Αφηρημένο

Ο ρόλος του στρώματος mesothelial στην εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων στην περιτοναϊκή είναι μόνο εν μέρει διευκρινιστεί. Εδώ προσπαθήσαμε να καθοριστεί καλύτερα η μεσοθηλιακών συνεισφορά στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων με χρήση απευθείας δοκιμή πρόσφυσης σε ανθρώπους-πρωτογενείς καλλιέργειες των μεσοθηλιακών κυττάρων (HPMCs) που προέρχεται από τις περιτοναϊκές πλύσεις των ασθενών με γαστρικό και του παχέος εντέρου. Γαστρική και του παχέος εντέρου κύτταρα καρκινώματος σπάρθηκαν σε διαφορετικές μεσοθηλιακών μονοστοιβάδες και ποσοτική ανάλυση φθορισμού διεξήχθη για να αναλύσει την ανάπτυξή τους και συγκολλητικές ιδιότητες. Η προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων δεν επηρεάστηκε από την προέλευση των HPMCs όταν προέρχονται από ασθενείς με διαφορετικές μορφές καρκίνου ή με καλοήθη νόσο. Σε αντίθεση, τα υψηλά επίπεδα έκφρασης ICAM1 και της παραγωγής ROS, που χαρακτηρίζουν αυτά τα γηρασμένα μεσοθηλιακών κυττάρων, ενίσχυσε την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι μεσοθηλιακών συγκολλητικές ιδιότητες εξαρτώνται από την κυτταρική γήρανση, ενώ δεν επηρεάζονται από το περιβάλλον του όγκου. Η χρήση της περιτοναϊκής πλύσεις ως πηγή για την απομόνωση HPMCs παρέχει μια πρακτική και αξιόπιστο εργαλείο για την in vitro ανάλυση των μεσοθηλιακών συνθήκες που επηρεάζουν την περιτοναϊκή καρκινωμάτωση

Παράθεση:. Ranieri D, Raffa S, Parente Α, Rossi Del Monte S, Ziparo V, Torrisi MR (2013) υψηλή πρόσφυση των κυττάρων όγκων σε Mesothelial Μονοστιβάδες Προέρχεται από περιτοναϊκή Wash διάχυτης γαστρεντερικού καρκίνου. PLoS ONE 8 (2): e57659. doi: 10.1371 /journal.pone.0057659

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, Πανεπιστήμιο Magna Graecia, Ιταλία

Ελήφθη: 9 Οκτώβρη 2012? Αποδεκτές: 24 Γενάρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Φλεβάρη, 2013

Copyright: © 2013 Ranieri et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το MIUR και από AIRC – Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 10272), Ιταλία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η περιτοναϊκή διασπορά των γαστρικών και του παχέος εντέρου αποτελεί ένα συχνό γεγονός που συνέβη μετά την θεραπευτική εκτομή [1] – [3]. Κρίσιμη για την περιτοναϊκή επανάληψη είναι η προσκόλληση των ελεύθερων διαδίδονται καρκινικά κύτταρα στο στρώμα μεσοθηλιακών και πολλά διαφορετικά μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται άμεσα σε αυτή τη διαδικασία έχουν προσδιοριστεί [4]. Για περιτοναϊκή καρκινωμάτωση, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να είναι σε θέση να επιβιώσουν στην περιτοναϊκή κοιλότητα, μετά την απόσπασή του από τον πρωτογενή όγκο, και πρέπει να εμφανίσει μια πολλαπλασιαστική και διηθητική συμπεριφορά, αφού προσκολλάται στο mesothelium. Ενώ πολλές μελέτες έχουν αντιμετωπιστεί με την ανάλυση της έκφρασης και την ενεργοποίηση των μοριακών οδών υπεύθυνη για τις διαδοχικές βιολογικές αλλαγές των διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων [5] – [7], μόνο ένας περιορισμένος αριθμός των εκθέσεων έχουν επικεντρωθεί στη συμβολή του το στρώμα μεσοθηλιακά στην προσκόλληση και εξάπλωση περιτοναϊκή του καρκίνου [8] – [10].

Για την λεπτομερή ανάλυση των μοριακών μηχανισμών που επηρεάζουν το στάδιο κόλλα, διαφορετικά in vitro ή ex-vivo μοντέλα έχουν αναπτυχθεί [11] – [13] και έχουν πρωτογενείς καλλιέργειες των μεσοθηλιακών κυττάρων έχουν ληφθεί για να δοκιμαστεί η προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων σε παρουσία της προώθησης ή παρεμβολής παράγοντες [8], [12]. Τα περισσότερα από αυτά τα μοντέλα χρησιμοποιούν είτε καθιερωμένες κυτταρικές σειρές ή ανθρώπινα πρωτογενή καλλιέργειες των μεσοθηλιακών κυττάρων που απομονώνονται από επιπλοϊκά θραύσματα [10], [14] – [15]. Ωστόσο, έχει προταθεί ότι και η περιτοναϊκή πλύσεις, όντας το χρυσό πρότυπο για την αξιολόγηση της παρουσίας περιτοναϊκή διάχυση του γαστρικού και του παχέος εντέρου [16] – [18], είναι ένα καλό και πιο πρακτική πηγή των μεσοθηλιακών κυττάρων που θα πολλαπλασιάζονται in vitro [19], αν και η χρήση τους σε μοντέλα συν-καλλιέργειας δεν έχει διερευνηθεί.

