Αφηρημένο

καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο (TCC) της ουροδόχου κύστης είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου του ουροποιητικού συστήματος. Οι περισσότερες από τις περιπτώσεις TCC είναι του επιφανειακού τύπου και αντιμετωπίζονται με διουρηθρική εκτομή (TUR). Ωστόσο, το ποσοστό υποτροπής είναι υψηλό και οι τρέχουσες θεραπείες έχουν το μειονέκτημα του να επάγει ισχυρή συστημική τοξικότητα ή να προκαλέσει επώδυνες κυστίτιδα. Ως εκ τούτου, θα ήταν να έχει θεραπευτική αξία για την ανάπτυξη νέων ιδεών και την ταυτοποίηση νέων φαρμάκων για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Ki-67 είναι ένα μεγάλο πυρηνισκικός φωσφοπρωτεϊνη των οποίων η έκφραση είναι στενά συνδεδεμένη με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και η κουρκουμίνη, ένα φυτοχημικό που προέρχεται από το ρίζωμα

Curcuma longa,

έχει αποδειχθεί ότι διαθέτει ισχυρές αντικαρκινικές ιδιότητες. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την συνδυασμένη αποτελεσματικότητα της κουρκουμίνης και siRNA κατά Ki 67-mRNA (Ki-67-7) σε αρουραίους (ΑΥ-27) και ανθρώπου (Τ-24) καρκινικών κυττάρων κύστης. Οι αντικαρκινικές επιδράσεις αξιολογήθηκαν από τον προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων, την απόπτωση και την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Ki-67-7 (10 nM) και η κουρκουμίνη (10 μΜ), όταν αντιμετωπίζονται ξεχωριστά, ήταν μετρίως αποτελεσματικά. Ωστόσο, σε συνδυασμένη παρουσία τους, τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης ήταν βαθιά (& gt? 85%) αναστέλλεται? ο ρυθμός της απόπτωσης στη συνδυασμένη παρουσία της κουρκουμίνης και Ki-67-7 (36%) ήταν μεγαλύτερη από ότι λόγω της Ki-67-7 (14%) ή κουρκουμίνη (13%) μόνο. Παρατηρήθηκε επίσης Μια παρόμοια συνέργεια μεταξύ κουρκουμίνης και Ki-67-7 στην επαγωγή διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Η ανάλυση στυπώματος Western πρότεινε ότι προκατεργασία με Ki-67-7 ευαισθητοποιημένα καρκινικών κυττάρων κύστης για να κουρκουμίνη απόπτωση που διαμεσολαβείται και κύκλου κυττάρου από ρ53- και p21-ανεξάρτητων μηχανισμών. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο συνδυασμός των αντι-Ki-67 siRNA και η κουρκουμίνη θα μπορούσε να είναι μια βιώσιμη θεραπεία κατά της διάδοσης των καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Pichu S, Krishnamoorthy S, Shishkov Α, Zhang Β, McCue P , Knockdown του Ki-67 από τα κύτταρα Dicer-υποστρώματος μικρό παρεμβαλλόμενο RNA ευαισθητοποιεί καρκίνο της ουροδόχου κύστης σε κουρκουμίνη-Induced όγκου Αναστολή Ponnappa π.Χ. (2012). PLoS ONE 7 (11): e48567. doi: 10.1371 /journal.pone.0048567

Επιμέλεια: Bharat Β Aggarwal, το Πανεπιστήμιο του Τέξας Μ D. Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Αυγούστου, 2012? Αποδεκτές: 28 Σεπτέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 12 Νοέμβρη, 2012

Copyright: © 2012 Πίτσου et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας επιχορήγησης AA016551. Ο οργανισμός χρηματοδότησης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και την ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η πιο συχνή ουρολογική καρκίνου σε. τη Νοτιοανατολική Ασία και η δεύτερη πιο συχνή ουρολογική κακοήθεια στη Βόρεια Αμερική [1]. Μεταβατική καρκίνωμα (TCC) αντιπροσωπεύει περισσότερο από το 90% των ασθενών που διαγιγνώσκονται με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [2]. Μεγαλύτερη από το 70% των όγκων TCC είναι επιφανειακών όγκων περιορίζονται σε βλεννογόνο ουροδόχου κύστης και έλασμα propia -ΤΑ ή Τ1 στημένες όγκους και τα υπόλοιπα είναι του τύπου επεμβατική. Η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου ουροδόχου κύστης έχει αυξηθεί συνεχώς κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες [3]. Μία προτιμώμενη θεραπεία για επιφανειακές όγκων είναι διουρηθρική εκτομή (TUR), αλλά ο κίνδυνος υποτροπής (60-70%), λόγω της επανασύνδεσης των απελευθερωμένων κυττάρων όγκου και του θανάτου από την ασθένεια (10-30%) είναι υψηλή [4]. Η κύρια προσέγγιση για την πρόληψη της υποτροπής του όγκου, μετά την TUR, υπήρξε ενδοκυστική θεραπεία ενστάλαξης (IVI) με τη χρήση χημειοθεραπευτικών φαρμάκων [5], [6], αλλά οι κυτταροτοξικές επιδράσεις των φαρμάκων είναι ανησυχητική. Λόγω της υψηλότερης αποτελεσματικότητας του, ενδοκυστική ανοσοθεραπεία χρησιμοποιώντας το

Bacillus Calmette Guerin

(BCG) έχει γίνει η θεραπεία επιλογής κατά τη διάρκεια των τριών τελευταίων δεκαετιών. Ωστόσο, η επαγωγή της κυστίτιδας και συστηματικής τοξικότητας είναι μερικές από σοβαρές παρενέργειες του [2]. Παρά τις επιθετικές θεραπείες, οι ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης έχουν ένα ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μόνο περίπου 50% [7]. Περαιτέρω, ουσιαστικός αριθμός των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι ανθεκτικά στη συμβατική θεραπεία ενδοκυστική και ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να αναπτυχθούν νεότερα και κατά προτίμηση λιγότερο τοξικά προσεγγίσεις για την καταπολέμηση της ασθένειας.

