Αφηρημένο

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη πιο κοινή αιτία της θνησιμότητας από καρκίνο στον δυτικό κόσμο με μετάσταση συνήθως παρούσα σε η στιγμή της διάγνωσης. Διαλογή για πολλαπλασιασμό και μεταστατική συμπεριφορά σε ένα νέο μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου χιμαιρικό ποντικού, οδηγείται από το μεταλλαγμένο ρ53 και β-κατενίνης, οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός μοναδικού, επεμβατική αδενοκαρκίνωμα. Σύγκριση του γονιδιώματος αυτού του όγκου, CB42, με γονιδιώματα από μη πολλαπλασιαστικό όγκων με array CGH και αλληλούχιση απεκάλυψε έναν amplicon στο χρωμόσωμα πέντε περιέχουν CDK6 και CDK14, και μια μετάλλαξη KRAS, αντίστοιχα. Ενιαία παράγων μικρό μόριο αναστολή είτε CDK6 ή ΜΕΚ, μια κινάση κατάντη του KRAS, οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης του όγκου in vivo, ενώ θεραπεία συνδυασμού όχι μόνο οδήγησε σε υποχώρηση των υποδόριων όγκων, αλλά και σχεδόν πλήρη αναστολή της μετάστασης πνεύμονα? ως εκ τούτου, γονιδιωματική ανάλυση αυτού του όγκου οδήγησε σε αποτελεσματική, εξατομικευμένη θεραπεία

Παράθεση:. Zhou Υ, Rideout WM III, Bressel Α, Yalavarthi S, Zi Τ, Potz D, et al. (2014) Αυθόρμητη Γονιδιωματική Μεταβολές σε ένα χιμαιρικό μοντέλο του καρκίνου του παχέος Ενεργοποίηση Μετάσταση και οδηγός Αποτελεσματική συνδυαστική θεραπεία. PLoS ONE 9 (8): e105886. doi: 10.1371 /journal.pone.0105886

Επιμέλεια: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Απριλίου 2014? Αποδεκτές: 24 Ιούλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Αυγούστου, 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε εξ ολοκλήρου από AVEO Pharmaceuticals. AVEO Pharmaceuticals είναι /ήταν ο εργοδότης όλων των συγγραφέων, εκτός από τον Marcus Bosenberg. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε εξ ολοκλήρου από AVEO Pharmaceuticals Inc. Marcus Bosenberg ήταν μια πληρωμένη σύμβουλος AVEO. Όλοι οι άλλοι συντάκτες είναι είτε εν ενεργεία ή πρώην εργαζομένων της AVEO Pharmaceuticals. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ένα από τα τέσσερα πιο κοινά και θανατηφόρα τύπους όγκων που προκαλεί περίπου 53.000 θανάτους ετησίως μόνο στις ΗΠΑ. Ευτυχώς, σημειώνεται πρόοδος κατά CRC καθώς τόσο η συχνότητα και η θνησιμότητα από αυτόν τον τύπο του όγκου έχουν πτωτική κατά την τελευταία δεκαετία σε περίπου 2-3% ετησίως. Παρά τη γενική αυτή την πρόοδο, το μέσο ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για το στάδιο 4 μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνοι είναι ακόμα ένα ζοφερό 12,5% [1]. Πολλές γενετικές αλλοιώσεις που συμβάλλουν στην CRC έχουν ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένων μεταλλάξεων οι οποίες απενεργοποιούν ογκοκατασταλτικά γονίδια (π.χ. ρ53 και APC μεταλλαγμένο στο 52% και το 76% των όγκων, αντίστοιχα) ή ενεργοποιούν ογκογονίδια (π.χ. KRAS και BRAF μεταλλαγμένο στο 42% και το 10% του όγκοι, αντίστοιχα) [2], [3]. Οι ασθενείς με σταδίου 3 ή 4 CRC χρειάζονται περισσότερο αποτελεσματικές και λιγότερο τοξικές θεραπείες για να βελτιώσει την επιβίωση και την ποιότητα της ζωής τους. Ως πιο στοχευμένες θεραπευτικές ουσίες γίνονται διαθέσιμες, κλινικές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι πολλοί από αυτούς είναι μόνο μετρίως αποτελεσματικά όταν χρησιμοποιούνται ως μονοθεραπεία. Αντιθέτως, μερικοί δείχνουν σημαντικά καλύτερα αποτελέσματα όταν συνδυάζεται με το υπάρχον χημειοθεραπευτικά ή άλλα φάρμακα που στοχεύουν [4], [5]. Για να εξετάζουν προσεκτικότερα συνδυασμούς φαρμάκων για εκείνους που θα προσφέρει το μεγαλύτερο όφελος, είναι ακριβή και προγνωστικά μοντέλα που απαιτούνται. Οι Γενετικά μοντέλα ποντικών του CRC έχουν αναπτυχθεί τις τελευταίες δύο δεκαετίες κυρίως από την αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (π.χ. APC1638N, [6] για επισκόπηση βλέπε [7]). Υπάρχοντα προκλινικά μοντέλα CRC πτώση κατά κύριο λόγο σε τέσσερις κατηγορίες: εγκατεστημένων ξενομοσχευμάτων κυτταρική σειρά, που προέρχεται ασθενή ξενομοσχεύματα (PDX), βλαστική γενετικά μοντέλα ποντικών (GEMMs) και Cre-Lox GEMMs όρους. Κάθε ένα από τα συστήματα μοντέλου έχει το δικό του σύνολο των πλεονεκτημάτων και των μειονεκτημάτων με ξενομοσχεύματα κυτταρικής σειράς είναι το πιο εύκολο να εκτελέσει, αλλά οι περισσότεροι μακρινή συγγένεια προς τον κύριο όγκο στον ξενιστή, ενώ στο άλλο άκρο του φάσματος Cre-Lox ενεργοποιούνται GEMMs προκύψει ο επιθυμητό ιστό σε ανοσοεπαρκή ξενιστή.