μόρια προσκόλλησης παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στο στάδιο περιλαμβάνει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων ελεύθερα στην περιτοναϊκή επιφάνεια [4] και κυτοκίνες, όπως η ιντερλευκίνη 1β (IL1ß) και παράγοντα νέκρωσης όγκου α (TNFa) που απελευθερώνεται στην φλεγμονώδη μικροπεριβάλλον, είναι γνωστό ότι προάγει την έκφραση τους [20], [21]. Μεταξύ των μορίων προσκόλλησης που παίζουν ένα ρόλο κλειδί στην εξάπλωση των νεοπλασματικών κυττάρων στο μεσοθηλιακών μονοστιβάδα, αρκετές μελέτες επεσήμανε την συγκεκριμένη λειτουργία της ενδοκυτταρικού μορίου προσκόλλησης 1 (ICAM1) που υπάρχουν επί των μεσοθηλιακών κυττάρων στην προώθηση της διαδικασίας [10], [21]? Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι ο up-διαμόρφωση της έκφρασης του, ως αποτέλεσμα του οξειδωτικού στρες και γήρανση των περιτοναϊκών κυττάρων, προάγει την προσκόλληση των νεοπλασματικών κυττάρων από ωοθηκών, του γαστρικού και του κόλου [22] – [24], καταδεικνύοντας την γενική και κρίσιμο ρόλο του ICAM1 στην εξάπλωση.

στην προσπάθεια να καθοριστεί καλύτερα η μεσοθηλιακών συμβολή στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων και, ειδικότερα, ο πιθανός ρόλος της ενεργοποίησης μεσοθηλιακών σε ένα καρκινικό περιβάλλον που μιμείται in vitro όσο το δυνατόν περισσότερο τις in vivo συνθήκες, χρησιμοποιήσαμε εδώ μια άμεση δοκιμή πρόσφυσης εκτελέστηκε στην ανθρώπινη πρωτογενείς καλλιέργειες των μεσοθηλιακών κυττάρων (HPMCs) που προέρχεται από τις περιτοναϊκές πλύσεις των ασθενών με γαστρικό και ορθοκολικούς όγκους ή ασθενών με καλοήθεις ασθένειες, προκειμένου να μιμηθεί in vitro όσο το δυνατόν περισσότερο τις in vivo συνθήκες. Με στόχο την ελαχιστοποίηση των πιθανές παραλλαγές αποδίδονται στον ομόλογό του όγκου, έχουμε συμφωνημένα διαφορετικές απομονωμένες HPMCs, που καλλιεργούνται επίσης σε διαφορετικά επίπεδα γήρανση, με δύο γνωστά καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η συγκολλητική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων δεν επηρεάζεται από την προέλευση των HPMCs από ασθενείς με διαφορετικούς όγκους. Ωστόσο, οι παρατηρήσεις μας επιβεβαιώνουν τον ρόλο της περιτοναϊκής γήρανση, μέσα από την αυξημένη παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και της έκφρασης ICAM1, στην προαγωγή της προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων [22] – [24] και δείχνουν ότι η χρήση της περιτοναϊκής πλύσεις ως πηγή να απομονώσει και να διαδώσει HPMCs μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα να αξιολογηθεί in vitro η κατάσταση του mesothelium σε ασθενείς με καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές

το ανθρώπινο μεσοθηλιακού Met- 5Α κυτταρική γραμμή [25] καλλιεργήθηκε σε Dulbecco τροποποιημένο Eagle /F12 Medium (DMEM /F12) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) συν αντιβιοτικά και υδροκορτιζόνη (0,1 μg /ml), ινσουλίνη (2,5 μg /ml), τρανσφερίνη (2,5 μg /ml) και σελήνιο (2,5 ng /ml) (Sigma Chemicals Co., St Louis, ΜΟ, USA). Το ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα Caco2 ανθρώπινη κυτταρική σειρά [18], [26] καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% FBS συν αντιβιοτικά (Sigma). Το αδενοκαρκίνωμα στομάχου AGS ανθρώπινη κυτταρική σειρά [18] καλλιεργήθηκε σε F12 μέσο Ham (Sigma) συμπληρωμένο με 10% FBS συν αντιβιοτικά (Sigma).

πρωτογενείς καλλιέργειες και συν-καλλιέργειες

Οι πρωτογενείς καλλιέργειες Ανθρωπίνων περιτοναϊκή μεσοθηλιακών κυττάρων (HPMCs) ελήφθησαν από διεγχειρητικά περιτοναϊκή πλύσεις [18] των ασθενών που πάσχουν από την περιτοναϊκή καρκινωμάτωση από ορθοκολικό καρκίνο (# 062) ή γαστρικό καρκίνο (# 219), καθώς και των ασθενών που πάσχουν από μη καρκινική νόσο (# 002), ο οποίος υποβλήθηκε σε χειρουργική επέμβαση στη Μονάδα Α Χειρουργικής του Sant’Andrea Νοσοκομείου. Τα χαρακτηριστικά του δότη κλινικοπαθολογοανατομικές περιγράφονται στον Πίνακα 1. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε εκτεταμένη ενημερώθηκαν και έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για την έρευνα. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την ηθική Διοικητικό Συμβούλιο του Sant’Andrea Νοσοκομείο, Ρώμη.

Η

Για να αποφευχθεί πιθανή ενεργοποίηση των περιτοναϊκή κύτταρα από τη χειρουργική διαδικασία, οι περιτοναϊκή πλύσεις ελήφθησαν στα στάδια εκκίνησης της χειρουργικής επέμβασης. Από κάθε ασθενή, 40 mL περιτοναϊκής πλύσης συλλέχθηκαν σε EDTA (50 μΜ). Οι περιτοναϊκές πλύσεις φυγοκεντρήθηκαν στις 1100 rpm για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και κατακρημνίσθηκε. Τα δείγματα επαναιωρήθηκαν για μαγνητική επισήμανση σε 80 μι ρυθμιστικού διαχωρισμού MACS® (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία). Για να αφαιρέσετε συστατικό επιθηλιακών κυττάρων από την περιτοναϊκή πλύση και, κατά συνέπεια, να εμπλουτίσει το τμήμα μεσοθηλιακών, ανοσομαγνητικής εξαντλήσεως χρησιμοποιώντας μικροσφαιρίδια αντι-CD326 /EpCAM (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία) διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, στήλες διαχωρισμού MS (MACS®, Miltenyi Biotec) είχε εξισορροπηθεί με 0,5 mL του ρυθμιστικού διαλύματος MACS® διαχωρισμού και τα μικροσφαιρίδια σημασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μαγνητικό πεδίο γούρνα το πέρασμα στήλης. Τα αρνητικά κύτταρα CD326 πλύθηκαν μακριά από την στήλη, και απλώθηκαν σε ϋΜΕΜ /Ρ12 ως ανωτέρω.

