Αφηρημένο

Το DNA αναστολείς μεθυλοτρανσφεράσης αζακυτιδίνη και Decitabine αντιπροσωπεύουν αρχετυπικό φάρμακα για επιγενετικές θεραπεία του καρκίνου. Για να χαρακτηριστεί η δραστικότητα του απομεθυλίωσης αζακυτιδίνη και δεκιταβίνη αντιμετωπίσαμε καρκίνο του παχέος εντέρου και των λευχαιμικών κυττάρων με δύο φαρμάκων και μεταχειρισμένων συστοιχία με βάση ανάλυση μεθυλίωσης του DNA από περισσότερα από 14.000 υποκινητές γονιδίων. Επιπροσθέτως, προκαλούμενη από φάρμακο απομεθυλίωση συγκρίθηκε με πρότυπα μεθυλίωσης ισογονικών καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα που στερούνται τόσο μεθυλτρανσφεράση DNA 1 (DNMT1) και DNMT3B. Δείχνουμε ότι τα πρότυπα απομεθυλίωση φάρμακο που προκαλείται είναι πολύ ειδικά, μη-τυχαία και επαναλήψιμη, υποδεικνύοντας στοχευμένη επαναμεθυλίωση συγκεκριμένων τόπων μετά την αντιγραφή. Αντίστοιχα, βρήκαμε ότι CG δινουκλεοτίδια CG εντός νησιά έγιναν προτίμηση remethylated, υποδεικνύοντας ένα ρόλο για το πλαίσιο αλληλουχία DNA. Εντοπίσαμε επίσης ένα υποσύνολο των γονιδίων που ποτέ δεν είχαν απομεθυλιώνεται με φαρμακευτική αγωγή, είτε σε καρκίνο του παχέος εντέρου ή σε λευχαιμικές κυτταρικές σειρές. Αυτά τα γονίδια απομεθυλίωση ανθεκτικά εμπλουτίστηκαν για Polycomb Κατασταλτικά Complex 2 συστατικών σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και για παράγοντα μεταγραφής μοτίβα που δεν υπάρχει στο απομεθυλιωμένο γονίδια δεσμευτική. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν λεπτομερείς γνώσεις σχετικά με τα μοτίβα μεθυλίωσης του DNA που προκαλείται από αζακυτιδίνη και Decitabine και προτείνουν τη συμμετοχή των σύνθετων ρυθμιστικών μηχανισμών που προκαλείται από φάρμακα απομεθυλίωσης DNA

Παράθεση:. Hagemann S, Heil O, Lyko F, ​​Brueckner Β ( 2011) αζακυτιδίνη και Decitabine Προκαλέστε Gene-Ειδικοί και μη τυχαία DNA απομεθυλίωση σε ανθρώπινα καρκινικά Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 6 (3): e17388. doi: 10.1371 /journal.pone.0017388

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Νοεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 1η Φεβρουαρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 7, Μαρτίου 2011

Copyright: © 2011 Hagemann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1463) σε FL (www.dfg.de). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ανώμαλη μεθυλίωση του DNA είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου του [1], [2], [3]. Στα καρκινικά κύτταρα, η παγκόσμια υπομεθυλίωση συνοδεύεται από υπερμεθυλιωμένων και μεταγραφικά αθόρυβη ογκοκατασταλτικά γονίδια. Αυτές οι αποκαλούμενες epimutations συμβάλλουν στην απώλεια του ελέγχου πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων [4], [5], [6].

Η διατήρηση της υπερμεθυλίωσης επαγόμενης epimutations απαιτεί τη συνεχή δραστηριότητα των μεθυλτρανσφερασών DNA (DNMTs) κατά την κυτταρική διαίρεση. Έτσι, η αναστολή της DNMTs έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε επιγενετικό θεραπεία του καρκίνου για να αντιστρέψει epimutations και να επανενεργοποιήσει επιγενετικώς αθόρυβη ογκοκατασταλτικών γονιδίων [7], [8], [9], [10]. Οι αρχέτυπες αναστολείς DNMT 5-αζακυτιδίνη (αζακυτιδίνη, ΑΖΑ) και 2′-δεοξυ-5-αζακυτιδίνη (δεκιταβίνη, DAC) έχουν εγκριθεί για τη θεραπεία του μυελοδυσπλαστικού συνδρόμου, ένα preleukemic διαταραχή του μυελού των οστών. Παρά τη χρήση τους στην κλινική και σε πολυάριθμες προκλινικές μελέτες, η γνώση του τρόπου δράσης αυτών των φαρμάκων είναι ακόμα ατελής [11].

Ένα από τα σημαντικότερα παρατηρήθηκαν με συνέπεια κυτταρικές επιδράσεις της αζακυτιδίνη και δεκιταβίνη είναι DNA απομεθυλίωση . Όπως νουκλεοσιδικά ανάλογα, ΑΖΑ και DAC ενσωματώνονται σε αναδιπλασιαζόμενο DNA, όπου μπορούν να σχηματίσουν ομοιοπολικούς δεσμούς με DNMTs [12], [13], [14]. Αυτή η παγίδευση DNMTs οδηγεί σε παθητική απομεθυλίωση κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA και την κυτταρική διαίρεση. Αναστολή της μεθυλίωσης του DNA με ΑΖΑ και DAC έχει αποδειχθεί με επιτυχία σε επιλεγμένες θέσεις σε διάφορες κλινικές μελέτες [7], [9], [15].

Πρόσφατα, τα αποτελέσματα της ΑΖΑ και DAC έχουν επίσης ερευνηθεί για επίπεδο του γονιδιώματος. Λόγω της περιορισμένης διαθεσιμότητας των κατάλληλων εργαλείων για την ανάλυση μεθυλίωσης του γονιδιώματος σε επίπεδο, αυτές οι μελέτες αρχικά περιορίζεται στην ανάλυση των μεταβολών της μεταγραφής που προκαλείται από φάρμακα. Για παράδειγμα, προφίλ γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα αποτελέσματα της ΕΑΒ με πρότυπο έκφρασης γονιδίου των καρκινικών κυττάρων κόλου HCT116 και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, εκτός από την ενεργοποίηση του γονιδίου της υπερμεθυλιωμένων γονιδίων, μεταγραφική ρύθμιση προς τα κάτω μπορεί να είναι ένα σημαντικό αποτέλεσμα της DAC [16], [17]. Πιο πρόσφατα, συστοιχίες Illumina GoldenGate χρησιμοποιήθηκαν για να χαρακτηρίσει άμεσα προκαλούμενη από φάρμακα απομεθυλίωσης DNA σε 1,505 CG δινουκλεοτίδια που εκπροσωπούν 807 σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια σε μυελοειδή κύτταρα λευχαιμίας [11]. Ωστόσο, λόγω του συγκριτικά χαμηλή κάλυψη αυτού του πίνακα, τα προκύπτοντα δεδομένα δεν αναλύονται λεπτομερώς και τα μοριακά χαρακτηριστικά των απαντήσεων απομεθυλίωση DNA παρέμεινε να διερευνηθεί.

Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε γονιδίωμα κλίμακας Infinium ανάλυση για τον χαρακτηρισμό συστηματικά τις αποκρίσεις απομεθυλίωση μετά ΑΖΑ και DAC θεραπεία σε δύο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Για το σκοπό αυτό ερευνήσαμε επίπεδα μεθυλίωσης πάνω από 27.000 CG δινουκλεοτίδια που αντιπροσωπεύουν περισσότερο από 14.000 γονίδια [19] σε HCT116 κύτταρα καρκίνου κόλου και HL-60 κυττάρων μυελοειδούς λευχαιμίας. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι AZA και DAC απομεθυλίωση CGs σε μη-CG νησιών πιο αποτελεσματικά από ό, τι εκείνες CG νησιά (CGI). Επιπλέον, η θεραπεία με ΑΖΑ και DAC αποτελέσματα σε μη τυχαία και επαναλήψιμη μοτίβα απομεθυλίωση DNA σε HCT116 και HL-60 κύτταρα. Επιπλέον, προσδιορίσαμε ένα υποσύνολο των ΟΟδ που ούτε απομεθυλιώνεται μετά ναρκωτικά θεραπεία ούτε σε κύτταρα με εξαιρετικά μειωμένα επίπεδα DNMT1 και καμία DNMT3B [20], [21]. Οι απομεθυλίωση ανθεκτικά CGs συνδέονται με γονίδια κατά προτίμηση δεσμεύεται από Polycomb Κατασταλτικά Συγκρότημα 2 (PRC2) συστατικών στα κύτταρα ES και εμπλουτίζονται για μοτίβα πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα που δεν υπάρχει στο απομεθυλιωμένο γονίδια. Αυτά τα αποτελέσματα διαλευκάνουν τα πρότυπα του DNA απομεθυλίωση από AZA και DAC και δείχνουν ότι το φάρμακο που προκαλείται από απομεθυλίωση ρυθμίζεται από ορίστηκε μοριακών μηχανισμών.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο κύτταρα HCT116 του κόλου καρκινώματος και HCT116 διπλό knockout (ϋΚΟ) κύτταρα (DNMT1 – /-? DNMT3B – /-) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Bert Vogelstein (Ιούλιος 2007) και καλλιεργήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες σε μέσο 5Α του McCoy συμπληρωμένο με 5% Ε-γλουταμίνη και 10% FCS (Invitrogen). Ταυτότητα των κυττάρων HCT116 επιβεβαιώθηκε από DMSZ (Braunschweig, Γερμανία? Ιανουαρίου 2008) χρησιμοποιώντας DNA προφίλ των οκτώ σύντομες διαδοχικές επαναλήψεις. κύτταρα HL60 ελήφθησαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες σε μέσο RPMI (Sigma) συμπληρωμένο με 5% Ε-γλουταμίνη και 10% FCS (Invitrogen). Φρέσκα δείγματα του όλες τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα. Για να αναλυθούν οι επιδράσεις των 5-αζακυτιδίνη (ΑΖΑ) και 2′-δεοξυ-5-αζακυτιδίνη (DAC), κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα συμπληρωμένα με τις ενώσεις, στις συγκεντρώσεις που υποδεικνύονται.

Αναστολείς

5 mM διαλύματα παρακαταθήκης του ΑΖΑ (Sigma) και ΕΑΒ (Calbiochem) παρασκευάστηκαν με διάλυση των ουσιών σε αποσταγμένο H

2O (GIBCO) και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Αμέσως πριν από τη θεραπεία, διαλύματα παρακαταθήκης αραιώθηκαν σε μέσο καλλιέργειας κυττάρων σε συγκεντρώσεις που υποδεικνύονται.

Genomic DNA μεθυλίωση ανάλυση

κύτταρα αγωγή με φάρμακο επωάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ΑΖΑ και DAC μετά από μια 24 h περίοδος σπορά, και γονιδιωματικό ϋΝΑ παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη DNeasy αίματος και Kit Tissue (Qiagen). Παγκόσμια επίπεδα μεθυλίωσης γονιδιωματικού DNA προσδιορίστηκαν με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22].

Array βασίζεται μεθυλίωσης του DNA ανάλυση

ειδική γονιδιακή ανάλυση μεθυλίωσης του DNA Array-based εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Infinium HumanMethylation27 τσιπ χάντρα τεχνολογία (Illumina) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σύντομα, κατεργασμένο με όξινο θειώδες γονιδιωματικό DNA ήταν ολόκληρου γονιδιώματος ενισχύεται και υβριδοποιήθηκε με τον HumanMethylation27 BeadChip. Ολιγομερή, που συνδέονται με δύο διαφορετικούς τύπους σφαιριδίων ανά ανακρίθηκε τόπο, ταιριάζουν είτε το μη μεθυλιωμένο ή μεθυλιωμένο κατάσταση, επιτρέποντας την επέκταση μίας βάσης και ανίχνευσης. Η κατάσταση μεθυλίωσης ενός ειδικού κυτοσίνης υποδεικνύεται από (AVB) τιμές μέσος βήτα όπου 1 αντιστοιχεί σε πλήρη μεθυλίωση και 0 έως καθόλου μεθυλίωση. Δέλτα βήτα (DB) τιμές υπολογίστηκαν αφαιρώντας αξίες AVB επεξεργασμένων ή νοκ-άουτ κύτταρα από τις τιμές AVB έλεγχο. Βιολογική επαναλήψεις (βλέπε σχήμα S2) του κάθε πειράματος ομαδοποιήθηκαν και ανιχνευτές σειρά με

P

≥0.05 εξαιρέθηκαν από την ανάλυση. Loci βαθμολογήθηκαν ως μεθυλιωμένο εάν η AVB ήταν μεγαλύτερη από ή ίση με 0.2 [23]. Τα πλήρη στοιχεία της μεθυλίωσης CG είναι διαθέσιμα στη βάση δεδομένων ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress). Για μια πιο λεπτομερή περιγραφή της κανονικοποίησης και περαιτέρω υπολογισμούς αναφέρονται σε μεθόδους S1. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού BeadStudio Illumina του, έκδοση 3.1.3.0 και με το R, έκδοση 2.10.0 [24]. Συγκεκριμένα, μετά από πακέτα R χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση δεδομένων: γραφικά (Boxplots), στατιστικά (εκτιμήσεις της πυκνότητας του πυρήνα και στατιστικές αναλύσεις), το πακέτο limma [25] για την κατασκευή διαγράμματα Venn και το πακέτο πλέγματος [26] για την εμφάνιση πολλών μεταβλητών στοιχεία (οικόπεδα πέργκολα).

