Αφηρημένο

Κινητά ετερογένεια διαδραματίζει κεντρικό ρόλο σε μια ποικιλία λειτουργικών διαδικασιών in vivo, συμπεριλαμβανομένων καρκινογένεση. Ωστόσο, οι γνώσεις μας για κυττάρου-προς-κύτταρο διαφορές διαφορετικότητα και πώς σε μεμονωμένα κύτταρα εκδηλώνεται με μεταβολές στο επίπεδο του πληθυσμού παραμένει πολύ περιορισμένη, κυρίως λόγω της έλλειψης των κατάλληλων εργαλείων που επιτρέπουν μελέτες σε επίπεδο ενός κυττάρου. Παρουσιάζουμε μια μελέτη σχετικά με τις αλλαγές στην κυτταρική ετερογένεια στο πλαίσιο της προ-κακοήθη εξέλιξη σε απόκριση σε υποξικό στρες. Αξιοποιώντας προ-κακοήθη εξέλιξη του οισοφάγου Barrett (ΒΕ) ως πρότυπο σύστημα ασθένεια μελετήσαμε μοριακών μηχανισμών στους οποίους την εξέλιξη από μεταπλασίας προς δυσπλαστικά (προ-καρκινική) στάδιο. Χρησιμοποιήσαμε μεθόδων που αναπτύχθηκαν πρόσφατα επιτρέπει μετρήσεις των διαφορών κυττάρου-προς-κύτταρο σε αριθμούς αντιγράφων του μιτοχονδριακού DNA, τα επίπεδα έκφρασης από ένα σύνολο μιτοχονδριακών και πυρηνικών γονιδίων που εμπλέκονται σε μονοπάτια απόκρισης υποξίας, και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Σε αντίθεση με τις μελέτες χύμα κυττάρων αναφερθεί και νωρίτερα, η μελέτη μας δείχνει σημαντικές διαφορές μεταξύ των μεταπλαστικού και των δυσπλαστικών να είναι κύτταρα σε αμφότερες τις μέσες τιμές και κατανομές των παραμέτρων μονοκύτταροι του mtDNA να αντιγράψετε αριθμούς, μιτοχονδριακή λειτουργία, και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των γονιδίων που μελετήθηκαν. Με βάση την ανάλυση των δεδομένων μονοκύτταρους, προτείνουμε ότι τα μιτοχόνδρια μπορούν να είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες για την προ-κακοήθη εξέλιξη στην ΒΕ

Παράθεση:. Wang J, Shi Χ, Johnson RH, Kelbauskas L, Ζανγκ W, Meldrum DR (2013) Ανάλυση μονοκύτταροι αποκαλύπτει πρώιμη εκδήλωση του καρκινικού φαινοτύπου σε προ-κακοήθη κύτταρα του οισοφάγου. PLoS ONE 8 (10): e75365. doi: 10.1371 /journal.pone.0075365

Επιμέλεια: Nagendra Yadava, UMass-Amherst /Tufts University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Ιουνίου 2013? Αποδεκτές: 12 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήρθε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH), Εθνική ανθρώπινο γονιδίωμα Ίδρυμα Ερευνών (NHGRI), Κέντρο αριστείας σε Γονιδιωματικό Επιστημών (CEGS) και μικροκλίμακα Επιστημών ζωής Κέντρο Grant Νο 5 P50 HG002360 (DRM PI) http: //www.genome .gov /. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου (ΑΗΚ) είναι ένας εξαιρετικά θανατηφόρο είδος καρκίνου και πιστεύεται ότι αναπτύσσονται από οισοφάγου επιθηλιακά κύτταρα μέσω μιας σειράς πολύπλοκων, βήμα-σοφός μετασχηματισμούς στο βιομοριακής επίπεδο [1] – [6]. Μόλις μετασχηματιστεί, EAC κύτταρα παράγουν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα των αντιοξειδωτικών μορίων που τους καθιστά ανθεκτικό σε αυξημένα επίπεδα αντιδραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) [2]. Παρά το γεγονός ότι πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ακολουθία μετασχηματισμού περιλαμβάνει την ανάπτυξη υπερπλασίας και μεταπλασία που προκαλούνται από χρόνια φλεγμονή του πλακώδους επιθηλίου του οισοφάγου, που ακολουθείται από πολυεστιακή δυσπλασία, καρκίνωμα

in situ

και, τέλος, επεμβατική EAC [1], [7], [8], η λεπτομερής μοριακός μηχανισμός που διέπουν αυτόν τον μετασχηματισμό απομένει να διευκρινιστεί

η υποξία διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στον καρκίνο [9] -. [16]. Όπως σε όλες σχεδόν τις συμπαγείς όγκους, την παροχή οξυγόνου σε καρκινικά κύτταρα είναι σε μεγάλο βαθμό σε κίνδυνο λόγω της ανεξέλεγκτης κυτταρικής ανάπτυξης και ανεπαρκή ανάπτυξη της μικροκυκλοφορίας. Το μιτοχόνδριο, το εργοστάσιο παραγωγής ηλεκτρικού ρεύματος του κυττάρου και η κύρια πηγή της τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) σε φυσιολογικά κύτταρα, είναι ο τόπος όπου λαμβάνει χώρα οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS). Τα μιτοχόνδρια έχουν επίσης βρεθεί να παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, ή απόπτωση, και δυσλειτουργία τους συνδέεται με μια ποικιλία ασθενειών. Για παράδειγμα, μεταβολές στο μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) αριθμός αντιγράφου έχουν συσχετισθεί όχι μόνο με διαφορετικές κυτταρικές φυσιολογικές συνθήκες, αλλά και με διάφορες αλλαγές των εσωτερικών και εξωτερικών μικροπεριβάλλοντα [17], [18]. Έχει αποδειχθεί ότι τα μιτοχόνδρια μπορούν να παράγουν αυξημένα επίπεδα ROS κατά την υποξία [19], η οποία οδήγησε στην αξίωμα ότι τα μιτοχόνδρια, ο πρωταρχικός στόχος για την οξειδωτική βλάβη, μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ενδογενές αισθητήρα οξυγόνου.