Για τα πειράματα προσκόλλησης, Met-5A ή HPMCs αναπτύχθηκαν προς συρροή και μετά από 24 ώρες Caco2 ή AGS κύτταρα σπάρθηκαν επί της μονοστιβάδας.

μορφολογική ανάλυση των HPMCs

για την μορφολογική ανάλυση HPMCs, τα δείγματα καλλιέργειας παρατηρήθηκαν σε ένα Zeiss Axiovert 200 ανεστραμμένο μικροσκόπιο εφοδιασμένο με αντίθεση φάσης (DIC) οπτική (Zeiss, Oberkochen , Γερμανία). Ποσοτική ανάλυση των πολυπύρηνων και multivacuolated κυττάρων πραγματοποιήθηκε με μέτρηση, για κάθε κυτταρική καλλιέργεια, ένα σύνολο τουλάχιστον 250 κύτταρα παρατηρήθηκαν σε πέντε μικροσκοπικά πεδία λαμβάνονται τυχαία από τρία διαφορετικά πειράματα. Όλα τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσες τιμές ± SE. Η σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τεστ Kruskal-Wallis ή ζεύγη δοκιμασία t του Student.

P

αξιών & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

ανοσοφθορισμού

Για HPMCs κύτταρα χαρακτηρισμό αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη ακολουθούμενη από επεξεργασία με 0,1. Μ γλυκίνη για 20 λεπτά στους 25 ° C και με 0,1% Triton Χ100 για επιπλέον 5 λεπτά στους 25 ° C για να επιτραπεί διαπερατοποίηση. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα στους 25 ° C με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-κυτοκερατίνες (αναγνωρίζοντας Ck8 και CK19 μεταξύ άλλων των Ck) (1:100 σε PBS? Κλώνο MNF116? Dako, Glostrup, Denmark) μονοκλωνικό αντίσωμα? αντι-βιμεντίνη (1:100 σε PBS? κλώνος V9? Dako) μονοκλωνικό αντίσωμα? αντι-καλρετινίνη (1:100 σε PBS? κλώνο DAK Calret 1? Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA, USA) μονοκλωνικό αντίσωμα? αντι-ΟΕΑ (1:100 σε PBS? Zymed, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) πολύκλωνα αντισώματα? Αντι-ΕρΟΑΜ (1:10 σε PBS? Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Γερμανία) μονοκλωνικό αντίσωμα συζευγμένο άμεσα με ΡΕ? αντι-ICAM1 (1:10 σε PBS? StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada) μονοκλωνικό αντίσωμα συζευγμένο με FITC άμεσα

Τα μη συζευγμένα πρωτογενή αντισώματα κατέστησαν ορατά, μετά από κατάλληλη πλύση με PBS, χρησιμοποιώντας κατσίκας αντι-ποντικού. FITC (1:50 σε PBS? Cappel Research Products, Durham, NC), κατσίκα αντι-ποντικού Texas Red (1:200 σε PBS? Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, ΡΑ, USA), κατσίκα αντι-κουνελιού FITC (1: 400 σε PBS? Cappel Research). Για να ταυτοποιηθούν κύτταρα ποδηλασία, ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με αντι-Κί67 αντισώματα κουνελιού πολυκλωνικό (1:50 σε PBS? Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Οι πυρήνες βάφτηκαν με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) (1:10.000 σε PBS? Sigma). Οι καλυπτρίδες τελικά τοποθετείται με 90% γλυκερόλη σε PBS για παρατήρηση. σήματα φθορισμού έγιναν ορατά με το Σύστημα ApoTome (Zeiss) συνδεδεμένο με ένα Axiovert 200 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Zeiss) και ανάλυση εικόνας διεξήχθη από το λογισμικό Axiovision (Zeiss) και KS300 λογισμικό αναλυτή εικόνας (Zeiss).

Ποσοστό ΕρΟΑΜ /Κί67-θετικών κυττάρων σε συν-καλλιέργειες Met-5A και τα κύτταρα AGS ή Caco2 αναλύθηκε μετρώντας συνολικά 500 κύτταρα παρατηρήθηκαν τυχαία σε 5 μικροσκοπικά πεδία για κάθε διαφορετικό χρονικά σημεία (1 ώρα, 24, 48) κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας της το πείραμα. Ποσοστό ICAM1-θετικών κυττάρων σε HPMCs αναλύθηκε καταμέτρησης για κάθε πρωτογενή καλλιέργεια συνολικά 300 κυττάρων, παρατηρήθηκε τυχαία σε 10 μικροσκοπικά πεδία από τρία διαφορετικά πειράματα. Ποσοτική ανάλυση της έντασης φθορισμού ICAM1 διεξήχθη με την ανάλυση 100 κύτταρα για κάθε δείγμα σε πέντε διαφορετικούς τομείς, λαμβάνονται τυχαία από τρία διαφορετικά πειράματα. Όλα τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσες τιμές ± SE. Η σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τεστ Kruskal-Wallis ή t δοκιμή Student?