Η πρόσφατη συλλογή και διάδοση των όγκων απ ‘ευθείας από τους ασθενείς απέφερε νέους πόρους PDX οι οποίες διατηρούν μεγαλύτερη ετερογένεια του όγκου, τόσο ιστολογικά και γενετικά [8]. Ωστόσο, η δημιουργία ανθρώπινων όγκων σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς εξασκεί πίεση επιλογής τόσο στην προσαρμογή σε ένα ξενιστή ποντικό και συνήθως σε μια έκτοπη θέση (δηλαδή υποδόρια). Αυτό περιορίζει εγγενώς την ποικιλία των αλληλεπιδράσεων που φυσιολογικά μεταξύ του όγκου, το στρώμα και το αιμοποιητικό σύστημα. Σε αρκετές μελέτες η αποτελεσματικότητα διάδοση του υλικού ασθενών που προέρχονται σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς έχει αναμιχθεί, με εκθέσεις έως και 77% των πολύ προχωρημένο ανθρώπινων όγκων του παχέος εντέρου πολλαπλασιαστικού σε άτριχα ποντίκια [9].

GEMMS ξεπεράσει πολλά από τα περιορισμούς των ξενομοσχευμάτων. Τρέχουσα GEMMs του καρκίνου του παχέος εντέρου αναπτύσσουν όγκους σε σύντομο χρονικό διάστημα καθοδηγείται από τις χαρακτηριστικές μεταλλάξεις σε κρίσιμα ογκογονίδια και τα γονίδια όγκων καταστολέα (για επισκόπηση βλέπε [7]). Ορισμένα υπάρχοντα μοντέλα ποντικών του καρκίνου του παχέος εντέρου, οι οποίες απασχολούν τις σχετικές μεταλλάξεις RAS, έχουν παράσχει γνώσεις σχετικά με τις πιθανές αντιδράσεις των ναρκωτικών [10]. Η προσέγγισή μας για τη δημιουργία GEMMs περιλαμβάνει ένα μη-βλαστικής σειράς, το σύστημα χίμαιρα ποντίκι με βάση με την οποία έχουμε δημιουργήσει πολύπλοκα μοντέλα του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του μαστού και του πνεύμονα μοντέλα [11], [12]. Η προσέγγισή μας εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων επιτρέπει την ταχεία παραγωγή νέων δοξυκυκλίνη επαγώγιμων μοντέλα με πολλαπλές γενετικές τροποποιήσεις, χωρίς να χρειάζεται να διασχίσουν αναπαράγονται τα τροποποιημένα αλληλόμορφα μαζί. Οι όγκοι από τα συστήματα αυτά μοντέλου έχουν διαδοθεί ως αλλομοσχεύματα και χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει τα αρχεία του υλικού όγκου επιτρέποντας έτσι την προοπτική εξέταση της απάντησης των ναρκωτικών και η συσχέτιση της με την απάντηση με τα χαρακτηριστικά του όγκου [12], [13]. Μοριακός χαρακτηρισμός από μικροσυστοιχιών και σειρά συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμού (aCGH) αναλύσεις όπως διαδίδεται βιβλιοθήκες των όγκων έχουν δείξει ότι επιπλέον όγκου προώθηση μεταλλάξεις είχε συμβεί στις γραμμές των όγκων που επηρεάζουν τους ρυθμούς ανάπτυξης, μετάσταση, και την αντιμετώπιση των θεραπευτικών [12], [13] , [14]. Ενώ μια σειρά από οθόνες γονιδιακής έκφρασης βιοδείκτη γίνονται όλο και πιο χρήσιμο στην κατεύθυνση της θεραπείας εν εξελίξει κλινικές δοκιμές (π.χ. 21, 50, 70 υποψήφιοι, αντίστοιχα, για Oncotype Dx, PAM50 και MammaPrint [15]) και αλληλούχισης επόμενης γενιάς γνωστά γονίδια του καρκίνου (n = 236) έχει αρχίσει να κατευθύνει επωφελής επιλογή της θεραπείας για ένα ευρύ φάσμα τύπων όγκου [16], την αύξηση της προσβασιμότητας του γονιδιώματος ευρεία προβολή της έκφρασης, αντιγράψτε τον αριθμό, και η ακολουθία μπορεί να παρέχει μια αμερόληπτη προσέγγιση για τον προσδιορισμό αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου.

Στην εργασία αυτή περιγράφεται η διαδικασία κατασκευής ενός με βάση το μοντέλο ES κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου οδηγείται από μετάλλαξη p53 και επαγόμενες ενεργοποιημένη β-κατενίνης (

CTNNB1

).

Οι CTNNB1

μεταλλάξεις βρέθηκαν σε 5% των ανθρώπινων CRC με και χωρίς τις αντίστοιχες μεταλλάξεις στο

APC

[2] ιδίως σε κληρονομική μη-πολυποειδούς ορθοκολικό καρκίνο (HNPCC) ασθενείς όπου η συχνότητα του

CTNNB1

αυξήσεις μετάλλαξη [17]. Οι όγκοι που προκύπτουν από αυτά τα μοντέλα που βασίζονται ES κυττάρων περιέχουν τις ίδιες γενετικές υπόβαθρο και τις αρχικές μεταλλάξεις του οδηγού? Ωστόσο, έχουν την τάση να αποκτήσουν de novo μεταλλάξεις και αριθμός αντιτύπου παραλλαγές κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, που δημιουργούν περιορισμένη ποικιλομορφία που μπορούν να επηρεάσουν την ανταπόκριση στη θεραπεία. Η β-κατενίνης (ΔN131) καθοδηγούμενου από το μοντέλο που παρουσιάζουμε εδώ δημιουργούνται νέες γνώσεις σχετικά με γενετικές αλλοιώσεις απαραίτητο για τον πολλαπλασιασμό των όγκων του ποντικιού, μετάσταση, και την αντιμετώπιση των ναρκωτικών.