Ένα από τα πιο σημαντικοί παράγοντες που καθορίζουν την αντίδραση στο φάρμακο και επιθετικότητα των όγκων είναι ο μεγάλος ενδονεοπλασματική ετερογένεια. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ακόμη και κυττάρων σε έναν κλωνικό πληθυσμό ή φαινομενικά ομογενής ιστός εμφανίζουν σημαντική μεταβλητότητα των διαφορετικών χαρακτηριστικών που κυμαίνονται από τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε φαινοτυπική χαρακτηριστικά [20] – [22]. Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι η μιτοχονδριακή ετερογένεια, συμπεριλαμβανομένων των μεταβολών στο mtDNA αριθμό αντιγράφων, μετάλλαξη του DNA /εξάντληση, έκφραση και ρύθμιση γονιδίων που κωδικοποιούνται από μιτοχονδριακό DNA, και τα επίπεδα δραστηριότητας, αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την μιτοχονδριακή πολυπλοκότητα και συμβάλλει στη συνολική ετερογένεια μεταξύ κυττάρων [23] – [25]

Οι πιο πρόσφατες βιοαναλυτική τεχνικές συλλέγουν στοιχεία χρησιμοποιώντας χιλιάδες σε εκατομμύρια κύτταρα, εγγενώς παρέχει αποτελέσματα κατά μέσο όρο για ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού των κυττάρων.. Όπως χύμα-κυττάρων προσεγγίσεις θα μπορούσαν δυνητικά να χάσετε σημαντικές και πολύτιμες πληροφορίες όταν ασχολούνται με ιδιαίτερα ετερογενή συστήματα [26], όπως ο καρκίνος [27]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη και εφαρμογή τεχνικών ικανά να εκτελέσουν τις αναλύσεις στο επίπεδο του ενός κυττάρου είναι κρίσιμη, όχι μόνο για την καλύτερη κατανόηση των βασικών κυτταρικών διεργασιών, αλλά και για νέες, πιο αποτελεσματικές στρατηγικές για την πρόληψη της νόσου, τη διαχείριση και τη θεραπεία [28 ] – [31].

Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιούμε δύο αθανατοποιημένα ανθρώπινα του Barrett του οισοφάγου επιθηλιακών κυτταρικών σειρών CP-Α και CP-C που προήλθαν αρχικά από ασθενείς με οισοφάγο Barrett (ΒΕ) χωρίς δυσπλασία και με δυσπλασία, αντίστοιχα [32]. Παρά το γεγονός ότι και οι δύο είναι κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα, βρέθηκε ότι τα κύτταρα CP-C ήταν πιο ανθεκτικά σε οξειδωτικό στρες που προκαλείται από τα χολικά οξέα (χηνοδεοξυχολικό οξύ (CDCA)) από ό, CP-Α, γεγονός που υποδηλώνει ότι, τουλάχιστον όσον αφορά την απόκριση οξύ, CP- κύτταρα C συμπεριφέρεται περισσότερο σαν οισοφάγου καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με κύτταρα CP-A [2]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να διευκρινίσει τους πιθανούς μηχανισμούς που οδηγούν σε κακοήθη μετασχηματισμό στο ΒΕ με ποσοτικοποίηση διαφορές στον τρόπο με κύτταρα ανταποκρίνονται στο οξειδωτικό στρες που προκαλείται από υποξία. Έχουμε εφαρμοστεί μια τεχνική που βασίζεται qPCR αναπτύχθηκε στο εργαστήριο μας για τον προσδιορισμό του αριθμού αντιγράφων του mtDNA και των επιπέδων έκφρασης των μιτοχονδριακών και πυρηνικών γονιδίων σε μεμονωμένα κύτταρα. Αξιοποιώντας ανάλυση μονοκύτταροι εμείς διακριθούν διαφορές στον αριθμό αντιγράφων mtDNA, το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και την απόκριση υποξίας επίπεδα έκφρασης γονιδίου μεταξύ CP-C κύτταρα τα οποία δεν μπορεί να προβλεφθεί με ανάλυση χύδην κύτταρο CP-Α και. Η εφαρμογή αυτών των νέων μεθόδων, μαζί με μονοκύτταρους O

2 μετρήσεις κατανάλωσης [33] – [35], επέτρεψε τον χαρακτηρισμό των λεπτές διαφορές απόκρισης υποξίας μεταξύ κυττάρων CP-C CP-Α και. Μια καλύτερη κατανόηση της μοριακής βάσης για την έναρξη και την ανάπτυξη της ΑΗΚ θα διευκολύνει τις προσπάθειες για τον καθορισμό πιθανών θεραπευτικών στόχων.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και υποξία Θεραπεία

οισοφάγου του Barrett που επιθηλιακών κυτταρικών σειρών CP-Α και CP-C ελήφθησαν από την ATCC και αναπτύχθηκαν σε Gibco® κερατινοκυττάρων Serum-Free Medium (SFM) μέσο κυτταρικής ανάπτυξης (Invitrogen, Carlsbad, CA), συμπληρωμένο με hEGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ) σε 5.0 μg /L, ΒΡΕ (εκχύλισμα υπόφυσης βοοειδούς) σε 50 mg /L και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη διάλυμα (Invitrogen, Carlsbad, CA) σε 100/100 μg /mL σε μια συσκευή επώασης καλλιέργειας ιστού στους 37 ° C σε υγροποιημένο αέρα με 5 % CO

2. Πριν από τα πειράματα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 75 cm

2 φιάλη σε περίπου 80% συρροή. Κύτταρα σε φάση G1 ταξινομούνται με FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA) χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα qPCR σε αυτή τη μελέτη. Για υποξία, κύτταρα CP-Α και CP-C σε 80% συρροή επωάστηκαν στο μέσο των κερατινοκυττάρων SFM που περιείχε 2% (ν /ν) Oxyrase (Oxyrase, Inc., Mansfield, ΟΗ) στους 37 ° C για 30 λεπτά, η οποία είναι ο βέλτιστος χρόνος θεραπείας Oxyrase όπως προσδιορίστηκε προηγουμένως [31]. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη σε 0.05% (ν /ν) διάλυμα θρυψίνης που περιέχει 2% (ν /ν) Oxyrase στους 37 ° C για 9 λεπτά. Η θρυψινοποίηση έχει αποκλειστεί από την προσθήκη του Dulbecco Modified Eagle Medium (ϋΜΕΜ) (Invitrogen) supplmented με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS) (Invitrogen) που περιέχει 2% (ν /ν) Oxyrase.