454 DNA αλληλουχίας όξινο θειώδες

Deep DNA αλληλουχίας όξινο θειώδες της CGs 4 γονίδια (PIK3CG, Ells1, AFF2, NTRK3) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27], [ ,,,0],28]. Για 454 αλληλουχίας, κατεργασμένου με όξινο θειώδες γενωμικό DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας αλληλουχία-ειδικούς εκκινητές που περιέχουν τη θεραπεία ειδικών γραμμωτών κωδικών και 454 συνδετικές αλληλουχίες (Σχήμα S7). 454 βαθιά αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε με τη διευκόλυνση DKFZ γονιδιωματικής και πρωτεϊνωματικής Core.

Ανάλυση του μεταγραφικού παράγοντα μοτίβα

Για την αναγνώριση μοτίβων δέσμευσης εμπλουτισμένο μεταγραφικού παράγοντα χρησιμοποιήσαμε το online εργαλείο PScan [29] και 130 δεσμευτικές μεταγραφή παράγοντας δέσμευσης προφίλ (

H. sapiens

) από τη βάση δεδομένων JASPAR [30]. Η ανάλυση των γονιδίων που ήταν επικεντρωμένη στην περιοχή -450 έως 50, σε σχέση με την περιοχή τους έναρξης της μεταγραφής. Για να συνοψίσουμε τα αποτελέσματα της PScan ανάλυση, θερμικός χάρτης εμφανίζει το φυσικό λογάριθμο των

τιμές P δημιουργήθηκε.

Αποτελέσματα

Δημιουργία συνθηκών θεραπείας για αζα- και DAC επαγόμενη απομεθυλίωση σε κύτταρα HCT116

Ως ένα πρώτο βήμα προς την κατεύθυνση μιας συστηματικής χαρακτηρισμό των απαντήσεων απομεθυλίωση που προκαλείται από αζακυτιδίνη (AZA) και Decitabine (ΕΑΒ), έχουμε ως στόχο να μεγιστοποιηθεί η αποτελεσματικότητα απομεθυλίωση, ώστε να ελαχιστοποιηθεί η τοξικότητα του φαρμάκου [31], [32] και για την πρόληψη επαναμεθυλίωση όπως παρατηρείται κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας θεραπείας [33]. Για το σκοπό αυτό, μπορούμε κατεργασμένα κύτταρα HCT116 με αυξανόμενες συγκεντρώσεις φαρμάκου (Σχήμα 1Α) και σε διάφορες χρονικές περιόδους (Σχήμα 1Β) για τον προσδιορισμό παγκόσμιο γονιδιωματική επίπεδα μεθυλίωσης με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς και για τα δύο φάρμακα που μέγιστη απομεθυλίωση επιτεύχθηκε με συγκεντρώσεις 1 μΜ μετά από 24-36 h με DAC που δείχνουν μια μείωση κατά 60% και ΑΖΑ παρουσιάζοντας μείωση κατά 50% των παγκόσμιων μεθυλίωσης του DNA.

Από azanucleosides απαιτούν η αντιγραφή του DNA για τη λειτουργία τους, αναλύσαμε εάν ο αριθμός των κυττάρων στη φάση S ενδέχεται να επηρεαστούν από φαρμακευτική αγωγή. κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0.1, 1, και 10 μΜ AZA ή DAC και διανομή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με FACS (Fluorescence Acitvated διαλογής κυττάρων). Ενώ η αναλογία των κυττάρων στη φάση S αυξήθηκε μετά από αγωγή 24 ώρες με 0,1-10 μΜ AZA ή DAC, μόνο μεγαλύτεροι χρόνοι επώασης οδήγησαν σε μείωση των αναπαραγόμενα κύτταρα για αρκετές συγκεντρώσεις φαρμάκου (Σχήμα S1A). Επιπλέον, FACS αναλύσεις αποκάλυψαν επίσης ότι μόνο οι υψηλές συγκεντρώσεις του φαρμάκου (10 μΜ) οδήγησε σε σύλληψη φάση G2, η οποία συνοδεύεται από μείωση των κυττάρων στη φάση G1 (Εικόνα S1B). Επίσης, έντονη κυτταρικός θάνατος παρατηρήθηκε μόνο με υψηλές συγκεντρώσεις του φαρμάκου, ειδικά μετά από θεραπεία με 10 μΜ ΑΖΑ, το οποίο υποδεικνύει ότι ΑΖΑ-κατεργασμένα κύτταρα σταμάτησαν να αναπαράγουν και να πεθάνει. Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαίωσαν ότι απομεθυλίωση θα πρέπει να αναλυθούν μετά από 24 ώρες και στη συγκέντρωση του φαρμάκου 1 μΜ να αποκλείσει τα συγκεχυμένα αποτελέσματα της τοξικότητας του φαρμάκου.

