Abstract

Ανθρώπινο μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) είναι εξαιρετικά επιθετική και αναπτύσσεται γρήγορα αντοχή στη θεραπεία. SCLC κύτταρα είναι τυπικά μη ευαίσθητα σε γλυκοκορτικοειδή οφείλεται σε μειωμένη υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών (GR) έκφρασης. Αυτό είναι σημαντικό, καθώς έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η έκφραση ενός διαγονιδίου GR επάγει κυτταρικό θάνατο

in-vitro

, και αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου

in-vivo

. Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός για την απώλεια της έκφρασης GR είναι άγνωστη. Η κυτταρική γραμμή SCLC, DMS79, έχει χαμηλή έκφραση GR, σε σύγκριση με μη-SCLC κυτταρικές γραμμές και κανονικές βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων. ρετροϊικής έκφρασης GR στα κύτταρα DMS79 προκάλεσε την ενεργοποίηση του αποπτωτικού μονοπατιού όπως αποδεικνύεται από την σημαντική επαγωγή της δραστικότητας κασπάσης-3. ανάλυση μεθυλίωσης του υποκινητή GR αποκάλυψε κάποια-μεθυλίωση στο 1D, 1E και υποκινητές του γονιδίου GR, ωστόσο η πανταχού παρούσα συστατικώς δραστικό υποκινητή 1C ήταν βαριά μεθυλιωμένα. Στην υποκινητή 1C υπήρχε μια ιδιαίτερα σημαντική αύξηση στην μεθυλίωση του DNA σε ένα πάνελ από 14 ανθρώπινα SCLC κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με ένα μικτό πάνελ GR εκφράζουν, και μη-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν και να μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος. Επιπλέον, στο πάνελ των κυτταρικών γραμμών SCLC υπήρξε σημαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ μεθυλίωση του υποκινητή 1C, και η έκφραση πρωτεΐνης GR. Αντιστροφή του γονιδίου μεθυλίωσης GR με αναστολή μεθυλτρανσφεράση DNA που προκαλείται αυξημένη GR mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, αλλά όχι μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη ευαισθησία Gc, μειωμένη έκφραση Bcl-2 και την αυξημένη δραστηριότητα της κασπάσης-3 σε SCLC κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση του DNA μειώνει την έκφραση του γονιδίου σε ανθρώπινα GR SCLC κυττάρων, με έναν παρόμοιο τρόπο με εκείνον που για τα συμβατικά ογκοκατασταλτικών γονιδίων

Παράθεση:. Kay P, Schlossmacher G, Matthews L, Sommer Ρ, Singh D, White Α, et al. (2011) απώλεια της έκφρασης γλυκοκορτικοειδών υποδοχέων από το DNA μεθυλίωση Αποτρέπει γλυκοκορτικοειδών επαγόμενη απόπτωση στα ανθρώπινα μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 6 (10): e24839. doi: 10.1371 /journal.pone.0024839

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 του Δεκέμβρη 2010? Αποδεκτές: 22 του Αυγούστου 2011? Δημοσιεύθηκε: 3η Οκτωβρίου 2011

Copyright: © 2011 Kay et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Κέντρο Ερευνών NIHR Μάντσεστερ Βιοϊατρική και το Πανεπιστήμιο του συνεταιρίζεσθαι Μάντσεστερ Αποφοίτων. PK και GS έχουν λάβει ένα βραβείο studentship BBSRC (https://www.bbsrc.ac.uk). GS διαθέτει επίσης ένα Barbara MAWER προικισμένο studentship. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αλλαγές στην επιγενετική κατάσταση των γονιδίων είναι σημαντική σε πολλές ανθρώπινες ασθένειες, αλλά ιδιαίτερα στον καρκίνο [1]. Ορισμένες από αυτές που προκαλούνται από αλλαγές στην έκφραση και τη δραστηριότητα των μεθυλτρανσφερασών DNA, DMNT1, Dnmt3a και DNMT3B [2], [3]. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν χαρακτηριστικά υπερμεθυλίωση νησιδίων CpG που συνδέονται με ογκοκατασταλτικά γονίδια [1], και DNMT1 φέρεται να είναι υπερ-εκφράζεται σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα που καπνίζουν [4]. Πρόσφατες μελέτες έχουν προσδιορίσει ότι ένα καρκινογόνο καπνό, νιτροζαμίνη 4- (μεθυλονιτροζαμινο) -1- (3-πυριδυλ) 1-βουτανόνη (επίσης γνωστή ως η νικοτίνη που προέρχεται νιτροζαμίνη κετόνη? ΝΝΚ) όχι μόνο επάγει γονιδιακές μεταλλάξεις, αλλά αυξάνει επίσης υπερμεθυλίωση των πολλαπλών υποκινητές ογκοκατασταλτικό γονίδιο συμπεριλαμβανομένων των εξαρτώμενων από κυκλίνη αναστολέα κινάσης 2Α (p16INK4a), που συνδέεται θάνατος πρωτεΐνη κινάση 1 (dapk1), και του υποδοχέα β ρετινοϊκού οξέος (RaRb) [4]. Το κάπνισμα είναι ο κύριος παράγοντας κινδύνου για ανθρώπινο καρκίνωμα μικρού κυττάρου πνεύμονα, και το κάπνισμα είναι η ίδια συνδέεται με μεθυλίωση άνω των 20 ογκοκατασταλτικών γονιδίων [5], [6].

Πολλοί παράγοντες μπορεί να επηρεάσουν την ευαισθησία των γλυκοκορτικοειδών, συμπεριλαμβανομένων των γενετικών παραλλαγή στο γονιδιακό τόπο GR, και έκφραση των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν [7] – [10]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι το ανθρώπινο SCLC κυτταρικές σειρές είναι ανθεκτικές σε γλυκοκορτικοειδών (GC) ορμόνες και φάρμακα και ότι αυτή η αντίσταση οφείλεται σε μειωμένη έκφραση GR [11], [12]. Αποκατάσταση της έκφρασης GR στα κύτταρα με επιμόλυνση ή ιική μεταγωγή είναι επαρκής για την αποκατάσταση της ευαισθησίας Gc [12]. Ωστόσο, το πιο σημαντικό, την αποκατάσταση της έκφρασης GR είναι επίσης επαρκής για να επάγει απόπτωση των κυττάρων SCLC τόσο in-vitro [13], καθώς επίσης και σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος [14]. Αυτό εγείρει την πιθανότητα ότι GR είναι μία νέα ογκοκατασταλτικό γονίδιο για SCLC, και ότι η απώλεια της έκφρασης GR εμπλέκεται στην παθογένεση SCLC.