Ένα από τα νεότερα προσεγγίσεων για την καταστολή της εξέλιξης του όγκου είναι με την χρησιμοποιώντας γονίδιο-ειδικά φάρμακα όπως, αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια (AsODNs) ή μικρά RNAs παρεμβολής (siRNAs) έναντι mRNAs του όγκου-ειδικών πρωτεϊνών. Μετά την ανακάλυψη της παρεμβολής RNA (RNAi) σε μία ποικιλία ειδών [8] – [10], υπήρξε μια τεράστια ενδιαφέρον για την παραγωγή του θεραπευτικού δυναμικού των siRNAs στην θεραπεία διαφόρων ασθενειών [11], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [12] και φλεγμονωδών ασθενειών [13]. Ki-67 είναι ένα μεγάλο πυρηνισκικός φωσφοπρωτεϊνη των οποίων η έκφραση είναι στενά συνδεδεμένη με τον κυτταρικό κύκλο και είναι αυστηρά σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [14]. Είναι ένα δέσμευσης DNA-πρωτεΐνης με ένα πρωταρχικό ρόλο στη διατήρηση της υψηλότερης τάξης για το DNA κατά τη διαδικασία της μίτωσης. Λεπτομερής ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι το αντιγόνο Ki-67 είναι παρόν σε πυρήνες του πολλαπλασιασμού (G1-, S-, G2- φάση και μίτωση), όχι όμως στους πυρήνες των ηρεμίας ή ηρεμίας κύτταρα (G0- φάση) [15]. Αυτό υποδηλώνει ότι οι αναστολείς Ki-67 μπορεί να έχουν σχετική ειδικότητα για κακοήθη κύτταρα. Yoa et al., [16] ανέφεραν ότι μεταξύ πολλών από τα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο που εξετάστηκαν, ότι του Ki-67 έκφραση ήταν ένα από τα υψηλότερα σε όγκους της ουροδόχου κύστης αρουραίου, φθάνοντας σχεδόν 20 φορές υψηλότερα επίπεδα σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό. Έτσι, Ki-67 υπήρξε ένα από τα γονίδια που ενδιαφέρουν να στοχεύουν, χρησιμοποιώντας AsODNs [17], [18] ή siRNAs [19], [20]. Σε πιο πρόσφατη έκθεση, AsODN έναντι Ki-67 χρησιμοποιήθηκε σε κλινικές δοκιμές Φάσης Ι για την θεραπεία του καρκίνου ανθρώπινης κύστης [21]. Παρά το γεγονός ότι, η αποτελεσματικότητα του AsODNs αποδεικνύουν την απόδειξη της αρχής, είναι γνωστό ότι τα siRNA είναι τουλάχιστον μία τάξη μεγέθους πιο ευαίσθητη από AsODNs [22], [23] και ως εκ τούτου, πολύ χαμηλότερο ποσό του φαρμάκου πρέπει να χρησιμοποιηθούν για παρόμοια αποτελεσματικότητα. Περαιτέρω, έχει δειχθεί ότι οι πλέον (27 bp) siRNAs Dicer-υπόστρωμα (DsiRNAs) είναι πιο ευαίσθητη από τις τυποποιημένες 19-21 siRNAs bp [24]. Έτσι, siRNAs /DsiRNAs παρέχουν ένα καλύτερο εργαλείο από AsDONs να στοχεύσουν τα γονίδια όγκου-ειδικά.

Εκτός από τα αντιπληροφοριακά μόρια, τα τελευταία χρόνια, τα φάρμακα φυτικής προέλευσης έχουν επίσης λάβει μεγάλη προσοχή λόγω των τεράστιων δυνατοτήτων τους σε η πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου [25]. Η κουρκουμίνη είναι ένα φυτοχημικό πολυφαινολικών που προέρχεται από το ρίζωμα,

Curcuma longa

. Λόγω των ισχυρών αντι-πολλαπλασιαστική και αντι-φλεγμονώδεις επιδράσεις, συνέταξε μια πολλή προσοχή από τους ερευνητές στον τομέα του καρκίνου. Μέχρι σήμερα, υπάρχουν περισσότερα από 70 κλινικές δοκιμές σε διάφορα στάδια ολοκλήρωσης, δοκιμάζοντας την αποτελεσματικότητα της κουρκουμίνης έναντι πολλών ασθενειών (www.clinicaltrials.gov). Ο ρόλος της κουρκουμίνης στη σύγχρονη ιατρική έχει πρόσφατα αναθεωρηθεί [26] – [28]. Η αντικαρκινική δυναμικό της κουρκουμίνης προέρχεται από την ικανότητά της να καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό μιας ευρείας ποικιλίας κυττάρων όγκου, με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων πολλαπλασιαζόμενων όπως COX2, ΜΜΡ-9, χημειοκίνες, κυκλίνη D1 και τον πυρηνικό παράγοντα κΒ (ΝΡ κΒ) [29]. Tharakan et al., [30] χρησιμοποιώντας ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης, ανέφεραν ότι η κουρκουμίνη κατάργησε την συστατική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ στον ιστό του όγκου, που προκαλείται από απόπτωση και μειωμένη έκφραση COX-2. Ωστόσο, με την παρουσία του χημειοθεραπευτικού φαρμάκου, γεμσιταβίνη, χαμηλές συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης ενισχύει τις επιδράσεις του φαρμάκου μέσω της ρύθμισης του μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ [31]. Αυτές οι παρατηρήσεις καταδεικνύουν σαφώς το θεραπευτικό δυναμικό της κουρκουμίνης στη θεραπεία του καρκίνου.