Array με βάση το γονιδίωμα-ευρεία μεθυλίωσης του DNA ανάλυση

Για να αναλύσουν το DNA μοτίβα μεθυλίωσης των κυττάρων HCT116 σε κλίμακα γονιδιώματος-ευρεία χρησιμοποιήσαμε Infinium μεθυλίωση προφίλ για να ανακρίνουν την κατάσταση μεθυλίωσης των 27.578 CG δινουκλεοτιδίων που εκπροσωπούν 14.475 σχετίζεται γονίδια [11], [19]. Η μεθυλίωση των επιμέρους τόπους προσδιορίστηκε κατά μέσο βήτα (AVB) τιμές που κυμαίνονταν από 0 (μη μεθυλιωμένα) έως 1 (πλήρως μετουσιωμένο). Με βάση προηγούμενες μελέτες [19], μόνο ΟΟδ που έδειξε μία μείωση ή αύξηση της αξίας τους AVB (δέλτα βήτα, DB) τουλάχιστον 0.2 χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των μεταβολών μεθυλίωσης. Βιολογική επαναλήψεις κυττάρων ελέγχου HCT116 και τα κύτταρα αγωγής με φάρμακο έδειξαν μια πολύ υψηλή ομοιότητα (Εικόνα S2A, B, C), επιβεβαιώνοντας την τεχνική ευρωστία της συστοιχίας και της υψηλής εξειδίκευσης προτύπων μεθυλίωσης που προκαλείται από φάρμακα.

Μεταγενέστερες ανάλυση των δεδομένων αποκάλυψε σαφώς διτροπική κατανομή του CG δινουκλεοτίδιο μεθυλίωσης με μια κορυφή χαμηλής μεθυλίωση (13667 του 27571 CGS) που βρέθηκε σε τιμές AVB κυμαίνονται από 0 έως 0,2 και μία κορυφή υψηλής μεθυλίωσης (8222 του 27571), που καλύπτει το διάστημα από 0,8 έως 1,0 (Σχήμα 1 C). Όπως και σε μη επεξεργασμένα κύτταρα, η διτροπική κατανομή μεθυλίωση παρατηρήθηκε επίσης μετά από αγωγή των κυττάρων με ΑΖΑ και DAC (βλέπε Σχήμα 1C). Ωστόσο, μετά τη φαρμακευτική αγωγή η κορυφή υψηλής μεθυλίωσης (AVB≥0.8 στα κύτταρα ελέγχου) μετατοπίστηκε σε χαμηλότερες τιμές μεθυλίωση, αναφέροντας τα ναρκωτικά που προκαλείται απομεθυλίωση.

Α, Παγκόσμια ανάλυση μεθυλίωσης (CE) των κυττάρων HCT116 που έλαβαν θεραπεία με οι υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ΑΖΑ και DAC για 24 ώρες. Β, Time-πορεία μέτρηση CE του φαρμάκου που προκαλείται από απομεθυλίωση χρησιμοποιώντας 1 μΜ AZA ή DAC? Co, μη επεξεργασμένα κύτταρα HCT116. C, οι εκτιμήσεις πυκνότητα πυρήνα του Infinium δεδομένων μεθυλίωσης για το μη επεξεργασμένο (Co) και τα κύτταρα υποστεί αγωγή με φάρμακο. D, Επικύρωση δεδομένων μεθυλίωσης Infinium χρησιμοποιώντας 454 θειώδους αλληλουχίας? δεδομένα μεθυλίωση 4 CG loci, μετρούμενη είτε με ανάλυση Infinium ή με 454 αλληλούχιση, συσχετίζονται έντονα (συντελεστής συσχέτισης r του Pearson = 0,84)? θεραπεία με ΑΖΑ και DAC υποδεικνύεται με Α και D, αντίστοιχα? Οι διαφορετικοί τόποι που υποδεικνύεται από τα χρώματα: PIK3CG (μπλε), NTRK3 (πράσινο), Ells1 (κόκκινο), και AFF2 (μαύρο)

Η

Για την επικύρωση των αποτελεσμάτων σειρά μεθυλίωσης, χρησιμοποιήσαμε εξαιρετικά ποσοτική 454 θειώδους. αλληλουχίας [28] για την ανάλυση τεσσάρων έντονα μεθυλιωμένα CGs που έγινε απομεθυλιωθεί από τα ναρκωτικά θεραπεία σε κύτταρα HCT116. Κατά μέσο όρο, λάβαμε περίπου 300 διαβάζει ανά ΚΒ (βλέπε Εικόνα S7). ανάλυση συσχέτισης των θειώδους δεδομένα αλληλουχίας και τα αποτελέσματα array (Εικόνα 1Δ) έδειξε μια πολύ καλή γενική συμφωνία και των δύο μεθόδων (r = 0,84). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η συστοιχία Infinium μεθυλίωση δημιουργεί μια ακριβή αναπαράσταση του προτύπου HCT116 μεθυλίωσης στα πειράματά μας.

ναρκωτικά που προκαλείται από τα πρότυπα απομεθυλίωση είναι μη-τυχαία

Περαιτέρω αναλύσεις των δεδομένων συστοιχίας έδειξαν ότι η θεραπεία με ΑΖΑ οδήγησε σε απομεθυλίωση (DB≤-0,2) 6% (852 από 13.911) του ΟΟδ μεθυλιωμένο σε κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2Α). Παρουσιάζοντας ακόμη υψηλότερη αποτελεσματικότητα, η θεραπεία της ΕΑΒ που προκαλείται απομεθυλίωση του 11% (1.487 από 13.911) από αυτά τα sites CG (Εικόνα 2Β). Μια δοκιμή αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon επιβεβαίωσε τη σημασία της διαφοράς μεταξύ μεθυλίωσης στο αζα- και DAC-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2C,

P

& lt? 2 × 10

-16). Η υψηλότερη απόδοση της DAC μεσολάβηση απομεθυλίωσης στο επίπεδο του γονιδίου-ειδικό είναι συνεπής με σφαιρική ανάλυση μας μεθυλίωσης σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 1Α, Β).

αλλαγές μεθυλίωσης σε κύτταρα HCT116 θεραπεία για 24 ώρες με ΑΖΑ (Α ) ή DAC (Β)? μπλε κουκκίδες και οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν απομεθυλιωθεί CGs (DB≤-0.2). C, Boxplots δείχνουν την κατανομή των μεθυλιωμένων CGs στα δείγματα ελέγχου HCT116 και τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με AZA ή DAC? μαύρες γραμμές δηλώνουν διαμέσους, χαράζει τα τυπικά σφάλματα, κουτιά το διατεταρτημοριακό εύρος, και μουστάκια το 2,5ο και 97,5 εκατοστημόρια. D, διαγράμματα Venn δείχνουν αλληλοεπικάλυψη απομεθυλιωμένο CGs στα κύτταρα αγωγή με φάρμακο.