Αποτελέσματα

ES κυττάρων με βάση το μοντέλο χίμαιρα του παχέος εντέρου

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν μια νέα προσέγγιση για την ανάπτυξη του καρκίνου μοντελοποίηση σε ποντίκια χρησιμοποιώντας χίμαιρες κυττάρων ES. Σε σύγκριση με τα συμβατικά βλαστικής σειράς διαγονιδιακά μοντέλα, ένα από τα βασικά πλεονεκτήματα του χιμαιρικού προσέγγισης είναι ότι επιτρέπει κύτταρα που φιλοξενούν ογκογόνο μεταλλάξεις να συνυπάρχουν με τα γειτονικά κύτταρα που είναι γενετικά άγριου τύπου, καλύτερα μιμούνται την ογκογόνο διαδικασία σε ανθρώπινους καρκίνους. Η διαγραφή της APC, ενός γνωστού ογκοκατασταλτικό, είναι ένα βασικό γεγονός στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η αδρανοποίηση των αποτελεσμάτων APC σε ανυψωμένα επίπεδα πυρηνικής β-κατενίνης, η οποία εμποδίζει τελική διαφοροποίηση και προάγει τον πολλαπλασιασμό. Για τη δημιουργία μοντέλου κόλου κυτταρικές γραμμές ES, ξεκινήσαμε με ΙΝΚ4 & +/- γραμμή (H12C23) και διαδοχικά τροποποίησε τα δύο αλληλόμορφα ρ53: το πρώτο αλληλόμορφο ρ53 εξαρτάται εισάγοντας ΙοχΡ θέσεις που πλευρίζουν τα εξόνια 2 έως 7 η οποία αλλάζει από ένα λειτουργικό αλληλόμορφο σε ένα ανενεργό αλληλόμορφο κατά την Cre ανασυνδυασμός μέσω? το δεύτερο αλληλόμορφο ρ53 έχει μία κασέτα LOX-stop-Ιοχ εισάγεται εντός ενδόνιο 1 σε συνδυασμό με τη μετάλλαξη R172H στο εξώνιο 5, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την έκφραση ενός ογκογόνου εκδοχή της ρ53 μετά Cre μεσολάβηση αφαίρεση της κασέτας στοπ. Στη συνέχεια, ένα GAPDH-LOX-stop-LOX-rtTA-IRES-λουσιφεράσης κασέτα (ο ενεργοποιητής /κασέτα δείκτη) κατασκευάστηκε, το οποίο, όταν ενεργοποιείται από Cre, εκφράζει rtTA (αντίστροφη τετρακυκλίνη trans-ενεργοποιητής) και λουσιφεράσης ταυτόχρονα. Τέλος, τα κύτταρα ES συν-επιμολύνθηκαν με κατασκευές για GAPDH-LOX-stop-LOX-rtTA-IRES-λουσιφεράση, βιλλίνης-Cre και TetO-β-κατενίνης (ΔN131), μια ακρωτηριασμένη εκδοχή του β-κατενίνης που δεν έχει την περιοχή ότι δεσμεύει το σύμπλοκο APC /αξίνης και ιδιοσυστατικά συσσωρεύεται στον πυρήνα. Σε μη γαστρεντερικών επιθηλιακών κυττάρων του χίμαιρες που προκύπτουν, ο προαγωγός βιλλίνης θα είναι σιωπηλός και έτσι Cre δεν θα εκφράζεται. Σε αυτήν την περίπτωση, ένα αλληλόμορφο ρ53 παραμένει άγριου τύπου και η κασέτα rtTA ενεργοποιητής είναι αδρανής (Εικ. 1 ES κυττάρου). Σε κύτταρα-στόχους στο εντερικό επιθήλιο όπου βιλλίνη προαγωγός κατευθύνει έκφραση Cre, μόνο μεταλλαγμένο ρ53 θα εκφράζεται και η κασέτα ενεργοποιητής θα εκφράσει rtTA και λουσιφεράση και ως εκ τούτου, β-κατενίνης (ΔN131) έκφραση μπορεί να επαχθεί ειδικά σε αυτά τα κύτταρα με δοξυκυκλίνη (Σχ . 1 GI κυττάρων και GI κυττάρων + DOX).

Α). Σε κύτταρα ES: εισήχθησαν 3 διαγονιδιακά κασέτες: βιλλίνη-Cre, GAPDH-LOX-stop-LOX-rtTA-IRES-λουσιφεράσης, και TetO- β-CateninΔN131? και οι τρεις παραμένουν σιωπηλοί στα κύτταρα ES. Επιπλέον, ένα αλληλόμορφο ρ53 floxed και εκφράζει άγριου τύπου ρ53 σε κύτταρα ES και το άλλο αλληλόμορφο στόχευσε με LOX-stop-LOX και σημειακή μετάλλαξη R172H, η οποία είναι λειτουργικά μηδενική σε κύτταρα ES. ΣΙ). Στο γαστρεντερικό επιθήλιο, η έκφραση της Cre οδηγεί σε διαγραφή των δύο κασέτες LOX-stop-Ιοχ καθώς και την floxed αλληλόμορφο ρ53. έκφραση p53 θα στραφούν από άγριου τύπου με την μεταλλαγμένη μορφή, και η έκφραση των rtTA και λουσιφεράσης θα ανάψει. ΝΤΟ). υπό την παρουσία δοξυκυκλίνης, rtTA θα συνδέονται προς τον υποκινητή TetO και ενεργοποιούν τη μεταγραφή του β-CateninΔN131.

Η

Είκοσι ES κλώνοι θετικοί και για τις πέντε γενετικά στοιχεία ενέθηκαν σε βλαστοκύστες για να δημιουργήσει χίμαιρες, τα οποία δόθηκαν 2500 ppm δοξυκυκλίνη τροφή μετά τον απογαλακτισμό. Μετά την επαγωγή για 2-4 εβδομάδες, για κάθε γραμμή ES, 2-3 χίμαιρες με & gt? 80% χιμαιρισμός με το χρώμα του τριχώματος θυσιάστηκαν και οι ιστοί συλλέχθηκαν από 3 διαφορετικές περιοχές του εντερικού σωλήνα. Αναλύσαμε έκφραση του Cre, rtTA, και β-κατενίνη με qRT-PCR και τον ανασυνδυασμό των αλληλομόρφων ρ53 και την κασέτα ενεργοποιητή με PCR. Οι αναλύσεις αυτές αναγνωρίζονται 5 γενετικά και λειτουργικά επικυρώνονται γραμμές ES (91A2, 91C5, 91D3, 91F5, και 91F7) για περαιτέρω μελέτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

επαγωγή β-κατενίνης στον κολονικό επιθήλιο οδηγεί σε επεμβατικές αδενοκαρκινώματα

εκατόν είκοσι εννέα χιμαιρικά ποντίκια που παράγονται χρησιμοποιώντας τις μοντέλο 5 επικυρωθεί παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές ES και τροφοδοτείται με δοξυκυκλίνη τροφή μετά τον απογαλακτισμό. Μετά από 3 μήνες της επαγωγής, έγινε διαλογή γιά κρυφό αίμα σε μηνιαία βάση και τα ποντίκια θετικά για 2 συνεχείς μήνες παρακολουθήθηκαν καθημερινά και θυσιάστηκαν όταν παρατηρήθηκε απώλεια βάρους. Το εντερικό σωλήνα αποκόπηκε διαμήκως, ξεπλύθηκαν σε PBS για την απομάκρυνση των κοπράνων, τότε πεπλατυσμένο επί χαρτοπετσέτας και σαρώνεται κάτω από στερεοσκόπιο για πολύποδες και όγκων.