Single-cell Συγκομιδή

συγκομιδή Single-κυττάρων (αναρρόφησης και διανομής) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροχειριστή που αναπτύχθηκε από την ομάδα μας [36], [37] (Μέθοδοι S1).

Αστάρι σχεδιασμό και την επιλογή του γονιδίου-στόχου

τα θραύσματα εντός της υπερμεταβλητής περιοχής Ι (HVI) σε mtDNA επιλέχθηκαν για ανάλυση αριθμού αντιγράφων [38], [39]. Σύνολο DNA που απομονώθηκε από το χύμα δείγματα (1 × 10

4 κύτταρα) χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για mtDNA αντιγράψετε μέτρησης του αριθμού και ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα πραγματικό χρόνο qPCR System (StepOne, Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας βελτιστοποιημένη εκκινητές ( μέθοδοι S1). Για RT-qPCR ανάλυση επίπεδο έκφρασης, τέσσερις μιτοχονδριακά κωδικοποιημένα γονίδια (16S rRNA,

COXI

,

COXIII, CYTBI

και τέσσερα πυρηνικά γονίδια (28S rRNA, VEGF, MT3 και PTGES) (αστάρια ακολουθίες όπως [31]) επιλέχθηκαν (Μέθοδοι S1).

Single-cell mtDNA Αριθμός Αντιγραφή Καθορισμός

Μετά τη συγκομιδή, οι σωλήνες που το καθένα περιέχει ένα κύτταρο αιωρούνται σε 6 μί DNaST ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [26] καταψύχθηκαν αμέσως σε ξηρό πάγο, και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση qPCR. Κάθε qPCR διεξήχθη σε έναν συνολικό όγκο 10 μL, που περιέχει 2 μι του κυτταρολύματος από διάλυμα DNaST ως πρότυπο. για τον προσδιορισμό του αριθμού αντιγράφων mtDNA, τα προϊόντα qPCR χύδην δείγματα καθαρίστηκαν, ποσοτικά και αραιώνονται σειριακά (αριθμός αντιγράφων του 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, 75, 50 , 25, 10, 5, 1, 0) για μια σειρά αντιδράσεων qPCR. τα αποτελέσματα χρησιμοποιήθηκαν για να σχεδιαστεί μια πρότυπη καμπύλη για κάθε γονίδιο. Η τιμή Ct εκάστης απλό κύτταρο στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε αριθμό αντιγράφων απόλυτη mtDNA χρησιμοποιώντας τις πρότυπες καμπύλες που ελήφθη.

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) ποσοτικοποιήθηκε με ανάλυση συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιώντας την ποτενσιομετρική βαφή JC-1 (100 ng /mL), όπως φθοροφόρο και δημοσιευμένα πρωτόκολλα χρώσης [40 ], [41] (Μέθοδοι S1).

Single-cell γονιδιακής έκφρασης Ανάλυση

Single-cell RT-qPCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31], [42].

Ανάλυση

δεδομένα

Στατιστικές αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων των δοκιμών σημασία, διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού OriginPro (v. 8, OriginLab, Northampton, ΜΑ). Στατιστική επίπεδα σημαντικότητας υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την δίπλευρη δοκιμή μη παραμετρικό Mann-Whitney-Wilcoxon.

Αποτελέσματα

qPCR με βάση τη μέθοδο για mtDNA Copy Number Adetermination σε μεμονωμένα κύτταρα

Αρκετές μιτοχονδριακό DNA περιοχές, όπως HVI, έχουν χρησιμοποιηθεί ως στόχοι για την ανάλυση αριθμός βασίζεται σε PCR αντίγραφο mtDNA χύδην δείγματα πριν [43]. Ένα ζεύγος εκκινητών με τη χαμηλότερη τιμή Ct, διακριτή αρνητικός έλεγχος, απότομη και διακριτές κορυφές του προϊόντος ενίσχυσης στις καμπύλες τήξης, και το σωστό προϊόν ενισχύσεως, όπως επιβεβαιώνεται από αλληλούχιση επιλέχθηκε για κάθε περιοχή για περαιτέρω ανάλυση μονού κυττάρου (Εικ. S1 ,

HV1

). Διαδοχικές αραιώσεις ενισχυμένο με PCR θραύσμα του mtDNA που περιέχει την περιοχή Ηνί χρησιμοποιήθηκε για να κάνει qPCR πρότυπες καμπύλες για mtDNA αριθμό αντιγράφων. Με τα επιλεγμένα ζεύγη εκκινητών, το HVI περιοχή αποδείχθηκε ότι έχουν την καλύτερη απόδοση, με

R

2 = 0,9925, για τον αριθμό αντιγράφων του DNA που κυμαίνονται από 10

2 έως 10

6 ( Εικ. S2).

RT-qPCR για ανάλυση έκφρασης γονιδίων σε μεμονωμένα κύτταρα

Πρόσφατα έχουμε αναφερθεί σε μια νέα τεχνική που επιτρέπει την απομόνωση, τον καθαρισμό, και αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA από ένα ενιαίο κύτταρο θηλαστικού που ακολουθείται από την ανάλυση RT-qPCR των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων πυρηνικών κωδικοποιούνται [31]. Ακολουθώντας την ίδια διαδικασία, προσδιορίσαμε σε μεμονωμένα κύτταρα τα επίπεδα έκφρασης αρκετών επιλεγμένων γονιδίων που εμπλέκονται στην απόκριση της υποξίας, συμπεριλαμβανομένων μιτοχονδριακώς κωδικοποιούνται

COXI

,

COXIII

, και

CYTBI

[43] – [45], και το

VEGF

,

MT3

,

ANGPTL4

και

PTGES

γονίδια που κωδικοποιείται από το πυρηνικό DNA, με 16S rRNA και 28S rRNA χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι [31], [38], [46] – [48].