Δεδομένου ότι η κουρκουμίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων με τη στόχευση πολλαπλές θέσεις στις οδούς αποπτωτικών και του πολλαπλασιασμού, υποθέσαμε ότι υπέρθεση του πολυ-στοχευμένη κουρκουμίνη ακόλουθους μοριακούς αναστολή της Ki-67, θα έχουν μεγαλύτερη ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου. Πράγματι, τα στοιχεία δείχνουν μας, για πρώτη φορά, ότι προκατεργασία καρκινικών κυττάρων κύστης με DsiRNA κατά Ki 67-mRNA προάγει τη σύλληψη κυτταρικού κύκλου και ευαισθητοποιεί τα κύτταρα προς κουρκουμίνη επαγόμενη απόπτωση. Οι υποθετικές μοριακούς στόχους της κουρκουμίνης και Ki-67 DsiRNA συζητηθεί.

Υλικά και Μέθοδοι

siRNA Σχεδιασμός

Ένα σύνολο από τρεις μεζονέτες DsiRNA στοχεύουν εναντίον αρουραίου mRNA Ki-67 σχεδιάστηκαν (Ενσωματωμένη τεχνολογία DNA, Coralville, IA, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Οι αλληλουχίες των τριών DsiRNAs έχουν ως εξής? 1) Ki-67 -2? νοηματική αλληλουχία 5 ‘- CGA ACA AAG UCA UCA GAC ACA GUG Α-3′? αντιπληροφοριακό αλληλουχία 5’-UCA CUG UGU CUG Αύγουστο ACU UUG UUC Ουυ-3 ‘? 2) Ki-67-7? νοηματική αλληλουχία 5 ‘- CAA GAG UGA GGG AGU GCC UUU GAA G-3’? αντιπληροφοριακό αλληλουχία 5 ‘- CUU ΥΠΑ ΑΓΓ CAC UCC CUC ACU CUU Ουυ -3′ και 3) Ki-67-9? νοηματική αλληλουχία 5’-CCA CCA GAG CCA AUA GAU ACU UCA G-3 ‘και την ακολουθία αντίθετης φοράς 5′-CUG Α.Ε.Ε. υΑυ CUA UUG ΕΕΜ CUG GUG GUG-3’. Ένα άσχετο DsiRNA, εφεξής ως «έλεγχος» DsiRNA σχεδιάστηκε και έχει παρακάτω ακολουθία? νοηματική αλληλουχία 5′-CAA GAG UGA GGG AGU GCC UUU GAA G-3 ‘? αντιπληροφοριακό αλληλουχία 5 ‘- CUU ΥΠΑ ΑΓΓ CAC CGG AUC ACU CUU Ουυ-3’. Παρά το γεγονός ότι η συντομογραφία «DsiRNA» χρησιμοποιείται αρχικά για να τονίσει το γεγονός ότι οι πλέον siRNAs χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, ο γενικός όρος «siRNA» χρησιμοποιείται εναλλακτικά σε ολόκληρο το κείμενο.

Cell Culture

Μεταμοσχεύσιμα αρουραίου προερχόμενα κύτταρα TCC (ΑΥ-27 κύτταρα) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. Ronal Moore (University of Alberta, Canada). Ο χαρακτηρισμός ενός μοντέλου όγκου της ουροδόχου κύστης χρήση αυτής της μεταφυτεύσιμων κυτταρική σειρά έχει αναφερθεί [32]. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μονοστιβάδες, σε μέσο καλλιέργειας αποτελούμενο από RPMI-1640 (Gibco-BRL), συμπληρωμένο με 10% FBS, 30 mM HEPES (ρΗ 7,3), 1 mM πυροσταφυλικού, πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη και 2,0 g /l του NaHCO

3. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε

2 και 95% ατμόσφαιρα αέρα 5% CO με τη μέθοδο του Xiao

κ.ά.

[32]. AY-27 κύτταρα πέρασαν, όταν συρρέουν από το πρότυπο θρυψινοποίηση και τη διαδικασία επανακαλλιέργεια. Όπου ενδείκνυται, για συγκριτικούς σκοπούς, προερχόμενα από άνθρωπο Τ-24 κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως (American Type Culture Collection) χρησιμοποιήθηκαν επίσης στη μελέτη αυτή και διατηρήθηκαν σε ιστοκαλλιέργεια όπως περιγράφεται για ΑΥ-27 κύτταρα.

siRNA Επιμόλυνση

Την ημέρα πριν την επιμόλυνση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, αραιώνονται με φρέσκο ​​μέσο και μεταφέρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων (0.8-1.0 × 10

5cells /φρεάτιο). DsiRNAs επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο σχεδιαστεί ειδικά για siRNA διαμόλυνσης (Lipofectamine ™ RNAiMax) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen, USA). Συνήθως, η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε στους 8-10% συρροή κυττάρων.

Η κουρκουμίνη Θεραπεία

Όταν ενδείκνυται, τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης (Sigma-Aldrich, USA), είτε μόνο του ή σε συνδυασμό με DsiRNA. Η κουρκουμίνη διαλύθηκε σε DMSO, και σε κάθε δεδομένη πείραμα, η τελική συγκέντρωση του DMSO ήταν πάντα μικρότερη από 0,1% κατ ‘όγκο.

