Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατα δεδομένα έδειξαν ότι υπάρχει μπορεί να είναι μια κακή ρύθμιση του μεταβολισμού του ενδοκανναβινοειδούς στον καρκίνο. Εδώ ερευνήσαμε την έκφραση του ενδοκανναβινοειδούς μεταβολισμού ένζυμο λιπαρών οξέων υδρολάσης αμιδίου (FAAH) σε ένα καλά χαρακτηρισμένο μικροσυστοιχιών ιστών από ασθενείς διαγνώστηκαν με καρκίνο του προστάτη σε διουρηθρική εκτομή για ούρησης προβλήματα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

FAAH ανοσοαντιδραστικότητα (FAAH-IR) αξιολογήθηκε σε φορμαλίνη σταθερό μη-κακοήθη και όγκων πυρήνες εγκλεισμένα σε παραφίνη από 412 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. CB

ανοσολογική αντίδραση του υποδοχέα 1 (CB

1IR) τα αποτελέσματα ήταν διαθέσιμα για αυτό το σύνολο δεδομένων. FAAH-IR παρατηρήθηκε σε επιθηλιακά κύτταρα και τα τοιχώματα των αιμοφόρων αγγείων, αλλά όχι στο στρώμα. Όγκων επιθηλιακής FAAH-IR συσχετίσθηκε θετικά με τη σοβαρότητα της νόσου κατά τη διάγνωση (σκορ Gleason, το στάδιο του όγκου,% του δείγματος που περιείχε όγκο) για τις περιπτώσεις με mid-range CB

σκορ 1IR, αλλά όχι για εκείνους με υψηλή CB

βαθμολογίες 1IR. Για τους 281 περιπτώσεις που έλαβαν μόνο παρηγορητική θεραπεία στις ακραίες στάδια της νόσου, ένα επιθηλιακό υψηλής όγκου FAAH-IR συσχετίστηκε με κακή συγκεκριμένες νόσους επιβίωση. αναλύσεις πολυμεταβλητή Cox αναλογικών κινδύνων παλινδρόμησης έδειξε ότι FAAH-IR έδωσε επιπλέον προγνωστικές πληροφορίες με εκείνη που προβλέπεται από την CB

1IR όταν ένα μεσαίας κατηγορίας, αλλά όχι μια υψηλή CB

χρησιμοποιήθηκε 1IR τιμή αποκοπής. Η ιντερλευκίνη-4 (IL-4) του υποδοχέα IR βρέθηκε σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα και επώαση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη PC-3 και R3327 AT1 με IL-4 αύξησε FAAH δραστικότητα τους.

Συμπεράσματα /Σημασία

όγκων επιθηλιακής FAAH-IR συνδέεται με τη σοβαρότητα του καρκίνου του προστάτη και τα αποτελέσματα σε mid-range, αλλά δεν είναι υψηλό, CB

σκορ 1IR. Η συσχέτιση με το CB

1IR στον ιστό του όγκου μπορεί να σχετίζεται με ένα κοινό τοπικό απορρύθμισης από ένα συστατικό του μικροπεριβάλλον του όγκου

Παράθεση:. Thors L, Bergh Α, Persson Ε, Hammarsten P, Stattin P , Egevad L, et al. (2010) λιπαρών οξέων υδρολάσης αμιδίου στον καρκίνο του προστάτη: Σύνδεσης με την σοβαρότητα της ασθένειας και Αποτέλεσμα, CB

1 υποδοχέα έκφρασης και του κανονισμού από την IL-4. PLoS ONE 5 (8): e12275. doi: 10.1371 /journal.pone.0012275

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Απριλίου, 2010? Αποδεκτές: 27 Ιούλη 2010? Δημοσιεύθηκε: 19, Αυγ 2010

Copyright: © 2010 Thors et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς ευχαριστήσω το σουηδικό Συμβούλιο Επιστήμης (Grant καμία 12158, ιατρική, CJ Fowler.)? η Σουηδική Εταιρεία Καρκίνου (Grant δεν CAN 2007/712, Anders Bergh.)? Τα Λιοντάρια Καρκίνου Ταμείο Έρευνας στο Πανεπιστήμιο της Umea /Cancer Research Ταμείο Norrland και οι Κονδυλίων Έρευνας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Umea (C. Fowler) για οικονομική υποστήριξη. Η πηγή χρηματοδότησης για το αντίσωμα (με τον Δρ Mackie) ήταν χορηγήσει ΝΙΗ DA11322. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνή μορφή καρκίνου στους άνδρες. Σύμφωνα με το Ινστιτούτο των ΗΠΑ National Cancer (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/prostate), ο αριθμός των νέων περιπτώσεων καρκίνου του προστάτη στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2009 ήταν 192.280, και ο αριθμός των θανάτων που οφείλονται στην νόσου ήταν 27.360. Οι θεραπευτικές επιλογές κυμαίνονται από προσδόκιμου να προστατεκτομή, ορμονική θεραπεία και την ακτινοβολία ανάλογα με τη φύση του καρκίνου.