Σαράντα τέσσερα τοις εκατό των χιμαιρικών ποντικών που επάγεται με δοξυκυκλίνη αναπτυχθεί εντερική νεοπλασματικές αλλοιώσεις εντός 3-17 μηνών με μία μέση λανθάνουσα κατάσταση όγκου 11 μήνες (Εικ. 2Β, και Πίνακας 1). Απεικόνιση βιοφωταύγειας, έδειξαν αυξημένη δραστικότητα λουσιφεράσης στην κάτω κοιλιακή περιοχή των ποντικών που φέρουν όγκο (Σχ. 2Α). Σε αυτά τα ποντίκια, προσδιορίσαμε κατά μέσο όρο 2-3 νεοπλασματικές αλλοιώσεις ανά ποντικό? ιστολογική ανάλυση επιβεβαίωσε το 60% των βλαβών ως πολύποδες, 25% ως αδενώματα και 15% ως αδενοκαρκινώματα (Σχ. 2C). Είναι ενδιαφέρον ότι οι πρώιμες βλάβες (πολυπόδων και αδενώματα) βρέθηκαν εξίσου τόσο στο άνω και κάτω εντερική οδό ενώ η συντριπτική πλειοψηφία (85%) των προηγμένων αλλοιώσεις βρέθηκαν στο παχύ έντερο. Τα αδενοκαρκινώματα κυμαινόταν από 2-8 χιλιοστά σε διάμετρο και έμοιαζε ανθρώπινους όγκους κόλου ιστολογικά. Εισβολή στο υπο-βλεννογόνου στιβάδας παρατηρήθηκε στο 70% των αδενοκαρκινωμάτων (Σχ. 2C). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η πυρηνική β-κατενίνης, σε συνδυασμό με μετάλλαξη ρ53, ήταν αρκετή για να οδηγήσει κακοήθη ανάπτυξη όγκων στον γαστρεντερικό σωλήνα.

Α). Απεικόνιση βιοφωταύγειας από τρία χιμαιρικά ποντίκια μετά από τρεις μήνες της επαγωγής δοξυκυκλίνη. Φωταύγειας σήματα ανιχνεύθηκαν στην κάτω κοιλιακή περιοχή σε δύο ποντίκια. ΣΙ). Καμπύλη Kaplan-Meyer που δείχνει την καθυστέρηση της ανάπτυξης των όγκων του παχέος εντέρου σε χιμαιρικά ποντίκια. ΝΤΟ). Η ιστολογική σύγκριση της κανονικής γαστρεντερικής οδού, καλοήθεις πολύποδες, και αδενοκαρκίνωμα από χιμαιρικά ποντίκια. ΡΕ). Χημική χρωματομετρική χρώση για Βλεννίνης και ανοσοϊστοχημική χρώση για β-κατενίνης, Ki-67, και Κυκλίνη D1 σε κανονική GI επιθήλιο, πολύποδες και αδενοκαρκίνωμα.

Η

Μοριακός χαρακτηρισμός των β-κατενίνης οδηγείται όγκων του παχέος εντέρου

Ανάλυση με ανοσοϊστοχημεία των υποψήφιων πρωτεϊνών στα β-κατενίνης με γνώμονα πρωτογενών όγκων έδειξε την ενεργοποίηση αρκετών οδών που είναι γνωστό ότι παίζουν ρόλο στην ογκογένεση του παχέος εντέρου. Οι κανονικές του παχέως μορφές επιθήλιο καλά οργανωμένο κρύπτη-λάχνης μονάδων (Σχ. 2C), με διαίρεση προγονικά κύτταρα που βρίσκονται στην κρύπτη περιοχή και διαφοροποιημένων μη διαιρούμενα κύτταρα στο λάχνης, όπως αποδεικνύεται από τον περιορισμό του Ki-67 και Κυκλίνη D1 θετικά κύτταρα για να η κρύπτη. Ενώ μεμβρανώδη β-κατενίνης ανιχνεύεται σε όλα τα επιθηλιακά κύτταρα, τα πυρηνικά β-κατενίνης βρίσκεται μόνο σε 20-30% των κυττάρων εντός της κρύπτης (Σχ. 2D). Σε αντίθεση, η κανονική δομή κρύπτη-λάχνης χάθηκε στα δύο πολύποδες και επεμβατική αδενοκαρκινώματα. χρώση της β-κατενίνης δεν ήταν πλέον περιορίζεται στην μεμβράνη? αντί 80-90% των κυττάρων παρουσίασαν κυτταροπλασματική και πυρηνική θετικότητα β-κατενίνης. 60-80% των κυττάρων όγκων έδειξαν ισχυρή Ki-67 χρώση και Κυκλίνη D1 θετικότητα, αποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα όγκου έχουν ενεργά πολλαπλασιαζόμενα. Επιπλέον, αν και ισχυρή θετική χρώση για επιθηλιακή βλεννίνη ανιχνεύθηκε στο 20-40% των κυττάρων σε όλες τις καλοήθεις πολύποδες που μελετήθηκαν, συνεπής με κολονική επιθηλιακής προέλευσης τους, Μουκίνη δεν ανιχνεύθηκε στα αδενοκαρκινώματα που εξετάστηκαν (Εικ. 2D). Ένα κλάσμα των αδενοκαρκινωμάτων έδειξε επίσης υπερέκφραση του EGFR (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Serial πολλαπλασιασμού όγκων του παχέος εντέρου

Η μακρά λανθάνουσα κατάσταση του μοντέλου αυτού, σε συνδυασμό με την ανάπτυξη ασύγχρονη όγκου, παρουσίασε μια εμπόδιο για την αποτελεσματική εκπλήρωση των προκλινικών θεραπευτικές μελέτες σε στατιστικά σημαντικό τρόπο. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, θα διερευνηθούν τρόποι για να επεκτείνει το υλικό του όγκου που συλλέγονται από αυτό το μοντέλο μέσω της σειριακής in vivo πολλαπλασιασμού. Μέχρι στιγμής, οι εκθέσεις του πολλαπλασιασμού των όγκων του παχέος εντέρου ποντικών ήταν απούσα από τη βιβλιογραφία. Δοκιμάσαμε in vivo πολλαπλασιασμό σε 3 διαφορετικά στελέχη ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, (SCID, NOD-SCID και Γυμνό) σε 3 διαφορετικούς χώρους (υποδόριο χώρο, κάψουλα του νεφρού, και στο τυφλό υπο-βλεννογόνου χώρου) (βλέπε Πίνακα S1 για λεπτομέρειες) είτε όγκου θραύσματα ή εναιωρήματα μονών κυττάρων ενσωματωμένα σε Matrigel. Διάδοση του υλικού όγκου από 82 όγκους εξετάστηκε σε ένα σύνολο 107 sites. Των όγκων που δοκιμάστηκαν, μόνο ένας δημιουργήσει με επιτυχία πολλαπλασιάζονται γραμμή όγκου, CB42, που προέκυψαν κατά τη τυφλό έντερο ενός χιμαιρικό ποντίκι από τη ES γραμμή 91C5 (Πίνακας 2 και Πίνακας S1).