κυτταρική ανάπτυξη Curve

Για την αξιολόγηση πολλαπλασιασμού των όγκων, αξιολογήθηκε η ανάπτυξη του όγκου με μέτρηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων σε διάφορα στάδια. Σε κάθε στάδιο, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με τρυψινοποίηση, πλύθηκαν με PBS, χρωματίστηκαν με trypan blue και τα ζωντανά κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο. Κάθε πειραματική συνθήκη επαναλήφθηκε τρεις έως έξι φορές.

ΜΤΤ Δοκιμασία

Τα αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα του siRNA κατά Ki-67 με την παρουσία ή απουσία της κουρκουμίνης προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Η δοκιμασία βασίζεται στην ικανότητα των μιτοχονδρίων να μειώσει 3- (4, 5 dimethylthiaol-2-υλ) -2, 5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ) βαφή σε αρουραίους (ΑΥ-27) και ανθρώπου (Τ-24) καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυττάρων, όπως περιγράφεται από Plumb [33]. Εν συντομία, μετά την έκθεση των κυττάρων σε διάφορες συνθήκες θεραπείας, το μέσο απομακρύνθηκε, ξεπλύθηκε με PBS, και διάλυμα ΜΤΤ (5 mg /ml σε μέσο RPMI) προστέθηκε και επωάστηκε για 37 ° C για 3 ώρες. Ακολούθως, το μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με ένα οξύ-ισοπροπανόλη διαλύτη για να διαλυθεί το ίζημα. Τα περιεχόμενα τοποθετήθηκαν σε συσκευή ανακίνησης για 5 λεπτά και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR)

Μετά την επιμόλυνση με siRNAs ή /και κατεργασία με κουρκουμίνη, κύτταρα ήταν συγκομίζονται στο κατάλληλο διάστημα και το ολικό RNA παρασκευάστηκε με PureLink RNA μίνι κιτ (Invitrogen, USA). Για τη σύνθεση cDNA, 1 μ§ ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA σε 20 μΐ χρησιμοποιώντας αντιδράσεις Quantitect αντίστροφη μεταγραφή kit (Invitrogen, USA). qPCR διεξήχθη με το Φως σύστημα ανίχνευσης cycler® 480 (Roche, USA) χρησιμοποιώντας το Brilliant® SYBR® Πράσινη QPCR πρωτόκολλο κύριο μίγμα (Stratagene, USA). Εν συντομία, 2 μΙ cDNA ενισχύθηκε με PCR σε 25 μΙ αντιδράσεις που περιέχουν 12,5 μΐ 2 χ SYBR πράσινο αντιδραστήρια και 0,2 μΜ από κάθε ένα από τα αρχικά τεμάχια. Η αρχική επώαση για 10 λεπτά στους 95 ° C ακολουθήθηκε από 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 1 λεπτό. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν

Ki-67 Protein Expression:. Ανοσοφθορισμός χρώσης

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες 25 mm σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά την έκθεση σε siRNA ή /και η κουρκουμίνη κάτω από διάφορες συνθήκες, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με Ki-67 πρωτογενές αντίσωμα (Μ19, Santa Cruz Biotechnology Inc.,) (1:100) για 3 ώρες και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Οι καλυπτρίδες ακολούθως επωάζονται με FITC-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα (1:400) στο σκοτάδι για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν με PBS και χρωματίστηκαν για 10 λεπτά με διάλυμα ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ). Οι καλυπτρίδες στη συνέχεια πλένονται με PBS και τοποθετείται σε μια διαφάνεια με την παρουσία του μέσου στερέωσης (διάλυμα αντιξεθωριάσματος, Invitrogen, USA). Οι πλάκες στη συνέχεια προβάλλονται με σύστημα Bio Rad Radiance 2001 σε συνδυασμό με ένα μικροσκόπιο Olympus IX70 με 60 × 40 × στόχους βύθισης πετρελαίου (UAp0340, NA 1.35). Μια διπλή γραμμή Kr /Ar πηγή λέιζερ ιόντων χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση με τις ρυθμίσεις διέγερσης 488 nm για FITC και 588 nm για PI.

Ανίχνευση απόπτωσης με Annexin V Δοκιμασία

Η απόπτωση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας PE αννεξίνης V Apoptosis Detection Kit Ι (BD Biosciences, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, μετά από έκθεση σε siRNA με ή με έξω κουρκουμίνη, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης που ακολουθείται από την προσθήκη ΡΕ αννεξίνης V και 7-αμινο-Acitomycin (7-AAD) και αναλύθηκαν σε Epics της Beckman Coulter XL-MCL ™ κυτταρομετρητή ροής, (ΗΠΑ). Συνήθως, ο μέσος φθορισμός που προέρχεται από 20.000 μετρήσεις κυττάρων ανά δείγμα καταγράφηκε.