Τα τελευταία χρόνια, έχει συσσωρευτεί απόδειξη που να δείχνουν ότι το σύστημα ενδοκανναβινοειδούς, που περιλαμβάνει το CB κανναβινοειδών

1 και CB

2 υποδοχείς, ενδογενή τους συνδετήρες ανανδαμιδίου και 2-αραχιδονοϋλογλυκερόλη, και συνθετικά και αποικοδομητικά ένζυμα τους, παίζει ένα ρόλο στην παθογένεση και την πιθανή θεραπεία των τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη (για πρόσφατες επισκοπήσεις, βλέπε [1] – [3 ]). Έτσι, για παράδειγμα, κανναβινοειδή παραγωγή ενός υποδοχέα απόπτωση CB σε κύτταρα γλοιώματος, ως αποτέλεσμα της διαρκούς παραγωγής κηραμιδίου [4] και διάφορα έγγραφα έχουν αναφέρει και τις δύο CB υποδοχέα-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από επιδράσεις των κανναβινοειδών επί της βιωσιμότητας, της κινητικότητας και invasivity των δύο ανδρογόνου ευαίσθητες και μη ευαίσθητες καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές [5] – [11]

In vitro

, μια τοπική ενδοκανναβινοειδούς τόνος είναι ένας σημαντικός παράγοντας που ελέγχει την κακοήθεια των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. . Έτσι, η ρύθμιση των επιπέδων ενδοκανναβινοειδών, με χρήση αναστολέων της ενδοκανναβινοειδούς σύνθεσης ή του μεταβολισμού, οδηγεί σε μια αλλαγή στις επεμβατικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του προστάτη κατά τρόπο συνεπή με μία προστατευτική επίδραση του ενδοκανναβινοειδών [8], [12]. Η ενδοκανναβινοειδούς ανανδαμιδίου μεταβολίζεται από το ένζυμο υδρολάση λιπαρού οξέος (FAAH) και υπερέκφραση του ενζύμου σε PC-3 αποτελέσματα κύτταρα σε φαινότυπο με αυξημένο επεμβατική συμπεριφορά

in vitro

[12]. Αυτές οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι «η αναστολή της δραστηριότητας FAAH με ειδικούς αναστολείς μπορεί να είναι ένας θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη» [12]. αναστολείς FAAH, οι οποίες δεν παράγουν το είδος της κεντρικής επιπτώσεις της συμπεριφοράς που σχετίζεται με κανναβινοειδή, όπως Δ

9-τετραϋδροκανναβινόλη [13], είναι επί του παρόντος στην ανάπτυξη φαρμάκων, κυρίως με τον πόνο ως ένα θεραπευτικό στόχο, και η κορυφαία ένωση είναι στη φάση ΙΙ της ανάπτυξής του.

λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με το ενδοκανναβινοειδούς σύστημα στον ιστό του όγκου του προστάτη, αλλά σε μια μελέτη χρησιμοποιώντας ένα μεγάλο αριθμό ασθενών με μακρά παρακολούθηση, εμείς πρόσφατα ανέφερε ότι η έκφραση της ΚΤ

1 υποδοχείς στον ιστό του όγκου που λαμβάνεται κατά τη διάγνωση σχετίστηκε με τη βαρύτητα της νόσου και την έκβαση [14]. Έτσι, τα άτομα με CB

ανοσολογική αντίδραση του υποδοχέα 1 (CB

1IR) ανωτέρω ή ίση με τη μέση βαθμολογία για το σύνολο δεδομένων είχαν υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης των μεταστάσεων κατά τη διάγνωση, και ένα μεγαλύτερο ποσοστό των περιπτώσεων με υψηλή βαθμολογία Gleason (ένας δείκτης της σοβαρότητας της νόσου με βάση την μορφολογία των δύο πιο κοινοί τύποι του όγκου στο δείγμα [15]) από ότι εκείνα τα άτομα με ένα CB

1IR κάτω από τη μέση για το σύνολο δεδομένων. Επιπλέον, για τα άτομα που είχαν ακολουθηθεί από προσδόκιμο μέχρι την εμφάνιση μεταστάσεων, ένα υψηλό CB

1IR σκορ σχετίστηκε με χαμηλότερο συγκεκριμένες νόσους επιβίωσης [14]. Όσον αφορά την FAAH, έχει αναφερθεί ότι σε μια εμπορικώς διαθέσιμη μικροσυστοιχία ιστό, πυρήνες από ιστούς καρκίνου του προστάτη είχαν υψηλότερη έκφραση του ενζύμου από ό, τι φαίνεται στο φυσιολογικό ιστό [12]. Ωστόσο, δεν υπάρχουν στοιχεία για τη σχέση μεταξύ της ανοσολογική FAAH (FAAH-IR) και το αποτέλεσμα της νόσου παρουσιάστηκε. Επιπλέον, πιθανοί λόγοι για το υψηλό επίπεδο FAAH-IR στον ιστό του όγκου δεν ερευνήθηκαν από τους συγγραφείς αυτούς. Κατά συνέπεια, στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την FAAH-IR στην μικροσυστοιχίες ιστού που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως από εμάς για να χαρακτηρίσει CB

1IR στον ιστό του όγκου [14], και να αναληφθούν μελέτες που χρησιμοποιούν καλλιεργημένα κύτταρα για να δείτε αν ένα γνωστό συστατικό του μικροπεριβάλλον του όγκου μπορεί να επηρεάσει τη δραστηριότητα FAAH. Περαιτέρω, ερευνήσαμε αν FAAH-IR συσχετίζεται με άλλες παθογενετικός και προγνωστικές μεταβλητές, όπως το τοπικό αριθμό στάδιο του όγκου και την ανοσοδραστική βαθμολογία για τον υποδοχέα του επιδερμικού φωσφορυλιωμένη αυξητικού παράγοντα (pEGFR).

Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

Η επιτροπή δεοντολογίας της έρευνας σε Umeå πανεπιστημιακό νοσοκομείο (Περιφερειακό ηθικά Διοικητικό συμβούλιο κριτική στη Umeå, Σουηδία) ενέκρινε τη μελέτη και παραιτήθηκε από την ανάγκη για πληροφορημένη συναίνεση.

