με καλοήθεις όγκους του φλοιού των επινεφριδίων και 44,4 μήνες για τους ασθενείς με ACC.

καλλιέργειας κυττάρων

Η κυτταρική σειρά ΝΟΙ-H295R ACC (ATCC, Rockville, MD ) αναπτύχθηκε και διατηρήθηκε σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 1% ITS + Premix (BD Biosciences, San Jose, CA), 2,5% Nu-Serum Ι (BD Biosciences), και 10.000 U /mL πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη σε μία πρότυπη υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε ένα 5%

2 ατμόσφαιρα CO. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 και 6 φρεατίων (4 χ 10

^ 4 κύτταρα σε 0,5 ml και 1,6 × 10

^ 5 κύτταρα σε 2 ml), τα κύτταρα επιμολύνονται με ένα μη ειδικό αρνητικό μάρτυρα siRNA και με ένα ειδικό siRNA KIAA0101 σε μια τελική συγκέντρωση των 40 και 80 ηΜ (AM4636 και AM46235, αντίστοιχα, Applied Biosystems, Foster City, CA). Το αντιδραστήριο TransIT siQuest (Mirus Bio, LLC) χρησιμοποιήθηκε για να παραδώσει siRNA στα κύτταρα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα ήταν παρόμοια για 40 και 80 nM. Όλα τα in vitro δοκιμασίες έγιναν με δύο 40 και 80 ηΜ συγκέντρωση του KIAA0101 ειδικών siRNAs και μη ειδική αρνητικός έλεγχος.

RNA και πρωτεΐνης Παρασκευή

RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή ( Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). ποσότητα και ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Thermo Fischer) και Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), αντίστοιχα.

ρυθμιστικό RIPA χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή προϊόντων λύσης ιστών και λύμα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκε με 1% SDS συν 10 mM Tris [ρΗ 7,5] ρυθμιστικού διαλύματος. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτείνης BioRad RC DC (Hercules, CA).

πραγματικού χρόνου ποσοτικής αλύσου πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφής αντίδραση (RT-PCR)

Ολικό RNA (125 ng) μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το RT cDNA σενάριο κιτ σύνθεσης (USB Corporation, Cleveland, ΟΗ). Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθούν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA σε σχέση με την αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης έκφραση mRNA (GAPDH). Κανονικοποιημένο επίπεδο έκφρασης του γονιδίου = 2

– (Ct

του γονιδίου που μας ενδιαφέρει – Ct

του GAPDH) × 100%, όπου C

t είναι το όριο του κύκλου PCR. Οι εκκινητές PCR και ανιχνευτές για KIAA0101 (Hs00207134_m1) και GAPDH (Hs99999905_m1) ελήφθησαν από την Applied Biosystems (Δοκιμασία-on-Demand kit®, Foster City, CA). Όλες οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε ένα τελικό όγκο 20 μΐ με 1 μΙ προτύπου cDNA σε έναν ΑΒΙ PRISM®7900 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems). Η θερμική κατάσταση ανακυκλωτή PCR ήταν 95 ° C για 12 λεπτά ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Western ανάλυση κηλίδος

Δείγματα πρωτεΐνης (40 μg) διαχωρίστηκαν σε 4% έως 20% γέλη SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Κηλίδωση Western διεξήχθη ακολουθώντας πρότυπες διαδικασίες με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων ποντικού πρωτογενή, αντι-KIAA0101 (Abcam? Ab56773) σε 1:100 αραίωση και αντι-β-ακτίνης (SC-81178, Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA) σε 1: 2000 αραίωση. ανίχνευση σήματος διεξήχθη χρησιμοποιώντας συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα και μία ενισχυμένη κιτ χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech).