Κυτταρικού Κύκλου Ανάλυση

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της αντι Ki-67 DsiRNA ή /και η κουρκουμίνη για τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, ΑΥ-27 κύτταρα εξετέθησαν σε διάφορες πειραματικές συνθήκες, αφαιρούνται τα μέσα και τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με τρυψινοποίηση. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε παγωμένο 70% αιθανόλης για 2 ώρες στους -20 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά με PBS, επαναιωρήθηκαν σε 300 μΐ ενός παγωμένου τροποποιημένο διάλυμα ΡΙ (διάλυμα 50 μg /ml ΡΙ, 0.1% Triton Χ-100, και 0,1% κιτρικό νάτριο, σε PBS) και επωάστηκαν για 30 λεπτά πριν από την ανάλυση. ΡΙ φθορισμός μετρήθηκε με της Beckman Coulter Epics XL-MCL ™ κυτταρομετρητή ροής, (ΗΠΑ). Συνήθως, ο μέσος φθορισμός που προέρχεται από 20.000 μετρήσεις κυττάρων ανά δείγμα καταγράφηκε. Τα κύτταρα βαθμολογήθηκαν ως ποσοστό των κυττάρων σε κάθε μία από τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου (G

o /G

1, S και G2 /M).

Ανάλυση Western Blot

ουροδόχου κύστης καρκινικά κύτταρα, μετά από έκθεση σε κουρκουμίνη και DsiRNA κάτω από διάφορες συνθήκες, θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Sigma- Cat # R0278). Τα προϊόντα λύσης διατηρήθηκαν επί πάγου για 20 λεπτά, στροβιλίστηκαν 3-4 φορές, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε σε μικροφυγόκεντρο σε 12,000 rpm για 15 λεπτά στους 0-4 ° C. Τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν και προσδιορίστηκαν ως προς την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες. Κλάσματα (40 μg) της πρωτεΐνης από κάθε δείγμα διαλύθηκαν σε 4 Χ NuPage λίθιο-δωδεκυλ θειικό (LDS) και υποβλήθηκε σε SDS-PAGE υπό αναγωγικές συνθήκες. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και αποκλείστηκε σε είτε 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) ή 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.1% Tween-20 (TBST) με τυποποιημένες διαδικασίες. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα πρωτογενή αντισώματα εναντίον αντιγόνων εξής: β-ακτίνη, κυκλίνη Ε και ρ53 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). Άλλα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κατά διασπασμένης Caspase3, φωσφορυλιωμένη-RB (pRb-P) (Cell Signaling Technology, Inc, Danvers, ΜΑ), κυκλίνη D1, (BD Bioscience, San Jose, CA), Κί-67, ΝΡ-κΒ (ρ65 υπομονάδα), ρ27 /Kip και p21 (Abcam, Cambridge, ΜΑ). Οι κηλίδες στη συνέχεια πλύθηκαν εκτεταμένα με ΤΒδ-Τ και επωάστηκαν με κατάλληλη υπεροξειδάση αρμορακίας-συζευγμένο αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) δευτερογενή αντισώματα σε αραιώσεις 1:15,000 και 1:20,000 αντίστοιχα για 2 h σε RT, πριν την τελική πλύση με TBST. Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας σύστημα SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας Υπόστρωμα (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Η KODAK Image Station 440CF (Kodak Scientific Imaging Systems, New Haven, CT) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση και την ποσοτικοποίηση της καθαρής ένταση του σήματος των ζωνών. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες φαίνονται.

Protein Assay

περιεκτικότητα πρωτεΐνης στα κυτταρολύματα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Micro BCA ™ (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού ως το εσωτερικό πρότυπο.

Στατιστική Ανάλυση

Όπου ενδείκνυται, οι τιμές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SE των (n) προσδιορισμούς. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε στατιστική ανάλυση με το t-test σε συνδυασμό μαθητή χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Microsoft Excel και τις τιμές με P & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Η αναστολή της Ki-67 Gene έκφρασης και κυτταρικού πολλαπλασιασμού από DsiRNA

Το

in vitro

απόδοση των τριών DsiRNA κατασκευάζει στοχευμένες αρουραίου Ki-67 mRNA ελέγχθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω στο AY-27 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, από τις τρεις DsiRNAs (Ki-67-2, -7, -9), Ki-67-7 έδειξαν μέγιστη αναστολή. Η έκφραση mRNA, αναλύθηκαν με qPCR, έδειξε μια 39%, 50% και 28% μείωση στην έκφραση του Ki 67-mRNA με Ki-67-2, 67-7-Ki και Ki-67-9 αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα υποβάλλεται σε επεξεργασία με αντιδραστήριο επιμόλυνσης μόνο. Παρομοίως, προσδιορισμός κυτταρικής βιωσιμότητας με ΜΤΤ έδειξαν ότι η θεραπεία Ki-67-7 ήταν η πιο αποτελεσματική από τις τρεις (Εικ. 1Β). Έτσι, Ki-67-7 επιλέχθηκε ως το πιο αποτελεσματικό DsiRNA κατά Ki-67 mRNA για τις επόμενες μελέτες. Περαιτέρω, μελέτες δόσης-απόκρισης έδειξαν ότι Ki-67-7 ήταν πιο αποτελεσματικό σε συγκέντρωση 10 ηΜ (1γ). Κάτω από τις πειραματικές μας συνθήκες, μια περαιτέρω αύξηση στη συγκέντρωση Ki-67 – 7 δεν ενίσχυσε την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του siRNA.