Το γονίδιο GR (NR3C1) είναι ένα εκφράζεται παντού, ενεργοποιημένου συνδέτη μεταγραφικός παράγοντας, ένας μέλος της υπεροικογένειας πυρηνικών υποδοχέων. Υπάρχει ένα μόνο αντίγραφο γονιδίου στο χρωμόσωμα 5, αλλά η δομή του είναι πολύπλοκη, και σχετικά λίγα είναι γνωστά για το πώς μεταγραφή ρυθμίζεται από αυτό [15]. Η μεταγραφή ελέγχεται από 9 προαγωγούς, το καθένα συνδέεται με μια εναλλακτική θέση έναρξης της μεταγραφής. Επτά από αυτούς τους προαγωγούς είναι συγκεντρωμένα μαζί σε ένα νησί CpG, έναν κοινό χαρακτηριστικό των γονιδίων housekeeping [16]. Όλες οι μεταγραφές παράγουν αυθεντική πρωτεΐνη GR πλήρους μήκους όπως η περιοχή έναρξης της μετάφρασης βρίσκεται στην κοινή εξώνιο 2.

Το GR ενεργοποιείται με GC ορμονών από το φλοιό των επινεφριδίων, υπό αυστηρό έλεγχο του υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων (ΗΡΑ) άξονα. Ο άξονας αυτός είναι υπό έλεγχο ανάδρασης στο ιππόκαμπο και τον υποθάλαμο, μέσω της ενεργοποίησης του GR πρωτεΐνης που εκφράζεται σε αυτές τις περιοχές. Μεταβλητότητα στο ύφος του άξονα ΗΡΑ αρουραίου έχει αποδοθεί σε αλλαγές στην έκφραση του ιππόκαμπου GR, που ρυθμίζεται από αλλαγμένη μεθυλίωση του υποκινητή GR αρουραίου εξόνιο 1-7 [17]. Αυτό βρίσκεται, όπως στον άνθρωπο, στην ανάντη CpG νησίδα. Πιο πρόσφατες μελέτες έχουν εξετάσει την κατάσταση μεθυλίωσης ενός αριθμού εναλλακτικών ανθρώπινης υποκινητών GR σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος [16]. Αυτές οι μελέτες έχουν αποκαλύψει εκτεταμένη, και μεταβλητό μεθυλίωση.

ιππόκαμπου και υποθαλάμου GR παίζει βασικό ρόλο στον αρνητικό έλεγχο ανάδρασης του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων. Αλλοιωμένη έκφραση GR στα αποτελέσματα του εγκεφάλου σε εκ νέου ρύθμιση του τόνου του άξονα αυτού νευροενδοκρινικών και αυτό σχετίζεται με αλλαγμένη μεθυλίωση του αυξητικού παράγοντα νεύρων επαγώγιμου-Α (NGFI-Α, ή Krox, EGR1) θέση πρόσδεσης στον υποκινητή εξόνιο αρουραίο 1,7 , ομόλογο με τον ανθρώπινο προαγωγό εξόνιο 1F [17] – [19]. Αυτή η μεθυλίωση ελεγχόμενη μεταβολή στην GR αποτελέσματα έκφρασης σε συνέπειες για ολόκληρο τον οργανισμό, με τη ρύθμιση των επινεφριδίων γλυκοκορτικοειδών παραγωγή.

Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε το πρότυπο μεθυλίωσης υποκινητή GR σε ανθρώπινα κύτταρα SCLC, και έδειξε ότι η αντιστροφή του μεθυλίου σήματα αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης GR, και τη λειτουργία. Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης υποστηρικτής GR 1C και την έκφραση της πρωτεΐνης GR σε μια ομάδα ανθρώπινων SCLC κυτταρικές σειρές και τα ανθρώπινα κύτταρα ελέγχου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και συντήρηση

κύτταρα καρκινώματος Α549 ανθρώπινου πνεύμονα επιθηλιακή, ΗΕΚ-293 ανθρώπινα εμβρυονικά κύτταρα νεφρού, κύτταρα HeLa ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος και κύτταρα ανθρώπινου οστεοσαρκώματος U20S (Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων, Wiltshire, Ηνωμένο Βασίλειο) ήταν όλα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Invitrogen).

μη μικροκυτταρικός γραμμές καρκίνου του πνεύμονα ΝΟΙ-Η358 και -H727 (Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων, Wiltshire, Ηνωμένο Βασίλειο) και ΝΟΙ-Η23, -H441 , -H1299 (American Type Culture Collection, USA) αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% FCS και 10 mM HEPES, όπως συνιστάται από τον προμηθευτή.

μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν κυτταρικές σειρές του 10’COR ‘Κορ L24, L27 Cor, Cor L31, L32 Cor, Cor L42, L47 Cor, Cor L51, L88 Cor, Cor L99 και Κορ L103. Επίσης χρησιμοποιείται ήταν DMS 79, DMS 153, HC12 και ΗΧ 148. Όλες αυτές οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ασθενείς με παθολογικά επιβεβαίωσε SCLC [20], [21] με την εξαίρεση της Cor L32, η οποία προέρχεται από έναν ασθενή με πτωχά διαφοροποιημένο πλακώδες καρκίνωμα του πνεύμονα. Αυτή η κυτταρική σειρά είχε όμως εμφανίζουν τα χαρακτηριστικά του SCLC [21]. Όλα τα SCLC κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% FCS και 10 mM HEPES, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12].

Ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος ελήφθησαν από υγιείς δότες τοπικό, σύμφωνα με έγκριση LREC 09 /H1013 /6.

Κανονικό ανθρώπινο βρογχικό επιθήλιο συλλέχθηκε από δείγματα εκτομή του πνεύμονα μετά τη χειρουργική επέμβαση για καρκίνο του πνεύμονα, με πλήρη, ενημερωμένη συγκατάθεση του ασθενούς.

Θεραπείες

Ενδεχομένως, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή 100 ηΜ δεξαμεθαζόνη (Sigma-Aldrich) για 24 ώρες στους 37 ° C, 5% C0

2 πριν τη λύση. Σε ορισμένα πειράματα, τα κύτταρα επωάστηκαν με όχημα ή 5 μΜ 5’Azadeoxycytidine (Sigma-Aldrich) για 72 ώρες ή 5 ημέρες. Μετά από επεξεργασία με 5’Azadeoxycytidine μερικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί άλλες 72 ώρες με 100 ηΜ δεξαμεθαζόνης.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ (100 mM Tris βάση, 150 mM NaCl, 1% Igepal, 2,5% δεοξυχολικό νάτριο, 1 mM EDTA) .Αυτή ρυθμιστικό επίσης περιείχε αναστολείς πρωτεάσης (Roche). Μετά από φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στα 10.000

g

υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για περιεκτικότητα πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας δοκιμασία Bradford (Bio-Rad). Τα δείγματα στη συνέχεια αραιώθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης [0.125 Μ Τρις (ρΗ 6,8), 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), 20% γλυκερόλη, 0,2% β-μερκαπτοαιθανόλη, 0.001% κυανό βρωμοφαινόλης]. Κυτταρικά εκχυλίσματα (50 μg) αναλύθηκαν στη συνέχεια με SDS-PAGE και κηλίδωση Western όπως περιγράφεται [22], [23]. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-HgR (Κλώνος 41, 1:2500), η οποία συνδέεται στην Ν-τερματική περιοχή του GR (BD Biosciences), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-hGR (Ρ-20, 1:500) που εγείρεται έναντι μια χαρτογράφηση πεπτιδίου στο ο-άκρο της ΥΑα (Santa Cruz) και το μονοκλωνικό ποντικού α-τουμπουλίνης (1:5000) (Sigma-Aldrich). Δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το horseradish υπεροξειδάση-συζευγμένο αντι-ποντικού (1:5000) και αντι-κουνελιού (1:5000) (GE Healthcare). Για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων της πρωτεΐνης, πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε. Οι κηλίδες σαρώθηκαν και η πυκνομετρία κάθε ζώνης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Ο εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης (αTubulin) ήταν επίσης ποσοτικούς και τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν ενάντια σε αυτές τις μετρήσεις. Αυτή η ανάλυση διεξήχθη σε 3 ξεχωριστές κηλίδες για κάθε πείραμα και ο μέσος όρος υπολογίζεται.

Reporter Gene Δοκιμασίες

Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 2 μg ενός κατασκευάσματος TAT3-λουσιφεράσης [13] και 0.5 μσ ενός ρΟΜν

Renilla

κατασκεύασμα λουσιφεράσης (για τη διόρθωση για αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής) χρησιμοποιώντας Fugene 6 (Roche). Σε μερικές περιπτώσεις, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν επίσης με 1 μg του φορέα έκφρασης GR (pFUNC1-GR-EYFP) [13]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dex όπως περιγράφηκε προηγουμένως διεξήχθησαν δοκιμασίες λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας διπλής λουσιφεράσης (Promega), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8].

λοιμώξεις από ρετροϊούς

pFUNC1-EYFP ή pFUNC1 -GR-EYFP διαμολύνθηκαν σε ΗΕΚ293 για ρετροϊική παραγωγή με τη χρήση Fugene HD (Roche, UK), ως αντιδραστήριο διαμόλυνσης σε αναλογία 3:02 reagent:DNA. Η μόλυνση των ρετροϊικών σωματιδίων σε DMS 79 κυττάρων διεξήχθη όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως. Μετά την μόλυνση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φυσιολογικά μέσα ανάπτυξης που περιέχει ορό επί 72 ώρες.

Διασπασμένη κασπάση 3

δοκιμασία

DMS 79 κύτταρα που εκφράζουν GR-EYFP ή EYFP εφαρμόσθηκαν σε πολυ-Ε-λυσίνη επικαλυμμένα καλυπτρίδες και μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα διαπερατά με PBS /0,2% Triton- × 100. Μετά την πλύση, τα κύτταρα μπλοκαρίστηκαν σε PBS /0.1% Tween-20 + 5% ορό γαϊδάρου. Αντι-δραστική κασπάση-3 pAb (Promega, UK) αραιωμένο 1:250 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού προστέθηκε σε κύτταρα και επωάστηκαν για όλη τη νύχτα. επώαση του δεύτερου αντισώματος διεξήχθη στο σκοτάδι χρησιμοποιώντας Alexa Fluor 546 γαϊδάρου αντι-κουνελιού IgG (Invitrogen, UK) αραιωμένο 1:500 σε PBS. Καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν χρησιμοποιώντας παρατείνουν Χρυσό με DAPI (Invitrogen, UK).

Εικόνες συλλέχθηκαν σε όρθια μικροσκόπιο της Olympus BX51 χρησιμοποιώντας ένα 60 × /1,40 UPlanApo αντικειμενική και κατέλαβε χρησιμοποιώντας μια κάμερα Coolsnap ES (Φωτομετρικά) μέσω MetaVue Λογισμικό (Molecular Devices). Ειδικά σύνολα ζωνοπερατό φίλτρο για ϋΑΡΙ, FITC και Texas red χρησιμοποιήθηκαν για να αποτραπεί διαρροή διαμέσου από το ένα κανάλι στο άλλο. Οι εικόνες επεξεργάστηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij).