σ

τιμές & lt? 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

δοκιμασίας προσκόλλησης

Υποσυρρέουσες Caco2 ή AGS κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό και επισημάνθηκαν με 5 μl /ml διαλύματος Vybrant®DiI (Invitrogen, Carlsbad, CA, ΗΠΑ) με επώαση για 30 λεπτά στους 37 ° C. Οι με Dil-επισημασμένα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές και επανεναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ /Ρ12 ως ανωτέρω. Τα επισημασμένα κύτταρα είχαν άμεση επιστρώθηκαν στην μεσοθηλιακών μονοστοιβάδας (25 × 10

3 /cm

2 του μονοστιβάδας) και επωάστηκε για 1, 24, 48 ώρες. Στις δοκιμασίες προσκόλλησης με το αντίσωμα αντι-μπλοκαρίσματος ICAM1 (StemCell Technologies), η επώαση πραγματοποιείται παρουσία διαφόρων αραιώσεων (1:10, 1:05 και 1:02) του αντισώματος. Ένα άσχετο αντίσωμα (αντι-κυτοκερατίνες? Κλώνος MNF116? Dako) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος σε 1:02 αραίωση. Τα μη προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν με άφθονη πλύσεις με μέσο χωρίς ορό, και τα προσκολλημένα κύτταρα και HPMCs μονοστιβάδες σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, ακολουθούμενη από κατεργασία με 0.1 Μ γλυκίνη για 20 λεπτά στους 25 ° C και με 0,1% Triton Χ-100 για επιπλέον 5 λεπτά στους 25 ° C για να επιτραπεί διαπερατοποίηση. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδολ) (1:10.000 σε PBS? Sigma). Ποσοτική ανάλυση του με Dil-θετικών κυττάρων /mm

2 πραγματοποιήθηκε με μέτρηση του αριθμού των θετικών κυττάρων σε 10 διαφορετικές οπτικές πεδία 2,24 mm

2, λαμβάνονται τυχαία από τρία διαφορετικά πειράματα. Τα αποτελέσματα έχουν εκφράζονται ως μέσες τιμές ± SE. Ρ τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση των δοκιμών και επίπεδο σημαντικότητας Kruskal-Wallis ορίστηκε ως p & lt?. 0.05

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου

ανίχνευσης

Για αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ανίχνευση, τα κύτταρα HPMCs επωάστηκαν με 2 ‘, 7’-διχλωρο διοξεικό (DCFH-DA, Fluka) (5 μΜ) για 10 λεπτά στους 37 ° C, πλύθηκαν εκτενώς με PBS και αμέσως παρατηρήθηκαν υπό Axioskop 2 μικροσκόπιο εφοδιασμένο με Pascal LSM 5 συνεστιακό λέιζερ σάρωσης (Zeiss, Oberkochen , Γερμανία) χρησιμοποιώντας ένα λέιζερ αργού με μια μπάντα διέγερσης 488 nm. Η εκπομπή μακρινή πάσα ήταν 505 φίλτρου: ένταση λέιζερ, ρυθμίσεις pinhole διάμετρο και φωτοπολλαπλασιαστή διατηρήθηκαν σταθερές για κάθε πείραμα [27]. Για την βελτιστοποίηση της μεθόδου, HPMCs # 062 στην ανακαλλιέργεια 2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το προ-οξειδωτικό υδροϋπεροξείδιο κουμενίου (Fluka Chemika, AG, Buchs, Switzerland) σε διαφορετικές δόσεις (100 και 200 ​​μΜ) παρουσία ή όχι του αντι-οξειδωτικού η βιταμίνη Ε (15 μg /ml) πριν από τον εθισμό της DCFH-DA. Η ένταση φθορισμού (fui, Ένταση Φθορισμού Μονάδες) μετρήθηκε με Zeiss KS300 λογισμικό αναλυτή εικόνας (Zeiss) αξιολόγηση τουλάχιστον 200 κύτταρα για κάθε κατάσταση σε τρία διαφορετικά μικροσκοπικά πεδία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται εκφράζονται ως μέσες τιμές ± SE από τρία διαφορετικά πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση paired t test και η σημασία επίπεδο Φοιτητών έχει οριστεί ως

σ

& lt? 0,05

Η γενιά των βασικών ενδοκυτταρική ROS μετρήθηκε επίσης με κυτταροφθορισμομετρικής δοκιμασία.. Οι HPMCs # 062, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DCFH-DA ως ανωτέρω, θρυψινοποιήθηκαν, σφαιροποιήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε προθερμασμένο μέσο και συλλέγεται με ροή MACSQuant® Analyzer κυτταρόμετρο (Miltenyi Biotec GmbH). Διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος ήταν 488 και 525 nm, αντίστοιχα (κανάλι FL2). Το πράσινο σήμα φθορισμού αναλύθηκε με λογισμικό MACSQuantify® (Miltenyi Biotec GmbH) και οπτικοποιούνται σε λογαριθμική κλίμακα τριών δεκαετία. Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) υπολογίστηκε από τρία ανεξάρτητα πειράματα με αξιολόγηση τουλάχιστον 20.000 γεγονότα για δοκιμασία και εκφράζεται ως σχετική ένταση φθορισμού (μέσος όρος ± SE). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση paired t test του Student με το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε ως

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Βελτιστοποίηση της δοκιμής in vitro για την αξιολόγηση της πρόσφυσης των καρκινικά κύτταρα στις μονοστιβάδες mesothelial

Ένα από τα πρώτα βασικό βήμα στην περιτοναϊκή μεταστατική διάδοση των γαστρεντερικών όγκων είναι η προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στο μεσοθηλιακών μονοστιβάδα [4]. Για τη μελέτη της βιολογικής συμπεριφοράς των δύο καρκίνου και μεσοθηλιακών κυττάρων και να αξιολογήσουν τους ιδιότητες πρόσφυσης, επιλέξαμε πρώτα και να προσαρμοστούν στις συνθήκες μας ένα σύστημα συν-καλλιέργειας και μία in vitro δοκιμασία για προσκόλληση (Σχ. 1Α), που χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως για τον καρκίνο των ωοθηκών [12]. Η ανθρώπινη μεσοθηλιακών κυτταρική σειρά Met-5A αναπτύχθηκε σε συρροή και τα ανθρώπινα γαστρικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος (κυτταρική σειρά AGS) ή κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος κόλου (κυτταρική σειρά Caco2) σπάρθηκαν σε συν-καλλιέργεια σε πυκνότητα 25.000 κυττάρων /cm