× 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Μετά από 24 ώρες, αυτά επιμολύνθηκαν με κάθε ένα από τα κατασκευάσματα siRNA (Ki-67-2, 67-7-Ki και Ki-67-9) που στοχεύουν ενάντια Ki-67 mRNA. Μετά από 48 ώρες, το RNA εκχυλίζεται και τα επίπεδα του mRNA προσδιορίσθηκαν με ποσοτική PCR όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Κύτταρα κατεργασμένα με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης μόνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Το ποσοστό της έκφρασης του Ki-67 mRNA κανονικοποιήθηκε με την έκφραση της β-ακτίνης. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τα δεδομένα από μία (από δύο) πείραμα χρησιμοποιώντας το μέσο όρο τριπλών προσδιορισμών. β) ΑΥ-27 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 12-φρεατίων (0,8 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) πλακών για 24 ώρες και επιμολύνθηκαν με διάφορες siRNA κατασκευές όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με δοκιμασία ΜΤΤ. Κύτταρα κατεργασμένα με αντιδραστήριο διαμόλυνσης μόνος χρησίμευσε ως μάρτυρας (= 100%). Μπάρες δείχνουν τιμές οι οποίες είναι τα μέσα ± S.E τριών προσδιορισμών. (

* P & lt? 0,05). γ) ΑΥ-27 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 12 φρεατίων (0.8 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA, η επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων Ki-67-7 στη βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Κύτταρα κατεργασμένα με αντιδραστήριο διαμόλυνσης μόνος χρησίμευσε ως μάρτυρας. Οι τιμές βιωσιμότητας των κυττάρων εκφράζεται ως ποσοστό ελέγχου και τα μέσα ± SE 3-8 προσδιορισμών (

* P & lt? 0,05,

*** P & lt? 0.005).

Η

Επίδραση της Η κουρκουμίνη σε όγκων Πολλαπλασιασμός: Συνέργεια με Ki-67-7

Τα αποτελέσματα της κουρκουμίνης και Ki-67-7 ελέγχθηκαν τόσο σε ανθρώπινο παράγοντα (T-24) και αρουραίου που προέρχονται από (ΑΥ-27) της ουροδόχου κύστης τα καρκινικά κύτταρα. Συγκρίσεις αλληλουχίας έδειξε ότι υπήρχε 80% ομολογία στην αλληλουχία στόχο του Ki-67-7 μεταξύ αρουραίου και ανθρώπου Ki-67 mRNA. Σε μελέτες δόσης-απόκρισης, παρατηρήσαμε ότι η ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου ανεστάλη με κουρκουμίνη με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2Α και 2Β) στους δύο τύπους κυττάρων αλλά T 24-κύτταρα ήταν πιο ευαίσθητα σε κουρκουμίνη από ΑΥ-27 κύτταρα σε 20 μΜ και παραπάνω. Ωστόσο, στο 10 μ Μ, ο βαθμός αναστολής (25-30%) ήταν παρόμοια σε δύο τύπους κυττάρων. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, παρατηρήθηκε μία δραστική μείωση (60-85%) σε βιωσιμότητα των κυττάρων μεταξύ 10 και 20 μΜ κουρκουμίνη. Ωστόσο, για σκοπούς συγκρίσεως των συνδυαστικών αποτελεσμάτων της DsiRNA και κουρκουμίνη (CusiRNA), η χαμηλότερη δόση (10 μΜ) της κουρκουμίνης χρησιμοποιήθηκε μαζί με τη βέλτιστη δόση (10 ηΜ) της DsiRNA (Ki-67-7). Δεδομένα έδειξε σχεδόν πλήρη (85%) αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων κατά τη διάρκεια της συνδυασμένης θεραπείας της κουρκουμίνης και DsiRNA (Σχ. 3Α και 3Β). Έλεγχος siRNA είχε αμελητέα επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων υποδηλώνοντας την εξειδίκευση του Ki-67-7 έναντι του στόχου.

T-24 (2α) και ΑΥ-27 (2β) κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων (0,8 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες (40-50% συρροή) όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Μετά την έκθεση σε διάφορες συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης για 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες σε κουρκουμίνη μέσο ελεύθερο. Τα κύτταρα επωάστηκαν με DMSO (0,1%) και μόνο υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ως μάρτυρες. DMSO μόνο είχε μικρή επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με βάση τη βιωσιμότητα των κυττάρων, μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως επί τοις εκατό βιωσιμότητας που παρατηρήθηκε σε κύτταρα μάρτυρες DMSO-θεραπεία. Οι τιμές είναι από ένα αντιπροσωπευτικό (δύο) (2α) ή 3-8 (μέση τιμή ± S.E) προσδιορισμούς (2β).

* P & lt? 0,05,

** P & lt? 0,01,

*** P & lt?. 0.005

Η

Ίδιος αριθμός (0,8 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα Τ-24 (3α) και ΑΥ-27 (3b) καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται στις μεθόδους είτε επιμολύνθηκαν με Ki-67 με 7 ή ελέγχου DsiRNA (10 ηΜ) ή κατεργασία με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης μόνος για 24 ώρες. Στη συνέχεια, όπου ενδείκνυται, κουρκουμίνη (10 μΜ) προστέθηκε στα κύτταρα και επωάστηκαν για 24 ώρες ακολουθούμενη από μία επιπλέον επώαση 24 ώρες απουσία της κουρκουμίνης. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ στο τέλος του 72 h από την επιμόλυνση. Κύτταρα κατεργασμένα με DMSO συν μετεμβολιασμού αντιδραστήριο χρησίμευσε ως μάρτυρας. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± S.E 3-5 προσδιορισμών (

* P & lt? 0,05,

** P & lt? 0,01). 3γ) ΑΥ-27 κύτταρα (0,8 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ακριβώς όπως περιγράφεται παραπάνω στη λεζάντα στα Σχήματα 3Α και 3Β και στο τέλος του 24, 48 και 72 ώρες μετά τη θεραπεία κουρκουμίνη (η οποία είναι ίδια με 48, 72 και 96 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA), την ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε με βάση τους αριθμούς των κυττάρων, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± S.E τριών προσδιορισμών.