Η

CB42 μεγάλωσε σθεναρά τόσο στην κάψουλα του νεφρού και του υποδόριου χώρου? για παράδειγμα, όταν 10

5 κύτταρα εγχύθηκαν ανά θέση, οι όγκοι έγιναν ορατές σε 5-7 ημέρες και έφθασαν ανθρώπινες όρια εντός άλλες 2 εβδομάδες. Η ιστολογική ανάλυση έδειξε ότι η αρχιτεκτονική των όγκων πολλαπλασιάζονται είτε σε κάψουλα του νεφρού ή υποδόριο χώρο έμοιαζε ότι του πρωτογενούς όγκου (Σχ. 3Α, Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα πολλαπλασιασμένα όγκοι διατήρησαν περισσότερο από το 80% των κυττάρων που εμφανίζουν κυτταροπλασματική και πυρηνική έκφραση β-κατενίνης (Εικ. 3C) και διατηρείται επιθηλιακά χαρακτηριστικά τους, όπως αποδεικνύεται από ομοιογενή χρώση IHC για τηγάνι κυτοκερατίνη (Σχ. 3D) και Ε-καδερίνης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται ). Η ανοσοϊστοχημική χρώση για τον HGF ήταν θετική σε 70-80% αυτών των κυττάρων του όγκου, και χρώση για φωσφο-ΜΕΤ αποκάλυψε υψηλή MET έκφραση και την ενεργοποίηση, αλλά περιέργως δεν θετικότητα EGFR (Σχ. 3C-F και τα δεδομένα δεν φαίνονται), όπως φαίνεται συνήθως στο ανθρώπινο CRC [18] και άλλες πρωτογενείς όγκους του μοντέλου Β-κατενίνης του παχέος εντέρου ES-χίμαιρα

Α) Ιστολογία (H & amp?. Ε χρώση) του CB42 πρωτοπαθούς όγκου. ΣΙ). Ιστολογία (H & amp? Ε) CB42 μετά από υποδόρια διάδοσης (CB42P1). ΝΤΟ). Η ανοσοϊστοχημική χρώση για β-κατενίνης. ΡΕ). Ανοσοϊστοχημική χρώση για τηγάνι Cytokeratin. ΜΙ). Η ανοσοϊστοχημική χρώση για τον HGF. ΦΆ). Ανοσοϊστοχημική χρώση για φωσφο-Met.

Η

γραμμή όγκου CB42 μεθίσταται στο συκώτι και τους πνεύμονες

Η μετάσταση παρουσιάζει την πραγματική θεραπευτική πρόκληση στην CRC. Για να επικυρώσετε το μοντέλο CB42 μας μελετήσαμε μεταστατικό δυναμικό του. Αρχικά διεξάγεται προσδιορισμούς 2 σποράς: σπορά των καρκινικών κυττάρων στον πνεύμονα μέσω ενδοφλέβιας ένεσης ή στο ήπαρ μέσω ενδοσπληνική ένεση ακολουθούμενη από σπληνεκτομή. Τα ποσοστά επιτυχίας για τις δύο δοκιμασίες σπορά ήταν υψηλό: στη δοκιμασία πνεύμονα, 10 από τους 10 ποντικούς ανέπτυξαν όγκους εντός 4-6 εβδομάδων μετά την ένεση με αποτέλεσμα αυξημένη μέση βάρη πνεύμονα για αυτούς τους ποντικούς σε 1,5 g (σε σύγκριση με 0,2 g για την κανονική πνεύμονα) ? στην δοκιμασία ήπαρ, 7 από τους 10 ποντικούς ανέπτυξαν ορατά οζίδια όγκων στο ήπαρ 5-8 εβδομάδες μετά την ένεση. Μια δεύτερη σειρά πειραμάτων μετάστασης ανακεφαλαίωνε στενότερα τη διαδικασία της μετάστασης σε ασθενείς με καρκίνο του ανθρώπου. Τα καρκινικά κύτταρα πρώτα με ένεση στον υποδόριο χώρο. Μόλις οι εμβολιάζονται όγκοι έφθασαν 500-800 mm

3 σε μέγεθος, τους αποκόπηκαν χειρουργικά και να παρακολουθείται εκ του σύνεγγυς τα ποντίκια για γενική υγιή εμφάνιση και την απώλεια βάρους, την ένδειξη της μετάστασης στα εσωτερικά όργανα. Οκτώ από τα 10 ποντίκια έδειξαν κανένα σημάδι αναγέννηση του υποδόριου όγκου και 2 είχε μόνο ένα πολύ μικρό οζίδιο (& lt? 200 χιλιοστά

3) στο χειρουργικό πεδίο. Ωστόσο, όλα τα 10 ποντίκια αρρώστησαν εντός 3-5 εβδομάδων μετά την επέμβαση. Νεκροψία αποκάλυψε μετάσταση στον πνεύμονα και στα 10 ποντίκια και μακρινό λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες σε 6 από τα 10 ποντίκια. Η προσεκτική ιστολογική εξέταση άλλα εσωτερικά όργανα συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου, του ήπατος, του σπληνός και των νεφρών δεν προέκυψαν οζίδια όγκων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Οι πνεύμονες και λεμφαδένα μεταστάσεων έμοιαζε με το πρωτογενές ιστολογικά όγκου, και ήταν θετικά για τηγάνι χρώση κυτοκερατίνη (Εικ. 4). Δεν ήταν σαφές, ωστόσο, με βάση αυτό το πείραμα, αν η επέμβαση ήταν αιτιακή σχέση με τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων σε απομακρυσμένα όργανα, ή απλώς επέτρεψε στους διαδίδονται όγκους περισσότερο χρόνο για να αναπτυχθούν στο μακρινό όργανο με την παράταση της ζωής αυτών των ποντικών. Για να γίνει διάκριση αυτών των δύο δυνατοτήτων, επαναλάβαμε το πείραμα χωρίς την χειρουργική αφαίρεση του υποδόριου όγκου. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν όταν οι όγκοι έφθασαν υποδόρια ανθρώπινος όρια και εξετάζεται προσεκτικά για σημάδια μετάστασης. Μικρές υπόλευκο οζίδια βρέθηκαν στους πνεύμονες των ποντικών 5/10, και 2 από αυτά τα ποντίκια είχαν πρησμένο βοηθητικές λεμφαδένες κοντά στο λαιμό. Αυτό το πείραμα έδειξε ότι CB42 ήταν αρμόδια να μεταστάσεις αυθόρμητα