Single-cell mtDNA Copy Number Ανάλυση σε CP-Α και CP-C κυττάρων Γραμμές

Προηγούμενες μελέτες που βασίζονται στην ανάλυση χύμα-κυττάρων έδειξε ότι ο μέσος όρος των μιτοχονδρίων μάζα δεν διαφέρει σημαντικά μεταξύ CP-C κύτταρα [2] CP-Α και. Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα πρώτης ανάλυσης χύμα-κυττάρων μας, επίσης έδειξε ελαφρώς υψηλότερη αλλά στατιστικώς μη σημαντική μέση mtDNA αριθμού αντιγράφων σε κύτταρα CP-C (~1,530 ανά κύτταρο) συγκριτικά με CP-Α (~1,392 ανά κύτταρο) (Σχ. S3). Η ανάλυση μονοκύτταροι βασισμένο σε 99 μονά κύτταρα από κάθε κυτταρική γραμμή απεκάλυψε στατιστικώς σημαντικές διαφορές (ρ & lt? 0.002) σε αριθμό αντιγράφων mtDNA μεταξύ κυττάρων CP-C CP-Α και (Εικ. 1Α, Β). 92 από 99 (92%) των κυττάρων CP-Α έδειξε mtDNA αντιγράψετε αριθμούς που κυμαίνονται μεταξύ 106-1,900 ανά κύτταρο με μόνο 8 κύτταρα (8%), που περιέχουν πάνω από 2.000 αντίτυπα ανά κύτταρο, ενώ σε 92 από 99 κύτταρα CP-C mtDNA αριθμούς αντιγράφων κυμάνθηκε μεταξύ 171-2,952 ανά κύτταρο, με 8 κύτταρα που έχουν περισσότερα από 3000 αντίγραφα ανά κύτταρο (Σχ. 1Α). Κατά μέσο όρο, τα κύτταρα CP-C είχε περίπου 43% περισσότερο από ό, τι τα κύτταρα mtDNA CP-A (1363 (CP-C) έναντι 951 (CP-Α)? Σχ. 1Β, Πίνακας 1). Περιγραφικές παράμετροι των ιστογράμματα πληθυσμού mtDNA, συμπεριλαμβανομένης της ασυμμετρίας (μέτρο της συμμετρίας), κύρτωση (μέτρο της peakedness) και τον παράγοντα Fano (μέτρο της διασποράς) υπολογίστηκαν. Και οι δύο τιμές ασυμμετρίας και κύρτωσης ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη σε κύτταρα CP-C σε σύγκριση με τα κύτταρα CP-A, ενώ ο παράγοντας Fano δεν ήταν σημαντικά διαφορετική (Πίνακας 1).

Α) Ενιαία κελί mtDNA αντιγράψετε αριθμό διανομές σε μεταπλασίας (CP-Α) και των δυσπλαστικών κυττάρων (CP-C), Β) είναι διαγράμματα κουτί των δύο κατανομών φαίνονται στον πίνακα Α Ακολουθώντας τιμές που απεικονίζονται: ανοιχτό τετράγωνο – μέση? συνεχής γραμμή – μέση? άνω και κάτω κουτί γραμμές – το 75

ου και 25

ου τοις εκατό, αντίστοιχα? άνω και κάτω μουστάκια – το 95

ου και 5

ου τοις εκατό, αντίστοιχα? x – ελάχιστη και μέγιστη τιμές της κατανομής. Η τιμή ρ & lt? 0.002 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το δίπλευρη μη παραμετρική δοκιμή Mann-Whitney test στατιστική σημασία (n = 99)? mtDNA αντιγραφή αριθμοί κυμαίνονται μεταξύ 150-1,900 C-D) JC-1 μικρογραφίες φθορισμού των υποξικών CP-A (C) και τα κύτταρα υποξική CP-C (D)? μόνο κύτταρο κατανομές της σχετικής δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε CP-Α (Ε) και τα κύτταρα CP-C (F). JC-1 μηνύματα από περίπου 100 κύτταρα ανά κυτταρική σειρά και την κατάσταση αναλύθηκαν? G) στατιστική απεικόνιση της κατανομής MMP στους δύο τύπους κυττάρων /συνθήκες.

Η

Διαφορικές Απαντήσεις σε υποξία μεταξύ CP-Α και CP-C κύτταρα στο επίπεδο του ενός κυττάρου-

δυναμικό της μεμβράνης μιτοχονδριακού διαφέρει σημαντικά μεταξύ των κυττάρων CP-C CP-Α και.

μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (ΜΜΡ) που παράγεται από τη μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων αντικατοπτρίζει τη λειτουργική κατάσταση των μιτοχονδρίων. Έχει συνδεθεί με φυσιολογική απόκριση και την παραγωγή των ROS [49]. JC-1 έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε μελέτες για την παρακολούθηση της απόπτωσης των μιτοχονδρίων υγεία και δυσλειτουργία στο πλαίσιο του καρκίνου και νευροεκφυλιστικών ασθενειών [40], [41].

απεικόνισης φθορισμού χρησιμοποιώντας χρώση JC-1 αποκάλυψε σημαντικές διαφορές μεταξύ των CP -Α και τα κύτταρα CP-C (100 κύτταρα από κάθε τύπο) υπό αμφότερες τις συνθήκες ελέγχου και υποξικές (Σχ. 1C, D). Υπό ορθοξικές συνθήκες ανάπτυξης (21% O

2), τα κύτταρα CP-Α έδειξε σχετικά χαμηλό κόκκινο (590 nm) προς πράσινο (529 nm) λόγος έντασης φθορισμού με ένα μέσο όρο 2, ενώ τα κύτταρα CP-C επέδειξε μια μέση αναλογία 3,8 (Εικ. 1 Ε-G). Μετά από έκθεση σε υποξία για 30 λεπτά (βλέπε Μέθοδοι), κύτταρα και των δύο τύπων παρουσίασαν μειωμένη κόκκινο /πράσινο αναλογίες ένταση φθορισμού, κατά μέσο όρο 0,6 και 1,5 για CP-Α και τα κύτταρα CP-C, αντίστοιχα (Εικ. 1 G). Τα δεδομένα περιγραφική στατιστική συνοψίζονται στον Πίνακα 2.

