Αφηρημένο

Κακοήθεια είναι ένα σημαντικό πρόβλημα σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ανοσοκατασταλτικά φάρμακα. Έχουμε αποδείξει ότι η θεραπεία με αναστολείς καλσινευρίνης (CNIS) μπορεί να επάγει την ενεργοποίηση του πρωτο-ογκογόνο Ras, και μπορεί να προωθήσει την ταχεία εξέλιξη της ανθρώπινης νεφρικού καρκίνου μέσω της υπερέκφρασης του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι CNI επαγόμενη υπερέκφραση του VEGF και καρκινικών κυττάρων πολλαπλασιασμός αναστέλλεται με ραπαμυκίνη θεραπεία, υποδηλώνοντας εν δυνάμει εμπλοκή του στόχου της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) οδού σε αυτό το ογκογόνο διαδικασία. Εδώ, εξετάσαμε το ρόλο του mTOR μονοπάτι στη μεσολάβηση CNI- και Ras-επαγόμενη υπερέκφραση του VEGF σε ανθρώπινα νεφρικά καρκινικά κύτταρα (786-0 και Caki-1). Βρήκαμε ότι το νοκ ντάουν αρπακτικών (με τη χρήση siRNA) μειώθηκε σημαντικά δράση προαγωγού CNI που προκαλείται από VEGF όπως παρατηρήθηκε με τη δοκιμασία υποκινητή-λουσιφεράση, γεγονός που υποδηλώνει το ρόλο του mTOR complex1 (mTORC1) στην CNI-επαγόμενη μεταγραφή VEGF. Είναι γνωστό ότι mTOR ενεργοποιείται ακόλουθη φωσφορυλίωση της αρνητικής PRAS40 ρυθμιστής της, η οποία είναι ένα μέρος της mTORC1. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία CNI και ενεργοποίηση του H-Ras (μέσω μορφομετατροπής ενός ενεργού πλασμιδίου H-Ras) αύξησε σημαντικά τη φωσφορυλίωση της PRAS40, και η διαμόλυνση των κυττάρων χρησιμοποιώντας έναν κυρίαρχο-αρνητικό πλασμιδίου του Ras, μειώθηκαν σημαντικά φωσφορυλίωση PRAS40. Πρωτεΐνη κινάση C (PKC) -ζ και ΡΚΟ-δ, τα οποία είναι κρίσιμα ενδιάμεσος μόρια για CNI επαγόμενη ογκογόνο οδό, σχηματίζεται σύμπλοκο με PRAS40 σηματοδότησης? και βρήκαμε ότι η θεραπεία CNI αύξησε το σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ PRAS40 και PKC, ιδίως (PKC) -ζ. Η αναστολή της δραστικότητας της PKC με χρήση φαρμακολογικών αναστολέα μειώθηκε αισθητά H-Ras-επαγόμενη φωσφορυλίωση του PRAS40. Η υπερέκφραση του PRAS40 σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται CNI- και Η-Ras-επαγόμενη VEGF μεταγραφικής ενεργοποίησης. Τέλος, παρατηρήθηκε ότι η θεραπεία CNI αύξησε την έκφραση του phosho-PRAS40 σε ιστούς όγκων νεφρική

in vivo

. Μαζί, η φωσφορυλίωση της PRAS40 είναι κρίσιμη για την ενεργοποίηση του mTOR στην CNI που προκαλείται από υπερέκφραση του VEGF και της εξέλιξης του καρκίνου του νεφρού

Παράθεση:. Basu Α, Banerjee P, Κοντρέρας AG, Flynn Ε, Pal S (2011) καλσινευρίνης αναστολέας-Induced και Ras-διαμεσολαβούμενη υπερέκφραση του VEGF στα κύτταρα του καρκίνου των νεφρών Συνεπάγεται mTOR μέσω του κανονισμού της PRAS40. PLoS ONE 6 (8): e23919. doi: 10.1371 /journal.pone.0023919

Επιμέλεια: Sujit Basu, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Ιούλ 2011? Δεκτές: 1 Αυγ 2011? Δημοσιεύθηκε: 23, Αυγούστου, 2011

Copyright: © 2011 Basu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε από το ακόλουθο κείμενο: 1) Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης R01 CA131145 (σε SP)? 2) John-Merrill Grant ASN-AST (με ΠΔ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι πρόσφατες βελτιώσεις σε ανοσοκατασταλτικές θεραπείες μείωσαν σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης οξείας απόρριψης αλλομοσχευμάτων, και αύξησε την επιβίωση των ασθενών με μεταμόσχευση [1], [2]. Ωστόσο, αυτοί οι παράγοντες μπορεί επίσης να συμβάλει στην αύξηση των ποσοστών θνησιμότητας λόγω αυξημένου κινδύνου καρκίνου του [3], [4], [5], [6]. Έχει διαπιστωθεί ότι ο καρκίνος αποτελεί τη δεύτερη κύρια αιτία θανάτου σε ασθενείς με μεταμόσχευση νεφρού με φυσιολογική λειτουργία του μοσχεύματος [7]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι το περιβάλλον μεταμόσχευση μπορεί να επιταχύνει υποτροπή ή εξέλιξη του καρκίνου [3],. Έτσι, πρέπει να αναπτυχθούν ώστε να αποφευχθεί ανάπτυξη καρκίνου σε ασθενείς υπό θεραπεία με ανοσοκατασταλτική θεραπευτικοί στόχοι.