μετάσταση στους πνεύμονες H & amp? Ε σε 5Χ (Α) και 20Χ (C) στόχος μεγέθυνσης? λεμφαδένα μετάσταση Η &? Ε σε 5Χ (Β) και 20Χ (D) στόχος μεγέθυνση? pan-κυτοκερατίνης ανοσοϊστοχημεία των πνευμόνων (Ε) και λεμφαδένα (F) μεταστάσεων.

Η

Αυθόρμητη αριθμό αλλαγών αντίγραφο γονιδίου σε CB42

Από CB42 ήταν μοναδικό ανάμεσα σε β-κατενίνης με γνώμονα παχέος εντέρου μας όγκοι στην ικανότητά της να διαδώσει και μετάσταση, πραγματοποιήσαμε μια σειρά αμερόληπτη γενωμικού προσδιορισμούς συμπεριλαμβανομένων μαζεύτηκαν συγκριτική γενωμική υβριδοποίησης (aCGH) και αλληλούχιση για τον εντοπισμό αυθόρμητων γονιδιωματικές μεταβολές που συσχετίζονται με πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από CB42 πρωτογενούς και υποδόρια, σειριακά πολλαπλασιαζόμενα (δίοδος 3, χαρακτηρισμένα ως CB42P3) δείγματα όγκου μαζί με DNA από 7 άλλες πρωτογενείς όγκους που δεν διαδίδουν επιλέχθηκαν για σύγκριση με aCGH. Η ανάλυση των στοιχείων αποκάλυψε πολλαπλές aCGH αμπλικόνια που ήταν παρούσα μόνο την υποδόρια πολλαπλασιάζονται CB42 όγκους (CB42P3), αλλά όχι του πρωτογενούς όγκου CB42, ούτε οποιαδήποτε από τις άλλες όγκων πρωτογενείς κόλου (Σχ. 5Α).

Α ). aCGH προφίλ του CB42 πρωτογενούς όγκου και το πέρασμα 3 πολλαπλασιάζονται όγκου. Ένα αμπλικόνιο 3,5 Mb στο χρωμόσωμα 5 ανιχνεύθηκε μόνο σε πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά. Ανιχνευτές για CDK6 ήταν χρωματισμένο με κίτρινο και ανιχνευτές για Cdk14 ήταν χρωματισμένο με μπλε χρώμα. ΣΙ). ανάλυση RT-PCR για την έκφραση των γονιδίων 7 στο χρωμόσωμα 5 αμπλικόνιο. Οι σχετικές τιμές έκφραση των όγκων CB42P4 (n = 4) κανονικοποιήθηκαν με εκείνη των φυσιολογικών τυφλού επιθήλιο (n = 4). ΝΤΟ). Western Blot ανάλυση για τα επίπεδα των CDK4 και CDK6 σε CB42 και 4 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου. ΡΕ). Συχνότητα CDK6 και CDK14 ενίσχυση σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου από 13 τύπους ιστών. Τα δεδομένα ανακτήθηκαν από την ιστοσελίδα CBio.

Η

Το πιο σημαντικό προϊόν ενίσχυσης ήταν 3,5 Mbp περιοχή στο χρωμόσωμα 5 μεταξύ CDK6 και Steap1 που περιέχουν πάνω από 25 γνωστά γονίδια. Εξετάσαμε με qRT-PCR της έκφρασης του 7 υποψήφια γονίδια μέσα στο αμπλικόνιο και ανακάλυψε ότι 3 από τις 7 γονίδια σημαντικά υπερεκφράζεται σε σύγκριση με φυσιολογικό επιθήλιο GI οδού: CDK6, Cdk14 (Pftk1) και Fzd1 (Σχήμα 5Β).. Η ανάλυση στυπώματος Western των CB42 και αρκετές ανθρώπινες γραμμές ξενομοσχεύματος όγκου κόλου επιβεβαίωσε υψηλή έκφραση του CDK6 σε CB42 και SW620 και ανιχνεύσιμο CDK6 σε HCT116 και HCC2998 υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση του CDK6 μπορεί να είναι πλεονεκτική για ξενομοσχεύματα ανθρώπινων όγκων (Σχ. 5C). Ανάλυση της βάσης δεδομένων Cancer Genome Atlas (TCGA) βρήκαν στοιχεία για την ενίσχυση του συνταινιακή περιοχής στο ανθρώπινο γονιδίωμα και αποκάλυψε ότι ενώ η ενίσχυση της περιοχής ήταν ασυνήθιστο στην ανθρώπινη CRC, κυμαινόταν μέχρι και 11% των γαστρικών όγκων (Εικ. 5D) .

Οι μεταλλάξεις εντοπίστηκαν με προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδιώματος

Εκτός από τον αριθμό αντιτύπου αλλαγές, εξετάσαμε DNA από πολλαπλασιαζόμενα όγκους CB42P3 για μετάλλαξης αλλαγές από ολόκληρο το γονιδίωμα, exome, και αλληλουχίας RNA που προσδιορίζονται με συνέπεια 9 μεταλλάξεις στο εξόνιο περιοχές (Πίνακας 3). Μία από τις μεταλλάξεις που προκάλεσε μια αλλαγή γλυκίνης σε κυστεΐνη στην θέση κωδικονίου 12 του γονιδίου KRAS. Μεταγενέστερες πυρο-αλληλούχιση του DNA και από τις δύο πρωτογενείς και πολλαπλασιάζονται CB42 καθώς και 10 άλλοι όγκοι πρωτογενούς κόλου επιβεβαίωσε την μετάλλαξη KRAS μόνο σε πολλαπλασιαζόμενα CB42, αλλά δεν βρήκε μεταλλάξεις KRAS σε οποιοδήποτε από τα άλλα δείγματα, υποδηλώνοντας έτσι ότι η ενεργοποίηση του KRAS δεν απαιτήθηκε για την έναρξη της πρωτοπαθούς όγκου του παχέος εντέρου στο μοντέλο CRC, αλλά απαιτείται για την κακοήθη ανάπτυξη του όγκου κατά τη διάρκεια της διάδοσης και της μετάστασης.