2 της mesothelial μονοστρωματική

Α) Σχηματικό διάγραμμα του συστήματος συν-πολιτισμό και τη δοκιμή πρόσφυσης χρησιμοποιείται σε όλη την μελέτη:. τα καρκινικά κύτταρα σπέρνονται σε mesothelial μονοστοιβάδα να αξιολογήσει την κυτταρική προσκόλληση. Β) Met-5A mesothelial κυτταρική σειρά αναπτύχθηκε σε συρροή και AGS ή Caco2 κύτταρα σπάρθηκαν στην mesothelial μονοστιβάδα σε συγκαλλιέργεια (25.000 κύτταρα /cm

2). Μετά από 24 ώρες από τη σπορά, ο συν-καλλιέργεια μονιμοποιήθηκαν, γίνανε διαπερατά και βάφτηκαν με ένα πρωτεύον αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι βιμεντίνης, που ακολουθείται από μία δευτερεύουσα Ab σημαίνεται με το fluorocrome FITC (πράσινο) για τον εντοπισμό των μεσοθηλιακών κυττάρων. Διπλό ανοσοφθορισμού με αντίσωμα α-ΕρΟΑΜ ΡΕ (κόκκινο) διεξήχθη για να αναγνωρίσει τα επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου. Cellular πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε). Η ανάλυση ανοσοφθορισμού αποκαλύπτει τις διαφορετικούς τύπους κυττάρων στο μοντέλο συγκαλλιέργειας μας. Το σήμα που αντιστοιχεί στο βιμεντίνη στην κυτταρική μονοστιβάδα είναι συμβατή με εκείνη του ενδιάμεσου νημάτια, καθώς περιπυρηνική κυτταροπλασματική δέσμες, ενώ η EpCAM χρώσης συνδυάζεται με τη μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων του πλάσματος. Και οι δύο AGS και Caco2 κύτταρα εμφανίζονται είτε σε μικρές ομάδες ή απομονωμένες και αυστηρά προσκολλημένη στα mesothelial κύτταρα. Bar: 10 μm. Γ) μικροσκοπία αντίθεσης φάσης χρησιμοποιείται για την επαλήθευση της ακεραιότητας του mesothelium μονοστιβάδας. Μετά από 48 ώρες από τη σπορά, τα προσκολλημένα κύτταρα Caco2 εμφανιστεί ένα μοτίβο αυξάνεται σε συμπαγή νησιά, ενώ τα AGS προσκολλημένων κυττάρων δείχνουν ένα πιο πεπλατυσμένο σχήμα και ένα απομονωμένο πρότυπο ανάπτυξης. Bar: 100 μm. δοκιμασία D) Πολλαπλασιασμός διεξάγεται με χρώση ανοσοφθορισμού με ένα πρωτεύον αντίσωμα αντι-Κί67, το οποίο προσδιορίζει τα κύτταρα ποδηλασίας, που ακολουθείται από μία δευτερεύουσα FITC-επισημασμένο Ab (πράσινο). Τα καρκινικά κύτταρα σημάνθηκαν με αντι-EpCAM ΡΕ Ab ως ανωτέρω. Μετά από 48 ώρες από την σπορά, η κατανομή των καρκινικών κυττάρων θετικών για το πυρηνικό σήμα Κί67 αποκαλύπτει μια διαφορετική συμπεριφορά της ανάπτυξης του όγκου: διαφορετικά από τα απομονωμένα AGS κύτταρα, το Ki67

+ κυττάρων Caco2 βρίσκονται στην περιφέρεια των νησιών. Bar:. 100 μm

Η

Για την αναγνώριση των διαφορετικών τύπων κυττάρων στο μοντέλο συγκαλλιέργειας μας, χρησιμοποιήσαμε ανοσοφθορισμού (IF) μικροσκοπία. Μετά από 24 ώρες από τη σπορά, για να αναγνωρίσει τα μεσοθηλιακών κυττάρων που απαρτίζουν την μονοστιβάδα Met-5Α, εμείς βάφονται τα συν-καλλιέργειες με ένα πρωτεύον αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι βιμεντίνης, ένα συστατικό των ενδιάμεσων νηματίων του κυτταροσκελετού, που ακολουθείται από μία δευτερεύουσα Ab σημαίνεται με η fluorocrome FITC (πράσινο): το σήμα ήταν συμβατή με τη δομή και τον εντοπισμό της βιμεντίνης, η οποία εμφανίζεται ως περιπυρηνικά κυτταροπλασματική δέσμες νημάτων (σχήμα 1Β.). Τα καρκινικά κύτταρα σημάνθηκαν με αντίσωμα α-ΕρΟΑΜ ΡΕ, αναγνωρίζει έναν ανθρώπινο επιθηλιακό μόριο προσκόλλησης και άμεσα συζευγμένο στο φθοριόχρωμα ΡΕ (κόκκινο): το αντίστοιχο σήμα που συνδέεται με την μεμβράνη των κυττάρων προσκολλημένα στη μονοστοιβάδα πλάσματος (Εικ. 1Β) . Οι κυτταρικοί πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε). Αμφότερα AGS και τα κύτταρα Caco2 εμφανίστηκε είτε σε μικρές συστάδες ή απομονώνεται και αυστηρά προσκολλημένα στα μεσοθηλιακών κυττάρων (Εικ. 1Β).