Ανοσοϊστοχημική (IHC) και Immuunofluoroscence χρώση

ιστοί όγκου μονιμοποιήθηκαν με φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη, και 5 micron κόπηκαν τομές πάχους για ανοσοχρώση. Οι τομές επωάστηκαν με το πρωτογενές αντι-KIAA0101 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά 1:300 αραίωση επί μία νύκτα στους 4 ° C (Abcam? Ab56773) που ακολουθείται από βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (1:150? Vector Laboratories, Burlingame, CA, ΗΠΑ). Οι τομές αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη DAB ως χρωμογόνο (ABC ελίτ kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) και αιματοξυλίνη ως αντιχρώση. Οι τομές επανυδατώθηκαν και τοποθετημένα με τοποθέτηση vectamount μέσο (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Τα πλακίδια σαρώθηκαν υπό της Olympus μικροσκόπιο φωτός (Nikon, Tokyo, Japan) και φωτογραφίες τραβήχτηκαν σε 20Χ και 40Χ μεγεθύνσεις. Ένα ημιποσοτική σύστημα βαθμολόγησης χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της έκφρασης KIAA0101? επίπεδο έκφρασης ταξινομήθηκε ως καμία χρώση (0), & lt? 30% των κυττάρων χρώση (1), 30-50% των κυττάρων (2), και & gt? 50% των κυττάρων. Δύο παρατηρητές, οι οποίοι είχαν τυφλωθεί με τον τύπο του όγκου, ανεξάρτητα σκόραρε κάθε δείγμα. Οι βαθμολογίες ήταν μέσες τιμές για να ληφθεί το τελικό σκορ έκφραση KIAA0101

χρώση Immuunofluoroscence έγινε χρησιμοποιώντας πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-KIAA0101mouse κατά τη διάρκεια της νύχτας 1:300 αραίωση. (Abcam? Ab 56773) και κουνελιού αντι-SF-1 (Millipore ? 07-618, 2 μg /ml) στους 4 ° C. Τα πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύτηκαν με φθοροφόρο συζευγμένη με IgG RedTX αντι-κουνελιού (Invitrogen, Carlsbad, CA) και FITC αντι-ποντικού IgG δευτερογενή αντισώματα (Vector Laboratories). Οι πλάκες στη συνέχεια εκπλύθηκαν και τοποθετήθηκαν με ϋΑΡΙ (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη) τοποθέτησης διάλυμα. Οι εικόνες αναλύθηκαν με Zeiss Axioskop-2 μικροσκόπιο σε 20Χ και 40Χ μεγεθύνσεις.

DNA Καθαρισμός

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από 1 mg όγκου και κανονικών δειγμάτων με τη χρήση του QIAamp Blood DNA Mini Kit ( Qiagen, Hilden, Γερμανία), που εκλούεται σε έναν συνολικό όγκο 200 μL και φυλάχθηκε στους -20 ° C. Οι συγκεντρώσεις DNA μετρήθηκαν με υν απορρόφηση χρησιμοποιώντας NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Thermo Fischer).

Sequencing KIAA0101 περιοχή κωδικοποίησης

Ο εξώνια KIAA0101 1, 2, 3 και 4 υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας. PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν για κωδικοποιητική περιοχή χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης UCSC γονιδίωμα, Primer 3 ολοκληρωμένα προγράμματα λογισμικού. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα 1. Οι εκκινητές έγιναν από IDT, Inc. (Coralville, ΙΑ). Τα εξόνια 1, 2, 3 και 4 ενισχύθηκαν ως τρεις ξεχωριστές αντιδράσεις σε 50 μΐ χρησιμοποιώντας PCR μάστερ μιξ (Fermentas Inc. USA). Οι πρότυπες συνθήκες PCR ήταν αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 30 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 5 λεπτά, ανόπτηση στους 50 ° C για 1 min, επέκταση στους 72 ° C για 1 λεπτό και τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. PCR προϊόντα έγιναν ορατά σε 2% πηκτή αγαρόζης. Τα προϊόντα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας τυποποιημένες εξο-νουκλεάσης Ι και FastAP (Fermentas Inc.). Τα καθαρισμένα προϊόντα PCR αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας αλληλουχητή ΑΒΙ 3730xl με μεγάλη μέθοδος χρωστικής (κιτ αλληλούχισης DNA, μεγάλο χρωστικής τερματισμού αλληλουχίας κύκλου? Applied Biosystems). Μεταλλάξεις αναλύθηκαν από το 3.3 Πρόγραμμα μετάλλαξη Surveyor V (Soft Γενετικής? Www.softgenetics.com). Όλα τα δεδομένα αλληλούχισης έχει κατατεθεί στην GenBank.

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα σε μια συγκέντρωση 5 × 10

^ 3 κύτταρα ανά 100 μι μέσο καλλιέργειας σε έξι αντίγραφα. Σε κάθε χρονικό σημείο, το μέσο αναρροφήθηκε από το φρεάτιο και τα κύτταρα καταψύχθηκαν αμέσως στους -80 ° C για 24 ώρες. Οι πλάκες αποψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, και προετοιμάστηκε για τον αριθμό των κυττάρων ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας CyQUANT ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η δοκιμασία CyQuant διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και αναλύθηκαν σε ένα φθορομετρικό αναγνώστη μικροπλάκας (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) στα 480 nm /520 nm.