ασθενείς

Οι φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη συγκεντρώθηκαν στο Κεντρικό Νοσοκομείο, Västerås, Σουηδία, μεταξύ 1975 και 1991, από ένα σύνολο 412 ασθενών που έχουν διαγνωστεί με καρκίνο του προστάτη σε διουρηθρική εκτομή για τις δυσκολίες ούρησης [16 ]. Η παρουσία των μεταστάσεων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα σπινθηρογράφημα οστών λίγο μετά την διουρηθρική εκτομή. Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν μέχρι το 2003. Για τις 388 περιπτώσεις όγκων FAAH-IR θα μπορούσε να σκοράρει (βλέπε παρακάτω), 281 ακολούθησαν προσεκτικής αναμονής μέχρι την εμφάνιση μεταστάσεων (η τυπική θεραπευτική προσέγγιση κατά το χρόνο). Οι άλλοι ασθενείς έλαβαν ορμονική θεραπεία, ακτινοθεραπεία ή ριζική προστατεκτομή. Οι βαθμολογίες Gleason και το ποσοστό του δείγματος που περιείχε όγκου εκτιμήθηκαν σε κάθε δείγμα. Αιτία του θανάτου εκτιμήθηκε από την αξιολόγηση των ιατρικών αρχείων. μικροσυστοιχίες ιστού (πυρήνες με διάμετρο 0,6 mm) κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Μέσο Beecher (Sun Prairie, WI, USA). Κάθε διαφάνεια μικροσυστοιχίες ιστού (56 στο σύνολο, συνήθως με πυρήνες από 8 περιπτώσεις ανά διαφάνεια) που περιέχονται μέχρι και οκτώ (συνήθως πέντε) δείγματα καρκινικού ιστού (τόσο της πρωτοβάθμιας όσο και της δευτεροβάθμιας περιοχές βαθμό Gleason περιλήφθηκαν) και μέχρι τέσσερα (συνήθως τέσσερις) δείγματα μη κακοήθη ιστό από κάθε ασθενή [16].

Ανοσοϊστοχημεία

τμήματα αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και τοποθετήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού ρΗ 6.0. Μετά το βρασμό σε μια χύτρα ταχύτητας για 60 λεπτά, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε νερό και στη συνέχεια σε ρυθμιστικό Ventana, μετά την οποία τοποθετήθηκαν σε ένα αυτοματοποιημένο αναλυτή Ventana (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, ΑΖ) με το οποίο το αντίσωμα FAAH (αραίωση 1 /2000) και το δευτερεύον σύστημα (iVIEW DAB Detection Kit, Ventana Medical Systems Inc.) προστέθηκαν. Το αντίσωμα που χρησιμοποιείται, ένας κουνελιού αντι-FAAH εγείρονται έναντι των τελευταίων 102 αμινοξέων της FAAH αρουραίου, έχει χαρακτηριστεί λεπτομερώς [17] και βρέθηκε να παράγει την κατάλληλη πρότυπο χρώσης (σωματοδενδριτική χρώση του κύριου κύτταρα) σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ιστού από ανθρώπινο ιππόκαμπο (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), σύμφωνα με τις ιππόκαμπου αρουραίου [18], [19]. CB

1 υποδοχέα ανοσολογική αντίδραση (CB

1IR) τα αποτελέσματα ήταν διαθέσιμα στη βάση δεδομένων, και έχουν αναφερθεί αλλού [14].

Οι επιμέρους πυρήνες βαθμολογήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο για FAAH-IR από ένα ερευνητή (LT), ο οποίος ήταν τυφλός για να τα κλινικά δεδομένα για τους ασθενείς. Το σύστημα βαθμολόγησης που χρησιμοποιήθηκε ήταν ουσιαστικά η ίδια με εκείνη που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως για CB

1IR [14]. Εν συντομία, για το επιθηλιακό ιστό, οι πυρήνες βαθμολογήθηκαν για ανοσοαντιδραστικά ένταση (0-3 όπου 0 είναι απόν και 3 είναι υψηλή) και κατανομή εντός της επιθηλιακού ιστού (0, 10, 25, 33, 50, 67 ή 100% του η συνολική κατανομή για κάθε ένταση). Η κατανομή για το πιο κοινό ένταση ορίστηκε σε 100 μείον το άθροισμα των άλλων εντάσεων. Η κλασματική κατανομή σε κάθε ένταση πολλαπλασιάστηκε με το σκορ ένταση και οι τιμές αθροίζονται για να δώσουν μια τελική βαθμολογία για τον πυρήνα. Έτσι, για παράδειγμα, ένας πυρήνας με εντάσεις 1 (10%), 2 (10%) και 3 (υπόλοιπο) (διανομή σε παρένθεση) θα λάβει σύνθετη βαθμολογία από 1 × 0.1 + 2 × 0.1 + 3 × 0,8 = 2,7 . Όταν αναγνωρίσιμες στον πυρήνα, το βασικό και αυλού επιθηλιακού ιστού βαθμολογήθηκε ξεχωριστά. τοιχώματα των αγγείων βαθμολογήθηκαν με τον ίδιο τρόπο, αλλά με ένα απλούστερο διανομής (0, 50 και 100%). Καθ ‘όλη τη βαθμολόγησης, παραδείγματα των πυρήνων βαθμολογήθηκε ως 1, 2 και 3 ήταν σε ετοιμότητα για σύγκριση ως «εσωτερικό πρότυπο». Πυρήνες όπου η δομή ή η ποιότητα του ιστού δεν ήταν αρκετά καλή ή όπου η χρώση ήταν ασαφής αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Για κάθε μέτρο, οι μέσες τιμές για τις σύνθετες βαθμολογίες για κάθε ασθενή ήταν υπολογίζονται και καταχωρούνται στη βάση δεδομένων από έναν δεύτερο ερευνητή (CF). Ως μέτρο της αξιοπιστίας των επιθηλιακών βαθμολογίες όγκου, 67 πυρήνες (16 ασθενείς) βαθμολογήθηκαν σε δύο ξεχωριστές περιπτώσεις από τον ίδιο ερευνητή. Ο συντελεστής συσχέτισης Spearman για τις επιμέρους βασικές βαθμολογίες μεταξύ αυτού του χειριστή και το κύριο της μελέτης ήταν 0,76 (n = 67, p & lt? 0.0001, 95% διάστημα εμπιστοσύνης 0,63 έως 0,85). Ο εσωτερικός συντελεστής συσχέτισης για ενιαία μέτρα (ICC (2,1), ένα μέτρο για την αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου βαθμολόγησης) ήταν 0,67 (95% διάστημα εμπιστοσύνης 0,51 έως 0,78, p & lt? 0.001).