Για την αξιολόγηση των συγκολλητικών ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, η οποία επιτρέπεται να επαληθεύσει την μονοστιβάδα mesothelium και να αφαιρεθεί οποιαδήποτε αμφιβολία σχετικά με τη δυνατότητα των καρκινικών κυττάρων ακολουθώντας το γυαλί ή πλαστικό στήριγμα. Η μορφολογική ανάλυση μετά από 48 ώρες από τη σπορά έδειξε ότι τα προσκολλημένα κύτταρα Caco2 εμφανίζεται ένα μοτίβο αυξάνεται σε συμπαγή νησιά (Εικ. 1Γ). Σε αντίθεση, τα AGS προσκολλημένα κύτταρα χαρακτηρίζεται από μια πιο πεπλατυσμένο σχήμα και μια πιο απομονωμένες πρότυπο ανάπτυξης (Εικ. 1 C).

Για την καλύτερη κατανόηση της βιολογικής συμπεριφοράς που παρατηρείται σε μικροσκοπία αντίθεσης φάσης και να αξιολογήσει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των προσκολλημένων κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε IF ανάλυση με το δείκτη Κί67 που αναγνωρίζει κύτταρα ποδηλασία. Μετά από 48 ώρες από τη σπορά, οι συν-καλλιέργειες χρωματίστηκαν με μία πρωτοταγή αντι-Κί67 αντίσωμα, που ακολουθείται από μία δευτερεύουσα FITC-επισημασμένο Ab (πράσινο). Τα καρκινικά κύτταρα σημάνθηκαν με αντι-EpCAM ΡΕ Ab ως ανωτέρω. Ενώ η πολλαπλασιαστική ποσοστό των δύο προσκολλώνται τύπους κυττάρων, αξιολογήθηκε ως το ποσοστό των κυττάρων θετικών για το πυρηνικό σήμα Κί67 ήταν συγκρίσιμη (21% ± 2 και 23% ± 2 για τις Caco2 και AGS κύτταρα αντίστοιχα? Δοκιμή Kruskal-Wallis:

σ

= NS), τη διανομή τους αποκάλυψε μια διαφορετική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων (σχ. 1D). Στην πραγματικότητα, σε αντίθεση με AGS κύτταρα, η Ki67

+ κυττάρων Caco2 βρίσκονταν στην περιφέρεια των νησιών, όπως αναμενόταν από τις αυθόρμητες ικανότητά τους να διαφοροποιηθούν in vitro [26].

Για μια ποσοτική αξιολόγηση του πρόσφυσης των δύο καρκινικών κυτταρικών σειρών στη μονοστοιβάδα Met-5Α, χρησιμοποιήθηκαν οι λιπόφιλες με Dil κυτταρικό ιχνηθέτη να ονομάσει τα καρκινικά κύτταρα πριν από τη δοκιμή προσκόλλησης [12]. Το Σχήμα 2Α δείχνει τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τη σύγχρονη χρήση του με Dil και ϋΑΡΙ χρώση των συν-καλλιέργειες σε διαφορετικά χρονικά σημεία (1 ώρα, 24, 48) από την σπορά. Εικόνες 10 διαφορετικών οπτικών πεδίων ελήφθησαν τυχαία όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Οι αριθμοί των με Dil

+ καρκινικά κύτταρα ανά mm

2 στη συνέχεια υπολογίστηκαν και αναλύθηκαν στατιστικώς όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 2Β έδειξαν ότι και οι δύο κύτταρα Caco2 και AGS ήταν προσκολλημένο στην μεσοθηλιακών μονοστιβάδα σε ίση ποσότητα κατά 1 ώρα του συν-καλλιέργειας. Ωστόσο, η προσκόλληση των κυττάρων Caco2 είχαν την τάση να διπλασιάσει μετά από 24 και 48 ώρες, ενώ τα κύτταρα AGS, αν και ελαφρά αλλά σημαντική αύξηση στον αριθμό κατά την διάρκεια της χρονικής περιόδου, ήταν λιγότερες από τα κύτταρα Caco2 είτε χρονικά σημεία (

ρ

& lt? 0,05). Επειδή η πολλαπλασιαστική ποσοστό των δύο τύπων κυττάρων στις 48 ώρες, όπως περιγράφεται ανωτέρω, δεν αποκαλύπτουν διαφορές που μπορεί να ευθύνεται για την αύξηση του αριθμού των κυττάρων Caco2 προσκολλημένο στην μονοστιβάδα σε σύγκριση με τα AGS κύτταρα, τα αποτελέσματα της δοκιμής με Dil-based εμφανίστηκε να αντικατοπτρίζουν το πραγματικό διαφορετικές συγκολλητικές ιδιότητες.

Α) Met-5A μονοστιβάδα mesothelial αναπτύχθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Caco2 και AGS κύτταρα σημάνθηκαν με την με Dil ιχνηθέτη και στη συνέχεια σπείρονται στην μονοστιβάδα όπως παραπάνω. Μετά από 1, 24 και 48 ώρες, συν-καλλιέργειες πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Bar: 200 μm. Β) Ποσοτική ανάλυση του αριθμού των προσκολλημένων με Dil

+ κύτταρα /mm

2 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Ενώ μετά από 1 ώρα από την σπορά τόσο Caco2 και AGS κύτταρα προσκολλώνται στη μονοστοιβάδα σε ίση ποσότητα, στις 24 και 48 ώρες χρονικά σημεία ο αριθμός των κυττάρων Caco2 σχεδόν διπλασιάζεται σε σύγκριση με εκείνη του AGS, η οποία αυξάνει μόνο ελαφρά αλλά σημαντικά με την πάροδο του χρόνου . Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσες τιμές ± IC 95%. Στατιστικά: δοκιμασία t του Student:

* p & lt?

0.01 vs AGS 1 ώρα?