κυτταρομετρία ροής και την απόπτωση αναλύσεις

KIAA0101 και αρνητικού ελέγχου siRNA κύτταρα κατεργασμένα συλλέχθηκαν, μονιμοποιημένα με αιθανόλη όλη τη νύκτα στους 4 ° C, και επαναιωρήθηκαν σε 1χ PBS σε μια συγκέντρωση 1 × 10

^ 6 κύτταρα /mL. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ϋΝάση ελεύθερη ΚΝάσης (100 μg /ml) για 20 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο σε συγκέντρωση 50 μg /ml και τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους 4 ° C. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε σε ένα Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Τα αρχεία δεδομένων δημιουργήθηκαν για 20.000 συμβάντα (κύτταρα) χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest. Το κλάσμα του συνολικού κυτταρικού πληθυσμού που υπάρχει στο καθένα από τα G1, S και /φάσεων του κυτταρικού κύκλου G2 Μ ελήφθη από το λογισμικό ModFit LT (Verity Software House, Inc.). Ανάλυση της απόπτωσης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση χρώσης αννεξίνης V (ApoAlert® αννεξίνης V απόπτωση Kit) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Clontech, Mountain View, CA).

μαλακό άγαρ αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ανάπτυξη δοκιμασία

Δύο- στρωματοποιημένο μαλακό άγαρ προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν σε πλακίδια έξι φρεατίων. Το κάτω στρώμα του άγαρ (2 ml /φρεάτιο) περιείχε 0,5% άγαρ (Difco Noble Agar, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) σε μέσο συντήρησης. Πέντε ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNA, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν και 50.000 κύτταρα αναμίχθηκαν με 1,3 ml του διαλύματος άγαρ κορυφής συμπληρωμένου με 10% Nu-ορού (0,3% άγαρ σε μέσο καλλιέργειας). Στερεοποιημένα άγαρ επικαλύφθηκε με 1 ml μέσου καλλιέργειας που περιέχει 10% Nu-ορό. Οι πλάκες καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2, και το μέσο αλλάχθηκε δύο φορές την εβδομάδα. Μετά από 16 ημέρες καλλιέργειας, οι αποικίες των κυττάρων χρωματίστηκαν με 0.2% κρυσταλλικό ιώδες διάλυμα και εξετάστηκαν με μικροσκοπία. Αποικίες μετρήθηκαν σε 5 διαφορετικούς τομείς ανά καθώς και επιβεβαιώθηκε από το λογισμικό V11 TotalLab Quant (https://www.totallab.com/).

τηλέφωνα εισβολή

δοκιμασία

Η έκταση της κυτταρικής εισβολής ήταν αξιολογήθηκε με τη χρήση του BD BIOCOAT ™ Matrigel ™ εισβολή Επιμελητηρίου (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένα σύνολο 1 × 10

^ 5 κύτταρα σπάρθηκαν πάνω στα ενθέματα (8-μΜ πόρου μεγέθους πολυανθρακική μεμβράνη) επικαλυμμένα με ένα λεπτό στρώμα Matrigel Υπόγειο Membrane Matrix (BD Biosciences). Τα ένθετα τοποθετήθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων με 10% μέσο καλλιέργειας που περιέχει ορό ή μέσο χωρίς ορό. Οι πλάκες επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα που εισβάλει στην μήτρα Matrigel στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Diff Quik Stain (Dade Behring, Newark, DE, USA) και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός. Τέσσερα πεδία σε τέσσερα χωριστά τεταρτημόρια κάθε μεμβράνης μετρήθηκαν και ο μέσος όρος.

Στατιστικές Αναλύσεις

Η συνεχής δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (S.D.). Δύο-ουρά ANOVA πολλαπλής σύγκρισης

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η διαφορά μεταξύ της μέσης έκφρασης μεταξύ φυσιολογικών, καλοήθεις και κακοήθεις δείγματα. τεστ συσχέτισης Pearson χρησιμοποιήθηκαν για συνεχή δεδομένα. Ένα

σ

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική. Η ανάλυση έγινε με τη Stat View 5.0 (Cary, NC) και SPSS v 16.0 (Chicago, IL) στατιστικών λογισμικών.