διθειώδες νάτριο Sequencing

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από αρκετές από τις κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν σε η μελέτη αυτή, μερικά από τα οποία είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με 5 ‘Azadeoxycytidine (βλέπε αποτελέσματα) χρησιμοποιώντας το αίμα και τους ιστούς κιτ DNeasy (Qiagen). Το καθαρισμένο γονιδιωματικό ϋΝΑ στην συνέχεια μετατράπηκε όξινου θειώδους χρησιμοποιώντας το Epitect όξινου θειώδους Kit (Qiagen). Αυτή η μετατροπή DNA χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια ως μήτρα στην αντίδραση PCR για να ενισχύσουν ειδικές περιοχές GR υποκινητή. περιοχές υποκινητή GR ενισχύεται (και οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν) ήταν οι εξής:

Ανάδοχος

1C (μακρόπνοη 5′-AGGTGGATCCGGAAGGAGGTAGYGAGAAAAGAAATT-3 ‘? αντιστροφής της 5′-AGGTGAATTCACACRAACTCRCAAAATAAAAAAAA-3’).

Ανάδοχος

1D (μακρόπνοη 5′-AGGTGGATCCTTTTATAAAAATTTTTTTGGTTGAGG-3 ‘? αντιστροφής της 5’-AGGTGAATTCCCCCCTACTCTAACATCTTAAAAA).

Ανάδοχος

1E (μακρόπνοη 5′-AGGTGGATCCTTAGAGTTATAAAAATTATAATTTGTGT-3.. «? αντιστροφής της 5′-AGGTGAATTCATACAAACAACTTTAAAATACCAAC-3 ‘)

Όλοι οι εκκινητές που παρέχονται από MWG-Eurofins

PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας Immolase πολυμεράσης (Bioline) , ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συνθήκες κύκλων είχαν ως εξής: 95 ° C για 10 λεπτά, 30 κύκλοι, στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, στους 56 ° C για 45 δευτερόλεπτα, και στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ακολούθησε μια τελική επέκταση 72 ° C για 10 λεπτά.

PCR προϊόντα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πολυ-ακρυλαμίδιο γέλη και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ εκχύλισης πηκτής (Qiagen). Οι συνδέσεις στη συνέχεια διεξάγεται με τη χρήση αυτών των θραυσμάτων PCR χρησιμοποιώντας το ρΟΕΜ-Τ-εύκολο σύστημα φορέα (Promega) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά τον μετασχηματισμό σε ικανά βακτήρια JM-109 (Promega), οι αποικίες συλλέχθηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε LB ζωμό σε 37 ° C. Μίνι-preps (Qiagen) διεξήχθησαν σε αυτά τα κυτταρικά αιωρήματα, ακολουθούμενη από μία πέψη περιορισμού χρησιμοποιώντας ΕοοΡΙ (Roche) για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του σωστού ενθέματος. Τα πλασμίδια που περιέχουν το ένθετο στη συνέχεια αποστέλλονται για προσδιορισμό αλληλουχίας χρησιμοποιώντας ένα εκκινητή SP16 στην Εγκατάσταση DNA Sequencing, Πανεπιστήμιο του Μάντσεστερ. Μια αρχική μελέτη διεξήχθη για να αναλύσει το δυναμικό μεθυλίωση και τα αποτελέσματα της 5’Azadeoxycytidine, χρησιμοποιώντας DNA από DMS 79 κύτταρα. Σε αυτήν την περίπτωση, ένας κλώνος αναλύθηκε για κάθε συνθήκη (κάθε μεμονωμένο προαγωγό, ακατέργαστα ή κατεργασμένα με 5’Azadeoxycytidine). Μια πιο σε βάθος μελέτη διεξήχθη για να αναλύσει μεθυλίωση του υποκινητή 1Γ σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών SCLC. Σε αυτή την περίπτωση, 3 κλώνοι αναλύθηκαν ανά κυτταρική σειρά.

Στατιστικά

Όλα στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SPSS για Windows, έκδοση 16. Περαιτέρω στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε για να συγκρίνει τα επίπεδα μεθυλίωσης του Δρ Ο Steve Roberts, Πανεπιστήμιο του Μάντσεστερ? χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης. Η εξίσωση που χρησιμοποιείται για την ανάλυση αυτή ήταν ως εξής:

Αποτελέσματα

Η έκφραση του GR έχει υποστεί απομείωση στην ανθρώπινη SCLC κυτταρική γραμμή, DMS79

GR πρωτεΐνης μετρήθηκε στο κύτταρο hSCLC γραμμή, DMS79 και σε σύγκριση με δύο ευαίσθητα κύτταρα γραμμές Gc, HeLa και Α549, καθώς και δύο Gc ανθεκτικά κύτταρα γραμμές, U2OS και ΗΕΚ293. Η SCLC κυτταρική γραμμή DMS79 εκφράζει χαμηλά επίπεδα του GR πρωτεΐνης, παρόμοια με τα κύτταρα U2OS, και σαφώς πολύ λιγότερο από ό, τι το HeLa και κύτταρα Α549 (Σχ. 1α). Σύγκριση με ένα πάνελ μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών υποδηλώνει ότι η έκφραση του GR είναι χαμηλότερη στα SCLC κύτταρα (Σχ. 1β). GR πρωτεΐνη βρέθηκε ότι εκφράζεται σε φυσιολογικό ανθρώπινο βρογχικό επιθήλιο, που συγκομίζονται από πνευμονικό ιστό σε εκτομή του καρκίνου του πνεύμονα (Εικ. 1c).