Η

μιτοχονδριακού ετερογένεια εντός και μεταξύ των διαφορετικών τύπων κυττάρων έχει αναφερθεί προηγουμένως, αποκαλύπτοντας μεγάλες διακυμάνσεις στην ΜΜΡ μεταξύ των κυττάρων του ίδιου τύπου μέσα σε ένα πιάτο και μόνο καλλιέργειας [23] . Στη μελέτη μας, η ανάλυση των δεδομένων ΜΜΡ μονοκύτταροι αποκάλυψε στατιστικώς σημαντικά υψηλότερες τιμές κύρτωση σε νορμοξικά κύτταρα CP-C σε σύγκριση με νορμοξικές κύτταρα CP-Α, ενώ η ασυμμετρία ήταν συγκρίσιμη. Υπό υποξικές συνθήκες παρατηρήσαμε μια αντίθετη τάση, με τα κύτταρα CP-Α που δείχνει σημαντικά υψηλότερες τιμές από κύρτωση από ότι τα κύτταρα CP-C, ενώ οι τιμές ασυμμετρίας δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν διαφορετικές αποκρίσεις στην υποξία μεταξύ των δύο κυτταρικών γραμμών και υποδηλώνει ότι οι δύο τύποι κυττάρων αντιδρούν στην υποξία διαφορετικά, όχι μόνο από την άποψη του μέσου ΜΜΡ, αλλά και σε σχέση με την κατανομή της μεταξύ μεμονωμένων κυττάρων. Οι τιμές κύρτωση διανομής MMP δείχνουν υψηλότερη ΜΜΡ ετερογένεια των μιτοχονδρίων σε δυσπλαστικά (CP-C) από μεταπλαστικού (CP-A) είναι κύτταρα.

Ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιακής έκφρασης σε μεμονωμένα κύτταρα.

Τρεις μιτοχονδριακά κωδικοποιημένα γονίδια,

COXI

,

COXIII

και

CYTBI

, επιλέχθηκαν για ανάλυση της έκφρασης λόγω της σημαντικής ρόλο τους στη λειτουργία των μιτοχονδρίων και η συμμετοχή σε απάντηση της υποξίας [44], [45]. Πρώτον, σε σύγκριση των σχετικών επιπέδων έκφρασης αυτών των γονιδίων μεταξύ νορμοξικές και υποξικές συνθήκες σε δείγματα χύμα κυττάρων χρησιμοποιώντας μιτοχονδριακή 16S rRNA ως εσωτερική αναφορά. Και οι τρεις μιτοχονδριακών γονιδίων έδειξε ένα πολύ παρόμοιο μοτίβο απόκρισης υποξίας: αύξηση κατά 1.5 – 2.6 φορές με υψηλή μεταβλητότητα παρατηρήθηκε και στα δύο κύτταρα CP-Α και CP-C (Σχ S4A, Β.)

Για γονιδίου. ανάλυση έκφρασης στο επίπεδο του ενός κυττάρου, συνολικά 24 κύτταρα κάθε κυτταρικό τύπο και την κατάσταση (νορμοξία και υποξία) απομονώθηκαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλό βαθμό κυττάρου-προς-κύτταρο μεταβλητότητα στα επίπεδα έκφρασης και των τεσσάρων μιτοχονδριακών γονιδίων σε κύτταρα και των δύο τύπων (Εικ. 2-4). Για παράδειγμα, τιμές Ct των 16s rRNA σε κύτταρα CP-Α κυμαίνονταν από 20 έως 26 (φτάνοντας τις 30 σε μία περίπτωση), και το εύρος στο CP-C κύτταρα ήταν μεταξύ 20 και 25. Ct τιμές των

COXI

,

COXIII

και

CYTBI

στις δύο κυτταρικές σειρές ήταν μεταξύ 20 και 35, με μέσες τιμές Ct των 22.4~27.9, 26.8~28.2 και 28.3~30.2, αντίστοιχα (Εικ. 2, 3 ). Μια σημαντική μείωση της Ct τιμή του γονιδίου 16S rRNA (

ρ

& lt? 0,05, n = 24) παρατηρήθηκε σε υποξικά CP-ένα και μόνο κύτταρα, ενώ μόνο ελαφρά αλλά στατιστικά σημαντική αλλαγή ανιχνεύθηκε σε υποξικά CP- κύτταρα C (

σ

& lt? 0.05, n = 24) (Εικ. 3,

16s rRNA

). Ομοίως, μια σημαντική μείωση στην τιμή Ct για

COXI

(

ρ

& lt? 0.001, n = 24) παρατηρήθηκε σε CP-Α, αλλά όχι σε κύτταρα CP-C κάτω από υποξικές συνθήκες όπως σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση (Εικ. 2, 3,

COXI

). Από χαμηλότερες τιμές Ct σημαίνει υψηλότερες mRNA αντιγραφή αριθμών, 16s rRNA και

COXI

επίπεδα mRNA σε κύτταρα CP-Α ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα από υποξία, υποδεικνύοντας ότι και τα δύο γονίδια σε κύτταρα CP-Α ανταποκρίνεται σε υποξία. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν ο μέσος όρος Ct

COXI

τιμές ομαλοποιήθηκαν ενάντια στο επίπεδο έκφρασης των 16s rRNA Ct

16S

, ένα πρότυπο βήμα για τον υπολογισμό των σχετικών επιπέδων mRNA χύμα δείγματα κυττάρων, η μείωση του