Αποτελέσματα

KIAA0101 mRNA και η πρωτεΐνη είναι εξαιρετικά εκφράζονται σε φλοιού των επινεφριδίων νεόπλασμα

Η έκφραση του KIAA0101 mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ACC, σε σύγκριση με την κανονική του φλοιού των επινεφριδίων ιστού και καλοήθεις φλοιού των επινεφριδίων όγκοι (12-φορές υψηλότερη από το κανονικό και 9 φορές υψηλότερη από ό, τι σε καλοήθεις όγκους, ρ & lt? 0.0001) (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης KIAA0101 mRNA ήταν χαμηλότερη σε μεταστατικούς και επαναλαμβανόμενες όγκους συγκριτικά με πρωτογενείς ACC (ρ & lt? 0.001) έκφραση KIAA0101 mRNA

Α) σε φυσιολογικά φλοιό των επινεφριδίων (n = 21), καλοήθεις φλοιού των όγκων (Ν = 80), ACC (Ν = 10), μεταστατική και υποτροπιάζουσες ACC (n = 30) και η κυτταρική γραμμή NCI-H295R. επίπεδο έκφρασης mRNA KIAA0101 προσδιορίσθηκε με ποσοτική RT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση GAPDH mRNA. Στήλες αντιπροσωπεύουν μέσες ± τυπική απόκλιση όμοιων προσδιορισμών. Στατιστικά σημαντική διαφορά σημειώνονται με αστερίσκο (*) (p & lt? 0,05, Kruskal Wallis test). Πρωτοβάθμια ACC εναντίον κανονική (p & lt? 0,0001), πρωτοβάθμια ACC εναντίον καλοήθεις όγκοι του φλοιού των επινεφριδίων (p & lt? 0.0001) και πρωτοβάθμια ACC έναντι μεταστάσεων (p & lt? 0,0001). Β) ανάλυση της καμπύλης ROC για την έκφραση KIAA0101 mRNA. Το λειτουργικό δέκτης χαρακτηριστική καμπύλη (ROC) απεικονίζεται στο γράφημα χρησιμοποιώντας δεδομένα RT PCR έκφραση KIAA0101 κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH σε κανονικό φλοιό των επινεφριδίων (n = 21), καλοήθεις όγκοι του φλοιού των επινεφριδίων (n = 80), ACC (n = 10). Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) ήταν 0,78. Ένα τέλειο διαγνωστικός δείκτης χωρίς ψευδώς αρνητικά ή ψευδώς θετικά θα έχει AUC της 1. Γ) έκφραση της πρωτεΐνης KIAA0101 στην ACC. τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης σε κανονικούς KIAA0101 φλοιό των επινεφριδίων (n = 5), η καλοήθης (n = 13), και κακοήθεις όγκοι του φλοιού των επινεφριδίων (n = 3), όπως φαίνεται στα αντιπροσωπευτικά κηλίδα Western με KIAA0101 ειδικές και β-ακτίνης αντισώματα ελέγχου. β-ακτίνης σήμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. C = ACC, Β = καλοήθη του φλοιού των επινεφριδίων όγκου, και Ν = φυσιολογικό φλοιό των επινεφριδίων. Δ) διάγραμμα διασποράς KIAA0101 mRNA και το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης σε κανονικούς, καλοήθεις και κακοήθεις δείγματα του φλοιού των επινεφριδίων ιστού. Υ-άξονας δείχνει κανονικοποιημένη έκφραση του mRNA με ποσοτική RT-PCR και το Χ-άξονας δείχνει το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης στο ίδιο δείγμα με βάση τη μέτρηση πυκνομετρία μπάντα κανονικοποιούνται σε β ακτίνης επίπεδο έκφρασης. Ακοντιστές συντελεστής συσχέτισης (r) = 0,61, p & lt? 0.001. Ε) Η ανοσοϊστοχημεία για την έκφραση της πρωτεΐνης KIAA0101 στην κανονική του φλοιού των επινεφριδίων ιστού, καλοήθεις όγκοι και ACC. Αντιπροσωπευτικά εικόνες παρουσιάζονται για κάθε κατηγορία σε μεγέθυνση 20x. Το βέλος δεικνύει τη θετική πυρηνική χρώση για KIAA0101. Σε κανονική δείγματα ιστού, μόνο η subcupsular περιοχή ήταν θετική. ΣΤ) KIAA0101 κυτταρικό εντοπισμό αναλύθηκε με immunoflouroscence. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε), το κόκκινο χρώμα δείχνει έκφραση KIAA0101. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από κακοήθη ACC και φυσιολογικά δείγματα εμφανίζονται σε μεγέθυνση 20x.