Οι ανοσοκατασταλτικοί παράγοντες πιστεύεται να συμβιβαστεί μηχανισμός (ες) ανοσολογική παρακολούθηση των καρκινικών κυττάρων ή /και να παρεμβαίνει με την κανονική επιδιόρθωση του DNA μηχανισμοί [4], [5], [8]. Συγκεκριμένα, αναστολείς καλσινευρίνης (CNIS) είναι εξαιρετικές ανοσοκατασταλτικοί παράγοντες για την αναστολή της απόρριψης αλλομοσχεύματος? ωστόσο μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη των διαφόρων όγκων [9], [10], [11], [12]. Το συγκρότημα καλσινευρίνης αποτελείται από τρεις υπομονάδες, την καταλυτική Α, το ρυθμιστικό Β, και καλμοδουλίνη [13]. Η κυτταρική ασβέστιο ενεργοποιεί την καταλυτική υπομονάδα για τη λειτουργία του ως φωσφατάσης σερίνης /θρεονίνης, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων (NFAT) οικογένεια παραγόντων μεταγραφής [14]. Η κυκλοσπορίνη CNI (CsA) δεσμεύεται με cyclophylin, κυτταροπλασματική πρωτεΐνη, και το προκύπτον σύμπλοκο συνδέεται με τη ρυθμιστική υπομονάδα Β της καλσινευρίνης και εμποδίζει την ενεργοποίηση του NFAT [15]. Ωστόσο, εκτός από την αναστολή της ΝΡΑΤ, ο CNIS μπορεί επίσης να ρυθμίζουν άλλα μόρια σηματοδότησης που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου [16], [17]. Hojo

et al.

[9] έδειξε ότι η CsA προωθεί την πρόοδο του καρκίνου και μετάσταση με άμεση κυτταρική δράση (-α), μέσω μετασχηματισμού αυξητικού παράγοντα-β (ΤΟΡ-β) παραγωγή, η οποία είναι ανεξάρτητη από την επίδρασή της στο ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Koehl

et al.

[18] ανέφεραν ότι η θεραπεία CsA προωθεί την ανάπτυξη του καρκίνου μετά τη μεταμόσχευση, η οποία εξαρτάται από τη διαδικασία της αγγειογένεσης του όγκου υψηλά. Ομοίως, Guba

et al.

[19] πρότειναν ότι η θεραπεία CsA μπορεί να επάγει την έκφραση αγγειογόνων κυτοκινών.

Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) είναι ένας από τους πιο ισχυρούς αγγειογενετική κυτοκίνες που παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου [20], [21]. Έχουμε αποδείξει πρόσφατα ότι η αγωγή με CNIS προκαλεί υπερέκφραση του VEGF, και προωθεί την ταχεία εξέλιξη της ανθρώπινης νεφρικού καρκίνου [22]. CNI επαγόμενη υπερέκφραση VEGF ρυθμίζεται τόσο σε μεταγραφικό και μετα-μεταγραφικό επίπεδο [22], [23]. Βρήκαμε επίσης ότι CNIS μπορεί να ενεργοποιήσει το πρωτο-ογκογόνο H-Ras σε ανθρώπινα νεφρικά καρκινικά κύτταρα [24]? και δείξαμε ότι CNI επαγόμενη υπερέκφραση VEGF προκαλείται μέσω της ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) -ζ και ΡΚΟ-δ [22], [23], τα οποία είναι εν δυνάμει κατάντη στόχοι της Ras [25].

σε αντίθεση με CNIS, ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) ραπαμυκίνη αναστολέα (RAPA) μπορεί να έχει ένα εντελώς αντίθετο αποτέλεσμα από την άποψη της ανάπτυξης του όγκου [10], [19], [26]. Οι μεταμοσχευθέντες ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία RAPA δεν αναπτύσσουν καρκίνο με τον ίδιο ρυθμό όπως αυτές που λαμβάνουν άλλα ανοσοκατασταλτικά μέσα όπως CNIS [27], [28]. Έχει αποδειχθεί ότι η θεραπεία RAPA μπορεί να έχει αντι-αγγειογενετική δράση [19]. Είναι ενδιαφέρον, έχουμε αποδείξει ότι η θεραπεία πρόσφατα RAPA μπορεί να αναστείλει σημαντικά την επαγόμενη από CNI-VEGF mRNA σταθερότητα [23], και CNI-επαγόμενο πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων νεφρικών κυττάρων καρκίνου [24]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν σαφώς πιθανό ρόλο του mTOR στην CNI επαγόμενη ογκογόνο οδούς. Προς υποστήριξη αυτών των παρατηρήσεων, έχει αναφερθεί ότι η οδός Akt-mTOR απαιτείται για CNI-επαγόμενη ανάπτυξη του όγκου [29]. Επιπλέον, τόσο PKC-ζ και PKC-δ μπορεί να ενεργοποιήσει την οδό ΑΚΤ mTOR [30], [31], [32], [33].