Η ιντερλευκίνη-4 (IL-4) ανοσοαντιδραστικότητα υποδοχέα εκτιμήθηκε σε φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη τομές ιστού χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα προς το εξωκυτταρικό πεδίο του ανασυνδυασμένου ανθρώπινου υποδοχέα IL-4 (MAB230, R &? D Systems Inc., Minneapolis, USA). Η αραίωση αντισώματος ήταν 1/200 και το ανοσοαντίδρασης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης Ventana όπως παραπάνω. λεμφαδένων ιστός χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος.

Η καλλιέργεια των κυττάρων

PC-3 και LNCaP κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου προστάτη (πέρασμα κυμαίνεται 32-38 και 14-19, αντίστοιχα), και R3327 AT -1 καρκινικά κύτταρα του προστάτη του αρουραίου (εύρος πέρασμα 49-59) ήταν διαθέσιμα στο Τμήμα. PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Hams F-10, 2mM L-γλουταμίνη, 10% ορό εμβρύου και 100 ml

-1 πενικιλλίνη 100 g ml

-1 στρεπτομυκίνη (PEST) βοοειδών. LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640, 2 mM γλουταμίνη, 10% ορό εμβρύου μόσχου και παρασίτων. R3327 κύτταρα ΑΤ-1 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640, 250 ηΜ δεξαμεθαζόνη, 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και παρασίτων. κύτταρα Ρ19 ποντικού εμβρυϊκά καρκίνωμα (εύρος 17-19 δίοδος) ελήφθησαν από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών Κυττάρων (Porton Down, UK). κύτταρα Ρ19 καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ άλφα 22571 με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 1% μη απαραίτητα αμινοξέα και και παρασίτων. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 75 cm

2 φιάλες καλλιέργειας στους 37 ° C με 5% CO

2 σε υγροποιημένη ατμοσφαιρική πίεση. Τα κύτταρα περάστηκαν δύο φορές την εβδομάδα και κυτταρική καλλιέργεια μέσο αλλάχθηκε τρεις φορές την εβδομάδα.

Η ιντερλευκίνη-4 (IL-4) διέγερση της δραστικότητας FAAH σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα

Τα κύτταρα απλώθηκαν σε μια πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων. Μετά την επώαση όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2, το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας αλλάχθηκε, σε μέσο συμπληρωμένο με IL-4, και επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και στη συνέχεια συλλέγονται χρησιμοποιώντας ένα λαστιχένιο ξέστρο. Σε πάγο, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS, φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα 1000 χ g και σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 10 mM ρυθμιστικό Tris σε ρΗ 9. Τα προϊόντα ομογενοποίησης αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C σε κλάσματα μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο [20].

Η δραστικότητα FAAH μετρήθηκε όπως περιγράφεται από Boldrup et al. [21]. Εν συντομία, μετά από επώαση των ομογενοποιημάτων με 2 μΜ [

3Η] επισημαίνονται στο τμήμα αιθανολαμίνης του μορίου ΑΕΑ (δοκιμασία ρΗ 9), ένα μείγμα ξυλάνθρακα (80 μl ξυλάνθρακα 300 μΙ 0.5 Μ HCI ανά σωλήνα) προστέθηκαν και σωλήνες τοποθετήθηκαν σε πάγο για να σταματήσει η αντίδραση. Το κάρβουνο στη συνέχεια καθιζάνουν με φυγοκέντρηση, 2,500 χ g για 10 λεπτά, και δείγματα του υπερκείμενου μεταφέρθηκαν σε φιαλίδια σπινθηρισμού και το περιεχόμενο τριτίου καθορίστηκε με φασματοσκοπία σπινθηρισμών υγρού με διόρθωση απόσβεσης. Οι κενές τιμές ορίζεται ως η συσσωρευμένη ποσότητα του τριτίου για δοκιμές που εκτελούνται υπό την απουσία του ομογενοποιημάτων.

εκχύλιση RNA και σύνθεση cDNA

PC-3 και LNCaP κύτταρα απλώθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με IL-4 όπως περιγράφηκε ανωτέρω. Για την ανάλυση PCR, ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το miRNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα όργανο Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), και cDNA συντέθηκε από 2 μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ σύνθεσης cDNA με τυχαίους εκκινητές (cDNA Υψηλή χωρητικότητα ανάστροφης κιτ μεταγραφής? Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Για ημι-ποσοτική PCR, τα δείγματα από την ίδια ομάδα θεραπείας συνενώθηκαν (n = 6).