Η

Με δεδομένη τη σημαντική διαφορά έκφρασης mRNA μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όγκων, ήμασταν ενδιαφέρονται για την εκτίμηση αν KIAA0101 ήταν μια ακριβής διαγνωστική ικανότητα πρόβλεψης των όγκων τύπος. έκφραση KIAA0101 ήταν 84% ακριβής για τη διάκριση μεταξύ ACC και της κανονικής και της καλοήθους δείγματα του φλοιού των επινεφριδίων όγκου (αριθμός των αληθώς θετικά και τα αρνητικά αποτελέσματα διαιρούμενο με τον συνολικό αριθμό δειγμάτων χρησιμοποιώντας ένα επίπεδο αποκοπής των 1.5). Η περιοχή κάτω από την καμπύλη χαρακτηριστική χειριστή του δέκτη (ROC) (AUC) ήταν 0,78 για την έκφραση KIAA0101 mRNA (Σχήμα 1Β), 0.79 για το μέγεθος του όγκου, και 0,85 για το συνδυασμό της έκφρασης KIAA0101 και το μέγεθος του όγκου.

Εκτός υψηλή έκφραση mRNA, έκφραση πρωτεΐνης KIAA0101 επίσης αυξημένα σε ACC, σε σύγκριση με την κανονική φλοιό των επινεφριδίων και καλοήθεις δείγματα φλοιού των όγκων. Στις κηλίδα Western, βρήκαμε υψηλότερη έκφραση σε ACC (n = 3) από καλοήθεις όγκοι του φλοιού των επινεφριδίων (n = 13), και σε φυσιολογικά δείγματα φλοιό των επινεφριδίων (n = 5) (Σχήμα 1 C). Υπήρξε καλός συσχετισμός μεταξύ KIAA0101 mRNA και τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης (Σχήμα 1 D, r = 0,61, ρ & lt? 0.001). Για να εκτιμηθεί περαιτέρω η έκφραση KIAA0101, πραγματοποιήσαμε ημιποσοτική ανάλυση ενός ιστικού πίνακα που περιέχει μικρά τμήματα των καλοήθων και κακοήθων όγκων με ανοσοϊστοχημεία για KIAA0101 πρωτεΐνη. Αυτή η ανάλυση έδειξε καμία σημαντική διαφορά στην έκφραση της πρωτεΐνης KIAA0101 μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όγκων (p = 0.31). Αυτό δεν προκαλεί έκπληξη καθώς ανοσοϊστοχημεία είναι μια ημιποσοτική μέθοδο και δεν μπορεί να ανιχνεύσει μικρότερες διαφορές στην έκφραση της πρωτεΐνης. Ωστόσο, όταν η έκφραση της πρωτεΐνης KIAA0101 εκτιμήθηκε σε μεμονωμένες καλοήθεις και κακοήθεις δείγματα στη συστοιχία, σημαντική υπερέκφραση παρατηρήθηκε σε σύγκριση με κανονικά δείγματα (Σχήμα 1 Ε). πρωτεΐνη KIAA0101 ήταν παρόν στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα, η οποία επιβεβαιώθηκε επίσης με ανοσοφθορισμό (Σχήμα 1 F).

Παρατηρήσαμε μόνο αραιά χρώση KIAA0101 σε μερικά φυσιολογικά δείγματα φλοιό των επινεφριδίων, η οποία περιορίζεται στην περιοχή subcapsular φλοιό ( Σχήμα 2Α). Για να προσδιορίσετε αν αυτό το εστιακό χώρο θετικό για KIAA0101 εκπροσωπείται επινεφριδίων προγονικά κύτταρα, έχουμε συν-βάφονται τα ίδια φυσιολογικά δείγματα φλοιό των επινεφριδίων με στερεοειδογόνο παράγοντα 1 (SF-1) αντίσωμα, ένα δείκτη των επινεφριδίων προγονικών κυττάρων [23]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η κανονική επινεφριδίων δείγματα φλοιού έδειξαν συν-χρώση KIAA0101 και SF-1 μαζί στο υποκαψικό ή προγονικών περιοχή του φλοιού των επινεφριδίων (Σχήμα 2Β).