Η

Με βάση την παρατήρηση ότι τα πρότυπα απομεθυλίωση φάνηκε να είναι εκπληκτικά ειδικά με υψηλή επαναληψιμότητα μεταξύ των επαναλήψεων, αναρωτηθήκαμε αν και τα δύο φάρμακα συνήθως απομεθυλιούνται CG δινουκλεοτίδια. Για τον προσδιορισμό των κοινώς απομεθυλιώνεται ΟΟδ εμείς ομαδοποιούνται ΑΖΑ και DAC αντιγράφεται, αντίστοιχα, και βρήκε μία ουσιαστική επικάλυψη των ΟΟδ που απομεθυλιώνεται και από τα δύο φάρμακα (Σχήμα 2D). Αυτή η επικάλυψη ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι αναμενόταν από τυχαία απομεθυλίωση (

P

& lt? 2 × 10

-16, ακριβής δοκιμασία Fisher), υποδεικνύοντας ότι οι συγκεκριμένες θέσεις είναι κατά προτίμηση απομεθυλιωθεί με AZA και DAC. Παρά την ευρεία δραστηριότητα απομεθυλίωσης του ΑΖΑ και DAC, ένας σημαντικός αριθμός CG δινουκλεοτιδίων εμφανίστηκε ανθεκτικά σε επαγόμενη από φάρμακα απομεθυλίωσης σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 2Α, Β).

Αντοχή στην επαγόμενη από φάρμακα απομεθυλίωσης κυρίως ξεπεραστούν DNMT1 ? DNMT3B διπλό νοκ-άουτ κύτταρα

Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η CGs ανθεκτικά στην επαγόμενη από φάρμακα απομεθυλίωσης πήραμε προφίλ μεθυλίωσης HCT116 κύτταρα με έντονα μειωμένα επίπεδα DNMT1 και πλήρη απώλεια της DNMT3B (κύτταρα DKO). Η ανάλυση των δεδομένων αποκάλυψε έντονη απομεθυλίωση σε κύτταρα ϋΚΟ με περισσότερο από το 85% των μεθυλιωμένων ΟΟδ να απομεθυλιωθεί (Σχήμα 3Α). κύτταρα ϋΚΟ έδειξε επίσης το μεγαλύτερο βαθμό απομεθυλίωσης που αντιπροσωπεύεται από διάμεσες τιμές DB μικρότερη από -0,55 σχέση με κύτταρα μάρτυρες (Σχήμα 3Β). Σε σύγκριση, παρατηρήσαμε σημαντικά (

P

& lt? 2 × 10

-16, Wilcoxon τεστ rank ποσό). Χαμηλότερους βαθμούς της απομεθυλίωση για AZA και DAC (Εικόνα 3Β)

, τα κύτταρα DKO παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές σε κύτταρα HCT116 στο πρότυπο μεθυλίωσης τους? μπλε κουκκίδες και οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν απομεθυλιωθεί ή υπερμεθυλιωμένων CGs (DB≤-0.2 ή ≥0.2). Β, Boxplots δείχνουν την απομεθυλίωση (DB) σε κύτταρα HCT16 αγωγής με φάρμακο και τα κύτταρα ϋΚΟ? μαύρες γραμμές δηλώνουν διαμέσους, χαράζει τα τυπικά σφάλματα, κουτιά το διατεταρτημοριακό εύρος, και μουστάκια το 2,5ο και 97,5 εκατοστημόρια. C, Σύγκριση σχετική μέση μεθυλίωση των κυττάρων αγωγή με φάρμακο και τα κύτταρα ϋΚΟ όπως προσδιορίζεται από την παγκόσμια γονιδιωματική ανάλυση μεθυλίωσης (CE) και ανάλυση μεθυλίωσης Infinium. D, διαγράμματα Venn δείχνουν αλληλεπικάλυψη απομεθυλιωμένο ΟΟδ μεταξύ κυττάρων υποστεί αγωγή με φάρμακο και τα κύτταρα ϋΚΟ.

Η

επόμενο σύγκριση το μέσο επίπεδο μεθυλίωσης του γονιδίου που σχετίζεται με ΟΟδ που προέρχονται από τη συστοιχία Infinium στην παγκόσμια μεθυλίωση μετρήθηκε με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (CE) (Σχήμα 3C). Εκτός από την ανάλυση μεθυλίωσης Infinium, CE ανακρίνει επίσης ΟΟδ σε επαναλαμβανόμενους στοιχεία τα οποία αποτελούν την πλειονότητα των μεθυλιωμένου DNA στο ανθρώπινο γονιδίωμα [34]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο βαθμός απομεθυλίωση ολόκληρο γενωμικού DNA ήταν πάντοτε υψηλότερη από γονίδιο-ειδική απομεθυλίωση. Αυτό υποδηλώνει ότι ΟΟδ σε επαναλαμβανόμενα στοιχεία έγινε πιο αποτελεσματικά από ό, τι απομεθυλιώνεται γονίδιο που σχετίζεται ΟΟδ. Όταν συγκρίναμε μοτίβα απομεθυλίωση των γραμμών αγωγή με φάρμακο και κυτταρική knockout, διαπιστώσαμε ότι το 92% των ΟΟδ απομεθυλιούνται δια ΑΖΑ και το 90% των ΟΟδ απομεθυλιούνται δια DAC επίσης απομεθυλιώνεται σε κύτταρα ϋΚΟ (Σχήμα 3D). Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επαγόμενη από φάρμακα απομεθυλίωσης συγκεκριμένων γονιδίων είναι σχετικά αναποτελεσματική όταν συγκρίνεται με το σύνολο του γονιδιώματος και να DNMT κύτταρα με ανεπαρκές.

Drug επαγόμενη απομεθυλίωση του καρκίνου που σχετίζονται και bona fide ογκοκατασταλτικά γονίδια

επόμενο αναλύονται τα ναρκωτικά που προκαλείται απομεθυλίωση σε ένα πάνελ του καρκίνου που σχετίζονται με τα γονίδια (προσαρμοσμένο από το GoldenGate μεθυλίωση Panel καρκίνου Ι, Illumina). Από 807 σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια σε αυτό το πάνελ, 784 (αντιπροσωπεύεται από 2.125 CGS) ήταν επίσης παρόντες στο τσιπ μεθυλίωση Infinium. Η ανάλυση των στοιχείων μεθυλίωσης μας αποκάλυψαν ότι τα γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο ήταν περισσότερο εντόνως μεθυλιωμένη από μη σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια, τα οποία είναι παρόντα στην πλατφόρμα Infinium αλλά όχι επί GoldenGate (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, σχετικά με τον καρκίνο μεθυλίωση ήταν έντονα μειωμένη στα κύτταρα ϋΚΟ (Σχήμα 4Α).