ανάλυση

(Α) Western στύπωμα της GR, και η έκφραση πρωτεΐνης τουμπουλίνης σε U20S, ΗΕΚ, HeLa, Α549 και DMS 79 κύτταρα. Blot είναι αντιπροσωπευτική 3 ξεχωριστά πειράματα. (Β) Σύγκριση της έκφρασης πρωτεΐνης GR μεταξύ SCLC, και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NS) κυτταρικές σειρές. Η ποσοτικοποίηση του GR έκφρασης σε σχέση με την τουμπουλίνη παρουσιάζονται ως μέση τιμή +/- S.E.M. (N = 3) με το * υποδεικνύει ρ & lt? 0,05, t-test του Student για ανεξάρτητα δείγματα. (C) Σύγκριση της έκφρασης πρωτεΐνης GR σε φυσιολογικό ανθρώπινο βρογχικό επιθήλιο (NBE) σε σύγκριση με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή (Α549), και μια ομάδα ανθρώπινων κυτταρικών σειρών SCLC. Η ποσοτικοποίηση του GR έκφρασης σε σχέση με την τουμπουλίνη παρουσιάζονται. Η μέση του n = 2. (δ) Ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης GR χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα παν-GR εγείρονται έναντι του τερματικού GR Ν (Ν-όρου), και ένα ειδικό αντίσωμα GR GRalpha εγείρεται έναντι του τερματικού C (C-term).

GR μετανάστευσε σαν δύο κύρια είδη, και η σχετική αφθονία φαίνεται να διαφέρει μεταξύ των κυτταρικών τύπων (Σχ. 1α, β). Αυτό μπορεί να αντανακλά εναλλακτικό μάτισμα προς την ισομορφή GRβ, ή χρήση εναλλακτική θέση έναρξης μετάφρασης [22] – [24]. Για την περαιτέρω χαρακτηρισμό των ειδών, ανοσοστυπώματα επαναλήφθηκαν χρησιμοποιώντας στήλη C τερματικό ειδικό αντίσωμα που αναγνωρίζει ειδικά ΥΑα (Σχ. 1 d). Το παρόμοιο μοτίβο λωρίδων που παρατηρείται με τα δύο αντισώματα δείχνει δύο πρωτεΐνες μοιράζονται ένα κοινό τερματικό πεδίο C, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ποικιλομορφία πρωτεΐνη βρίσκεται με τη χρήση της ιστοσελίδας έναρξης εναλλακτική μετάφραση.

Αποκατάσταση της έκφρασης GR επάγει την απόπτωση

σε κύτταρα DMS79 έκφραση ενός διαγονιδίου GR-EYFP από ρετροϊική μόλυνση οδήγησε σε αυξημένη πρωτεΐνη GR-EYFP (Εικ. 2Α) και την απόπτωση όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη διασπασμένη κασπάση 3 στα SCLC κύτταρα που εκφράζουν το GR-EYFP (Σχ. 2β). Σε αυτές τις μελέτες, μόνο μια μειοψηφία των κυττάρων είναι αποτελεσματικά σε μεταγωγή, εξ ου και η χαμηλή αφθονία εκφρασμένη πρωτεΐνη σύντηξης στην πισίνα των κυττάρων. Επιπλέον, η έκφραση του διαγονιδίου που επάγεται απόπτωση, μειώνοντας περαιτέρω συγκέντρωση GR-EYFP σε συγκεντρωμένα προϊόντα λύσης κυττάρου [13], [14].

(Α) DMS 79 κύτταρα μολύνθηκαν με είτε GR-EYFP ή EYFP ρετροϊών και GR πρωτεΐνη αξιολογούνται σε 72 ώρες. κύτταρα (Β) DM79 επεξεργασμένο όπως παραπάνω είχαν καθοριστεί για ανοσοϊστοχημεία για την ανίχνευση διασπασμένης κασπάσης-3. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν για ενεργοποιημένη κασπάση-3 και στη συνέχεια αναλύονται για συν-εντοπισμό είτε με GR-EYFP ή EYFP. Ποσοστό κυττάρων θετικών για διασπασμένης κασπάσης-3 και EYFP ή GR-EYFP. Οι αριθμοί κυττάρων που προέρχονται από 3 ανεξάρτητες μολύνσεις και παριστάνεται ως εκατοστιαία αναλογία της κασπάσης-3 θετικό σε EYFP θετικά ως μέση τιμή +/- S.E.M. (N = 3) με *** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001, t-test του Student για ανεξάρτητα δείγματα

Η

κατάσταση μεθυλίωσης του GR προαγωγού σε SCLC κύτταρα

Η μειωμένη έκφραση GR in. SCLC κυττάρων μπορεί να προκύψει από μεταβολή στη μεθυλίωση GR υποκινητή, ή από ένα έμμεσο μηχανισμό. Ως εκ τούτου, κατάσταση μεθυλίωσης των υποκινητών GR στα κύτταρα DMS79 εξετάστηκε με όξινο θειώδες αλληλουχίας. Εμείς δεν εντόπισε καμία μεθυλίωσης του DNA στους υποστηρικτές 1Β, και 1F. Η 1D και 1Ε προαγωγός ο καθένας είχε ένα μόνο μεθύλιο CpG, που σημειώνονται με ένα ανοικτό κιβώτιο (Σχ. 3α, β). Αντίθετα ο υποκινητής 1C είχε τέσσερις μεθύλιο CpGs (Σχ. 3c). Οι παρατηρούνται μεθυλιωμένα CpGs βρίσκεται σε θέσεις δέσμευσης δυναμικό παράγοντα μεταγραφής, (CpGs 6, 44 και 52), ή βρίσκονται κοντά σε μια τέτοια περιοχή (CpG 69) (Σχ. 3γ).

αλληλούχιση διθειώδους διεξήχθη σε εκχυλίζεται γονιδιωματικό DNA από DMS 79 κύτταρα επωάζονται με 5’Azadeoxycytidine για 5 ημέρες (χωρίς αγωγή ως έλεγχος). Η αρχική αλληλουχία (που λαμβάνεται από ΓΟΝΙΔΙΩΜΑ Browser) συγκρίθηκε με κατεργασμένο με όξινο θειώδες ϋΝΑ από τον έλεγχο και την 5’Azadeoxycytidine κατεργασμένα δείγματα. Bold, ανοιχτά κουτιά τονίσει συγκεκριμένες μεθυλιωμένα CpGs, η οποία έδειξε αναστροφή της μεθυλίωσης μετά 5’Azadeoxycytidine επώασης. Το δυναμικό παράγοντα μεταγραφής τοποθεσίες σε κοντινή απόσταση με τα μεθυλιωμένα θέσεις δέσμευσης υποδεικνύονται με γκρι σκίαση για την περιοχή πρόσδεσης του παράγοντα Sp1 και σκούρο γκρι σκίαση για θέση πρόσδεσης C /ΕΒΡβ. (Α) CpG μεθυλίωση της περιοχής υποκινητή GR 1Δ σε DMS 79 κύτταρα. Οι μεμονωμένες CpGs αριθμημένα και με κεφαλαία γράμματα. (Β) μεθυλίωση CpG σε μία περιοχή του υποκινητή 1E GR από DMS 79 γονιδιωματικό DNA. Οι μεμονωμένες CpGs αριθμημένα και με κεφαλαία γράμματα. (Γ) Γονιδιωματικό DNA από μία περιοχή του υποκινητή 1C GR από DMS 79 κύτταρα. Οι μεμονωμένες CpGs αριθμημένα και με κεφαλαία γράμματα. Πλάγια γραφή υποδεικνύει την έναρξη του εξονίου 1C.