Α) χρώση Ανοσοϊστοχημεία της κανονικής φλοιού επινεφριδίων για SF-1 και KIAA0101. Στο πρώτο πάνελ, οι ζώνες του φλοιού των επινεφριδίων υποδεικνύεται στο 10Χ, 1: μυελώδους μοίρας που περιέχει προγονικά κύτταρα, 2: Zona fasciculata, 3: Zona δικτυωτή. Δεύτερο και τρίτο πίνακα δείχνουν την SF-1 (20X 40X με ένθετο) και KIAA0101 θετική ανοσοχρώση στην μυελώδους μοίρας σε μεγέθυνση 20x. Κόκκινα βέλη δείχνουν τις θετικές περιοχές για SF-1 και KIAA0101 χρώση. Β) Immunofluoroscence για SF-1 και KIAA0101 στην κανονική φλοιό των επινεφριδίων. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε), το κόκκινο χρώμα δείχνει έκφραση KIAA0101 και πράσινο χρώμα δείχνει έκφραση SF-1. Συγχωνευθείσας Εικόνες (κίτρινο χρώμα) σε 40Χ δείχνουν συνεντόπισης των δύο πρωτεϊνών, SF-1 και KIAA0101 στα προγονικά κύτταρα του φυσιολογικού φλοιό των επινεφριδίων.

Η

Μηχανισμός KIAA0101 υπερέκφραση σε ACC

Για να καθοριστεί αν η υπερέκφραση KIAA0101 ήταν συνέπεια των παραλλαγών της αλληλουχίας του γονιδίου, εκτελέσαμε ανάλυση μετάλλαξης στο KIAA0101. Βρήκαμε ένα de

novo

G & gt? Μια μεταβατική μετάλλαξη στη θέση 186 η οποία εμπίπτει σε μη κωδικεύουσα περιοχή του KIAA0101 σε ένα καλοήθη δείγμα. Παρατηρήσαμε επίσης μία πολυμορφισμό στην 5 ‘UTR στο εξόνιο 1-2 (88T & gt? C). Περίπου 6.6% των καλοήθων ήταν ετερόζυγοι και 12,5% στην κανονική αλλά κανένας σε κακοήθη δείγματα (Πίνακας 2). Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αποτελέσματα είναι μάλλον απίθανο ότι η υπερέκφραση KIAA0101 είναι αποτέλεσμα της μετάλλαξης.

Η

Το λειτουργικό αποτέλεσμα της εξουδετέρωσης των γονιδίων KIAA0101 σε ένα ACC κυτταρική σειρά

Με δεδομένη τη σημαντική υπερέκφραση του KIAA0101 σε ACC (Σχήμα 1) και την παρατήρηση ότι η έκφραση KIAA0101 περιορίζεται σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα επινεφριδίων progentitor (Σχήμα 2Β), υποθέσαμε ότι KIAA0101 παίζει ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη του φλοιού των επινεφριδίων. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, χρησιμοποιήσαμε siRNA σε νοκ ντάουν έκφραση KIAA0101 στην κυτταρική σειρά ACC, NCI-H295R. Παροδική επιμόλυνση KIAA0101 ειδικών siRNA είχε ως αποτέλεσμα μια 10-πλάσια knockdown μέσα σε 24 ώρες και το αποτέλεσμα αυτό διατηρήθηκε για μέχρι 6 ημέρες στο mRNA και 80% μειωμένο στα επίπεδα της πρωτεΐνης σε σύγκριση με ένα μη στόχευσης siRNA (αρνητικός έλεγχος siRNA) ( Σχήμα 3). KIAA0101 knockdown οδήγησε σε μέτρια αύξηση σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό με μια αύξηση του αριθμού των κυττάρων μέχρι 25% (p = 0,005) (Σχήμα 4Α). Επίσης, το ποσοστό του χρόνου και την ανάπτυξη των κυττάρων γραμμή διπλασιασμού ήταν διαφορετικές για siRNA knockdown σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο (μέσος χρόνος 4,7 και το ρυθμό ανάπτυξης του 0,14 διπλασιασμό σε σύγκριση με μέσο χρόνο διπλασιασμού 3,5 και το ρυθμό ανάπτυξης του 0,19 από την ημέρα 1 έως 5 , αντίστοιχα). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν μια μέτρια αύξηση στον αριθμό των κυττάρων στην φάση G1 (p = 0,013) (Σχήμα 4Β). Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αντιφατικά αποτελέσματα, αξιολογήσαμε επίσης mRNA έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών G1 του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 μετά KIAA0101 νοκ ντάουν. KIAA0101 knockdown δεν μετέβαλε σημαντικά την έκφραση του mRNA του ρ21 και Κυκλίνη D1, ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου, σε μία κυτταρική γραμμή ACC. Επιπλέον, KIAA0101 γονίδιο knockdown δεν είχε σημαντική επίδραση στον αριθμό των κυττάρων στην απόπτωση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α) κύτταρα H295R επιμολύνθηκαν με KIAA0101 siRNA και αρνητικό μάρτυρα και αναλύθηκαν ως προς την έκφραση του mRNA KIAA0101 μετά από 48 ώρες της θεραπείας. Στήλες αντιπροσωπεύουν ποσοστό έκφρασης KIAA0101 mRNA σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα ± τυπική απόκλιση των τεσσάρων πειραμάτων. Β) Αντιπροσωπευτικά στυπώματος Western καταδεικνύει πρωτεΐνη έκφραση KIAA0101 μετά από 6 ημέρες από siRNA και αρνητικό έλεγχο. C) Σχετική ένταση της Western Blot χρησιμοποιώντας J εικόνας Λογισμικού. Στήλες δείχνουν αναλογία KIAA0101 και την ένταση GAPDH μετρήσεις. NC40 = αρνητικός μάρτυρας σε 40 nm? SI40 = siRNA σε 40 nm? NC80 = αρνητικός μάρτυρας σε 80 nM? SI80 = siRNA στα 80 nm.