** ρ

& lt? 0.001 vs Caco2 1 ώρα και AGS 24 ώρες? ***

σ

& lt? 0.01 vs AGS 1 ώρα και

σ

= NS vs AGS 24 ώρες? ****

σ

& lt?. 0.001 vs Caco2 24 ώρες

Η

Η προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων σε πρωτογενή ανθρώπινα μονοστρωματική mesothelial προέρχεται από την περιτοναϊκή πλύσεις

Για να εκτιμηθεί η πιθανός ρόλος του mesothelium στη διαδικασία προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων σε σύστημα συν-καλλιέργειας μας, χρησιμοποιήσαμε το παραπάνω τεστ με πρωτογενείς καλλιέργειες των μεσοθηλιακών κυττάρων που λαμβάνονται από την περιτοναϊκή πλύση των ασθενών που πάσχουν από την περιτοναϊκή καρκινωμάτωση από ορθοκολικό καρκίνο του στομάχου ή και μη νόσος καρκίνωμα. Στην πραγματικότητα, η περιτοναϊκή πλύση αντιπροσωπεύει μία πρακτική πηγή των μεσοθηλιακών κυττάρων [19], αντί της χρησιμοποίησης θραυσμάτων επίπλουν.

Για να χαρακτηρίζουν τα ανθρώπινα περιτοναϊκή μεσοθηλιακών κυττάρων (HPMCs), που ελήφθη όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους, χρησιμοποιήσαμε μικροσκοπία ανοσοφθορισμού (Εικ. 3). Για να αναγνωρίσουν τα πρωτογενή μεσοθηλιακών κυττάρων από άλλους τύπους κυττάρων που υπάρχουν στο περιτοναϊκής πλύσεως, όπως είναι οι ινοβλάστες και επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα, θα βάφονται των καλλιεργειών με ένα συνδυασμό αντισωμάτων που κατευθύνονται έναντι γνωστών μεσοθηλιακών δείκτες, όπως βιμεντίνη, κυτοκερατίνη (Ck8 και CK19) και καλρετινίνη. Για να είμαστε σίγουροι ότι τα κύτταρα ήταν μεσεγχυματικής προέλευσης και όχι του επιθηλίου, που χρησιμοποιούνται παράλληλα τα ίδια αντισώματα σε κύτταρα Caco2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι HPMCs ήταν θετικά τόσο για βιμεντίνη και κυτοκερατίνη χρώση, η οποία εμφανίστηκε ως περιπυρηνική κυτταροπλασματική δέσμες ενδιάμεσα νημάτια (Εικ. 3, αριστερά πάνελ). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα Caco2 αρνητικά χρωματίστηκαν για βιμεντίνη και θετικά σημασμένο για κυτοκερατίνες (Εικ. 3, δεξιά πάνελ). Για να διακρίνουν σαφώς τις HPMCs από ινοβλάστες που πιθανώς υπάρχουν σε καλλιέργειες μας, τα κύτταρα σημάνθηκαν με αντισώματα εναντίον καλρετινίνη, ένα ενδοκυτταρικό ασβέστιο δέσμευσης πρωτεΐνη που ανήκει στην τροπονίνη-C υπεροικογένειας που εκφράζεται σε μεσοθηλιακών κυττάρων: το σήμα ήταν σε κυτοσολικό θερμά σημεία (Σχ. 3, δεξί πάνελ). Και πάλι, τα επιθηλιακά κύτταρα Caco2 ήταν αρνητικά (Εικ. 3, αριστερό πάνελ). Σε αντίθεση, HPMCs ήταν αρνητικά για το επιθηλιακό EpCAM δείκτη που εκφράστηκε στις μεμβράνες των κυττάρων Caco2 (Εικ. 3, κάτω πάνελ, κόκκινο σήμα) στο πλάσμα και για το δείκτη όγκου καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο CEA, του οποίου το σήμα ήταν ορατή είτε στο ενδοκυτταρικό κηλίδες ή επί των κυτταρικών επιφανειών (Εικ. 3, κάτω πάνελ, πράσινο σήμα).

Πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων μεσοθηλιακών κυττάρων περιτοναϊκής (HPMCs) απομονώθηκαν από περιτοναϊκή πλύσεις όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Caco2 κόλον καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένας έλεγχος. Ανάλυση ανοσοφθορισμού με τη χρήση αντισωμάτων που κατευθύνονται έναντι μεσοθηλιακών (βιμεντίνης, Ck8 και κυτοκερατίνες CK19 και καλρετινίνη) και επιθηλιακά (EpCAM και CEA) δεικτών δείχνει ότι HPMCs είναι θετικά για βιμεντίνη και χρώση κυτοκερατίνη, που εμφανίζεται ως περιπυρηνική δέσμες νημάτων, καθώς επίσης και για το θερμό -spotted σήμα καλρετινίνη, αλλά είναι αρνητικές για την EpCAM χρώσης πλασματική μεμβράνη και για το σήμα ενδοκυτταρική και επιφάνεια CEA. κύτταρα Caco2 είναι θετικά για κυτοκερατίνες και διπλά θετικά για την EpCAM και CEA επιθηλιακών δεικτών ορατές στις επιφάνειες των κυττάρων (EpCAM, πράσινο σήμα) ή στις μεμβράνες του πλάσματος και στην ενδοκυτταρική κηλίδες (CEA, κόκκινο σήμα). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Bar: 20 μm

Η

Για μια ποσοτική αξιολόγηση της ικανότητας των δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές (AGS και Caco2 κύτταρα) να συμμορφώνονται με διαφορετικές μονοστιβάδες HPMC, χρησιμοποιήσαμε το με Dil ιχνηθέτη όπως παραπάνω για να επισημάνετε το. καρκινικά κύτταρα πριν από τη δοκιμή προσκόλλησης. Για την ανάλυση χρησιμοποιήσαμε τρία πρωτογενείς καλλιέργειες των μεσοθηλιακών κυττάρων, που προέρχονται από τις περιτοναϊκές πλύσεις των ασθενών χωρίς νόσο καρκινώματος (Σχ. 4Α), με τον ορθοκολικό καρκίνο (Εικ. 4Β) ή με καρκίνο του στομάχου (Σχ. 4C) και ήμασταν σε θέση να συγκρίνετε της συμβολής των διαφόρων μεσοθηλιακών μονοστιβάδων με την προσκόλληση του ίδιου τύπου των καρκινικών κυττάρων σε διαφορετικά χρονικά σημεία (1 ώρα, 24, 48). Η ποσοτική ανάλυση της πρόσφυσης του με Dil