COXI

τιμές Ct σε απόκριση σε υποξία δεν ήταν σημαντική, η οποία είναι συνεπής με τα αποτελέσματα ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης χύδην επίπεδο αυτής της μελέτης (Εικ. S4). Σε αντίθεση, μια σημαντική αύξηση τιμή Ct ανιχνεύθηκε σε

CYTBI

(

σ

= 0.03, n = 24) σε κύτταρα CP-C, αλλά όχι σε κύτταρα CP-A (

p

= 0,43, n = 24) (Εικ. 2, 3,

CYTB1

), η οποία πρότεινε μια ρύθμιση προς τα κάτω από την υποξία του παρόντος μιτοχονδριακά κωδικοποιείται γονιδίων σε κύτταρα CP-C. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης του 16S rRNA σε νορμοξικά κύτταρα CP-C είναι υψηλότερα από ό, τι σε νορμοξικά κύτταρα CP-Α (C

t (CPC) = 22.73 vs. C

t (CPA) = 23,66 , p & lt? 0.006) και προσεγγίζει τα επίπεδα σε υποξικά κύτταρα CP-Α (C

t (CPA) = 22.09). Ωστόσο, η μελέτη μας έδειξε επίσης ότι οι μέσοι αριθμοί αντιγράφων ανά κύτταρο mtDNA είναι υψηλότερες σε CP-C κύτταρα (Σχ. 1 Β, Πίνακας 1). Ως εκ τούτου, για να κάνει μια άμεση σύγκριση μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών είναι δυνατόν, υπολογίσαμε τις σχετικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου και να τους κανονικοποιήθηκαν έναντι του μέσου όρου των mtDNA αντιγραφή αριθμούς χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: όπου mtDNA είναι ο μέσος αριθμός μιτοχονδριακό DNA αντίγραφο ανά κύτταρο. Υπολογίζοντας r

κανόνας μπορούμε να προσδιορίσουμε τις σχετικές διαφορές στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων ανά μόριο mtDNA. Η παράμετρος αυτή μπορεί επίσης να ερμηνευθεί ως ένα μέτρο της «δραστηριότητας mtDNA» επειδή αντιπροσωπεύει την αναλογία μεταξύ των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων και τον αριθμό αντιγράφων mtDNA. Αξιοποιώντας αυτή την έκφραση διαπιστώνουμε ότι υπό ορθοξικές συνθήκες 16S rRNA εκφράζεται 33% υψηλότερη ανά μόριο mtDNA στην CP-C κυττάρων από ό, τι στα κύτταρα CP-A. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα είναι έγκυρο για

COXI

(28% υψηλότερα σε CP-C από CP-Α) και

COXIII

(32%), ενώ

CYTBI

εκθέματα 2,45 φορές χαμηλότερη έκφραση ανά μόριο mtDNA στην CP-C σε σύγκριση με τα κύτταρα CP-A. Επίσης παρατηρούμε σημαντικές διαφορές στην κατανομή γονιδιακής έκφρασης παραμέτρους-ασυμμετρία και κύρτωση-μεταξύ των απαντήσεων υποξία στο CP-C κύτταρα (Εικ. 4) CP-Α και. Αν και δεν υπάρχει σαφής τάση ανομοιόμορφων κατανομών ή κύρτωση είναι προφανές σε απόκριση σε υποξία σε κύτταρα CP-Α (Σχ. 4Α, C, E, G), τα κύτταρα CP-C παρουσιάζουν μία σαφή και στατιστικά σημαντική αύξηση τόσο ασυμμετρία και κύρτωση της διανομές

COXI

,

COXIII

και

CYTBI

γονιδιακής έκφρασης (Σχ. 4F, Η). Από την άλλη πλευρά, εκτός από το

PTGES

, τα πυρηνικά γονίδια που μελετήθηκαν δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στις παραμέτρους της διανομής σε CP-C κύτταρα (Σχ. 4Β, D). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι μέσες τιμές του

COXI

και

COXIII

επίπεδα έκφρασης σε νορμοξικές και υποξικών κυττάρων CP-C δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές σε επίπεδο μεγαλύτερο μέρος (Εικ. S4). Το εύρημα αυτό αποδεικνύει και πάλι τη χρησιμότητα του μονοκύτταρους αναλύσεις για να αποκτήσουν πρόσβαση σε πληροφορίες διαθέσιμες με άλλο τρόπο.

Τα ιστογράμματα των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων στον έλεγχο (

άδειο μπαρ

) και υποξία-θεραπεία (30 λεπτά ,

στερεά μπαρ

) κύτταρα CP-Α και CP-C. Τα ιστογράμματα κατανομής δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το ίδιο μέγεθος κάδου.

Η

οικόπεδα ασφαλείας των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων ενός κυττάρου και

σ

-τιμές που σχετίζονται με τις διαφορές μεταξύ ορθοξικές και συνθήκες υποξίας σε οι δύο κυτταρικές σειρές. Το διάγραμμα κουτί δείχνει ακόλουθες στατιστικές τιμές: Ανοικτή πλατεία – μέση, σταθερή γραμμή – μέση, άνω και κάτω κουτί γραμμές – οι 75η και 25η τοις εκατό, αντιστοίχως, άνω και κάτω μουστάκια – η 95η και η 5η τοις εκατό, αντίστοιχα, x – μέγιστη και ελάχιστη αξιών.

Η

σύγκριση ανομοιόμορφων κατανομών (Α, Β, Ε, F) τιμές των κατανομών επίπεδο γονιδιακής μεταγραφής μονοκύτταροι μεταξύ νορμοξικές και υποξικές συνθήκες και κύρτωσης (C, D, G, H) . Μια σαφής τάση αυξημένης τόσο ασυμμετρία και κύρτωση μιτοχονδριακώς κωδικοποιημένων κατανομές έκφρασης γονιδίου μπορεί να φανεί στο CP-C κύτταρα σε απόκριση στην υποξία, αλλά είναι απούσα σε κύτταρα CP-A. Μεταξύ των πυρηνικών γονιδίων που μελετήθηκαν μόνο το γονίδιο PTGES έδειξαν σημαντικές αλλαγές στην ασυμμετρία και κύρτωση παραμέτρων σε κύτταρα CP-C.