Ημι-ποσοτική PCR

Τα επίπεδα mRNA για ανθρώπινη CB

1, FAAH και GAPDH αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Taq PCR πυρήνα (Qiagen, Hilden, Γερμανία), ένα θερμοκυκλοποιητή Biometra TProfessional (Biometra, Göttingen, Γερμανία) και τα ακόλουθα εναύσματα: hFAAH (197 bp), προς τα εμπρός 5′-TGGAAGTCCTCCAAAAGCCCAG-3 ‘, αντίστροφη 5’ – TGTCCATAGACACAGCCCTTCAG-3 ‘, HCB

1 (165 bp), προς τα εμπρός 5′-AAGGTGACATGGCATCCAAAT-3′, αντίστροφη 5′-AGGACGAGAGAGACTTGTTGTAA-3 ‘, και hGAPDH (180 bp), προς τα εμπρός 5′-CAACTACATGGTTTACATGTTC-3′, αντίστροφη 5’-GCCAGTGGACTCCACGAC-3 ‘. Οι συνθήκες για την PCR ήταν: μετουσίωση στους 94 ° C για 2 λεπτά, ανόπτηση για 40 s στους 57 ° C (GAPDH) ή 60 ° C (FAAH, CB

1), ακολουθούμενη από επιμήκυνση στους 72 ° C για 60 s? σε επόμενους κύκλους μετουσίωσης διεξήχθη στους 94 ° C για 40 s. Για FAAH και CB

1, οι αναλύσεις που περιλαμβάνονται 35 κύκλους, ενώ 25 κύκλοι που χρησιμοποιούνται για GAPDH.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Εκτός από την ημι-ποσοτική PCR σε ομαδοποιημένα δείγματα , η ανάλυση των μεμονωμένων δειγμάτων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Χρησιμοποιήθηκαν τόσο SYBR Green (FAAH, CB

1, GAPDH) και TaqMan (β-ακτίνη) κινητική. Για FAAH, CB

1 και GAPDH, οι εκκινητές που περιγράφηκαν παραπάνω χρησιμοποιήθηκαν μαζί με υδραυλικό SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ενώ το ανθρώπινο β-ακτίνης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα προ-κατασκευασμένο εκκινητή -probe μείγμα (Hs00357333_g1, Applied Biosystems) μαζί με TaqMan Οικουμενική PCR Master Mix (Applied Biosystems). Οι ενισχύσεις εκτελέστηκαν σε ένα ΑΒΙ PRISM 7900 Sequence ΗΤ συστήματος και του λογισμικού ανίχνευσης (Applied Biosystems), και τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν. Τόσο GAPDH και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως γονίδια housekeeping, με παρόμοια αποτελέσματα (τα δεδομένα για β-ακτίνη δεν φαίνεται). Η σχετική έκφραση των FAAH και CB

1was υπολογίζεται από

Ct

τιμές χρησιμοποιώντας την τυποποιημένη μέθοδο καμπύλης.

Western Blot

Για την κηλίδωση Western, πρωτεϊνικά δείγματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 10% SDS – πολυακρυλαμιδίου υπό αναγωγικές συνθήκες και κλασματωμένα πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικώς σε μεμβράνη Immobilon-Ρ μεμβράνη (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν για όλη τη νύχτα στους 4 ° C πάνω σε περιστροφικό αναδευτήρα σε γάλα σε σκόνη 5% μη-λιπαρά, 0,05% Tween-20 σε PBS (PBS-T) πριν από την επώαση με πρωτογενές κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι FAAH (1:1000-1 :5000? το ίδιο αντίσωμα όπως χρησιμοποιείται στην ανοσοϊστοχημική μέρος της μελέτης) ή πρωτογενή πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι ακτίνης (1:8000? Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA). Πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν σε ΡΒδ-Τ 3% (FAAH) ή PBS-T 5% (ακτίνη) μη λιπαρό γάλα σε σκόνη. Μετά την επώαση με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση (Amersham Biosciences), πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences). Μοριακά μεγέθη των ζωνών πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με παράλληλη ηλεκτροφόρηση των δεικτών μοριακού βάρους (Bio-Rad Laboratories ΑΒ, Sundbyberg, Σουηδία). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης BSA (Pierce, Rockford, IL, USA)

Ενώσεις

ανανδαμίδη (αιθανολαμίνη-1-

3Η? συγκεκριμένη δραστηριότητα:. 2.2 TBqmmol

-1) ελήφθη από την American Radiolabeled Chemicals Inc. (St Louis, MO, USA). Η μη σημασμένη ανανδαμιδίου και URB597 ελήφθησαν από την Cayman Chemical Co. (Αηη Arbor, ΜΙ, USA). Η ιντερλευκίνη-4 λήφθηκε από Sigma-Aldrich.

Στατιστικά

Με την εξαίρεση του Cox αναλογικών κινδύνων παλινδρόμησης και εσωτερικός συντελεστής συσχέτισης αναλύσεις, που έγιναν με τη χρήση του λογισμικού SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), όλα τα στατιστικοί υπολογισμοί έγιναν χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο ενσωματωμένη στο πρόγραμμα υπολογιστή GraphPad Prism 5 για Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Για τις αναλύσεις επιβίωσης, ένα γεγονός ορίστηκε ως ο θάνατος οφείλεται σε καρκίνο του προστάτη και καταχωρηθεί στη βάση δεδομένων ως «συμβάν = 1». Θάνατος από άλλες αιτίες λογοκρίθηκε, όπως ήταν οι περιπτώσεις όπου ο ασθενής ήταν ακόμα ζωντανός κατά την ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθησης. Αυτά ομαδοποιήθηκαν ως «συμβάν = 0». Περιπτώσεις (n = 3), όπου η έκβαση της νόσου ήταν άγνωστη αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις η επιβίωση. Η διάρκεια της εκδήλωσης επιβίωσης χωρίς ορίζεται ως ο χρόνος από τη διάγνωση μέχρι την ημερομηνία θανάτου από καρκίνο του προστάτη, του θανάτου από άλλα αίτια, ή αν συμβεί κανένας θάνατος, μέχρι την ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθησης.