Α, Διάμεση επίπεδα μεθυλίωσης του καρκίνου που σχετίζονται με και μη σχετιζόμενη με τον καρκίνο ΟΟδ σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (Co), κύτταρα σε αγωγή με φάρμακο (ΑΖΑ, DAC) και τα κύτταρα DKO. Β, Heatmap της CG μεθυλίωσης στον καρκίνο που σχετίζεται με τα γονίδια. C, Heatmap της υπερμεθυλιωμένων καλή κατασταλτικά γονίδια πίστη όγκου σε κύτταρα φάρμακο και DNMT νοκ-άουτ.

Η

Μια λεπτομερής ανάλυση αποκάλυψε ότι από 2.125 σχετίζονται με τον καρκίνο ΟΟδ, ένα σύνολο 906 CGs ήταν υπερμεθυλίωση ( AVB≥0.8) σε κύτταρα ελέγχου HCT116. DAC απομεθυλιώνεται αυτές υπερμεθυλιωμένων σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια με παρόμοια απόδοση ως ΑΖΑ (Σχήμα 4Β). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι σχεδόν όλα τα γονίδια ήταν έντονα απομεθυλιώνεται σε κύτταρα ϋΚΟ. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης για ένα σύνολο υπερμεθυλιωμένων bona fide ογκοκατασταλτικά γονίδια (Σχήμα 4C). Αυτά τα δεδομένα απεικονίζουν περαιτέρω την ικανότητα της ΕΑΒ και ΑΖΑ την απομεθυλίωση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, και δείχνουν ότι το φάρμακο που προκαλείται από τη συνολική ειδική γονιδιακή απομεθυλίωση είναι συγκριτικά ασθενής.

Μη-CG νησιά και ιδιαίτερα μετουσιωμένο CGs είναι κατά προτίμηση απομεθυλιωμένο

Για να περιορίσετε περαιτέρω την ανάλυσή μας, θα διέκρινε μεταξύ CGI και μη-CGI-συνδέονται CGs. Όπως ήταν αναμενόμενο [35], [36], CGs σε μη CGIs ήταν κυρίως μετουσιωμένο (3667 του 7513, AVB≥0.8), ενώ εκείνες CGIs ήταν ως επί το πλείστον μη μεθυλιωμένη (12.782 από 20.002, AVB≤0.2) (Εικόνα 5Α). Επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης εξέχοντα κλάσμα του εξαιρετικά μετουσιωμένο CGs που σχετίζονται με CGIs (4.527 από 20.002, AVB≥0.8), το οποίο είναι σύμφωνο με το CGI υπερμεθυλίωση στον καρκίνο [6]. Είναι ενδιαφέρον, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι και οι δύο, ΑΖΑ και DAC, απομεθυλιωθεί ένα υψηλότερο ποσοστό των μετουσιωμένο CGs δεν βρίσκεται στην CGIs. Ειδικά, σε κύτταρα HCT116, ΑΖΑ απομεθυλιώνεται 3,0% (219 από 7224) των μεθυλιωμένων δινουκλεοτιδίων CG σε CGIs αλλά 9,5% (633 από 6.687) μεθυλιωμένου ΟΟδ σε μη CGIs (Σχήμα 5Β)? ΕΑΒ απομεθυλιούνται 6,6% (474 ​​από 7.224) των CG δινουκλεοτιδίων στο CGIs αλλά 15,2% (1.013 από 6.687) CGs σε μη-CGIs (Σχήμα 5C). Ως εκ τούτου, καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι η CG δινουκλεοτίδια εντός CGIs έγινε προτίμηση remethylated μετά το φάρμακο που προκαλείται από το παθητικό απομεθυλίωση (

P

& lt? 2 × 10

-16, ακριβής δοκιμασία του Fisher).

Α, Boxplots υποδεικνύουν διαφορές στη μεθυλίωση μεταξύ CGIs και μη CGIs. Β, Boxplots αποδοτικότητας δείχνουν απομεθυλίωση υποδεικνύεται από τις τιμές της DB στην αζα- και DAC-επεξεργασμένα κύτταρα HCT116 εξαρτώνται από την ένωση CG με CGIs. Για το Α και Β, μαύρες γραμμές δηλώνουν διαμέσους, χαράζει τα τυπικά σφάλματα, κουτιά το διατεταρτημοριακό διάστημα, και μουστάκια το 2,5ο και 97,5 εκατοστημόρια. C, Boxplots δείχνουν αποδοτικότητες απομεθυλίωση ως συνάρτηση του βαθμού του CG-μεθυλίωσης σε αζα- και DAC-επεξεργασμένα κύτταρα HCT116. επίπεδα μεθυλίωσης ομαδοποιήθηκαν σε διαστήματα 10% από 0 έως 100% μεθυλίωση? μαύρα σημάδια υποδηλώνουν διαμέσους, κουτιά το διατεταρτημοριακό διάστημα, και μουστάκια το 2,5ο και 97,5 εκατοστημόρια.

Η

Για να αναλυθεί το κατά πόσον απόδοση απομεθυλίωση είναι συνάρτηση του βαθμού CG μεθυλίωσης, θα ομαδοποιούνται CGs με μεθυλίωση τους επίπεδο σε 10 διαστήματα από 10% έως 100% μεθυλίωση και αποφασισμένο να οποίες απομεθυλιώνεται έκταση ΟΟδ σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αζα- και DAC προκαλούμενη απομεθυλίωση ήταν πιο αποτελεσματικό για υψηλά μεθυλιωμένη ΟΟδ (διαστήματα μεθυλίωση από 60% έως 100% μεθυλίωσης). Η σημασία αυτής της επίδρασης επεξηγείται περαιτέρω με μία ανάλογη ανάλυση της αποδοτικότητας απομεθυλίωσης σε κύτταρα ϋΚΟ. Εδώ, CGs σε όλα τα επίπεδα μεθυλίωσης ήταν απομεθυλιούνται εξίσου καλά, όπως αποδεικνύεται από την συνεχώς αυξανόμενη απόσταση από τις διαμέσους τους με το σενάριο αναφοράς (Εικόνα 5D). Ως εκ τούτου, καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι AZA και DAC κατά προτίμηση να οδηγήσει σε απομεθυλίωση άκρως μεθυλιωμένων δινουκλεοτιδίων CG.