η

ανάπτυξη και η μετάσταση του CB42 είναι Met /HGF μονοπάτι ανεξάρτητο

από την έκφραση και ενεργοποίηση ΚΟΑ ήταν αυξημένα σε Πολλαπλασιάζονται CB42 (Εικ. 3F) και ο ρόλος της ΚΟΑ στην εισβολή και τη μετάσταση υποστηρίζεται καλά στην βιβλιογραφία [19], [20], [21], ελέγξαμε κατά πόσο θα μπορούσε να διαδραματίσει η οδός ΚΟΑ ένα σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση CB42. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, θα πραγματοποιηθεί μια σειρά από 3 πειράματα. Στο πρώτο πείραμα, ποντίκια που έλαβαν αγωγή με εμφυτεύονται υποδόρια όγκους CB42 με crizotinib (50 mg /kg ρο qd), ένα μικρό μόριο αναστολέα του ΚΟΑ και ALK. Παραδόξως, παρά το υψηλό επίπεδο έκφρασης και την ενεργοποίηση ΜΕΤ, η θεραπεία της CB42 με crizotinib δεν είχε επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου (TGI = 0%, Σχ. 6Α). Στο δεύτερο πείραμα, μελετήσαμε κατά πόσο θα μπορούσε να αναστείλει crizotinib CB42 μετάσταση. καρκινικά κύτταρα CB42 ενέθηκαν υποδορίως και οι πρωτογενείς όγκους αφαιρέθηκαν χειρουργικά μετά από 14 ημέρες, όταν το μέσο μέγεθος του όγκου έφθασε 500 mm

3. Αυτοί οι ποντικοί cohorted σε μία ομάδα οχήματος (n = 10) και μία ομάδα θεραπείας (η = 10), και η θεραπεία ξεκίνησε την δεύτερη ημέρα μετά την χειρουργική επέμβαση. Ποντικοί στις δύο ομάδες άρχισαν να αρρωσταίνουν 2-3 εβδομάδες μετά την επέμβαση. Όταν θυσιάστηκαν, πνευμονικών μεταστάσεων βρέθηκαν σε 9/9 ποντικούς στην ομάδα οχήματος και 10/10 ποντίκια στην ομάδα που έλαβε crizotinib, ενώ μετάσταση λεμφαδένα παρατηρήθηκε σε 2 ποντίκια από κάθε ομάδα. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στον αριθμό ή το μέγεθος των μεταστάσεων παρατηρήθηκε μεταξύ των ομάδων θεραπείας, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναστολή της ΚΟΑ δεν επηρέασε μεταστατική ανάπτυξη μετά την καθιέρωση των μακρινών μεταστατικών όγκων.

Α). MET crizotinib αναστολέας δεν αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου CB42. ΣΙ). CDK4 /6 αναστολέας PD0332991 ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου CB42 (*** P & lt? 0.001). ΝΤΟ). /2 αναστολέας PD0325901 εντελώς αποκλεισμένη ανάπτυξη MEK1 CB42 όγκου (*** P & lt? 0.001). ΡΕ). Συνδυασμός CDK4 /6 /και 2 που προκαλείται από αναστολέα υποχώρηση του όγκου MEK1 CB 42 (**** P & lt? 0,0001). ΜΙ). Υποδόρια όγκοι του όγκου από τα τρία σκέλη θεραπείας κατά το τέλος της μελέτης. Ο συνδυασμός είναι σημαντικά πιο ισχυρό από CDK4 /6 αναστολέα μόνο (**** Ρ & lt? 0.0001) ή το ΜΕΚ αναστολέα μόνο (*** Ρ & lt? 0.001). ΦΆ). Gross εξέταση των λοβών του πνεύμονα για μεταστατικών οζιδίων αποκάλυψε ότι τόσο CDK4 /6 αναστολέα και ΜΕΚ αναστολέα αναστέλλει σημαντικά μετάσταση στους πνεύμονες CB42 (* Ρ & lt? 0,05), αλλά ο συνδυασμός ήταν σημαντικά πιο αποτελεσματική από ό, τι είτε μόνες παράγοντα (**** Ρ & lt? 0,0001) και σχεδόν πλήρως εξαλειφθεί μετάσταση στους πνεύμονες.

η

στο τρίτο πείραμα, ελέγξαμε εάν η αναστολή ΚΟΑ θα μπορούσε να αποτρέψει τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων από μικρές περιοχές πρωτοπαθούς όγκου. Σε αυτό το πείραμα, η δοσολογία του οχήματος ή crizotinib ξεκίνησαν δύο ημέρες μετά την υποδόρια ένεση των κυττάρων CB42 σε ποντικούς-δέκτες. Οι υποδόριοι όγκοι αφαιρέθηκαν χειρουργικά δύο εβδομάδες αργότερα και η δοσολογία συνεχίστηκε μέχρι τα ποντίκια αρρώστησε. μεταστάσεις πνεύμονα παρατηρήθηκε σε όλους τους ποντικούς, ανεξάρτητα από το εάν έλαβαν crizotinib ή όχημα. Με βάση αυτά τα πειράματα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η ΚΟΑ δεν ήταν απαραίτητη για την ανάπτυξη του όγκου CB42 και μετάσταση.