Δέκτης που λειτουργούν χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλες χρησιμοποιήθηκαν για να καθορίσουν cut-off για FAAH-IR, τα οποία στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή καμπυλών επιβίωσης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier. Διαφορές στο αποτέλεσμα μεταξύ των ομάδων ελέγχθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Cox αναλογικών κινδύνων αναλύσεις παλινδρόμησης προκειμένου να αξιολογηθεί η επίδραση της βαθμολογίας FAAH από το αποτέλεσμα σε διαφορετικά CB

αποκοπές 1IR. Οι διαφορές στην κατανομή των μεταβλητών μεταξύ των ομάδων των ασθενών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square.

Για τους αναγνώστες δεν είναι εξοικειωμένοι με τις στατιστικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της επίδρασης των FAAH-IR κατά την πορεία της νόσου, μια σύντομη επεξήγηση τους χρησιμότητα δικαιολογείται, ιδιαίτερα σε σχέση με την επιλογή των τιμών αποκοπής για FAAH-IR. Η δοκιμή ROC αναπτύχθηκε αρχικά για να βοηθήσει την ερμηνεία των σημάτων ραντάρ, και οικόπεδα ο αριθμός των αληθινή αρνητικά (1- το ψευδώς θετικό κλάσμα, που ονομάζεται 1 – ειδικότητα).

vs

αλήθεια θετικών (ευαισθησία) σε μια δεδομένη αποκοπής αξίας (δηλαδή για τις περιπτώσεις με σκορ ίσο ή μεγαλύτερο από, η επιλεγμένη τιμή). Η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC μπορεί στη συνέχεια να υπολογιστεί. Για μια δοκιμή με απολύτως καμία διαγνωστική αξία, η καμπύλη θα είναι μία ευθεία γραμμή, με έκταση 0.5. Ένα τέλειο τεστ θα δώσει μια τιμή 1,0, έτσι ώστε η πιο μακριά από 0,5 η τιμή, τόσο καλύτερη είναι η δοκιμή. Για μια δοκιμή με μια περιοχή κάτω από την καμπύλη σημαντικά μεγαλύτερη από 0.5, ένα σημαντικό θέμα είναι η επιλογή της αποκοπής, η τιμή που επιλέγεται ως ένα μήνυμα ότι ο ασθενής μπορεί να έχει την εν λόγω ασθένεια. Εάν η τιμή αποκοπής ορίζεται χαμηλά, τότε η ευαισθησία θα είναι υψηλό, αλλά θα υπάρξει ένας μεγάλος αριθμός ψευδών θετικών. Εάν η τιμή αποκοπής είναι υψηλή, τότε ο αριθμός των ψευδώς θετικών θα είναι χαμηλότερη, αλλά ένας μεγάλος αριθμός των αληθώς θετικά θα χαθεί. Η επιλογή του αποκοπής είναι έτσι μια ανταλλαγή μεταξύ μεγιστοποίησης του αριθμού των αληθώς θετικά αποτελέσματα και ελαχιστοποιώντας τον αριθμό των ψευδώς θετικών. Επιλογή της αποκοπής εξαρτάται από τη σχετική σημασία της λείπει πραγματικά θετικά

vs.

Misdiagnosing αλήθεια αρνητικά για τη συγκεκριμένη ασθένεια, αλλά ένας χρήσιμος τρόπος εξεύρεσης της βέλτιστης αποκοπής είναι να προσδιοριστεί το σημείο αποκοπής με τη μέγιστη κάθετη απόσταση μεταξύ της παρατηρούμενης τιμής και της αντίστοιχης τιμής για ένα τεστ χωρίς διαγνωστική αξία, που υπολογίζεται ως μέγιστη ευαισθησία + ειδικότητα -1. Η τιμή αυτή ονομάζεται δείκτης Youden, J, και έχουμε χρησιμοποιήσει αυτή την τιμή εδώ για FAAH-IR (που ονομάζεται J

FAAH). Για χρήσιμα σχόλια σχετικά με τις καμπύλες ROC και την επιλογή της βέλτιστης τιμές αποκοπής, βλέπε [22] – [24]

Όσον αφορά τις στατιστικές αναλύσεις των καμπυλών επιβίωσης, με τη μέθοδο Kaplan-Meier, όπου οι διαφορές στο αποτέλεσμα μεταξύ. ομάδων ελέγχεται με τη δοκιμασία log-rank, παρέχει ένα χρήσιμο (και οπτικά) μέθοδος για την αξιολόγηση διαφορές στις καμπύλες επιβίωσης. Η Cox αναλογικών κινδύνων παλινδρόμησης αναλύει τον κίνδυνο «ως συνάρτηση των επεξηγηματικών μεταβλητών και αγνώστων συντελεστών παλινδρόμησης πολλαπλασιάζεται με μια αυθαίρετη και άγνωστες συνάρτηση του χρόνου» (παραπομπή από το αρχικό χαρτί του Cox [25]), δηλαδή αξιολογεί τη συνεισφορά των διαφόρων δυνητικούς παράγοντες κινδύνου για το τελικό σημείο που μετράται (σε ​​αυτή την περίπτωση, ο θάνατος οφείλεται σε καρκίνο του προστάτη) χωρίς να κάνει υποθέσεις σχετικά με το ίδιο το βασικό καμπύλη επιβίωσης.

Αποτελέσματα

Διανομή FAAH ανοσολογική αντίδραση σε μη κακοήθη και όγκου

ιστού

FAAH-IR σκόραρε σε πυρήνες από ένα σύνολο 412 ασθενών. Από αυτά, τα αρχεία για έξι ασθενείς δεν βρέθηκαν στη βάση δεδομένων, και έτσι τα στοιχεία για αυτούς τους ασθενείς δεν συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις.