Από μη CGI που σχετίζονται CGs δείχνουν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης από CGI-συνδέονται CGs (Σχήμα 5Α), που αναλύονται περαιτέρω, αν η διαφορά μεθυλίωση των δύο ομάδων είχαν ως αποτέλεσμα την παρατηρούμενη διαφορά στην αποτελεσματικότητα μεταξύ απομεθυλίωση CGI- και μη-CGI-σχετίζεται ΟΟδ (Σχήμα 5Β, C). Για το σκοπό αυτό, μπορούμε ομαδοποιούνται ΟΟδ, ανάλογα με το επίπεδο μεθυλίωσης τους σε μη επεξεργασμένα κύτταρα, σε διαστήματα ίσου μεθυλίωσης και προσδιορίζεται απομεθυλίωση ΟΟδ σε CGIs και μη CGIs (Σχήματα S3, S4). Αυτή η ανάλυση επιβεβαίωσε ότι για τα επίπεδα μεθυλίωσης μεγαλύτερο από 50-60% σε κύτταρα HCT116 (μεγαλύτερη από 20-30% για HL60 κύτταρα, βλέπε παρακάτω), ΟΟδ σε μη CGIs καταστεί σημαντικά πιο απομεθυλιωμένο από ΟΟδ σε CGIs.

ναρκωτικά που προκαλείται απομεθυλίωση σε μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων

Σας ζητείται να επιβεβαιώσει προηγούμενα ευρήματα μας σε ένα μοντέλο πιο στενή σχέση με την εγκεκριμένη ένδειξη της ΕΑΒ και AZA. Για το σκοπό αυτό, υποβάλλαμε σε αγωγή HL-60 μυελοειδούς λευχαιμίας για 24 ώρες με συγκεντρώσεις του φαρμάκου που προκαλείται στο ισχυρότερο απόκριση απομεθυλίωση (0,5 μΜ DAC ή ΑΖΑ) και πάλι λαμβάνεται προφίλ μεθυλίωση με ανάλυση Infinium. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με ΑΖΑ οδήγησε σε ισχυρή απομεθυλίωση (DB≤-0.2) του 16% (1.839 από 11.406) του ΟΟδ μεθυλιωμένο σε κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 6Α). επεξεργασία ΕΑΒ που προκαλείται απομεθυλίωση του 8% (941 από 11.406) από αυτά τα sites CG (Εικόνα 6Β). επίπεδα μεθυλίωσης μεταξύ κυττάρων υποστεί αγωγή με φάρμακο διέφεραν σημαντικά (

P

& lt? 2 χ 10

-16, Wilcoxon τεστ Rank Sum), όπως περιγράφεται παραπάνω για τα κύτταρα HCT116, και παρατηρήσαμε πάλι μια ισχυρή επικάλυψη των ΟΟδ απομεθυλιωθεί με AZA και DAC (Σχήμα S5E). Η σύγκριση του CGI-σχετίζεται ΟΟδ και μη-CGI-σχετίζεται ΟΟδ έδειξε ότι ΟΟδ σε CGIs ήταν λιγότερο μεθυλιωμένα από εκείνες σε μη CGIs, η οποία είναι σε συμφωνία με τα ευρήματά μας στα κύτταρα HCT116. Επίσης, όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως στα κύτταρα HCT116, ΑΖΑ και DAC απομεθυλιωθεί CGs σε μη-CGIs πιο αποτελεσματικά από ό, τι εκείνα CGIs σε HL60 κύτταρα (Σχήμα 6C, D) (

P

& lt? 2 × 10

– 16, Wilcoxon τεστ ποσό rank). Σύμφωνα με τα ευρήματά μας στα κύτταρα HCT116, προκαλούμενη από φάρμακα απομεθυλίωσης ήταν επίσης πιο αποτελεσματικό για υψηλά μεθυλιωμένη ΟΟδ σε HL60 κύτταρα (Σχήμα 6Ε, F).

αλλαγές μεθυλίωσης σε HL60 κύτταρα θεραπεία για 24 ώρες με ΑΖΑ (Α) ή DAC (Β)? μπλε κουκκίδες και οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν απομεθυλιωθεί CGs (DB≤-0.2). C, D, Boxplots αποδοτικότητας δείχνουν απομεθυλίωση υποδεικνύεται από τις τιμές της DB στην αζα- και DAC-αντιμετωπίζονται HCT116 κύτταρα εξαρτώνται από την ένωση CG με CGIs? μαύρες γραμμές δηλώνουν διαμέσους, χαράζει τα τυπικά σφάλματα, κουτιά το διατεταρτημοριακό εύρος, και μουστάκια το 2,5ο και 97,5 εκατοστημόρια. Boxplots δείχνουν αποδοτικότητες απομεθυλίωση ως συνάρτηση του βαθμού μεθυλίωσης CG σε Ε, αζα- και F, DAC-κατεργασμένα κύτταρα HL60. επίπεδα μεθυλίωσης ομαδοποιήθηκαν σε διαστήματα 10% από 0 έως 100% μεθυλίωση? μαύρα σημάδια υποδηλώνουν διαμέσους, κουτιά το διατεταρτημοριακό διάστημα, και τα μουστάκια τους 2,5ο και 97,5 εκατοστημόρια.

Η

Αντοχή σε απομεθυλίωση συσχετίζεται με PRC2 πληρότητα και δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής

Τέλος, θεωρείται εν δυνάμει μοριακούς μηχανισμούς που μπορούν να ρυθμίζουν τα ναρκωτικά που προκαλείται από την αποτελεσματικότητα απομεθυλίωση. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ειδική σύνδεση του Polycomb συμπλοκών (PRC2) μπορεί να επάγει υπερμεθυλίωση προαγωγών γονιδίου κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης [37], [38]. Κατά συνέπεια, οι περιφέρειες PRC2 σχετιζόμενη μπορεί να έχει προδιάθεση για την ταχεία επαναμεθυλίωση μετά την αντιγραφή. Έτσι, βάλαμε τα στοιχεία σύνδεσης γονιδιώματος κλίμακα για SUZ12, ΕΤΔ και H3K27 trimethylation [39] στις αντίστοιχες CGs στο τσιπ Infinium. Η ανάλυσή μας έδειξε ότι ΟΟδ που συνδέονται με τους ερωτώμενους συστατικά PRC2 δείχνουν υψηλότερη διάμεση μεθυλίωση από ΟΟδ δεν συνδέονται με τη PRC2 (Σχήμα 7Α). Είναι ενδιαφέρον, PRC2 που σχετίζονται με CGs ήταν σημαντικά πιο ανθεκτικά σε απομεθυλίωση από AZA και DAC (Σχήμα 7Β, C).