Το μονοπάτι mTOR παίζει ένα ρόλο κλειδί στην κυτταρική επιβίωση , την ανάπτυξη, την πρωτεϊνική σύνθεση, τον κυτταρικό μεταβολισμό και την αγγειογένεση [34], [35]. Μεταβολές στο μονοπάτι ρύθμιση mTOR συμβεί σε πολλές στερεές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του νεφρού [36], [37], [38]. mTOR, το οποίο συστατικώς ενεργοποιημένο σε πολλούς καρκίνους με απορρυθμισμένο ενεργοποίηση των ογκογονιδίων ή απώλειας των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, λειτουργεί ως μακρομοριακά συμπλέγματα [39]. Η mTOR complex1 (mTORC1), που περιέχει αρπακτικών, είναι RAPA ευαίσθητη? ενώ η complex2 mTOR (mTORC2), που περιέχει rictor, είναι RAPA αναίσθητη [34], [39]. Έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι μια πλούσια σε προλίνη Akt υπόστρωμα 40 kDa (PRAS40) μπορεί να ρυθμίσει αρνητικά την δραστικότητα του mTOR [40], [41]. Πριν πάρει φωσφορυλιώνεται από Akt, PRAS40 συνδέεται με αρπακτικών και απομονώνει αρπακτικών από mTORC1? αυτό οδηγεί στη διάσπαση των mTORC1 παρόμοια με την επίδραση του RAPA [40], [42]. Η αλληλεπίδραση των PRAS40 με αρπακτικών ανταγωνίζεται με την αλληλεπίδραση των αρπακτικών με S6K1 και 4Ε-BP1 [42], [43]. Επιπλέον, αυτή η αλληλεπίδραση του PRAS40 είναι πολύ ειδικό για το mTORC1, καθώς PRAS40 δεν συνδέουν με ή διαταράσσουν mTORC2 [34].

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι CNI επαγόμενη και Ras-διαμεσολαβούμενη από PKC VEGF υπερέκφραση μπορεί να διοχετευθεί μέσω του μονοπατιού σηματοδότησης mTORC1, και αυτό επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση της ρύθμισης των PRAS40. Έχουμε αποδείξει ότι η θεραπεία CNI και ενεργοποίηση του H-Ras και PKC μπορεί να οδηγήσει στην φωσφορυλίωση της PRAS40? και η υπερέκφραση του PRAS40 οδηγεί στην προς τα κάτω ρύθμιση των CNI- και Ras-επαγόμενη VEGF μεταγραφικής ενεργοποίησης. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν μια νέα cross-talk μεταξύ Ras, PKC και mTOR στη ρύθμιση CNI που προκαλείται από υπερέκφραση του VEGF.

Αποτελέσματα

Συμμετοχή του complex1 mTOR στην καλσινευρίνης που προκαλείται από αναστολείς VEGF υπερέκφραση σε κύτταρα ανθρώπινου νεφρικού καρκίνου

Έχουμε αποδείξει πρόσφατα ότι η θεραπεία με αναστολείς καλσινευρίνης (CNIS) μπορούν να προωθήσουν την υπερέκφραση του VEGF σε ανθρώπινα νεφρικά καρκινικά κύτταρα μέσω τόσο μεταγραφική και μετα-μεταγραφικό κανονισμών [22], [23]. Δείξαμε επίσης ότι η επαγόμενη από CNI VEGF mRNA σταθερότητα, και CNI-επαγόμενο πολλαπλασιασμό κυττάρων καρκίνου του νεφρού είναι αναστέλλεται σημαντικά μετά από θεραπεία με την ραπαμυκίνη αναστολέα mTOR (RAPA) [23], [24]. Τα ευρήματά μας έδειξε σαφώς τον πιθανό ρόλο του mTOR στην CNI που προκαλείται από ογκογόνο μονοπάτια. Εδώ, εξετάσαμε πρώτα το ρόλο του mTOR σε CNI-επαγόμενη ενεργοποίηση VEGF μεταγραφική σε ανθρώπινα νεφρικά καρκινικά κύτταρα (786-0 και Caki-1). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο υποκινητή-λουσιφεράση VEGF, και στη συνέχεια κατεργάζεται με την κυκλοσπορίνη CNI (CsA) σε απουσία ή παρουσία RAPA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η θεραπεία CsA προωθείται VEGF μεταγραφική ενεργοποίηση σε 786-0 κύτταρα και θεραπεία RAPA ανέστειλαν σημαντικά την δράση του VEGF υποκινητή CsA επαγόμενη. Βρήκαμε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) σε κύτταρα Caki-1. Στη συνέχεια, παρατηρήσαμε επίσης ότι η θεραπεία με CsA που επάγεται η έκφραση της πρωτεΐνης VEGF όπως παρατηρήθηκε με ανάλυση κηλίδος Western? και η κατεργασία με RAPA ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του VEGF που επάγεται CsA-(Εικόνα 1Β).

Α,

786-0 κύτταρα επιμολύνθηκαν με το κατασκεύασμα υποκινητή-λουσιφεράση 2,6-kb VEGF (0.5 μg /Λοιπόν). Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 12 ώρα, και στη συνέχεια κατεργάζεται όλη τη νύκτα (12 ώρες) με διαφορετικούς συνδυασμούς CsA (5,0 μg /ml) και RAPA (10.0 ng /ml) ή μόνο όχημα (έλεγχος). Μετά 24 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και φορές αλλαγή στην δραστικότητα της λουσιφεράσης υπολογίστηκε ως σχετικές απαριθμήσεις λουσιφεράση από κάθε ομάδα κυττάρων σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με όχημα μόνο. Τα δεδομένα απεικονίζουν τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Στήλες,

μέσο όρο των εις τριπλούν αναγνώσεις των δύο διαφορετικά δείγματα?

μπάρες σφάλματος,

SD.

B,

κύτταρα 786-0 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικούς συνδυασμούς CsA (5,0 μg /ml) και RAPA (10.0 ng /ml) ή μόνο όχημα (έλεγχος) για 24 ώρα. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-VEGF και αντι-β-ακτίνης για να ποσοτικοποιηθεί η πρωτεΐνη έκφραση του VEGF και β-ακτίνης, αντίστοιχα. Το γράφημα γραμμή κάτω από το στύπωμα Western απεικονίζει την σχετική έκφραση του VEGF με πυκνομετρία, όπου τα σήματα τυποποιήθηκαν προς έκφραση του εσωτερικού ελέγχου β-ακτίνης. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Στήλες,

μέσο όρο της σχετικής έντασης της έκφρασης του VEGF από τρεις διαφορετικές κηλίδες?