Η

SCLC κυτταρικές σειρές έχουν αυξημένη μεθυλίωση του υποκινητή GR 1C

Για να καθοριστεί εάν οι παρατηρούμενες αλλαγές στη μεθυλίωση GR υποστηρικτής βρέθηκαν σε άλλες ανθρώπινες SCLC κυτταρικές γραμμές, ένα πάνελ 14 hSCLC κυτταρικών σειρών με ποικίλες έκφρασης GR συγκρίθηκαν με δύο κυτταρικές σειρές που εκφράζουν GR, (Α549 και HeLa) μη κυτταρική γραμμή που εκφράζει, (U2OS) και μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος ως πρωταρχικό σύγκριση κύτταρο (Σχ. 4α, b). Τα σφαιρίδια αντιπροσωπεύουν CpG δινουκλεοτίδια από τη θέση 1 στη θέση 69. Είναι προφανές ότι υπάρχει συχνή μεθυλίωση κατά τις τελευταίες δύο χάντρες στα δεξιά, οι οποίες αντιπροσωπεύουν CpG 68 και 69. Αυτό είναι παρόν σε όλη την ομάδα των SCLC κυττάρων, και είναι επίσης δει στα κύτταρα ελέγχου. Ωστόσο, υπάρχει επίσης μια αξιοσημείωτη αύξηση στη μεθυλίωση σε θέσεις 1-67 σε όλον τον πίνακα SCLC, χωρίς καμία αξιοσημείωτη ομαδοποίησης. Αντίθετα υπάρχει πολύ μικρή μεθυλίωση CpG δει στις θέσεις 1-67 στον πίνακα κύτταρο ελέγχου (Εικ. 4α, b).

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από ειδικές κυτταρικές γραμμές ελέγχου (Α), συμπεριλαμβανομένης της πρωτογενούς περιφερικού αίματος μονοπύρηνα λευκοκύτταρα από έναν υγιή δότη και (Β) 14 κυτταρικές γραμμές hSCLC. Μετά μετατροπή διθειώδους η περιοχή προαγωγού 1C ενισχύθηκε με PCR. 3 κλώνους ανά κυτταρική γραμμή στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν. Μεθυλίωση στον πίνακα των SCLC κυτταρικές σειρές και κυτταρικές σειρές ελέγχου εμφανίζεται ως «χάντρες». Κάθε επιμέρους σφαιρίδιο αντιπροσωπεύει ένα μονό CpG στον υποκινητή GR 1C σε αριθμητική σειρά από αριστερά προς τα δεξιά. Λευκές χάντρες δείχνουν μη μεθυλιωμένα CpGs ενώ μαύρες χάντρες δείχνουν μεθυλιωμένα CpGs. Όλες οι 3 κλώνοι που εμφανίζονται για κάθε κυτταρική σειρά αναλύθηκαν.

Η

λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η μεθυλίωση μεταξύ του SCLC πάνελ, και όλα τα κύτταρα ελέγχου (Πίνακας 1). Αυτό αποκάλυψε ότι υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων με μεθυλίωση σε CpG 69 ατομικά? και με CpG 68 και 69 σε συνδυασμό, και σε όλη την περιοχή ολόκληρη υποκινητή. Μια σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ των ομάδων για όλα τα CpGs εξαίρεση 68 και 69 (Πίνακας 1).

Η

μεθυλίωση GR υποκινητή συσχετίζεται με την έκφραση GR

Σε όλους τις κυτταρικές σειρές hSCLC εκεί ήταν ένα ευρύ φάσμα της έκφρασης GR, αν και σε όλες τις περιπτώσεις GR ήταν λιγότερο άφθονο από το HeLa και κυτταρικές γραμμές ελέγχου Α549 (Σχ. 5a, b). Υπήρξε επίσης μια σημειώνονται διακύμανση στην αφθονία των δύο ειδών GR πρωτεΐνης διαμέσου των κυτταρικών σειρών που εξετάστηκαν, αλλά για την ανάλυση αυτή, τόσο ισομορφές πρωτεΐνης GR θεωρήθηκαν από κοινού. Η σχέση μεταξύ της μεθυλίωσης υποκινητή GR 1C και η έκφραση της πρωτεΐνης GR εξετάστηκε σε ολόκληρη πάνελ των κυτταρικών γραμμών hSCLC. Υπήρξε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ αριθμού μεθυλιωμένων CpGs, και την έκφραση της πρωτεΐνης GR μέσα στον πίνακα των κυτταρικών γραμμών hSCLC? r

2 = 0.54, και ρ = 0.01 (Εικ. 5c).