Η

Α) Ο αριθμός των κυττάρων για την KIAA0101 siRNA θεραπεία και αρνητικού ελέγχου αντιμετωπίζονται οι ομάδες φαίνονται στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία (σημαντικές τιμές που υποδεικνύονται από τον αστερίσκο (*) (p = 0.005?. σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα) μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου και είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων πειραμάτων NC80 = αρνητικός μάρτυρας στα 80 ηΜ?. SI80 = siRNA στα 80 ηΜ Β) γονίδιο KIAA0101 knockdown και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου ενδείκνυται. σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Αντιπροσωπευτική εικόνα του προφίλ του κυτταρικού κύκλου από siRNA και αρνητικές ομάδες θεραπείας ελέγχου. Γ) Κάθε στήλη δείχνει την κατανομή του G0 /G1 πληθυσμό κυττάρων σε κάθε ομάδα σε διάφορα χρονικά σημεία. Οι ράβδοι σφάλματος παριστάνουν ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου και είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων πειραμάτων * Ημέρα 3 και 5, σελ & lt?. 0,05? σε σχέση με αρνητικό μάρτυρα.

Η

Με δεδομένες τις παράδοξες συνέπειες, μια μέτρια αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και G1 σύλληψη, χρησιμοποιήσαμε επιπλέον λειτουργικές δοκιμασίες για να κατανοήσουν καλύτερα τις φαινοτυπικές αλλαγές που σχετίζονται με KIAA0101 νοκ ντάουν. Συγκεκριμένα tumorogenicity και μεταστατικό δυναμικό αξιολογήθηκαν. KIAA0101 knockdown σε κύτταρα NCI-H295R μείωσε τον αριθμό των αποικιών που ήταν σε θέση να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ σχεδόν κατά 80% (p = 0.001) σε 16 ημέρες καλλιέργειας (Εικόνες 5Α και 5Β) με μείωση κατά 60% των κυττάρων εισβολής στην κυτταρική γραμμή NCI-H295R (p = 0,006) (Σχήματα 5C και 5D).