μπαρ,

SD.

C,

786-0 κύτταρα επιμολυσμένα με είτε αρπακτικών siRNA (25 nM) ή τον έλεγχο siRNA. Μετά από 24 ώρες siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με το κατασκεύασμα VEGF-υποκινητή λουσιφεράσης 2,6-kb (0.5 μg /φρεάτιο). Μετά από 12 ώρα πλασμιδίου επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί μία νύκτα (12 ώρες) είτε με CsA (5,0 μg /ml) ή μόνο όχημα (έλεγχος). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και φορές αλλαγή στην δραστικότητα της λουσιφεράσης υπολογίστηκε ως σχετικές απαριθμήσεις λουσιφεράση από κάθε ομάδα κυττάρων σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα μόνο. Τα δεδομένα απεικονίζουν δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Στήλες,

μέσο όρο των εις τριπλούν αναγνώσεις των δειγμάτων?

μπάρες σφάλματος,

SD. Η knockdown αρπακτικών επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western μετά από 48 ώρα siRNA διαμόλυνσης (

δεξί πάνελ)

(Α-Β) *,

ρ

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με κύτταρα υπό αγωγή με όχημα ? **

σ

& lt? 0,01 σε σύγκριση με μόνο κύτταρα CSA-θεραπεία. (C) *,

ρ

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα και υπό αγωγή με όχημα κύτταρα? **

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του siRNA επιμολυσμένα και CSA-επεξεργασμένα κύτταρα

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε το ρόλο του mTOR complex1 (mTORC1) στην CNI που προκαλείται από VEGF. μεταγραφή. Όπως συζητήθηκε νωρίτερα, αρπακτικών είναι ένα μέρος της mTORC1 [34], [39]. Εδώ, παρατηρήσαμε ότι το νοκ ντάουν των αρπακτικών χρήση siRNA μειωτικά σημαντικά δραστηριότητας CNI που προκαλείται από VEGF υποκινητή (σχήμα 1Γ). Το νοκ ντάουν των αρπακτικών (~ 70%) επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western (Σχήμα 1 C,

δεξί πάνελ

). Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν σαφώς τη συμμετοχή της mTORC1 στην CNI που προκαλείται από υπερέκφραση του VEGF στην νεφρική καρκινικών κυττάρων.

Η θεραπεία με CNI και η ενεργοποίηση της H-Ras Προωθεί φωσφορυλίωση της PRAS40

Έχουμε δείξει πρόσφατα ότι η θεραπεία CNI μπορεί να επάγει την ενεργοποίηση του H-Ras σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα [24]. Σε μια πρόσφατη έκθεση [44], έχει αποδειχθεί ότι η ενεργοποίηση του Ras μπορεί να προωθήσει σηματοδότηση mTOR. Όπως συζητήθηκε νωρίτερα, PRAS40 δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της mTORC1, και αναστέλλει τη δράση της για τα καθοδικά συμβάντα σηματοδότησης [34], [40], [41]. Μετά τη φωσφορυλίωση, PRAS40 παίρνει διαχωριστεί από αρπακτικών της mTORC1, και ως εκ τούτου mTOR ενεργοποιείται. Όπως νωρίτερα το πείραμά μας έδειξε τη συμμετοχή των αρπακτικών στην CNI-επαγόμενη μεταγραφή VEGF, εδώ θελήσαμε να αξιολογήσει εάν η θεραπεία CNI και την ενεργοποίηση της H-Ras θα μπορούσε να ρυθμίσει τη φωσφορυλίωση PRAS40. Πρώτον, ελέγξαμε την έκφραση φωσφο-PRAS40 σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα νεφρού (RPTEC), και 786-0 και Caki-1 νεφρικών καρκινικών κυττάρων. Μέσω της ανάλυσης στυπώματος Western, βρήκαμε ότι η έκφραση φωσφο-PRAS40 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε 786-0 και Caki-1 κύτταρα σε σύγκριση με RPTEC (Σχήμα 2Α,

πάνω πάνελ

)? Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στην έκφραση του συνολικού PRAS40 σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 2Α,

κατώτερο πάνελ

). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι η οδός mTOR είναι ενεργή σε νεφρική καρκινικών κυττάρων.

Α,

Η έκφραση της φωσφο-PRAS40 και PRAS40 μετρήθηκε σε κυτταρικά λύματα των RPTEC, 786-0 σύνολό της, και Caki-1 με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-PRAS40 και αντι-PRAS40.

B,

786-0 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (1,0 και 5,0 μg /ml) της CsA ή μόνο (έλεγχος) για 3 ώρα με όχημα. Τα κύτταρα λύθηκαν, και η έκφραση φωσφο-PRAS40 και PRAS40 μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western.

κύτταρα C,

Caki-1 διαμολύνθηκαν είτε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (0.1-1.0 μg /φρεάτιο) του H-Ras (12V) ή κενό φορέα έκφρασης (έλεγχος) επί 24 ώρας. Τα κύτταρα λύθηκαν, και η έκφραση φωσφο-PRAS40, PRAS40, Ras, και β-ακτίνης σε προϊόντα λύσης κυττάρου μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western.

D,

κύτταρα Caki-1 διαμολύνθηκαν είτε με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0,5 και 1,0 μg /φρεάτιο) του κυρίαρχου-αρνητικού Ras (17Ν) ή κενό φορέα έκφρασης (έλεγχος) επί 24 ώρας. Τα κύτταρα λύθηκαν, και η έκφραση φωσφο-PRAS40 και PRAS40 μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. (Α-Δ) Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια ευρήματα.