Α, Boxplots δείχνουν την κατανομή των CG μεθυλίωσης σε PRC2 που σχετίζονται με CGs και μη PRC2 που σχετίζονται CGs σε HL60 κύτταρα. B, C, Boxplots αποδοτικότητας δείχνουν απομεθυλίωση υποδεικνύεται από τις τιμές της DB στην αζα- και DAC-θεραπεία HL60 κύτταρα εξαρτάται από την σύνδεση με τα συστατικά PRC2. Για τα Α, Β, και Γ μαύρες γραμμές δηλώνουν διαμέσους, χαράζει τα τυπικά σφάλματα, κουτιά το διατεταρτημοριακό διάστημα, και μουστάκια το 2,5ο και 97,5 εκατοστημόρια. D, διαγράμματα Venn δείχνουν CGs που δεν έγινε απομεθυλιωμένο (AVB≥0.8) σε HCT116 αντιμετωπίζονται τα ναρκωτικά και τα κύτταρα HL60 και στα κύτταρα DKO, αντίστοιχα. Ε, Ποσοστό απομεθυλίωση ανθεκτικών ΟΟδ σχετίζεται με συστατικά PRC2 σε HCT116 και τα κύτταρα HL60, και για επικαλυπτόμενες ΟΟδ των δύο κυτταρικών σειρών (HCT116 & amp? HL60). F, τη σημασία του εμπλουτισμού του μεταγραφικού παράγοντα τοποθεσίες σε γονίδια με απομεθυλίωση ανθεκτικά CGs σε HCT116 και τα κύτταρα HL60 και με CGs που έγινε απομεθυλιωθεί με AZA και DAC σε HCT116 και τα κύτταρα HL60 (ευαίσθητα σε απομεθυλίωση) σύνδεση. Heatmap στήλες αντιπροσωπεύουν log (

P

τιμές) για τον εμπλουτισμό των 130 μεταγραφικών παραγόντων.

Η

Για να βελτιώσετε την ανάλυση αυτή, μπορούμε στη συνέχεια επικεντρώθηκε στην απομεθυλίωση ανθεκτικά CGs. Εντοπίσαμε ένα σύνολο 1129 CGs γονιδίου που σχετίζεται με τα οποία ήταν ανθεκτικά στην απομεθυλίωση από AZA και DAC σε HL60 κύτταρα (AVB≥0.8). Είναι ενδιαφέρον ότι, το 75% αυτών των ΟΟδ ήταν επίσης ανθεκτικά σε επαγόμενη από φάρμακα απομεθυλίωσης σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 7D). Μια λεπτομερής ανάλυση έδειξε ότι τα συστατικά PRC2 έντονα εμπλουτισμένη στο περιοχές υποκινητή των ΟΟδ ανθεκτικά σε απομεθυλίωση σε HCT116 και τα κύτταρα HL60, καθώς και σε επικαλυπτόμενα ανθεκτικά ΟΟδ των δύο κυτταρικών σειρών (Σχήμα 7Ε). Να προσδιορίσει περαιτέρω διακριτικά χαρακτηριστικά του απομεθυλίωση ευαίσθητων και ανθεκτικών ΟΟδ, μπορούμε επίσης να αναλυθεί εάν τα γονίδια που φέρουν απομεθυλίωση ανθεκτικά CGs χαρακτηρίζονται από διαφορετικά σύνολα μεταγραφικού παράγοντα μοτίβα πρόσδεσης σε σύγκριση με τα γονίδια που γίνονται απομεθυλιωμένο. Χρησιμοποιώντας το εργαλείο λογισμικού Pscan [29], αναλύσαμε την παρουσία θέσεων πρόσδεσης για 130 παράγοντες μεταγραφής σε 644 γονίδια (851 CGS) που ήταν ανθεκτικά σε απομεθυλίωση σε HCT16 και HL-60 κύτταρα και 121 γονίδια (128 CGS) που έγινε απομεθυλιώνεται σε δύο κυτταρικές σειρές μετά την αγωγή του φαρμάκου. Η ανάλυση αποκάλυψε ότι οι απομεθυλίωση ευαίσθητα και ανθεκτικών ΟΟδ που σχετίζονται με τα γονίδια που δείχνουν ένα συμπληρωματικό εμπλουτισμό θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικού παράγοντα (Σχήμα 7F, Σχήμα S8). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι αντίστοιχες παράγοντες μεταγραφής επίσης ανήκουν σε διαφορετικές οικογένειες παράγοντα μεταγραφής (βλέπε σχήμα S9). Για παράδειγμα, θέσεις Forkhead κουτί πρόσδεσης παραγόντων (Fox) μεταγραφή εμπλουτισμένο σε ευαίσθητες απομεθυλίωση γονίδια ενώ βασικός έλικας-βρόχου-έλικας (bHLH) παράγων μεταγραφής θέσεις πρόσδεσης είναι εμπλουτισμένα σε ανθεκτικά απομεθυλίωση γονίδια. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν την αντίληψη ότι η συγκεκριμένη μοριακοί μηχανισμοί, που βασίζονται στα συμφραζόμενα ακολουθία και τη διαμόρφωση της χρωματίνης, εμπλέκονται στη ρύθμιση της που προκαλείται από φάρμακα απομεθυλίωσης DNA.

Συζήτηση

Ο ρόλος της μεθυλίωσης του DNA σε όγκο κυτταρική βιολογία έχει συστηματικά αναλύθηκε σε κύτταρα HCT116 και τα κύτταρα knockout DNMT στις δύο προηγούμενες μελέτες [16], [17]. Οι μελέτες αυτές χρησιμοποιούνται την έμμεση προσέγγιση των φαρμακολογικών αποκάλυψης [40] για τον εντοπισμό μεθυλιωμένα γονίδια μέσω αλλαγών στο προφίλ της μεταγραφής τους. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα τελευταία στοιχεία δείχνουν ότι AZA και DAC να προκαλέσει διαφορετικά σύνολα γονιδίων με μικρή μόνο επικάλυψη [41].