(Α) Αντιπροσωπευτική Western Blot για GR και τουμπουλίνης σε 10 SCLC κυτταρικές σειρές όπως επίσης και κυτταρικές σειρές ελέγχου ΗΕΚ (ανθρώπινα εμβρυονικά νεφρικά ), U2OS (οστεοσάρκωμα), HeLa (τραχηλικό καρκίνωμα) και Α549 (μη μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα). (Β) Πυκνότητας διεξήχθη επί 5 ξεχωριστές κηλίδες για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης GR σε σχέση προς τουμπουλίνη. Γράφημα δείχνει τη μέση, διορθωμένη έκφραση GR ± S.E.M. (Γ) Σχέση μεταξύ μεθυλίωση του GR Promoter 1C και έκφραση GR σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου πνεύμονα ανθρώπου. Συνολικά μεθυλίωσης (ποσοστό) κατά μήκος 1Γ υποκινητή σχεδιάστηκε έναντι έκφραση GR, με τυπικό σφάλμα, για κάθε κυτταρική σειρά. Η γραμμή παλινδρόμησης ήταν σημαντικά διαφορετική από το μηδέν (P = 0,01), και η καλοσύνη της προσαρμογής ήταν r

2 = 0,54.

Η

Αποκατάσταση της έκφρασης GR με αντιστροφή της μεθυλίωσης του DNA

Εάν η απώλεια της έκφρασης GR στα κύτταρα DMS79 προέκυψε από μεθυλίωση του DNA, ίσως συνεπεία καρκινογένεση, η έκφραση GR θα προβλέπεται να αυξηθεί μετά την αναστροφή της μεθυλίωσης. Μετά από 72 ώρες επεξεργασίας με 5’Azadeoxycytidine, τα επίπεδα mRNA GR αυξηθεί δραματικά στα κύτταρα DMS79 σε σύγκριση με ΗΕΚ και Α549 κύτταρα όπου δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στην έκφραση (Σχ. 6α). Επιπλέον, μετά από 72 ώρες, ή μετά από 5 ημέρες επώαση με 5’Azadeoxycytidine, υπήρξε μια εντυπωσιακή αύξηση στην GR πρωτεΐνη (Εικ. 6β). Σε αντίθεση με την αύξηση της έκφρασης GR φαίνεται στο DMS79, υπήρχε μειωμένη έκφραση σε κύτταρα U2OS, πιθανώς λόγω της τοξικότητας (Εικ. 6β).

έκφραση (Α) GR mRNA ρυθμίζεται σύμφωνα με GAPDH σε απόκριση έως 72 ώρες θεραπεία με 5’azadeoxycytidine (5’Aza) σε DMS 79 κύτταρα, GR κύτταρα ανεπαρκή ΗΕΚ, και GR κύτταρα που εκφράζουν Α549. (Β) Δύο GR ανεπάρκεια κυτταρικές σειρές, DMS 79 και U2OS, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5’Azadeoxycytidine (5’Aza) για 72 ώρες και 5 ημέρες (ακατέργαστα κύτταρα ως έλεγχος). Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια αναλύθηκαν με western blot για την έκφραση ΓΡ. Για DMS 79 κύτταρα, η έκφραση GR ομαλοποιήθηκε έναντι α τουμπουλίνης, και σχεδιάστηκαν ως μέσο έκφρασης GR συν S.E.M. (N = 3). * Υποδηλώνει ρ & lt? 0.01 σε σύγκριση με μάρτυρα που έλαβαν φορέα. (Γ) Ένα πάνελ ανθρώπινων κυτταρικών σειρών SCLC (άνω πάνελ) συγκρίθηκε με ένα πάνελ μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών (κάτω πίνακας) για την απόκριση του GR πρωτεΐνης από την επώαση με 5’Azadeoxycytidine (5’Aza).

η επίδραση της 5’Azadeoxycytidine συγκρίθηκε στη συνέχεια σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές SCLC και μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές για να προσδιοριστεί εάν η ρύθμιση της έκφρασης GR με μεθυλίωση ήταν διαδεδομένη στον καρκίνο του πνεύμονα. Τρεις από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα έδειξαν επαυξημένης έκφρασης GR μετά τη θεραπεία 5’Azadeoxycytidine, σε σύγκριση με μόνο μία από τις τέσσερις μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές (Σχ. 6c).

Η αύξηση στην έκφραση GR φαίνεται στο DMS79 κύτταρα αναμένεται να αποκαταστήσει Gc ευαισθησία σε αυτά τα κύτταρα. Πράγματι, υπάρχουν αυξήθηκε Gc μετενεργοποίηση ενός απλού γονιδίου αναφοράς (Σχ. 7α). Το μέγεθος της επαγωγής Gc ήταν σημαντικά μικρότερη από αυτή που παρατηρείται με την υπερέκφραση GR, αλλά το τελευταίο έχει σαν αποτέλεσμα υπερ-φυσιολογικές συγκεντρώσεις GR στα κύτταρα-στόχους (Εικ. 7Α).

(Α) Κατεργασία DMS 79 κυττάρων με 5’Azadeoxycytidine (5’Aza) επαναφέρει την ευαισθησία GC. DMS 79 κύτταρα κατεργασμένα με 5’Aza για 72 ώρες διαμολύνθηκαν με το κατασκεύασμα ανταποκριτή TAT3-λουσιφεράσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα με ή χωρίς 100 ηΜ δεξαμεθαζόνη. Γράφημα δείχνει την μέση μεταβολή φορές (Dex θεραπεία /χωρίς θεραπεία), (σχετικές μονάδες φωτός), (τριπλούν) συν το S.E.M. (* = P & lt? 0,05). DMS 79 κύτταρα επίσης συν-επιμολύνθηκαν με pFUNC1 GR-EYFP (ως θετικός μάρτυρας) και το κατασκεύασμα ανταποκριτή TAT3-λουσιφεράσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα με ή χωρίς 100 ηΜ δεξαμεθαζόνη. Γράφημα δείχνει την μέση μεταβολή φορές (Dex θεραπεία /χωρίς θεραπεία) συν το S.E.M. Όλα τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν έναντι ενός ελέγχου Renilla. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ξεχωριστά πειράματα. (Β) Bcl-2 mRNA έκφρασης κανονικοποιούνται σε GAPDH σε απόκριση 72 ώρες αγωγή με 5’Azadeoxycytidine (5 ‘Αζα) σε κύτταρα ΗΕΚ DMS79 και. (Γ) Η επεξεργασία των κυττάρων με Aza και, στη συνέχεια, δεξαμεθαζόνη αποτελέσματα στην απόπτωση. Αντιπροσωπευτική εικόνα των SCLC κυττάρων (CORL47) και μη-SCLC κύτταρα (NCI-Η358) που έλαβαν θεραπεία με Αζα όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με δεξαμεθαζόνη για 72 ώρες, σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση για την ενεργό κασπάση-3. (Δ) Η απομεθυλίωση οδηγεί σε σημαντική αύξηση στην απόπτωση που διαμεσολαβείται από Gc σε SCLC κυττάρων σε σύγκριση με μη-SCLC κυττάρων. Η απόπτωση μετρήθηκε με κασπάσης-3 ενεργοποίησης μετά 5’Aza και δεξαμεθαζόνη όπως περιγράφεται παραπάνω. Γκρι ιστία αντιπροσωπεύουν κύτταρα κατεργασμένα με δεξαμεθαζόνη, μαύρες μπάρες για κύτταρα κατεργασμένα με 5’Aza και στη συνέχεια με δεξαμεθαζόνη. Κάθε κυτταρική γραμμή επωάστηκε εις τριπλούν και 100 κύτταρα μετρήθηκαν να αξιολογήσει% θετική χρώση. t-test Ανεξάρτητοι σπουδαστή * = ρ & lt? 0,05, ** = ρ & lt? 0,01, *** = ρ & lt?. 0.001