Η

Είμαστε δίπλα προσδιοριστεί η επίδραση της θεραπείας με CsA για φωσφορυλίωση PRAS40. 786-0 κύτταρα επεξεργάστηκαν είτε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του CsA ή του οχήματος και μόνο? και η έκφραση φωσφο-PRAS40 εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η θεραπεία CsA αυξηθεί σημαντικά το επίπεδο έκφρασης της φωσφο-PRAS40 σύγκριση με τον έλεγχο υπό αγωγή με όχημα (

πάνω πάνελ

)? Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην έκφραση του συνολικού PRAS40 παρακάτω CsA θεραπείας (

κάτω πίνακα

).

Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να αξιολογηθεί η επίδραση της ενεργοποίησης H-Ras σε φωσφορυλίωση PRAS40. Για το σκοπό αυτό, Caki-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με είτε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του πλασμιδίου που εκφράζει ενεργοποιημένη μορφή του H-Ras, H-Ras (12V), ή τον κενό φορέα έκφρασης. Μετά την επιμόλυνση, η έκφραση φωσφο-PRAS40 και συνολική PRAS40 μετρήθηκε. Βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση του H-Ras αύξησε σημαντικά το επίπεδο της phosho-PRAS40 σύγκριση με τον έλεγχο φορέα-επιμολυσμένα (Σχήμα 2C,

πρώτο πάνελ

)? δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στη συνολική PRAS40 μετά την ενεργοποίηση H-Ras (Σχήμα 2C,

δεύτερο πάνελ

). Η υπερέκφραση του H-Ras (12V) σε αυτά τα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western (Σχήμα 2C,

τρίτο πάνελ

).

Τέλος, ελέγξαμε την επίδραση της αναστολής της ενδογενούς Ras σε φωσφορυλίωση PRAS40. Τα κύτταρα Caki-1 διαμολύνθηκαν είτε με την κυρίαρχη-αρνητική μεταλλαγμένη του Ras, Ras (17Ν), ή ο κενός φορέας, και η έκφραση φωσφο-PRAS40 μετρήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Δ, η αναστολή της Ras μείωσε την έκφραση της φωσφο-PRAS40 (

πάνω πάνελ

)? Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην έκφραση του συνολικού PRAS40 (

κάτω πίνακα

). Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η θεραπεία CNI και ενεργοποίηση της οδού H-Ras σε ανθρώπινα νεφρικά καρκινικά κύτταρα μπορούν να επάγουν mTOR μέσω αυξημένης φωσφορυλίωσης PRAS40.

Μορφές PKC Συγκρότημα με PRAS40, και μπορεί να επάγουν την φωσφορυλίωση του

Στην προηγούμενη έκθεσή μας [22], έχουμε αποδείξει ότι και οι δύο PKC-ζ και PKC-δ είναι κρίσιμο ενδιάμεσο μόρια για CNI που προκαλείται από VEGF μεταγραφική ενεργοποίηση σηματοδότησης? και αυτές οι ισομορφές PKC μπορούν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί στόχοι κατάντη του δραστικού Ras [25]. Εδώ, επιδιώξαμε να καθορίσει εάν PKC θα μπορούσε να ρυθμίσει τη φωσφορυλίωση της PRAS40. Πρώτα, ελέγξαμε αν υπήρχε κάποιο πολύπλοκο σχηματισμό μεταξύ PRAS40 και είτε PKC-ζ και PKC-δ στο RPTEC και 786-0 κύτταρα υπό βασικές συνθήκες. Με ανοσοκατακρήμνιση, παρατηρήσαμε ότι πράγματι τόσο PKC-ζ και PKC-δ μπορούσε να κάνει συγκρότημα με PRAS40 (Εικόνα 3Α)? Ωστόσο, η ένταση του συγκροτήματος ήταν πολύ ισχυρότερη σε καρκινικά κύτταρα έναντι των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων νεφρικού. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν η θεραπεία με CNI θα μπορούσε να διαμορφώσει το σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ PRAS40 και PKC-ζ και PKC-δ σε 786-0 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, η θεραπεία με CsA αυξηθεί σημαντικά το σύμπλοκο μεταξύ PRAS40 και PKC-ζ σε σύγκριση με τον έλεγχο υπό αγωγή με όχημα? Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή (τα δεδομένα δεν φαίνονται) στο σύμπλοκο σχηματισμού μεταξύ PRAS40 και PKC-δ.

Α,

Λύματα RPTEC και 786-0 κύτταρα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι PRAS40.

B,

786-0 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με CsA (5,0 μg /ml) ή μόνο όχημα (έλεγχος) για 2 ώρες. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντι-PRAS40. (Α-Β) ανοσοκαταβύθισης (ΙΡ) συλλήφθηκαν από σφαιρίδια πρωτεΐνης A-Sepharose, βρασμένα σε ρυθμιστικό SDS, και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε με τη χρήση είτε αντι-ΡΚΟζ, ή αντι-ΡΚΟδ, ή αντι-PRAS40.

C,

786-0 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (50-250 nmol /L) του calphostin C ή έκδοχο μόνο (έλεγχος) για 3 ώρα. Τα κύτταρα λύθηκαν, και η έκφραση φωσφο-PRAS40 και PRAS40 μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western.