Η

Η αντιπολλαπλασιαστική επίδραση προσδιορίστηκε επίσης με παρακολούθηση της καμπύλης ανάπτυξης των κυττάρων. Οι καμπύλες ανάπτυξης με βάση τους αριθμούς των κυττάρων προσδιορίστηκαν σε 24, 48 και 72 ώρες μετά την DsiRNA και θεραπεία κουρκουμίνη. Συνδυασμένη θεραπεία (CusiRNA) είχε ως αποτέλεσμα μια αξιοσημείωτη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και μιμήθηκε την ίδια τάση με εκείνη των μελετών κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχ. 3C). Τα κυτταρικά τιμές πρωτεΐνη συσχετίζεται επίσης καλώς με καμπύλες ανάπτυξης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Επιδράσεις της Ki-67 – 7 και Κουρκουμίνη επί Ki 67-mRNA και Protein Expression

Για να προσδιοριστεί αν η μείωση σε βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της θεραπείας CusiRNA σχετιζόταν με τα επίπεδα Ki-67 πρωτεΐνη, μετρήσαμε τα επίπεδα τόσο Ki 67-mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης. μειώσεις δεδομένα δείχνουν στα επίπεδα του Ki 67-mRNA κατά 17%, 37% και 57% όταν εκτίθενται σε κουρκουμίνη, Ki-67-7 και CusiRNA αντίστοιχα (Σχ. 4Α). Ομοίως, χρησιμοποιώντας την τεχνική χρώση ανοσοφθορισμού, παρατηρήσαμε ότι σε αντίθεση με Ki-67-7, κουρκουμίνη

per se

είχαν ελάχιστες επιπτώσεις στο Ki-67, η έκφραση της πρωτεΐνης (Εικ. 4Β).

α) AY -27 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ki-67 siRNA σε παρουσία ή απουσία της κουρκουμίνης ακριβώς όπως περιγράφεται στο υπόμνημα με τα Σχήματα 3Α και 3Β. Στο τέλος της θεραπείας, RNA εκχυλίστηκε και Ki-67 mRNA έκφραση προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας β-ακτίνης ως εσωτερικό πρότυπο, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα επίπεδα Ki-67 mRNA που εκφράζεται ως επί τοις εκατό του ρυθμού έκφρασης σε κύτταρα, τα οποία υποβλήθηκαν σε αγωγή με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης και DMSO. Μπάρες δείχνουν αξίες που είναι η μέση τιμή ± S.E τριών προσδιορισμών. β) ΑΥ-27 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες τοποθετούνται μέσα πλάκες 12-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με siRNA (Ki-67-7), η κουρκουμίνη ή ως συνδυασμός, όπως περιγράφεται στη λεζάντα με τα Σχήματα 3Α και 3Β. Στο τέλος της περιόδου θεραπείας, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε Κί67 πρωτογενές αντίσωμα (Μ19) και ΡΙΤΟ-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα που ακολουθείται από ΡΙ (ιωδιούχο προπίδιο), και παρατηρήθηκαν κάτω συνεστιακή μικροσκοπία όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. μπαρ κλίμακα εισάγει = 5 μm. Αυξημένη κάτω ρύθμιση του Ki-67 πρωτεΐνη λόγω Ki-67-7 παρατηρήθηκε.

Η

επαγωγή της απόπτωσης από Ki-67-7 και κουρκουμίνη

Απώλεια

της βιωσιμότητας των κυττάρων είναι συχνά το αποτέλεσμα της απόπτωσης ή νέκρωσης. Η έκταση της απόπτωσης, μια πρώιμη ένδειξη του κυτταρικού θανάτου, ποσοστώθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη V για να ανιχνεύσει τα διάφορα στάδια της απόπτωσης (Σχ. 5). Δεδομένα υποδηλώνουν ήπια επαγωγή της απόπτωσης όταν τα κύτταρα χωριστά σε επεξεργασία με κουρκουμίνη ή Ki-67-7. Ωστόσο, η έκταση της απόπτωσης (τα δεξιά δύο τεταρτημόρια στο Σχ. 5), με την παρουσία CusiRNA βρέθηκε να είναι συνεργιστική (36% έναντι 13% για την κουρκουμίνη και 14% για Ki-67-7) μετά από διόρθωση για την έναρξη της απόπτωσης ( 11%) σε κύτταρα ελέγχου (Εικ. 5). Το σχήμα δείχνει επίσης (αριστερά κορυφή τεταρτημόριο στην Εικ. 5), ότι η έκταση της κυτταρικής νέκρωσης (αννεξίνης V αρνητική, 7ΑΑΌ θετική) ήταν ελάχιστη κατά τη διάρκεια όλων των συνθηκών θεραπείας.

ΑΥ-27 κύτταρα κατεργάστηκαν με αντι -Ki-67 siRNA, κουρκουμίνη ή στη συνδυασμένη παρουσία και των δύο, όπως περιγράφεται στη λεζάντα στα Σχήματα 3Α και 3Β. Στο τέλος της περιόδου θεραπείας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, χρωματίστηκαν με φθορισμό-συζευγμένη αννεξίνη V και 7ΑΑΌ όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Μετά την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής, το ποσοστό (αριθμός ένθετα στο σχήμα) των φυσιολογικών κυττάρων ή εκείνων που υφίστανται απόπτωση και νέκρωση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας κατάλληλο λογισμικό (Flow Jo V.9). Ο ρυθμός της απόπτωσης μετρήθηκε με την προσθήκη των ποσοστών στα σωστά δύο τεταρτημόρια σε καθένα από τα σχήματα. Τα δεδομένα είναι από ένα αντιπροσωπευτικό (δύο πανομοιότυπα) πείραμα.