Η

Η διαφορική έκφραση των γονιδίων απόκρισης πυρηνικής υποξία.

Έχουμε δείξει ότι τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου προσδιορίστηκε από την ανάλυση μονοκύτταροι δεν ήταν πάντοτε σύμφωνες με εκείνες που λαμβάνονται μέσω της ανάλυσης χύμα-κυττάρων. Διαφορική έκφραση δύο πυρηνικών γονιδίων σε απόκριση προς υποξία παρατηρήθηκε μεταξύ χύδην CP-Α και τα δείγματα CP-C. Σε αντίθεση με τα κύτταρα CP-Α, όπου

ρυθμιζόταν up-MT3

~ 7 φορές και

VEGF

έδειξε καμία αλλαγή, τα κύτταρα CP-C παρουσίασαν περίπου 5 φορές αύξηση στην

VEGF

έκφραση, ενώ

MT3

δεν έδειξε καμία σημαντική αλλαγή (Εικ. S4A, Β). Στο επίπεδο μονοκύτταρους έχουμε παρατηρήσει ότι ακόμα και

28S rRNA

, το οποίο χρησιμοποιείται συχνά ως εσωτερική αναφορά σε μελέτες χύμα κυττάρων, έδειξαν σημαντική ρύθμιση προς τα πάνω στο CP-Α (

σ

& lt? 0.05, η = 36), αλλά όχι σε CP-C (

σ

= 0,05, κύτταρα n = 36) κάτω από υποξία (Εικ. 5,

28S

). Λόγω των διαφορετικών επιπέδων έκφρασης του

28S rRNA

, πρώτες τιμές Ct των γονιδίων απόκρισης υποξίας, αντί των παραδοσιακών δέλτα Ct (ομαλοποιηθεί έναντι ενός γονιδίου καθαριότητας) χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

Τα ιστογράμματα της τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε έλεγχο (

άδειο μπαρ

) και υποξία-θεραπεία (30 λεπτά,

στερεά μπαρ

) κύτταρα. Τα ιστογράμματα κατανομής δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το ίδιο μέγεθος κάδου.

Η

Αν και

28S

έκφραση rRNA ανιχνεύθηκε σε όλα τα μεμονωμένα κύτταρα στη μελέτη, μεταγραφές από τις τρεις άλλες πυρηνικές κωδικοποιημένα γονίδια δεν ήταν πάντοτε ανιχνεύθηκε σε κύτταρα CP-Α τόσο από τον έλεγχο και την υποξική ομάδες, πιθανότατα λόγω της χαμηλής αφθονίας τους. Για παράδειγμα, από τα 36 μεμονωμένα κύτταρα,

MT3

μεταγραφές ανιχνεύτηκαν σε 33 ελέγχου και 34 υποξικά μεμονωμένα κύτταρα,

PTGES

σε 29 και 36, και

VEGF

σε 16 και 24. στην CP-C μονά κύτταρα, ωστόσο, εκτός από το

VEGF

(33 από 36), μεταγραφές από όλα τα γονίδια ανιχνεύθηκαν σε όλες τις 36 μονά κύτταρα. Με βάση τις πρώτες τιμές Ct, δύο γονίδια απάντηση της υποξίας

MT3

(

σ

& lt? 0.001, n = 33, 35 στον έλεγχο και υποξική ομάδες, αντίστοιχα) και

PTGES

(

ρ

& lt? 10

-4, n = 27, 36) είχαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης σε κύτταρα CP-Α (Σχήμα 5, 6).. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε υποξικά κύτταρα CP-C μόνο

PTGES

έδειξαν σημαντική αυξητική ρύθμιση (

ρ

& lt? 0,001, η = 36, 36) ενώ τα άλλα δύο,

VEGF

και

ΜΤ3

, δεν το έκανε (Εικ. 5, 6). Διαφορική

VEGF

έκφραση γονιδίου κάτω από υποξία δεν παρατηρήθηκε ούτε CP-Α ή CP-C σε επίπεδα μονού κυττάρου. Σε αντίθεση με τις μελετήθηκαν μιτοχονδριακά γονίδια, εμείς δεν παρατηρούμε όσες στατιστικά σημαντικές διαφορές στην ασυμμετρία και κύρτωση παραμέτρων των κατανομών ενιαίας κυτταρικής γονιδιακής έκφρασης (Εικ. 4Α-D) μεταξύ νορμοξικές και υποξικών κυττάρων και των δύο τύπων. Η κατανομή του

PTGES

γονίδιο παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές αυξήσεις στα δύο τιμές ασυμμετρία και κύρτωση σε υποξικά εναντίον ορθοξικές κύτταρα CP-C. Τα σχήματα κατανομής των επιπέδων έκφρασης των άλλων τριών γονιδίων »δεν έδειξε στατιστικά σημαντικές αλλαγές σε απάντηση στην υποξία. Στα κύτταρα CP-A μόνο το

MT3

γονίδιο έδειξε μια σημαντικά αυξημένη κύρτωση σε απάντηση στην υποξία. Όλα τα άλλα γονίδια δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές στις παραμέτρους κατανομής έκφραση μονοκύτταροι

Οι παράθυρο γράφημα δείχνει ακόλουθες στατιστικές τιμές:. Ανοίξτε πλατεία – μέση, σταθερή γραμμή – μέση, άνω και κάτω γραμμές box – η 75η και η 25η τοις εκατό, αντιστοίχως, άνω και κάτω μουστάκια – η 95η και η 5η τοις εκατό, αντίστοιχα, x -. μέγιστες και ελάχιστες τιμές