D,

κύτταρα Caki-1 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία είτε με calphostin C (100 nmol /L) ή μόνο όχημα? και τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με είτε Η-Ras (12V) (1,0 μg /φρεάτιο) ή φορέα μόνο για 24 ώρα, σε απουσία ή παρουσία calphostin C. Τα κύτταρα λύθηκαν, και η έκφραση φωσφο-PRAS40 και PRAS40 μετρήθηκε με Η ανάλυση στυπώματος Western. (Α-Δ) Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια ευρήματα.

Η

Στη συνέχεια, ελέγξαμε αν η αναστολή της PKC μέσω της επεξεργασίας των φαρμακολογικών αναστολέων θα μπορούσε να μειώσει τη φωσφορυλίωση της PRAS40. 786-0 κύτταρα επεξεργάστηκαν είτε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις calphostin C, ή το έκδοχο μόνο. Μετά την κατεργασία, η έκφραση φωσφο-PRAS40 και συνολική PRAS40 μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, η θεραπεία με calphostin C μείωσε σημαντικά το επίπεδο της phosho-PRAS40 σύγκριση με τον έλεγχο υπό αγωγή με όχημα (

πάνω πάνελ

)? Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην έκφραση του συνολικού PRAS40 (

κάτω πίνακα

). Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι PKC μπορεί να συνδεθεί με PRAS40, και να ρυθμίζουν τη φωσφορυλίωση της. Ωστόσο, δεν μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα εάν υπάρχει άμεσου σχηματισμού συμπλόκου μεταξύ PKC και PRAS40, και αν ορισμένοι άλλοι συνδέονται μόρια που εμπλέκονται στην PRAS40 φωσφορυλίωσης PKC μεσολάβηση.

Αναστολή της PKC ρυθμίζει προς τα κάτω H-Ras-Induced φωσφορυλίωση PRAS40

Σε προηγούμενα πειράματα μας, έχουμε δείξει ότι η ενεργοποίηση H-Ras θα μπορούσε να προκαλέσει φωσφορυλίωση PRAS40. Εδώ, θελήσαμε να διερευνήσει εάν η αναστολή της PKC μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω H-Ras-επαγόμενη φωσφορυλίωση της PRAS40 σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Caki-1 διαμολύνθηκαν είτε με H-Ras (12V) ή τον κενό φορέα έκφρασης σε απουσία ή παρουσία του αναστολέα PKC calphostin C. Μετά την επιμόλυνση, η έκφραση φωσφο-PRAS40 και συνολική PRAS40 μετρήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D (

ανώτερο πλαίσιο

), η ενεργοποίηση του H-Ras επαγόμενη τη φωσφορυλίωση PRAS40 σύγκριση με τον έλεγχο φορέα επιμολυσμένα? και η αναστολή της PKC σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται φωσφορυλίωση PRAS40 H-Ras-επαγόμενη. Δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή στην έκφραση του συνολικού PRAS40 μετά την ενεργοποίηση H-Ras και αναστολή PKC (Σχήμα 3D,

κάτω πίνακας)

. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν σαφώς ότι η οδός Ras-PKC, η οποία είναι κρίσιμη για την CNI που προκαλείται από ογκογόνο γεγονότα σηματοδότησης, μπορεί να φωσφορυλιώνει PRAS40, και έτσι μπορεί να ενεργοποιήσει mTOR.

Η υπερέκφραση του PRAS40 Αναστέλλει CNI- και H-Ras-Induced μεταγραφική ενεργοποίηση του VEGF

προηγούμενα πειράματα μας πρότειναν ότι CNI που προκαλείται και Ras-μεσολάβηση μονοπατιών σηματοδότησης θα μπορούσε να αδρανοποιήσουν PRAS40 μέσω της αυξημένης φωσφορυλίωσης της. Εδώ, εξετάσαμε πρώτα εάν η υπερέκφραση PRAS40 μπορούσε να αναστείλει CNI επαγόμενη υπερέκφραση του VEGF σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα. 786-0 κύτταρα συν-επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα υποκινητή-λουσιφεράση VEGF και είτε PRAS40 πλασμίδιο υπερέκφραση ή τον κενό φορέα έκφρασης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με CsA ή το όχημα μόνο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, η θεραπεία CsA αυξημένη μεταγραφική ενεργοποίηση του VEGF σε σύγκριση με τον έλεγχο υπό αγωγή με όχημα? και η υπερέκφραση του PRAS40 σημαντικά μειωμένη δραστικότητα VEGF υποκινητή CsA επαγόμενη. Η υπερέκφραση του PRAS40 σε επιμολυσμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western (Σχήμα 4Α,

κατώτερο πάνελ

).

Α, κορυφή,

786-0 κύτταρα συν- επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα 2.6-kb VEGF υποκινητή-λουσιφεράσης (0.5 μg /φρεάτιο) και είτε ένα πλασμίδιο PRAS40 υπερέκφραση (myc-PRAS40) (0,5 μg /φρεάτιο) ή κενό φορέα. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 12 ώρα, και στη συνέχεια κατεργάζεται όλη τη νύκτα (12 ώρες) είτε με CsA (5,0 μg /ml) ή μόνο όχημα (έλεγχος). Μετά τη θεραπεία CsA, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και φορές αλλαγή στην δραστικότητα της λουσιφεράσης υπολογίστηκε ως σχετικές απαριθμήσεις λουσιφεράση από κάθε ομάδα κυττάρων σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα μόνο.

A, κάτω,

η υπερέκφραση του myc-PRAS40 πλασμιδίου σε επιμολυσμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-PRAS40? και η έκφραση της β-ακτίνης μετρήθηκε ως εσωτερικό έλεγχο.