Η

Ki-67-7 και κουρκουμίνη για τις φάσεις του κύκλου κυττάρων

Η επίδραση του Ki-67-7 επί του κυτταρικού κύκλου προσδιορίσθηκε με την παρουσία ή απουσία της κουρκουμίνης. Τα δεδομένα δείχνουν μια γενική μετατόπιση προς την κατεύθυνση της G0 /G1 φάση σε όλες τις συνθήκες θεραπείας, αλλά το αποτέλεσμα ήταν μέγιστη σε παρουσία CusiRNA (Εικ. 6). Δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην G2 /M φάση όταν εκτίθεται σε χωριστά είτε κουρκουμίνη ή Ki-67-7, αλλά μία μείωση 33% παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε CusiRNA. Είναι ενδιαφέρον ότι, με την αύξηση των G0 /G1 και μείωση στην G2 /M φάσεις, υπήρχε διπλάσια μετατόπιση (λόγος G0 /G1 έως G2 /M) προς αναστολή της ανάπτυξης υπό την παρουσία CusiRNA σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 6 ).

ΑΥ-27 κύτταρα κατεργάστηκαν με Ki-67-7, κουρκουμίνη ή και με τα δύο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως στην λεζάντα στα Σχήματα 3Α και 3Β. Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΡΙ και την κατανομή των κυττάρων σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα κύτταρα βαθμολογήθηκαν ως ποσοστιαία κατανομή των κυττάρων σε κάθε μία από τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου (G

o /G

1, S και G2 /M). Μπάρες δείχνουν αξίες που αποτελούν το μέσο ± SE των τριών προσδιορισμών

Η

Επίδραση του Ki-67-7 και κουρκουμίνη σε πολλαπλές Σηματοδοσίας:. Μοριακοί στόχοι στην κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

Η αναστολή της πρόοδο του κύκλου των κυττάρων, επαγωγή απόπτωσης ή συνδυασμό των δύο, είναι τα βασικά συμβάντα που σχετίζονται με την αναστολή του όγκου. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται παραπάνω σαφώς δείχνουν ότι ο συνδυασμός της κουρκουμίνης και Ki-67 – 7 επηρεάζουν τόσο τα γεγονότα. Για να κατανοήσουμε τον ρόλο μερικών μοριακών ενδιάμεσα τα οποία είναι πιθανό να επηρεάσουν αυτά τα γεγονότα, προσδιορίσαμε τα επίπεδα ορισμένων από τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες που συνδέονται με την απόπτωση και κυτταρικό κύκλο εξέλιξης. Αυξημένα επίπεδα διασπώνται-caspase3 με ανάλυση κηλίδος Western επιβεβαίωσε την επαγωγή της απόπτωσης, η οποία ήταν περισσότερο έντονη στην ομάδα CusiRNA (Εικ. 7). Ωστόσο, υπήρξε μια σημαντική μείωση στα επίπεδα του καταστολέα όγκου πρωτεΐνης, ρ53, στην ίδια ομάδα. Οι κυκλίνες D1 και Ε, οι πρωτεΐνες που συνδέονται με G1-S μετάβαση στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, επίσης βαθιά αναστέλλονται από CusiRNA. Όπως ήταν αναμενόμενο, η μείωση της κυκλίνης D1 σχετίστηκε με μείωση των επιπέδων της pRb-Ρ. Μείωση p53 συσχετίστηκε επίσης με μείωση της ρ21, έναν αναστολέα της κυκλίνης Ε, ωστόσο, ήταν η αύξηση στην πρωτεΐνη ρ27, ένας άλλος αναστολέας της κυκλίνης Ε που φάνηκε να συσχετίζονται καλά με την αναστολή της κυκλίνης Ε στην ομάδα CusiRNA. Αυτές οι παρατηρήσεις ήταν παρόμοια σε δύο τύπους κυττάρων. Από την άλλη πλευρά, η αναστολή του παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ ήταν πιο αποδιδόμενες στη θεραπεία κουρκουμίνη σε ΑΥ-27 κύτταρα ενώ σε Τ-24 κύτταρα, ανεστάλη κατά κύριο λόγο από CusiRNA.

καρκινικών κυττάρων κύστης (Τ -24 και ΑΥ-27) καλλιεργήθηκαν και εκτέθηκαν σε Ki-67 – 7 και η κουρκουμίνη, όπως περιγράφεται παραπάνω στη λεζάντα στα Σχήματα 3Α και 3Β. Στο τέλος της περιόδου θεραπείας, η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται και υποβλήθηκε σε κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας κατάλληλα αντισώματα όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Για τους σκοπούς της συμμετοχής πρωτεϊνών με συγκεκριμένους ρόλους, αυτοί ομαδοποιήθηκαν σε χωριστές κατηγορίες, όπως μεταγραφή γονιδίου (Α), την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (Β) και την απόπτωση (C). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Δεδομένου ότι διαφορετικές πρωτεΐνες (π.χ. κυκλίνη D1 και NF-κΒ) από την ίδια μεμβράνη αναγνωρίστηκαν σε διαφορετικές κατηγορίες, η ίδια β-ακτίνης κηλίδα εμφανίζεται σε περισσότερες από μία περιπτώσεις. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι κηλίδες Western από ένα μοναδικό πείραμα, το οποίο είναι αντιπροσωπευτικό του 2-3 ​​πανομοιότυπα πειράματα.

Η

Συζήτηση

καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο (TCC) της ουροδόχου κύστης είναι η πιο κοινή καρκίνο του ουροποιητικού συστήματος.