Α) κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 15 ημέρες παρουσία του υποδεικνύεται συγκεντρώσεων siRNA και αρνητικό έλεγχο. Αντιπροσωπευτικά εικόνες εμφανίζονται σε 12Χ και 40Χ μεγεθύνσεις. Β) Η κατανομή και ο αριθμός των αποικιών σε ομάδα που έλαβε αγωγή με KIAA0101 siRNA και ομάδα αρνητικού ελέγχου στους 80 ηΜ (p = 0.001? Σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα? NC80 = αρνητικός μάρτυρας στα 80 ηΜ? SI80 = siRNA σε 80 ηΜ). Οι ράβδοι σφάλματος παριστάνουν ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου και είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων πειραμάτων. Γ) εισβάλλοντας κύτταρα βάφτηκαν με 0.2% κρυσταλλικό ιώδες και οπτικοποιήθηκαν με μικροσκοπία. Εκπρόσωπος εικόνες 20Χ ακόλουθη δοκιμασία εισβολής. Δ) Η κατανομή των αριθμού των κυττάρων στο KIAA0101 siRNA και ομάδα αρνητικού μάρτυρα. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. * P & lt? 0,05 KIAA0101 siRNA έναντι αρνητικού ελέγχου. κύτταρα H295R επιμολύνονται με αρνητικό μάρτυρα ή KIAA0101 siRNA σε 80 ηΜ για 120 ώρες, ακολουθούμενη από μια δοκιμασία εισβολής για 48 ώρες.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την έκφραση KIAA0101 και η λειτουργία στην ACC. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι KIAA0101 υπερεκφράζεται σε ACC, είναι ένα καλό διαγνωστικό δείκτη για ACC, και είναι ένας δείκτης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Καταστολή της έκφρασης KIAA0101 σε κύτταρα του φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα οδήγησε στην καταστολή της ανάπτυξης και της εισβολής, γεγονός που υποδηλώνει ότι παίζει έναν ρόλο προαγωγής της ανάπτυξης σε ACC.

Προηγούμενες μελέτες έχουν καταδείξει αλλαγμένη έκφραση KIAA0101 σε ανθρώπινες κακοήθειες και απουσιάζει ή χαμηλή έκφραση σε κανονική ιστός [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Ωστόσο, αντικρουόμενα αποτελέσματα έχουν ληφθεί για έκφραση KIAA0101 σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC). Σε μία μελέτη, η έκφραση KIAA0101 βρέθηκε να προς τα κάτω σε HCC [13]. Αντίθετα, σε μια ξεχωριστή μελέτη, σε μια μεγάλη σειρά ασθενών με HCC, KIAA0101 ρυθμίζεται αυξητικά [18]. Η μελέτη μας κατέδειξε επίσης την υπερέκφραση KIAA0101 στην πρωτοβάθμια ACC, αλλά, περιέργως, η έκφραση KIAA0101 mRNA ήταν χαμηλότερη σε όγκους από μια σειρά ασθενών με μεταστατικό και επαναλαμβανόμενες ΚΕΠ που ανταποκρίθηκαν στη συστηματική χημειοθεραπεία και υποβλήθηκαν σε εκτομή. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση KIAA0101 μπορεί να ποικίλει ως αποτέλεσμα της θεραπείας και θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για την ανταπόκριση σε θεραπεία ACC και άλλων καρκίνων.

Αν και βρήκαμε ότι η έκφραση KIAA0101 πρωτεΐνη ήταν υψηλότερη σε κακοήθεις και καλοήθεις όγκους σε σύγκριση με τα κανονικά δείγματα, κάναμε την ανίχνευση της έκφρασης KIAA0101 σε ένα υποσύνολο των κανονικών δειγμάτων. έκφραση της περιορίστηκε στην subcapular περιοχή του φλοιού των επινεφριδίων και επικαλύπτεται το SF-1 θετικά κύτταρα χρώση. Στην περιοχή αυτή, οι SF-1 θετικά κύτταρα υποτίθεται ότι είναι επινεφριδίων προγονικά κύτταρα [24]. Τα προγονικά κύτταρα έχουν υψηλή ικανότητα πολλαπλασιασμού. KIAA0101 και SF-1 συν-έκφραση της περιοχής πρόγονος της κανονικής φλοιού των επινεφριδίων υποδηλώνει ότι KIAA0101 μπορεί να είναι ένας δείκτης του πολλαπλασιασμού σε φλοιού των επινεφριδίων κύτταρα. Σε συμφωνία με αυτό, μια μελέτη από Simpson et al., Απέδειξε τον εντοπισμό του KIAA0101 σε βασικό στρώμα κυττάρων της επιδερμίδας και της πολλαπλασιαστικής ζώνης στις κρύπτες του παχέος εντέρου [15].

Λίγα είναι γνωστά για το λειτουργία του γονιδίου KIAA0101 σε κύτταρο όγκου βιολογία. Προηγουμένως, οι μελέτες έχουν δείξει ότι KIAA0101 εμπλέκεται στην ρύθμιση της αντιγραφής του DNA, του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [13], [14], [15], [18], [25], [26].