η

Συζήτηση

η εύρεση σημαντικά αυξημένα επίπεδα του mtDNA σε CP -C σύγκριση με τα κύτταρα CP-Α (Εικ. 1, Πίνακας 1) είναι σημαντική δεδομένου ότι φέρει το δυναμικό λειτουργική συνάφεια. έχουν ενδιαφέρον, τόσο αυξάνεται και μειώνεται ποσότητες mtDNA έχουν αναφερθεί σε διάφορους τύπους ανθρώπινων κυττάρων συμπαγούς όγκου. Για παράδειγμα, έχουν μειώσει τα επίπεδα mtDNA έχουν βρεθεί σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και σχετίζεται με επεμβατικές φαινότυπο [50], ένα προς τα κάτω ρύθμιση της μιτοχονδριακής βιογένεσης συσχετίστηκε με διηθητικό καρκίνο του μαστού [51] και στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών [52]. Αντιθέτως, έχουν αυξημένες ποσότητες του mtDNA έχουν αναφερθεί σε προστάτη [53], παγκρεατικό [54], καρκίνο κεφαλής και λαιμού, τα γλοιώματα [55], και βρέθηκε να συσχετίζονται θετικά με κλινικοπαθολογοανατομικές στάδιο καρκίνου του παχέος εντέρου [56], Shapovalov κ.ά. . έχουν δείξει αυξημένα επίπεδα mtDNA και μείωσε τα ποσοστά της αναπνοής στον επιθετικό κύτταρα οστεοσαρκώματος σε σύγκριση με οστεοβλάστες ή καλοήθη κύτταρα οστεοσαρκώματος [57]. Επιπλέον, έχουν αυξημένα επίπεδα mtDNA έχουν συσχετιστεί με τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του μαστού [58] ενώ οι αυξήσεις των mtDNA αντιγραφή αριθμοί έχουν αναφερθεί σε εξέλιξη από την κανονική σε προ-κακοήθη να κακοήθη πρόοδο σε ενδομήτριο [59], την καρκινογένεση των καρκίνων της κεφαλής και του τραχήλου [60] και στην εξέλιξη της οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [61]. Ενώ ο λειτουργικός ρόλος των αυξημένων επιπέδων mtDNA σε προ-κακοήθη να κακοήθη εξέλιξη μένει να διευκρινιστεί, προς τα πάνω ρύθμιση της μιτοχονδριακής βιογένεσης προτάθηκε για να χρησιμεύσει ως αντισταθμιστικό μηχανισμό για εξασθενημένη μιτοχονδριακή λειτουργία που οφείλεται σε βλάβη του mtDNA σε προ-κακοήθεις αλλοιώσεις [60], [61]. Είναι έτσι πιθανό ότι δυσπλαστικών οισοφάγου επιθηλιακά κύτταρα ρυθμίζουν προς τα πάνω μιτοχονδριακή βιογένεση να αυξηθεί η συνολική διαθεσιμότητα του προτύπου για μεταγραφή, η οποία με τη σειρά της θα πρέπει να αυξήσουν το καθαρό ποσό του μιτοχονδριακού mRNA και τα αντίστοιχα επίπεδα της πρωτεΐνης για να διατηρήσει μιτοχονδριακή λειτουργία. Σημειώνουμε ότι μόνο η ανάλυση επίπεδο μονοκύτταροι αποκάλυψε ότι τα επίπεδα του mtDNA μεταξύ των κυττάρων CP-C CP-Α και διαφέρουν σημαντικά, ενώ η ανάλυση χύμα επιπέδου δεν έδειξε σημαντική διαφορά (Εικ. S3). Οι παρατηρούμενες υψηλότερες ασυμμετρίας και peakedness τιμές του mtDNA διανομής περιεχομένου σε κύτταρα CP-A είναι ενδεικτικά ενός υψηλότερου βαθμού απόκλιση από την κανονική κατανομή CP-Α σε σύγκριση με CP-C κύτταρα. Ενώ λειτουργική σημασία αυτού του ευρήματος παραμένει να διευκρινιστεί, το ίδιο το αποτέλεσμα είναι ενδιαφέρον, καθώς δείχνει τις διαφορές σε επίπεδο πληθυσμού μεταξύ των δύο σταδίων σε προ-κακοήθη ΒΕ. Είναι πιθανό ότι οφείλεται σε επιλεκτική πίεση που ανατίθενται από τη χολή και παλινδρόμηση οξέος στον οισοφάγο, ένας ή περισσότεροι υποκλώνους στο πιο ετερογενή πληθυσμό μεταπλαστικών κύτταρα (CP-Α) που επιλέγονται για αποτέλεσμα μια λιγότερο ετερογενής, πιο κοντά στο φυσιολογικό προφίλ κατανομής του περιεχομένου mtDNA στις πιο προηγμένες, δυσπλαστικών στάδιο (κύτταρα CP-C) της ΒΕ. Μελέτες με επίκεντρο ετεροπλασμία του μιτοχονδριακού DNA σε επίπεδο μονοκύτταρους θα πρέπει να διεξαχθεί για να παρέχουν πιο λεπτομερή εικόνα για αυτό το εύρημα. Παρ ‘όλα αυτά, το εύρημα αυξημένων επιπέδων mtDNA σε δυσπλαστικά να είναι κύτταρα δεικνύει ότι η προ-κακοήθη εξέλιξη BE είναι παρόμοια με άλλους τύπους εξέλιξης (ESCC και καρκίνο κεφαλής και τραχήλου) και ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για την έγκαιρη ανίχνευση της δυσπλασίας σε διαφορετικές τύπους ιστού.

Το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) μετρήσεις αποκάλυψαν σημαντικά υψηλότερες τιμές σχετικής σε νορμοξικά CP-C (1.86 ± 0.41) σε σύγκριση με CP-Α (0.80 ± 0.17) κύτταρα (Σχ. 1, Πίνακας 2 ). Όταν κανονικοποιημένο έναντι του mtDNA αντιγράψετε τον αριθμό, οι μέσες τιμές σχετικής ΜΜΡ είναι περίπου 37% υψηλότερη σε CP-C σε σχέση με τα κύτταρα CP-A. Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι κατά μέσο όρο ανά μόριο mtDNA τα δυσπλαστικά κύτταρα διατηρούν υψηλότερες τιμές ΜΜΡ από μεταπλασίας κύτταρα.