Ένα παράδειγμα της FAAH-IR για τη μη κακοήθη ιστό φαίνεται στο Σύκο. 1Α. FAAH-IR παρατηρήθηκε στα επιθηλιακά κύτταρα, και στα αιμοφόρα αγγεία, όπως επίσης και σε κύτταρα (ενδεχομένως λεμφοκύτταρα, τα οποία εκφράζουν FAAH [26]) διεισδύοντας το στρώμα σε ορισμένες πυρήνες. Σε όλες, 1247 πυρήνες από 377 ασθενείς βαθμολογήθηκαν για μη κακοήθη επιθηλιακά FAAH. Από αυτούς, 733 πυρήνες από 307 περιπτώσεις είχαν προσδιορίσιμο βασικά: αυλού μορφολογία και το FAAH-IR για αυτές τις περιπτώσεις βαθμολογήθηκαν ξεχωριστά και χρησιμοποιούνται στις αναλύσεις. Επιπλέον, 993 πυρήνες από 369 περιπτώσεις βαθμολογήθηκαν για FAAH-IR στα τοιχώματα των αιμοφόρων αγγείων. Η σωρευτική κατανομή των βαθμολογιών στα βασικά και του αυλού των επιθηλιακών κυττάρων φαίνεται στο Σχ. 1Β, όπου είναι σαφές ότι η διάμεση FAAH-IR είναι υψηλότερη στα βασικά επιθηλιακά κύτταρα από ό, τι στα αυλού κύτταρα. Στην πραγματικότητα, από τα 733 πυρήνες σκόραρε, η βασική βαθμολογία FAAH-IR ήταν υψηλότερη από την αντίστοιχη του αυλού σκορ σε 724 πυρήνες και τα δύο σκορ ήταν ίση με 9 πυρήνες. Η βαθμολογία του αυλού ήταν ποτέ μεγαλύτερη από τη βασική βαθμολογία. Το αιμοφόρο αγγείο FAAH-IR σκόραρε λίγο διαφορετικά, οπότε η άμεση σύγκριση των τιμών δεν είναι σχετικό. Ωστόσο, υπήρξε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της βασικής FAAH-IR και των αιμοφόρων αγγείων FAAH-IR, αλλά όχι μεταξύ του αυλού και των αιμοφόρων αγγείων FAAH-IR (Πίνακας 1).

Πίνακας Α Παράδειγμα FAAH-IR σε ένας πυρήνας μη κακοήθη προστατικό ιστό που λαμβάνεται σε διουρηθρική εκτομή από μια παλιά ασθενή 75 χρόνια. Οι αστερίσκοι δεικνύουν τα αιμοφόρα αγγεία, και το σύμβολο # υποδεικνύει FAAH θετικά κύτταρα, πιθανώς διηθητικά λεμφοκύτταρα. Στον πίνακα C, η FAAH-IR σε έναν πυρήνα του ιστού του όγκου από έναν ασθενή ηλικίας 64 έτος παρουσιάζεται. Οι γραμμές στο πάνω δεξιά πάνω από τους πυρήνες δείχνουν 100 μm. Πάνελ Β δείχνει τις αθροιστικές συχνότητες των βαθμολογιών FAAH-IR για τη βασική και αυλική μη κακοήθεις (N) επιθηλιακού ιστού (n = 307 και στις δύο περιπτώσεις) και για το επιθηλιακό ιστό του όγκου (Τ) (n = 388). Οι μέσες τιμές (με διατεταρτημοριακό εύρος σε παρένθεση) ήταν: βασική (N), 2.625 (2,125 έως 2,9)? αυλού (Ν), 1.25 (1 – 1,75)? επιθηλιακά (Τ), 2.05 (1.8-2.3). Οι μέσες τιμές ήταν σημαντικά διαφορετικό από κάθε άλλο (p & lt? 0.001, τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Dunn εξής σημαντική δοκιμασία Kruskal-Wallis). Πίνακας Α δείχνει τη σχέση του επιθηλιακών όγκων FAAH-IR στο σκορ Gleason (GS) κατά τη διάγνωση. Οι βαθμολογίες FAAH-IR χωρίστηκαν σε τεταρτημόρια όπου αναφέρεται σε βαθμολογίες μεταξύ & lt? 1,8 (n = 96), II μεταξύ 1,8 και 2 (n = 94), III μεταξύ 2,05 και 2,25 (n = 99) και IV μεταξύ 2,3 και 3 (n = 99). Η κατανομή των ομάδων GS ήταν σημαντικά διαφορετική στα τεταρτημόρια (χ

2 = 27.03, df = 9, p & lt? 0.0005).

Η

Ένα σύνολο από 1851 πυρήνες από 388 περιπτώσεις βαθμολογήθηκαν για FAAH-IR στα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. Για τα αιμοφόρα αγγεία, βαθμολογήθηκαν 1201 πυρήνες από 360 ασθενείς. Ένα παράδειγμα της χρώσης για έναν πυρήνα όγκου φαίνεται στο Σχ. 1C και η αθροιστική κατανομή των επιθηλιακών βαθμολογίες φαίνονται στο Σχ. 1Β, όπου μπορεί να φανεί ότι η μέση βαθμολογία ήταν σημαντικά υψηλότερο από το μη-κακοήθη σκορ αυλού, αλλά χαμηλότερο από το βασικό σκορ.

Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται εδώ έχουν προηγουμένως διερευνηθεί από εμάς όσον αφορά την έκφραση της επιθηλιακά CB

1 υποδοχείς [14]. Για τους μη-κακοήθεις δείγματα, δεν υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της CB

βαθμολογίες 1IR και είτε βασική, αυλού ή των αιμοφόρων αγγείων FAAH-IR. Αντίθετα, μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ΚΤ όγκου

1IR και της επιθηλιακής όγκου και των αιμοφόρων αγγείων FAAH-IR παρατηρήθηκε (Πίνακας 1).