Σημαντική αναστολή της υποδόριας και μεταστατικής ανάπτυξης του όγκου από CDK4 /6 ή ΜΕΚ αναστολή

Από πολλαπλασιάζονται CB42 είχε μια γονιδιωματική ενίσχυση του CDK6 και ισχυρή κυτταρική έκφραση (βλέπε παραπάνω), ελέγξαμε μία ένωση, PD0332991, η οποία αναστέλλει τόσο την CDK4 και CDK6 [22]. Παρά την επιβεβαίωση από την Western blot που παρουσίασε ισχυρή CDK6 και ασθενέστερες έκφραση CDK4 σε CB42 (Σχ. 5C), ένα 3 ημέρα δοκιμασία πολλαπλασιασμού in vitro έδειξαν ότι PD0332991 δεν ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό ενός CB42 κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται, ακόμη και στην υψηλότερη δόση (10 μΜ) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση, θεραπευτική αγωγή ποντικών εμφυτευμένων με υποδόριους όγκους CB42 με PD0332991 (125 mg /kg, ρο qd) παρεμπόδισε έντονα την ανάπτυξη του υποδόριου όγκου (TGI-75%, ρ & lt? 0,00005, Σχήμα 6Β.) Και μειωμένο μετάσταση πνεύμονα. Στο τέλος του πειράματος, μόνο πέντε από τα 15 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με PD0332991 είχε ορατό οζίδια στον πνεύμονα ενώ και τα 15 ποντίκια στις ομάδες όχημα είχε ορατό μεταστάσεις πνεύμονα. Υπήρχαν κατά μέσο όρο οζίδια πνεύμονα 5 ανά ποντικό στην ομάδα PD0332991 έναντι 18,3 στην ομάδα οχήματος (ρ = 0,00002). Συνολικά αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι CDK6 υπερέκφραση επιτρέπει όγκους GI ποντίκι για να αναπτυχθούν εκτός του παχέος υπο-βλεννογόνου περιβάλλον και ότι η ενεργοποίηση των CDK6 μπορεί να συμβάλει σε όγκους GI επιβιώνουν και ακμάζουσα με μεταστατικό ρύθμιση.

Από CB42 είχε επίσης αποκτήσει μια ενεργοποιώντας Kras μετάλλαξη και βιβλιογραφία προτείνει ότι KRAS μεταλλαγμένο όγκοι ήταν ευαίσθητα σε αναστολείς ΜΕΚ [23], η PD0325901 αναστολέα ΜΕΚ δοκιμάστηκε για την ικανότητά της να αναστέλλει την ανάπτυξη του CB42 in vitro και in vivo. μπλοκ αναστολή ΜΕΚ κατάντη σηματοδότησης του KRAS. In vitro, PD0325901 μπλοκάρει ισχυρά Erk1 /2 σηματοδότηση σε κύτταρα CB42 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). In vivo, μία μόνο δόση PD0325901, είτε στα 5 mg /kg, ή 15 mg /kg, οδήγησε σε πλήρη αναστολή της /2 φωσφορυλίωση Erk1 4 ώρες μετά τη δόση (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η θεραπεία με PD0325901 υποδόριων όγκων σε ποντίκια CB42, είτε 5 mg /kg ή 15 mg /kg, να οδηγήσει σε σχεδόν πλήρη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου (93% και 96% deltaTGI, αντίστοιχα, το Σχ. 6C). Σάρωση των πνευμόνων κατά το τέλος της μελέτης κατέδειξαν επίσης μια σημαντική μείωση τόσο του αριθμού και του μεγέθους των μεταστατικών οζιδίων στα ποντίκια που έλαβαν αγωγή εναντίον ομάδα οχήματος. Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι η ανάπτυξη και η μετάσταση του CB42 ως υποδόρια αλλομοσχεύματος επίσης εξηρτάτο σε μεγάλο βαθμό από τη μετάλλαξη KRAS.

Παλινδρόμηση των CB42 με συνδυασμένη αναστολή της KRAS /ΜΕΚ σηματοδότησης και CDK4 /6

Οι πολλαπλές γενετικές αλλοιώσεις που προσδιορίζονται στο CB42 πρότεινε ότι το μέγιστο θεραπευτικό αποτέλεσμα μπορεί να επιτευχθεί με ένα συνδυασμό στοχευμένων παραγόντων που αναστέλλουν αρκετές από τις απορυθμισμένη οδών. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε κατεργάζεται CB42 με την PD0325901 αναστολέα ΜΕΚ (5 mg /kg) σε συνδυασμό με τον αναστολέα PD0332991 CDK4 /6 (125 mg /kg). Ο συνδυασμός αυτών των δύο φαρμάκων ήταν καλά ανεκτή και δεν είχε ως αποτέλεσμα σημαντική απώλεια βάρους (& lt? 10%) (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνδυασμένη θεραπεία με PD0332991 και PD325901 δεν υποχωρούν δραματικά όγκων κατά μέσο όρο 35% (Εικ. 6D), ενώ οι βραχίονες και μόνο αγωγή με τον παράγοντα έδειξε και πάλι σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Σύγκριση των ατομικά απεικονίζονται τα μεγέθη του όγκου μεταξύ των τριών βραχιόνων θεραπείας κατά το τέλος της μελέτης απεικονίζονται τρόπο σημαντική και ομοιόμορφη υποχώρηση του όγκου ήταν στο σκέλος του συνδυασμού (Σχ. 6Ε). Επίσης, στο τέλος της μελέτης, οι πνεύμονες αποκόπηκαν και εξετάσθηκαν για παρατηρήσιμες μεταστατικών οζιδίων. Λιγότερες μεταστάσεις παρατηρήθηκαν και στα δύο σκέλη μόνο θεραπεία παράγοντα (μέχρι 5 οζίδια /ποντικό σε σύγκριση με 15 οζίδια /ποντικό στην ομάδα ελέγχου οχήματος), ενώ ιδιαίτερα, ο βραχίονας συνδυασμός κατά μέσο όρο λιγότερο από ένα οζίδιο ανά ποντικό (Σχ. 6F). Έτσι, για CB42, και οι δύο αποκτώνται γενετική βλάβες συνέβαλε στην ανάπτυξη του όγκου υποδόρια καθώς και μεταστατικό δυναμικό και /ή μετάσταση την ανάπτυξη του όγκου.

Η αναγκαστική έκφραση CDK6 και CDK14 οδήγησε σε propagatable όγκων του παχέος εντέρου

Αν και υπάρχει κάποια βιβλιογραφία ενδείξεις ότι τόσο CDK6 [24], [25] και CDK14 [26], [27] εμπλέκονται σε διάφορες πτυχές της ογκογένεσης, το δυναμικό τους ρόλους τους στην ογκογένεση κόλου επί του παρόντος δεν είναι καλά κατανοητή. Πήραμε πλεονέκτημα της ευελιξίας της προσέγγισης ES μοντέλο χίμαιρα και πρόσθεσε κασέτες έκφρασης δοξυκυκλίνη επαγόμενο από CDK14 μόνη της ή σε συνδυασμό με CDK6 και Fzd1 με το αρχικό μοντέλο του παχέος εντέρου γραμμή ES 91C5 να δημιουργήσει νέες σειρές μοντέλων.