B,

κύτταρα Caki-1 συν-επιμολύνθηκαν με το κατασκεύασμα 2.6-kb VEGF υποκινητή-λουσιφεράσης (0.5 μg /φρεάτιο) και διάφορους συνδυασμούς H-Ras (12V), myc-PRAS40 και τον κενό φορέα (0,5 μg /φρεάτιο από κάθε πλασμίδιο). Μετά 24 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και φορές αλλαγή στην δραστικότητα της λουσιφεράσης υπολογίστηκε ως σχετικές απαριθμήσεις λουσιφεράση από κάθε ομάδα κυττάρων σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα. (Α-Β) Τα δεδομένα αντανακλούν τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Στήλες,

μέσο όρο των εις τριπλούν αναγνώσεις των δύο διαφορετικά δείγματα?

μπάρες σφάλματος,

SD. Στο Α, *,

ρ

& lt? 0,01 σε σύγκριση με κενό φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα και υπό αγωγή με όχημα? **

σ

& lt? 0,01 σε σύγκριση με άδειο φορέα-επιμολυσμένα και CSA-επεξεργασμένα κύτταρα. Στην Β, *

σ

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα φορέα-επιμολυσμένα? **

σ

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με οργανισμούς φορείς και H-Ras (12V) επιμολυσμένα κύτταρα

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται αν η υπερέκφραση του PRAS40 θα μπορούσε να αναστείλει Η- Ras-προκαλούμενη μεταγραφή VEGF. Caki-1 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το κατασκεύασμα VEGF-υποκινητή λουσιφεράση και H-Ras (12V) σε απουσία ή παρουσία του πλασμιδίου PRAS40 υπερέκφραση. Τα κύτταρα μάρτυρες επιμολύνθηκαν με άδειο φορείς έκφρασης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, η ενεργοποίηση του H-Ras αυξημένη μεταγραφική ενεργοποίηση του VEGF σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα? και η υπερέκφραση του PRAS40 μειώθηκε σημαντικά H-Ras-επαγόμενη δραστικότητα VEGF υποκινητή. Μαζί, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι CNI- και Ras που προκαλείται από γεγονότα σηματοδότησης μπορεί να προωθήσει VEGF μεταγραφική ενεργοποίηση σε mTOR που εξαρτώνται από μονοπάτι μέσω της ρύθμισης των PRAS40.

CNI θεραπεία αυξάνει τη φωσφορυλίωση της PRAS40 σε νεφρικούς ιστούς όγκων

στο Vivo

η

Έχουμε επιδείξει πρόσφατα ότι σε ανοσοανεπάρκεια (

ηυ /ηυ

) ποντικούς, CNI (CsA) θεραπεία επιτάχυνε σημαντικά την ανάπτυξη των ανθρώπινων νεφρικών όγκων (786-0) μέσω VEGF-επαγόμενη αγγειογένεση, σε σύγκριση με ελέγχους υπό αγωγή με όχημα [22]. Ωστόσο, δεν αξιολογεί το επίπεδο έκφρασης της φωσφο-PRAS40 στους όγκους. Έτσι, εδώ εξετάσαμε την κατάσταση του φωσφο-PRAS40 σε αυτούς τους ιστούς όγκου από CSA-αγωγή, καθώς και τα ποντίκια ελέγχου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, η έκφραση φωσφο-PRAS40 ήταν σημαντικά αυξημένη (όπως παρατηρείται με πλάκες κόκκινου χρώσης σκοτάδι) σε ιστούς όγκων νεφρική λαμβάνονται από CSA-αγωγή ποντικούς (

επάνω δεξιά πάνελ

), σε σύγκριση με καρκινικά ιστοί από την ομάδα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα (

πάνω αριστερό πλαίσιο

). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στην έκφραση της συνολικής PRAS40 σε καρκινικούς ιστούς που λαμβάνονται από CSA-αγωγή (

Μέση δεξί πάνελ

) ή ομάδα υπό αγωγή με όχημα (

μεσαίο αριστερό πίνακα

). Μας

in vivo

δεδομένα είναι παρόμοια με το

in vitro

τα ευρήματά μας, και αυτό δείχνει ότι CNI μεσολάβηση και VEGF-επαγόμενη επιτάχυνση της ανάπτυξης των ανθρώπινων νεφρικών όγκων μπορεί να συνεπάγεται αυξημένη φωσφορυλίωση της PRAS40, η οποία μπορεί να να οδηγήσει στην ενεργοποίηση του mTOR μονοπάτι

Ανθρώπινα νεφρικά καρκινικά κύτταρα (1.0 × 10

6? 786-0). ενέθηκαν sc σε γυμνούς (

ηυ /ηυ

) ποντικούς (

n

= 5 σε κάθε ομάδα), και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με CsA (10 mg /kg /ημέρα) ή με το όχημα ως έλεγχος . Οι όγκοι συλλέχθηκαν την ημέρα 25 μετά την ένεση του όγκου. Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες απεικονίζουν την ανοσοϊστοχημική έκφραση της φωσφο-PRAS40 (

πάνω πάνελ

) και PRAS40 (

μεσαίο πάνελ

) σε συγκομίζονται ιστούς νεφρική όγκου (μεγέθυνση Χ400).

Μπαλώματα των σκούρο κόκκινο χρώμα,

έκφραση phosho-PRAS40, η οποία ήταν σημαντικά αυξημένη σε καρκινικούς ιστούς από ποντίκια CSA-θεραπεία. H & amp? Ε, αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Εκπρόσωπος της τρία διαφορετικά δείγματα ιστών και των δύο CsA- και ομάδες υπό αγωγή με όχημα.