δραστηριότητα FAAH σε καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη επηρεάζεται από την ιντερλευκίνη-4

μια εξήγηση για τη διαπίστωση ότι η επιθηλιακών όγκων FAAH-IR είναι υψηλότερη από ό, τι FAAH-IR σε φυσιολογικό ιστό επιθηλιακά προστάτη [12] είναι ότι ένα συστατικό του μικροπεριβάλλον του όγκου επηρεάζει τη δραστηριότητά της. Η T

H2 κυτοκίνη ιντερλευκίνη-4 (IL-4), η οποία έχει αναφερθεί για τη ρύθμιση FAAH και CB

1 υποδοχέων σε λεμφοκύτταρα και κύτταρα Jurkat [26] – [28], εμπλέκεται παθογένεση διαφόρων καρκίνο τύπων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη (βλέπε [29] – [35]). Οι υποδοχείς IL-4 έχουν αναφερθεί και στις δύο επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα και σε καλλιεργημένα καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές [29], [36]. Επιβεβαιώσαμε την παρουσία IL-4 IR σε καρκίνο του προστάτη επιθηλιακό ιστό (Εικ. 2Α), και βρέθηκε ότι η επώαση των δύο PC-3 κύτταρα ανθρώπινου ανδρογόνου αναίσθητη και αρουραίου Dunning R3327 ΑΤ-1 κύτταρα καρκίνου προστάτη με IL-4 για 24 h παρήγαγε μια σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα FAAH των κυττάρων (Σχ. 2Β και C). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε με ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη LNCaP (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτή η επίδραση της IL-4 δεν είναι μοναδική σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, δεδομένου ότι παρατηρήθηκε επίσης Ρ19 ποντικού τερατοκαρκινώματος κύτταρα (Σχ. 2D).

Πίνακας Α, IL-4 ανοσοαντιδραστικότητα υποδοχέα σε ένα δείγμα ιστού όγκου προστάτη ( Gleason σκοράρει 8). Η γραμμή στο κάτω αριστερό μέρος της εικόνας αντιπροσωπεύει 100 μm. Πλαίσια Β-D, αποτέλεσμα της IL-4 από τη δραστικότητα της ανθρώπινης FAAH PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα (Β)? αρουραίος R3327 ΑΤ-1 καρκίνου του προστάτη κύτταρα (C) και κύτταρα Ρ19 ποντικού τερατοκαρκινώματος (D). Οι κυτταρικές σειρές επωάστηκαν για 24 ώρες με 5 ng /ml IL-4 και η δραστικότητα FAAH στο κελί ομογενοποιήματα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας 2 μΜ [

3Η] ανανδαμιδίου ως υπόστρωμα. Η ενζυμική δραστικότητα σε όλες τις περιπτώσεις ήταν μπλοκαρισμένη από την επιλεκτική URB597 αναστολέα FAAH. Τα δεδομένα είναι μέσα και S.E.M., η = 4-5? * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, paired t-test. Στο Πάνελ (Ε) και (F) κύτταρα PC-3 και LNCaP επωάστηκαν με IL-4 (5 ng /ml) για 24 ώρες. Εκχύλιση του RNA, σύνθεση cDNA και PCR ανάλυση διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο τμήμα «Μέθοδοι». Πάνελ Ε Ημι-ποσοτική ανάλυση PCR της έκφρασης FAAH mRNA σε PC-3 και LNCaP κύτταρα. Η έκφραση του mRNA του FAAH κανονικοποιήθηκε έναντι GAPDH. Η ημι-ποσοτική ανάλυση PCR χρησιμοποιώντας ομαδοποιημένα δείγματα (n = 6). Πίνακας F. ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση της έκφρασης FAAH mRNA, κανονικοποιημένη έναντι GAPDH. Τα ποσοτικά δεδομένα PCR απεικονίστηκαν ως μέσα (n = 6) και SEM, όπου η ομάδα ελέγχου χωρίς αγωγή σημαίνει ορίζεται ως 100%.

Η

Σε επόμενα πειράματα, τα αποτελέσματα της IL-4 θεραπεία κατά της πρωτεΐνης FAAH και mRNA αξιολογήθηκαν. Θεραπεία της PC-3 και LNCaP κύτταρα με IL-4 για 24 ώρες δεν ρυθμίζουν την έκφραση του mRNA του FAAH, όπως αξιολογήθηκε με δύο ημι-ποσοτική PCR και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Σχήμα 2Ε, 2F). Σε ένα επιπρόσθετο πείραμα, κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-4 (5 ng /ml) για 3 ώρες, για να μελετήσει το δυνατόν πρώιμη ρύθμιση της έκφρασης FAAH. Παρόμοια με το πείραμα 24 h, ωστόσο, η θεραπεία της PC-3 κυττάρων με IL-4 για 3 ώρες δεν ρυθμίζουν την έκφραση του mRNA του FAAH (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση με την κατάσταση για κύτταρα Jurkat και Τ-λεμφοκύτταρα, η έκφραση του CB

1 σε κύτταρα LNCaP δεν ρυθμιζόταν από την IL-4: η σχετική έκφραση του CB

1 /GAPDH (% του μη επεξεργασμένου ελέγχου, μέσα ± sem, η = 6) μετά από 24 ώρες θεραπείας είτε με όχημα ή IL-4 ήταν 100 ± 33 και 109 ± 20, αντίστοιχα. Τα PC-3 κύτταρα που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο μας δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα του CB

1 mRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Προκαταρκτική κηλίδες Western αναλύσεις έγιναν επίσης και με τη χρήση κυτταρολυμάτων από κύτταρα PC3 θεραπεία για 24 ώρες με είτε όχημα ή 5 ng /ml IL-4.