Η

Η αυξημένη έκφραση GR σε απόκριση σε θεραπεία με 5’Azadeoxycytidine οδήγησε σε καταστολή του προ-επιβίωσης γονίδιο Bcl-2 και στα δύο ΗΕΚ και κύτταρα DMS79 (Εικ. 7b). Εκεί ήταν επίσης αυξημένη διασπάστηκε ενεργοποίηση της κασπάσης-3 στις SCLC κύτταρα αλλά όχι τα μη-SCLC κύτταρα (Σχ 7c & amp?. 7d). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι μετά από 5 ημέρες επώαση με 5’Azadeoxycytidine υπήρχε επαγωγή κυτταρικού θανάτου, πιθανώς λόγω επανάκτηση της έκφρασης GR, ή ρύθμιση των άλλων γονιδίων επιβίωσης.

Συζήτηση

Επιγενετική οι διαταραχές ενοχοποιηθεί σε πολλές ανθρώπινες ασθένειες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Ο καπνός του τσιγάρου είναι ο κύριος παράγων προαγωγής περιβαλλοντική SCLC και πρόσφατα, καρκινογόνος καπνός του τσιγάρου, ΝΝΚ, έχει αποδειχθεί ότι ασκεί μια συγκεκριμένη επίδραση που προάγουν έκφραση DNMT1, και δραστηριότητα [4]. Συνεπώς, αυτό το καρκινογόνο μπορεί να δρουν επάγοντας επιγενετικές μεταβολές των βασικών γονιδίων που εμπλέκονται στην παθογένεση του καρκίνου.

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι ο υποδοχέας γλυκοκορτικοειδών είναι ουσιαστικά ένα γονίδιο καταστολέα όγκου για SCLC, του οποίου η έκφραση αναστέλλεται [12] . Έχουμε επεκτείνει την ανάλυση σε αυτή τη μελέτη με περαιτέρω απόδειξη ότι η έκφραση GR είναι χαμηλότερη σε ένα πάνελ SCLC κυττάρων σε σύγκριση με μη-SCLC κύτταρα ή κανονικά βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων. Επανάκτηση έκφρασης GR, και γλυκοκορτικοειδών ευαισθησία σε SCLC κυττάρων

in vitro

, ή σε ξενομοσχεύματος όγκους οδηγεί σε απόπτωση [13], [14]. GR εκφράζεται στα περισσότερα κύτταρα και τους ιστούς, και ασκεί πλειοτροπικές επιδράσεις σε κύτταρα. Ωστόσο, σχετικά λίγα είναι γνωστά για το πώς γονιδιακής έκφρασης GR ρυθμίζεται, καθώς έχει μία ασυνήθιστα περίπλοκη δομή υποκινητή. Πιο πρόσφατες μελέτες στην πρωτοβάθμια μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος ορίζεται ιδιαίτερα ατομικά μοτίβα μεθυλίωσης GR υποκινητή [16]. Το έργο αυτό χαρτογραφείται επίσης δυναμικό, και αποδεδειγμένο παράγοντα μεταγραφής θέσεις εντός των υποκινητών δέσμευσης, η πλειοψηφία των οποίων περιείχε CpG θέσεων που θα μπορούσαν να μεθυλιωθεί. Αυτό υποδηλώνει ότι η διαφορική μεθυλίωση του υποκινητή του ανθρώπινου GR είναι ένας μηχανισμός για τον έλεγχο της χρησιμοποίησης υποστηρικτής, και έτσι η έκφραση του γονιδίου GR.

Τρεις GR υποστηρικτές εξετάστηκαν στην κυτταρική δείκτη γραμμής, DMS79, και τα τρία περιείχαν μεθυλιωμένα CpG θέσεις . Περαιτέρω ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τον υποκινητή 1C καθώς έχει αποδειχθεί ότι εκφράζεται παντού σε όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα [15]. Υπήρχε μια προφανής και εξαιρετικά σημαντική αύξηση του CpG μεθυλίωσης σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών hSCLC σύγκριση με το μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρική γραμμή Α549. Είναι σημαντικό ότι δεν υπήρξε καμία αύξηση των δύο μη κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τον έλεγχο (U2OS και ΗΕΚ293), υποδεικνύοντας ότι η μεθυλίωση 1C υποκινητής δεν είναι υποχρεωμένη να περιορίσει έκφραση GR, αλλά και οι άλλοι μηχανισμοί μπορούν να εφαρμοστούν για τη ρύθμιση της έκφρασης GR σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Μια ευρύτερη σύγκριση μεταξύ των κυττάρων hSCLC και ένα ετερογενές πάνελ GR εκφράζουν, και μη-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν βρήκε επίσης μια πολύ σημαντική αύξηση στις μεθυλιωμένες θέσεις CpG στα κύτταρα hSCLC.