Η

Συζήτηση

Η ανάπτυξη, καθώς και ταχεία εξέλιξη του καρκίνου είναι ένα σημαντικό πρόβλημα σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ανοσοκατασταλτικά παραγόντων [3], [4], [5]. Έχουμε αποδείξει προσφάτως ότι αναστολείς καλσινευρίνης (CNIS) μπορούν να προάγουν την ταχεία εξέλιξη της ανθρώπινης νεφρικού καρκίνου μέσω της υπερέκφρασης του VEGF [22], [23]? και Η-Ras και PKC μπορεί να δράσει ως κρίσιμο ενδιάμεσο σηματοδότηση μορίων για CNI επαγόμενη υπερέκφραση του VEGF [22], [24]. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε μία νέα οδό, στην οποία CNI επαγόμενη και Ras-διαμεσολαβούμενη από PKC σήματα μπορεί να εμπλέκει mTORC1 μέσω της ρύθμισης της ανασταλτικής PRAS40 μορίου του, και την προώθηση της υπερέκφραση του VEGF.

Όπως συζητήθηκε νωρίτερα, CNIS μεσολαβούν ανοσοκατασταλτικό λειτουργία τους μέσω της αναστολής της καλσινευρίνης-ΝΡΑΤ μονοπάτι [15]. Ωστόσο, μπορεί επίσης να CNIS ρυθμίζουν άλλα μόρια σηματοδότησης που εμπλέκονται στην έκφραση του VEGF και άλλων γονιδίων [16], [17]. Δείξαμε πρόσφατα ότι η θεραπεία μπορεί να ενεργοποιήσει CNI H-Ras, και μπορεί επίσης να επάγει την φωσφορυλίωση του κατάντη στόχοι της, PKC-ζ και PKC-δ? και προωθεί την υπερέκφραση του VEGF σε ανθρώπινα νεφρικά καρκινικά κύτταρα [22], [23]. Chen

et al.

[45] ανέφεραν ότι CsA που προκαλείται οξειδωτικό στρες μπορεί να ρυθμίζουν και να ενεργοποιήσετε PKC-ζ σε μολυσμένα με ιό ανθρώπινα Β κύτταρα, που μπορούν να οδηγήσουν στην επαγωγή λεμφοϋπερπλαστικές διαταραχές σε ασθενείς με μεταμόσχευση.

είναι ενδιαφέρον, έχουμε καταδείξει ότι η CNI επαγόμενη υπερέκφραση του VEGF και του πολλαπλασιασμού νεφρικών κυττάρων καρκίνου αναστέλλεται με κατεργασία RAPA, υποδηλώνοντας τον πιθανό ρόλο του mTOR σε CNI επαγόμενη ογκογόνο οδούς που περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της Ras [23], [ ,,,0],24]. . Προς υποστήριξη με τις παρατηρήσεις μας, Carriere

κ.ά.

[44], έχουν πρόσφατα αναφερθεί ότι μιτογονική και ογκογόνο ενεργοποίηση της οδού της Ras μπορεί να επάγει mTORC1? έχει επίσης δειχθεί ότι η οδός Akt-mTOR απαιτείται για CNI-επαγόμενη ανάπτυξη του όγκου [29]. Επιπλέον, τόσο PKC-ζ και PKC-δ μπορεί να προάγει την επαγωγή του μονοπατιού Akt-mTOR [30], [31], [32], [33]? και το PI-3K /Akt /mTOR σήματα μεσολάβηση μπορεί να διοχετευθεί μέσω του HIF και Sp1 [46], [47], δύο σημαντικοί παράγοντες μεταγραφής για την έκφραση του VEGF [25], [48].

Στο παρούσα μελέτη, διαπιστώνουμε ότι αρπακτικών, η οποία αποτελεί μέρος της mTORC1 είναι κρίσιμη για την CNI που προκαλείται από VEGF μεταγραφική ενεργοποίηση. Δείχνουμε ότι CNI /Ras-επαγόμενη και PKC μεσολάβηση υπερέκφραση του VEGF σε ανθρώπινα νεφρικά καρκινικά κύτταρα εμπλέκει PRAS40, ένας αρνητικός ρυθμιστής του mTORC1 [34], [40], [41]. Η θεραπεία CNI, καθώς και η ενεργοποίηση της Ras και PKC προωθεί φωσφορυλίωση PRAS40, η οποία μπορεί να οδηγήσει στην επαγωγή του mTOR μονοπάτι σηματοδότησης. Η μελέτη μας δείχνει το ρόλο της H-Ras στη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης PRAS40? Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε τους ρόλους των δύο άλλων Ras ισομορφές (K-Ras και Ν-Καδ) σε αυτή τη διαδικασία. Προηγουμένως, δείξαμε ότι η αγωγή με CNI μεσολαβεί μια ταχεία εξέλιξη της ανθρώπινης νεφρικής όγκου μέσω VEGF-επαγόμενη αγγειογένεση [22]? εδώ, δείχνουμε ότι η έκφραση φωσφο-PRAS40 είναι σημαντικά αυξημένη σε αυτούς τους ιστούς νεφρική νεοπλασία μετά την αγωγή CNI. Η υπερέκφραση του PRAS40 μείωσε σημαντικά CNI- και Ras-επαγόμενη VEGF μεταγραφικής ενεργοποίησης. Έτσι, η μελέτη μας δείχνει σαφώς ότι mTOR είναι ένα κρίσιμο μόριο σηματοδότησης σε CNI επαγόμενη ογκογόνα οδού (ες) που μπορεί να οδηγήσουν σε υπερέκφραση του VEGF σε καρκίνο του νεφρού.