+ κύτταρα στις μονοστιβάδες HPMC (Σχ. 4Α-C) έδειξε μειωμένα επίπεδα πρόσφυσης σε χρονικό διάστημα το για τις δύο κυτταρικές γραμμές όγκου σε σύγκριση με την δοκιμή πρόσφυσης εκτελέστηκε επί met-5A (βλέπε Σχ. 2Β). Σε αυτά τα πρωτογενή καλλιεργημένα μονοστιβάδες, τα κύτταρα Caco2 ήταν περισσότερο προσκολλημένη από τα κύτταρα AGS είτε σε 24 ή 48 ώρες, ανεξάρτητα από την προέλευση των περιτοναϊκή πλύσεις. Ωστόσο, ενώ η προσκόλληση των κυττάρων Caco2 ήταν συγκρίσιμο σε όλες τις μεσοθηλιακών στρώματα, ανεξάρτητα από την πηγή τους από ασθενείς με νεοπλασματική ή καλοήθη νόσο, τα AGS κύτταρα εμφανίζουν σημαντικές διαφορές στη συμπεριφορά τους, δείχνουν υψηλότερα προσκόλληση στα HPMCs από ασθενή με καρκίνο του παχέος εντέρου (# 062) σε σχέση με τις HPMCs είτε από γαστρικό ασθενή με καρκίνο (# 219) ή από τη νόσο μη-καρκινώματος (# 002). Έτσι, ενώ οι ιδιότητες προσκόλλησης των μεσοθηλιακών μονοστιβάδων εμφανίζεται ανεξάρτητη από το περιβάλλον του καρκίνου, μοντέλο συν-καλλιέργειας μας είναι σε θέση να ανιχνεύσει τις διαφορές μεταξύ των HPMCs.

HPMCs απομονωθεί από την περιτοναϊκή πλύση ενός ασθενούς μη καρκινικό ( Α, # 002), από ότι από έναν ασθενή με καρκίνο του παχέος εντέρου (Β, # 062) και από εκείνη του γαστρικού ασθενή με καρκίνο (C, # 219), αναπτύχθηκαν σε συρροή μονοστιβάδα ως ανωτέρω. Caco2 και AGS κύτταρα σημάνθηκαν με με Dil, σπάρθηκαν στα στρώματα HPMC, αφήνεται να προσκολληθούν για διαφορετικά χρονικά σημεία (1, 24 και 48 ώρες) και στη συνέχεια πλένονται, σταθερό και διαπερατά. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Ποσοτική ανάλυση του αριθμού των προσκολλημένων με Dil

+ κύτταρα /mm

2 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Ανεξάρτητα από την προέλευση των περιτοναϊκή πλύσεις, τα κύτταρα Caco2 δείχνουν υψηλότερα επίπεδα σε σχέση προσκόλλησης με ΕΕΑ στις 24 και 48 ώρες. Ωστόσο, ενώ η προσκόλληση των κυττάρων Caco2 είναι παρόμοια σε όλες τις μεσοθηλιακών στρώματα, τα AGS κύτταρα εμφανίζουν σημαντικές διαφορές, δείχνοντας υψηλότερο προσκόλληση στο στρώμα # 062 σε σχέση με το # 219 και το # 002. Τα αποτελέσματα της ποσοτικής ανάλυσης εκφράζονται ως μέσες τιμές ± IC 95%. Kruskal-Wallis test: Α)

* p & lt?

0,05 έναντι του AGS 1 ώρα? **

σ

& lt? 0.01 vs Caco2 1 ώρα,

σ

& lt? 0.01 vs AGS 24 ώρες? ***

σ

& lt? 0,05 έναντι του AGS 1 ώρα και

σ

= NS σε σχέση με τις AGS 24 ώρες? ****

σ

& lt? 0.01 vs Caco2 24 ώρες. Β)

* p & lt?

0,01 έναντι του AGS 1 ώρα? **

σ

& lt? 0.01 vs Caco2 1 ώρα,

σ

= NS vs AGS 24 ώρες? ***

σ

& lt? 0,01 έναντι του AGS 1 ώρα,

σ

= NS AGS 24 ώρες? ****

σ

& lt? 0.01 vs Caco2 24 ώρες. Γ)

* p & lt?

0,01 έναντι του AGS 1 ώρα? **

σ

& lt? 0.01 vs Caco2 1 ώρα,

σ

& lt? 0.01 vs AGS 24 ώρες? ***

σ

& lt? 0,05 έναντι του AGS 1 ώρα,

σ

= NS 24 AGS ώρες? ****

σ

& lt?. 0.001 vs Caco2 24 ώρες

Η

Ο ρόλος της HPMC γήρανση στη διαδικασία προσκόλλησης

Για να αναλύσουμε με το μοντέλο μας, η συμβολή της δυνατόν κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που μπορεί να παίζουν ρόλο στα διάφορα συγκολλητικές ιδιότητες των HPMCs, εστιάσαμε την προσοχή μας στην μεσοθηλιακών γήρανσης. Στην πραγματικότητα, μεταξύ των φυσιολογικά χαρακτηριστικά του μεσοθηλιακών μονοστιβάδας, το επίπεδο γήρανση των HPMCs πιστεύεται ότι προάγει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων [22] – [24]. Είναι ενδιαφέρον, HPMCs μας, που προέρχεται από την περιτοναϊκή πλύσεις αντί από δείγματα επίπλουν, που εμφανίζεται ήδη κατά την πρώτη in vitro πέρασμα τα γνωστά χαρακτηριστικά του γηρασμού, όπως μια διευρυμένη μορφολογία, πολλαπλές πυρήνες και κυτταροπλασματικές κενοτοπίων [14].